CN115820862A - 一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒 - Google Patents
一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115820862A CN115820862A CN202211548410.0A CN202211548410A CN115820862A CN 115820862 A CN115820862 A CN 115820862A CN 202211548410 A CN202211548410 A CN 202211548410A CN 115820862 A CN115820862 A CN 115820862A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- mutation
- seq
- fluorescent
- digital pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 122
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 title claims description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 126
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 65
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 65
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 22
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 claims description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- 102220101909 rs878854850 Human genes 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 24
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 abstract description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 abstract description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 11
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 206010071975 EGFR gene mutation Diseases 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- -1 digital PCR chip Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 1
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,属于基因检测技术领域,用于人类EGFR基因19de l、T790M和L858R多重突变的数字PCR检测,通过数字PCR平台的方法将多重突变检测集中在一张芯片上进行,能精确方便地实现对19de l、T790M和L858R各缺失型进行四‑五通道的高灵敏度检测,灵敏度可达0.1%,能够降低成本,减少样本的消耗,提高检测准确度和灵敏度,降低假阳性,尤其对于样本比较稀缺的ctDNA,也方便肿瘤组织等其他样本类型的检测,为非小细胞肺癌的患者提供一定的用药指导。
Description
技术领域
本发明涉及一种PCR试剂盒,具体涉及一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,属于基因检测技术领域。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是I型酪氨酸激酶受体,是原癌基因c-erB-1(HER-1)的表达产物;其参与细胞通路PI3K/Akt/mTOR、RAS/RAF/MEK/ERK-MAPK等,通过这些通路调节细胞的生长、增值、转化等重要生理过程;同时EGFR基因也是靶向治疗的重要作用靶点。
研究表明,EGFR基因突变主要发生在第19~21号外显子,包括第19号外显子的缺失突变,第20号外显子的片段***和第21号外显子的点突变,约占EGFR基因突变的90%。NSCLC患者其EGFR突变80%以上发生的突变为外显子l9的缺失突变(Ex19Del)及外显子21的L858R突变。其中外显子19缺失突变占约46%,而L858R突变占约42%。第19号外显子的缺失导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失,从而改变了细胞对TKIs的敏感性;引起耐药的主要原因是第20号外显子第790位密码子(核苷酸位置2669碱基替换)出现T-M转换突变;第21号外显子的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换,使该位点的亮氨酸转变为精氨酸,简称为L858R。研究表明,EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物(EGFR-TKI)(例如吉非替尼、厄罗替尼、埃克替尼)的治疗与EGFR基因突变有密切相关性;其中,19#外显子的缺失突变和21#外显子上的L858R点突变个体表现出对此类药物较强的敏感性,20#外显子上的T790M点突变表现出对此类药物的耐药性。EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物(EGFR-TKI)是通过抑制EGFR胞内磷酸化而阻滞信号转导,抑制肿瘤细胞增值,实现靶向治疗。另外,EGFR基因L858R和19del突变引起EGFR胞内酪氨酸激酶功能区结构变化,提高了其与靶向药物的结合能力。因此,通过检测EGFR基因L858R和19del突变,以及T790M突变,可使疾病的诊断和用药更加精准有效。
目前,常用的基因突变检测方法有两种:测序法和PCR法。测序法中包含直接测序法和二代测序(NGS)。直接测序法是金标准,可以检测已知突变和未知突变,缺点是灵敏度低,需要丰度达到20%,耗时长,假阴性高。NGS二代测序能同时检测多种基因突变,灵敏度达到5%但是成本较高,耗时也长。患者一般需等待一周才能拿到检测报告。
PCR法中包括高分辨率溶解曲线法(high-resolution melting,HRM)、扩增阻滞突变***(amplification refractory mutation system,ARMS)和数字PCR法等。
高分辨率熔解曲线是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术,可以检测出单个碱基的差异,但检测敏感度约5%,只能检测已知突变,不适合做多重PCR。
扩增阻滞突变***是一种基于PCR法检测DNA点突变的新方法,其原理是:在严格反应条件下,只有引物3’端与模板配对时,PCR扩增反应才能正常进行,从而得到扩增产物。当3’端与模板不匹配时,Taq DNA聚合酶缺少3’-5’的外切酶活性,因此无法切下不匹配的碱基,导致3’末端无法正常延伸,反应终止,得不到扩增产物。通过设计3’端与突变模板互补但是与野生型模板不互补的引物进行PCR反应,根据有无特异长度的产物来判断样品模板中是否存在突变。该方法的灵敏度能达到1%,目前广泛应用于肿瘤组织中的突变检测。
数字PCR法是一种核酸分子绝对定量技术,可直接测出模板的拷贝数。利用数字PCR结合Taqman或MGB探针可将检测灵敏度得到提升。
目前用数字PCR检测EGFR Ex19Del缺失突变常见的方法有2种:
1、Ex19Del缺失突变位置相对固定,在缺失位置设计检测探针或Block阻断探针,在缺失位置外侧设计通用探针,然后再设计***通用引物,通过缺失位置检测探针或Block阻断探针的结合与否区分野生型和突变型。这种方法只能间接判断缺失区域是否存在与野生型不一致序列,当缺失区域存在SNP或者其他类型的碱基变化时,这种方法会出现“假阳”;
2、针对每个缺失突变型都设计专用的缺失突变检测探针,这种方法可以直接的特异性检测每个缺失突变型,但由于检测体系中探针总浓度过高而导致荧光本底值过高,从而导致“阳性信号堆”与“阴性信号堆”界限模糊,影响阈值线确定,影响检测。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,用于人类EGFR基因19del、T790M和L858R多重突变的数字PCR检测,本发明提供的引物和探针组合,包括19del的上游引物、下游引物、通用探针、针对每个缺失突变型专用的缺失突变检测探针以及新型猝灭探针;T790M上游引物、下游引物、通用探针和突变探针;L858R上游引物、下游引物、通用探针和突变探针;内参基因的上游引物、下游引物、检测探针;通过数字PCR平台的方法将多重突变检测集中在一张芯片上进行,能精确方便地实现对19del、T790M和L858R各缺失型进行四-五通道的高灵敏度检测,灵敏度可达0.1%,能够降低成本,减少样本的消耗,提高检测准确度和灵敏度,降低假阳性,尤其对于样本比较稀缺的ctDNA,也方便肿瘤组织等其他样本类型的检测,为非小细胞肺癌的患者提供一定的用药指导。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,所述试剂盒包括:10×dPCRBuffer、dPCR酶、EGFR基因检测体系、阳性对照品、阴性对照品、数字PCR芯片、数字PCR用油相A和数字PCR用油相B;
所述EGFR基因检测体系包括检测Ex19Del的每个缺失突变型的检测引物、缺失突变检测探针和新型荧光猝灭探针、检测L858R位点和T790M位点的检测引物和Taqman荧光猝灭探针。
在上述技术方案的基础上,本发明还作出了进一步限定:
进一步,所述EGFR基因检测体系包括200-800nM检测引物、50-400nM检测探针、50-400nM新型荧光猝灭探针。
进一步,L858R突变检测的引物如下序列所示:
上游引物SEQ ID NO:1:AGCATGTCAAGATCACAGATTT;
上游引物SEQ ID NO:2:cgcagcatgtcaagatcacagat;
上游引物SEQ ID NO:3:gaaaacaccgcagcatgtcaag;
下游引物SEQ ID NO:4:CCTCCTTCTGCATGGTATTC;
下游引物SEQ ID NO:5:TTTGCCTCCTTCTGCATGGT;
下游引物SEQ ID NO:6:ACTTTGCCTCCTTCTGCATG;
探针如下序列所示:
突变探针SEQ ID NO:7:5’荧光标记-TGGCCCGCCCAAA-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:8:5’荧光标记-TGGCCCGCCCAA-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:9:5’荧光标记-TGGGCGGGCCAAA-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:10:5’荧光标记-TGGGCGGGCCA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:11:5’荧光标记-TGGGTGCGGAAGAGAAAG-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:12:5’荧光标记-TGCTGGGTGCGGAAGAG-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:13:5’荧光标记-GTGCGGAAGAGAAAGAATACC-3’猝灭基团。
进一步,Ex19del突变的具体基因型为E746-A750del(1),和/或E746-A750del(2),和/或l747-p753>S,和/或E746_T751>I,和/或E746_S752>V,和/或L747_T751>Q,和/或L747_E749del,和/或L747_S752del,和/或L747_A750>P,和/或L747_P753>Q,和/或L747_T751del,和/或L747_T751>P。
进一步,检测Ex19del突变的引物序列如下所示:
上游引物SEQ ID NO:14:AGTTAAAATTCCCGTCGCT;
上游引物SEQ ID NO:15:TTAAAATTCCCGTCGCTAT;
上游引物SEQ ID NO:16:ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT;
下游引物SEQ ID NO:17:GCCTGAGGTTCAGAGCCAT;
下游引物SEQ ID NO:18:CAAAGCAGAAACTCACATCG;
下游引物SEQ ID NO:19:GAGAAAAGGTGGGCCTGAG;
检测探针序列如下所示:
突变探针del1 SEQ ID NO:20:5’荧光标记-TCGGAGATGTTTTGATAGCGACG-3’猝灭基团;
突变探针del1 SEQ ID NO:21:5’荧光标记-ttcggagatgttttgatagcgac-3’猝灭基团;
突变探针del1 SEQ ID NO:22:5’荧光标记-ctttcggagatgttttgatagcg-3’猝灭基团;
突变探针del2 SEQ ID NO:23:5’荧光标记-CGGAGATGTCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团;
突变探针del2 SEQ ID NO:24:5’荧光标记-ttcggagatgtcttgatagcgac-3’猝灭基团;
突变探针del2SEQ ID NO:25:5’荧光标记-gctttcggagatgtcttgatagcg-3’猝灭基团;
突变探针del3 SEQ ID NO:26:5’荧光标记-TGGCTTTCGGAACCTTGATAGC-3’猝灭基团;
突变探针del3SEQ ID NO:27:5’荧光标记-gctttcggaAccttgatagcgac-3’猝灭基团;
突变探针del3 SEQ ID NO:28:5’荧光标记-ctttcggaAccttgatagcgacgg-3’猝灭基团;
突变探针del4 SEQ ID NO:29:5’荧光标记-TGGCTTTCGATTCCTTGATAGCG-3’猝灭基团;
突变探针del4 SEQ ID NO:30:5’荧光标记-TTGGCTTTCGATTCCTTGATAGC-3’猝灭基团;
突变探针del4 SEQ ID NO:31:5’荧光标记-ggctttcgattccttgatagcgac-3’猝灭基团;
突变探针del5 SEQ ID NO:32:5’荧光标记-TGGCTTTCGGAGATTCCTTGATAG-3’猝灭基团;
突变探针del5 SEQ ID NO:33:5’荧光标记-ctttcggagattccttgatagcga-3’猝灭基团;
突变探针del5 SEQ ID NO:34:5’荧光标记-CGGAGATTCCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:35:5’荧光标记-AGCCAACAAGGAA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:36:5’荧光标记-CGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:37:5’荧光标记-AGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团;
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:38:GCTATCAA;
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:39:ACATCTCCG;
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:40:CGAAAGCCA。
进一步,T790M突变检测的引物序列如下所示:
上游引物SEQ ID NO:41:TCTGCCTCACCTCCAC;
上游引物SEQ ID NO:42:ATCTGCCTCACCTCCAC;
上游引物SEQ ID NO:43:ATCTGCCTCACCTCCA;
下游引物SEQ ID NO:44:TTGTGTTCCCGGACATAG;
下游引物SEQ ID NO:45:TTTGTGTTCCCGGACATAG;
下游引物SEQ ID NO:46:TTTGTGTTCCCGGACATA;
检测探针序列如下所示:
突变探针SEQ ID NO:47:5’荧光标记-CAGCTGCATGATGA-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:48:5’荧光标记-AGCTGCATGATGAT-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:49:5’荧光标记-AGCTGCATGATG-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:50:5’荧光标记-AGCTGCATGATGA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:51:5’荧光标记-AAGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:52:5’荧光标记-GCTGCGTGATGA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:53:5’荧光标记-AGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团。
进一步,在序列的5’端,和/或3’端标记BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化的任一种或两种;
荧光标记为FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、CY5.5中的任一种;3’端为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化中的任一种。
进一步,所述试剂盒包括Ex19Del突变探针相同的荧光探针,L858R和T790M的野生探针和/或通用探针使用另外的不同的4种荧光通道。
进一步,所述PCR Buffer包括10-100mM Tris-HCl、1-5mM MgCl2、0-100mM KCl、0-50mM硫酸铵、0.2-0.4mM dNTP、0.01%-0.5%吐温-20、0.01%-0.5%聚乙二醇、0.01%-0.5%Triton X-100、0.01%-0.5%CA-630;
所述dPCR酶包括1-5U Taq DNA聚合酶、0.01-1U UNG酶、20-80%甘油。
进一步,所述数字PCR用油相A包括含氢量0.1%-0.8%的含氢硅油、0.01%-0.5%Triton X-100;
所述数字PCR用油相B包括端乙烯基硅油、0.1%的铂催化剂、0.15%的EM90。
本发明实现了如下技术效果:
1、通量高:本试剂盒实现了Ex19Del突变、T790M突变和L858R位点合为一芯片检测,提高了检测通量,降低了试剂耗材成本,提高了临床样本的利用率;
2、灵敏度高:本试剂盒在复杂的检测背景下,检测灵敏仍可达0.1%,相比于ARMS方法的1%灵敏度更有优势;
3、特异性强:本试剂盒针对EGFR基因的多种Ex19Del突变型设计了特定的检测突变型探针,所述引物和探针组合在PCR扩增反应时特异性强,20ng野生型基因组背景下无非特异信号;
4、阴阳性信号堆集中,信噪比高,节约荧光通道:本试剂盒采用新型猝灭探针方法,只需占用一个荧光通道,即可直接的特异性检测Ex19Del的5-12种缺失突变,克服了由于探针总浓度过高导致的荧光本底值高,“阳性信号堆”与“阴性信号堆”界限清晰,阈值线确定准确,检测结果可靠。
附图说明
图1为本发明实施例2数字PCR检测结果图;
图2为本发明实施例2数字PCR检测结果图;
图3为本发明实施例2数字PCR检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,包括:10×dPCR Buffer(10-100mMTris-HCl、1-5mM MgCl2、0-100mM KCl、0-50mM硫酸铵、0.2-0.4mM dNTP、0.01%-0.5%吐温-20、0.01%-0.5%聚乙二醇、0.01%-0.5%Triton X-100、0.01%-0.5%CA-630)、dPCR酶(1-5U Taq DNA聚合酶、0.01-1U UNG酶、20-80%甘油)、EGFR基因检测体系(200-800nM检测引物、50-400nM检测探针、50-400nM新型荧光猝灭探针,序列如下表1-3)、阳性对照品、阴性对照品、数字PCR芯片、数字PCR用油相A(含氢量0.1%-0.8%的含氢硅油、0.01%-0.5%Triton X-100)和数字PCR用油相B(端乙烯基硅油、0.1%的铂催化剂、0.15%的EM90);
表1 L858R突变检测序列
表2 Ex19del突变检测序列
表3 T790M突变检测序列
可选的,在序列的5’端,和/或3’端标记BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化的任一种或两种;
荧光标记为FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、CY5.5中的任一种;3’端为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化中的任一种;
核酸序列可与待猝灭探针的5’端或3’端互补;
互补核酸序列Tm值可选择≤50℃、或≤60℃;
试剂盒包括Ex19Del突变探针相同的荧光探针,L858R和T790M的野生探针和/或通用探针使用另外的不同的4种荧光通道。
实施例2
实施例1中试剂盒引物探针效果检测
1、制备本申请试剂盒的引物探针
选用上表1-3中的序列及数字PCR试剂盒中的其他组分作为检测体系,以不含表2中新型荧光猝灭探针的混合体系作为对照。
2、扩增试剂准备
按如下表4准备扩增试剂。
表4试剂组分及含量
试剂组分 | 加入体积(μL) |
10×dPCR Buffer | 3 |
dPCR酶 | 1 |
人EGFR基因检测体系 | 11 |
DNA样本 | 15 |
3、进样
按PCR操作说明,将步骤2中配制的反应液完成数字PCR芯片进样。
4、PCR反应
扩增程序如下表5
表5扩增程序
5、数据读取
从专用PCR仪中取出芯片,将芯片放入数字PCR芯片阅读仪中进行阅读分析。
6、结果
结果如图1-3所示,由图可知,图1的对比检测试剂中的阴性和阳性分界线不明显;而本申请试剂盒的检测结果的阳性信号和阴性信号分界线明显,信噪比高。
说明,本申请试剂盒中加入新型猝灭探针后检测效果更好。
实施例3
实施例1中试剂盒最低检出限检测
1、制备最低检测限质控品
检测限参考品涵盖每种突变类型,包括七份企业参考品(由突变类型的质粒与人EGFR野生型细胞系DNA混合制备),均用数字PCR定量突变比例。
DNA模板量为20ng,突变比例为0.1%的样本作为本实施例的检出限质控品。最低检测限质控品具体如表6所示:
表6最低检测限质控品
2、步骤同实施例2。
3、试剂盒的突变率计算和质控
本申请试剂盒可定量检测Ex19Del突变型、Ex19Del野生型、T790M突变型、T790M野生型、L858R突变型和L858R野生型,L858R的突变率可用L858R突变型/(L858R突变型+L858R野生型)计算;T790M的突变率可用T790M突变型/(T790M突变型+T790M野生型)计算;Ex19DEL的突变率可用19del突变型/(19del突变型+19del野生型)计算;
L858R定量结果(L858R突变型+L858R野生型),或T790M定量结果(T790M突变型+T790M野生型),或19del突变型/(19del突变型+19del野生型),或内参基因用于质控模板DNA的浓度和质量,这样使得本发明体系更加完善。
4、重复性检测20次,检测得到的实验结果如表7所示:
表7重复性检测结果
名称 | 定性结果 |
EGFRL858R | 阳性 |
EGFRE746-A750del(1) | 阳性 |
EGFRT790M | 阳性 |
E746-A750del(2) | 阳性 |
l747-p753>S | 阳性 |
E746-S752>V | 阳性 |
E747-T751del | 阳性 |
由表7可知,DNA模板量为20ng,本申请试剂盒能检出0.1%的EGFR突变。
实施例4
实施例1中试剂盒重复性检测
1、制备重复性质控品
2、选用EGFR基因L858R、T790M及19del突变的DNA质粒和EGFR阴性的细胞系基因组DNA按比例混合,配制突变体的突变比例为1%的标本,作为本实施例的重复性质控品,具体如表8所示:
表8重复性质控品
3、步骤同实施例2。
4、重复性检测10次,检测得到的实验结果如表9-15所示:
表9
由表9的实验结果可知,重复检查10次,检测结果阳性符合率100%;
表10
由表10的实验结果可知,重复检查10次,检测结果阳性符合率100%;
表11
由表11的实验结果可知,重复检查10次,检测结果阳性符合率100%;
表12
由表12的实验结果可知,重复检查10次,检测结果阳性符合率100%;
表13
由表13的实验结果可知,重复检查10次,检测结果阳性符合率100%;
表14
由表14的实验结果可知,重复检查10次,检测结果阳性符合率100%;
表15
由表15的实验结果可知,重复检查10次,检测结果阳性符合率100%。
Claims (10)
1.一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:10×dPCR Buffer、dPCR酶、EGFR基因检测体系、阳性对照品、阴性对照品、数字PCR芯片、数字PCR用油相A和数字PCR用油相B;
所述EGFR基因检测体系包括检测Ex19Del的每个缺失突变型的检测引物、缺失突变检测探针和新型荧光猝灭探针、检测L858R位点和T790M位点的检测引物和Taqman荧光猝灭探针。
2.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述EGFR基因检测体系包括200-800nM检测引物、50-400nM检测探针、50-400nM新型荧光猝灭探针。
3.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,L858R突变检测的引物如下序列所示:
上游引物SEQ ID NO:1:AGCATGTCAAGATCACAGATTT;
上游引物SEQ ID NO:2:cgcagcatgtcaagatcacagat;
上游引物SEQ ID NO:3:gaaaacaccgcagcatgtcaag;
下游引物SEQ ID NO:4:CCTCCTTCTGCATGGTATTC;
下游引物SEQ ID NO:5:TTTGCCTCCTTCTGCATGGT;
下游引物SEQ ID NO:6:ACTTTGCCTCCTTCTGCATG;
探针如下序列所示:
突变探针SEQ ID NO:7:5’荧光标记-TGGCCCGCCCAAA-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:8:5’荧光标记-TGGCCCGCCCAA-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:9:5’荧光标记-TGGGCGGGCCAAA-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:10:5’荧光标记-TGGGCGGGCCA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:11:5’荧光标记-TGGGTGCGGAAGAGAAAG-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:12:5’荧光标记-TGCTGGGTGCGGAAGAG-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:13:5’荧光标记-GTGCGGAAGAGAAAGAATACC-3’猝灭基团。
4.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,Ex19del突变的具体基因型为E746-A750del(1),和/或E746-A750del(2),和/或l 747-p753>S,和/或E746_T751>I,和/或E746_S752>V,和/或L747_T751>Q,和/或L747_E749del,和/或L747_S752del,和/或L747_A750>P,和/或L747_P753>Q,和/或L747_T751 del,和/或L747_T751>P。
5.根据权利要求4所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,检测Ex19del突变的引物序列如下所示:
上游引物SEQ ID NO:14:AGTTAAAATTCCCGTCGCT;
上游引物SEQ ID NO:15:TTAAAATTCCCGTCGCTAT;
上游引物SEQ ID NO:16:ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT;
下游引物SEQ ID NO:17:GCCTGAGGTTCAGAGCCAT;
下游引物SEQ ID NO:18:CAAAGCAGAAACTCACATCG;
下游引物SEQ ID NO:19:GAGAAAAGGTGGGCCTGAG;
检测探针序列如下所示:
突变探针del 1SEQ ID NO:20:5’荧光标记-TCGGAGATGTTTTGATAGCGACG-3’猝灭基团;
突变探针del 1SEQ ID NO:21:5’荧光标记-ttcggagatgttttgatagcgac-3’猝灭基团;
突变探针del 1SEQ ID NO:22:5’荧光标记-ctttcggagatgttttgatagcg-3’猝灭基团;
突变探针del 2SEQ ID NO:23:5’荧光标记-CGGAGATGTCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团;
突变探针del 2SEQ ID NO:24:5’荧光标记-ttcggagatgtcttgatagcgac-3’猝灭基团;
突变探针del 2SEQ ID NO:25:5’荧光标记-gctttcggagatgtcttgatagcg-3’猝灭基团;
突变探针del 3SEQ ID NO:26:5’荧光标记-TGGCTTTCGGAACCTTGATAGC-3’猝灭基团;
突变探针del 3SEQ ID NO:27:5’荧光标记-gctttcggaAccttgatagcgac-3’猝灭基团;
突变探针del 3SEQ ID NO:28:5’荧光标记-ctttcggaAccttgatagcgacgg-3’猝灭基团;
突变探针del4 SEQ ID NO:29:5’荧光标记-TGGCTTTCGATTCCTTGATAGCG-3’猝灭基团;
突变探针del4 SEQ ID NO:30:5’荧光标记-TTGGCTTTCGATTCCTTGATAGC-3’猝灭基团;
突变探针del4 SEQ ID NO:31:5’荧光标记-ggctttcgattccttgatagcgac-3’猝灭基团;
突变探针del5 SEQ ID NO:32:5’荧光标记-TGGCTTTCGGAGATTCCTTGATAG-3’猝灭基团;
突变探针del5 SEQ ID NO:33:5’荧光标记-ctttcggagattccttgatagcga-3’猝灭基团;
突变探针del5 SEQ ID NO:34:5’荧光标记-CGGAGATTCCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:35:5’荧光标记-AGCCAACAAGGAA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:36:5’荧光标记-CGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:37:5’荧光标记-AGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团;
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:38:GCTATCAA;
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:39:ACATCTCCG;
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:40:CGAAAGCCA。
6.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,T790M突变检测的引物序列如下所示:
上游引物SEQ ID NO:41:TCTGCCTCACCTCCAC;
上游引物SEQ ID NO:42:ATCTGCCTCACCTCCAC;
上游引物SEQ ID NO:43:ATCTGCCTCACCTCCA;
下游引物SEQ ID NO:44:TTGTGTTCCCGGACATAG;
下游引物SEQ ID NO:45:TTTGTGTTCCCGGACATAG;
下游引物SEQ ID NO:46:TTTGTGTTCCCGGACATA;
检测探针序列如下所示:
突变探针SEQ ID NO:47:5’荧光标记-CAGCTGCATGATGA-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:48:5’荧光标记-AGCTGCATGATGAT-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:49:5’荧光标记-AGCTGCATGATG-3’猝灭基团;
突变探针SEQ ID NO:50:5’荧光标记-AGCTGCATGATGA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:51:5’荧光标记-AAGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:52:5’荧光标记-GCTGCGTGATGA-3’猝灭基团;
通用探针SEQ ID NO:53:5’荧光标记-AGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团。
7.根据权利要求3、5、6任一项所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,在序列的5’端,和/或3’端标记BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化的任一种或两种;
荧光标记为FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、CY5.5中的任一种;3’端为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化中的任一种。
8.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括Ex19Del突变探针相同的荧光探针,L858R和T790M的野生探针和/或通用探针使用另外的不同的4种荧光通道。
9.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述PCR Buffer包括10-100mM Tris-HCl、1-5mM MgCl 2、0-100mM KCl、0-50mM硫酸铵、0.2-0.4mM dNTP、0.01%-0.5%吐温-20、0.01%-0.5%聚乙二醇、0.01%-0.5%Triton X-100、0.01%-0.5%CA-630;
所述dPCR酶包括1-5U Taq DNA聚合酶、0.01-1U UNG酶、20-80%甘油。
10.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述数字PCR用油相A包括含氢量0.1%-0.8%的含氢硅油、0.01%-0.5%Triton X-100;
所述数字PCR用油相B包括端乙烯基硅油、0.1%的铂催化剂、0.15%的EM90。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211548410.0A CN115820862A (zh) | 2022-12-05 | 2022-12-05 | 一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211548410.0A CN115820862A (zh) | 2022-12-05 | 2022-12-05 | 一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115820862A true CN115820862A (zh) | 2023-03-21 |
Family
ID=85544001
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211548410.0A Pending CN115820862A (zh) | 2022-12-05 | 2022-12-05 | 一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115820862A (zh) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105624309A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-06-01 | 深圳华大基因研究院 | 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒 |
CN106319042A (zh) * | 2016-08-18 | 2017-01-11 | 上海睿昂生物技术有限公司 | 检测人egfr基因突变的微滴pcr试剂盒 |
CN107723213A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-02-23 | 北京爱普拜生物技术有限公司 | 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法 |
CN108642154A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-10-12 | 领航基因科技(杭州)有限公司 | 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用 |
US20190352703A1 (en) * | 2016-05-25 | 2019-11-21 | Gencurix Inc. | Composition for detecting epidermal cell growth factor receptor gene mutation, and kit comprising same |
CN110511984A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-11-29 | 北京大学 | Egfr基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用 |
CN110964833A (zh) * | 2020-01-06 | 2020-04-07 | 中南大学湘雅医院 | 一种一管检测血浆游离dna中kras和braf基因突变的试剂盒 |
CN114250273A (zh) * | 2020-09-23 | 2022-03-29 | 迈克生物股份有限公司 | 用于核酸检测的组合物 |
-
2022
- 2022-12-05 CN CN202211548410.0A patent/CN115820862A/zh active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105624309A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-06-01 | 深圳华大基因研究院 | 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒 |
US20190352703A1 (en) * | 2016-05-25 | 2019-11-21 | Gencurix Inc. | Composition for detecting epidermal cell growth factor receptor gene mutation, and kit comprising same |
CN106319042A (zh) * | 2016-08-18 | 2017-01-11 | 上海睿昂生物技术有限公司 | 检测人egfr基因突变的微滴pcr试剂盒 |
CN107723213A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-02-23 | 北京爱普拜生物技术有限公司 | 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法 |
CN108642154A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-10-12 | 领航基因科技(杭州)有限公司 | 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用 |
CN110511984A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-11-29 | 北京大学 | Egfr基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用 |
CN110964833A (zh) * | 2020-01-06 | 2020-04-07 | 中南大学湘雅医院 | 一种一管检测血浆游离dna中kras和braf基因突变的试剂盒 |
CN114250273A (zh) * | 2020-09-23 | 2022-03-29 | 迈克生物股份有限公司 | 用于核酸检测的组合物 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CHING-HSIUNG LIN等: "Rapid detection of epidermal growth factor receptor mutations with multiplex PCR and primer extension in lung cancer", J BIOMED SCI, vol. 17, no. 1, 12 May 2010 (2010-05-12), pages 37, XP021071222, DOI: 10.1186/1423-0127-17-37 * |
TAI-LONG CHEN等: "A primer and probe set for detecting multiple types of EGFR exon 19 deletions", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 513, 15 November 2016 (2016-11-15), pages 61 - 67 * |
孟谊等: "竞争性等位基因特异性荧光探针聚合酶链法检测肺腺癌组织EGFR基因突变", 现代肿瘤医学, vol. 24, no. 10, 30 April 2016 (2016-04-30), pages 1518 - 1522 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107419018B (zh) | 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒 | |
EP1866438B1 (en) | Polynucleotide primers | |
CN111235272B (zh) | 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用 | |
CN110541033B (zh) | Egfr基因突变检测用组合物及检测方法 | |
CN108456721B (zh) | 同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用 | |
CN111534588B (zh) | 基于荧光定量pcr检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法 | |
CN111118138A (zh) | 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法 | |
CN106498028B (zh) | Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒 | |
CN110452983B (zh) | 一种检测kras基因12密码子6种热点突变的引物、探针、检测体系和试剂盒及方法 | |
CN106498029B (zh) | 提高egfr的t790m突变的诊断效率的方法 | |
CN110863053A (zh) | 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法 | |
CN107513577A (zh) | 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒 | |
CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
US20180187267A1 (en) | Method for conducting early detection of colon cancer and/or of colon cancer precursor cells and for monitoring colon cancer recurrence | |
CN109136367B (zh) | 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法 | |
CN111647650B (zh) | 检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒 | |
CN115820862A (zh) | 一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒 | |
CN116949143A (zh) | 一种用于检测mthfr和mtrr基因的序列组合物、试剂盒及应用 | |
CN109355362B (zh) | 一种高灵敏的SNPs检测体系及应用 | |
CN110438224B (zh) | 一种用于ugt1a1基因多态性检测的引物、试剂盒及检测方法 | |
CN112779322A (zh) | 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用 | |
CN113930501A (zh) | 人egfr基因突变的数字pcr检测方法及应用 | |
CN111607593A (zh) | 一种用于检测egfr基因突变的核苷酸序列组及其应用 | |
CN115261463B (zh) | 检测人idh基因和tert基因启动子突变的试剂盒、引物探针组合物、引物组合物 | |
CN110951849B (zh) | 一种用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |