CN115820860A - 基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法及其标志物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法及其标志物和应用。人类基因组增强子区域的异常DNA甲基化会导致非小细胞肺癌的异常基因表达调控。本发明所述的非小细胞肺癌标志物筛选方法基于这一原理，进一步结合配对末端标签测序分析染色质相互作用技术(ChIA‑PET)，筛选出造成非小细胞肺癌异常基因表达调控的基因组增强子区域DNA甲基化标志物。这一筛选方法具有精准、快速、高通量的优点。本发明所述的DNA甲基化标志物为cg00787780、cg16434331、cg21862081和cg24327132。标志物对非小细胞肺癌的诊断效能很好，表现为准确度高、灵敏度高、特异性强，能够更好地帮助提高非小细胞肺癌的检出率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法及其标志物和应用。
背景技术
肺癌是世界范围内最常见的癌症之一，也是导致癌症死亡的主要原因。非小细胞肺癌(NSCLC)作为主要的组织学类型，约占新诊断肺癌的85％。由于大多数患者一经检测就被诊断为晚期转移，因此肺癌患者的预后通常较差。被诊断患有转移性肺癌的患者的5年生存率低于10％。相比之下，依靠手术，早期诊断的肺癌患者预后要好得多，5年生存率高达80％。低剂量螺旋计算机断层扫描(CT)筛查肺癌已被证明可以提高肺癌的早期诊断率，从而有助于降低死亡率。
虽然基于低剂量CT的筛查非常敏感，但低特异性会使其报告许多假阳性，这可能会导致进一步的随访或侵入性操作。因此，需要更准确的新型生物标志物用于临床肺癌诊断。
异常的DNA甲基化，是各种癌症中的常见事件，表明DNA甲基化可以作为癌症诊断的生物标志物。与蛋白质和基因突变等其他生物标志物相比，DNA甲基化的改变非常稳定，并且在癌症的早期阶段就会出现。
主流的肺癌DNA甲基化标志物主要集中在抑癌基因或癌基因的启动子或基因内部的异常DNA甲基化区域。最新研究表明，基因远端的调控区域，特别是增强子区域的异常DNA甲基化也会引起癌症的发生和发展。
目前，并没有已报道的基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法及其标志物和应用。
为实现上述目的，本发明所设计一种基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法，包括以下步骤：
S1、利用WGBS测序技术分别获得非小细胞肺癌样本的全基因组DNA甲基化数据和正常肺组织样本的全基因组DNA甲基化数据；
S2、利用BatMeth2软件，对非小细胞肺癌样本的全基因组DNA甲基化数据和正常肺组织样本的全基因组DNA甲基化数据进行DNA甲基化差异分析，得到差异DNA甲基化区域(DMR)的基因组位置信息；
S3、通过EnhancerAtlas 2.0数据库分别获取肺组织基因组增强子区域的基因组位置信息或者非小细胞肺癌组织相关细胞系(如A549)基因组增强子区域的基因组位置信息，结合步骤S2中获得的差异DNA甲基化区域(DMR)的基因组位置信息，保留与增强子区域的基因组位置存在交集的DMR，即得到增强子区域差异DNA甲基化区域(eDMR)；
S4、利用配对末端标签的染色质远程交互测序(ChIA-PET)技术获取肺组织的RNAPOL2 ChIA-PET数据或非小细胞肺癌相关细胞系(如A549)的RNAPOL2 ChIA-PET数据，利用ChIA-PET Tool V3软件，得到肺组织RNAPOL2全基因组三维染色质交互信息或非小细胞肺癌相关细胞系(如A549)的RNAPOL2全基因组三维染色质交互信息，结合步骤S3得到的增强子区域差异DNA甲基化区域(eDMR)，获得一端位于增强子区域差异DNA甲基化区域(eDMR)，另一端位于基因启动子的全基因组增强子区域差异DNA甲基化区域(eDMR)-基因启动子染色质交互信息；
S5、利用步骤S4中获得的全基因组增强子区域差异DNA甲基化区域(eDMR)-基因启动子交互对信息，筛选得到与基因启动子有染色质交互的eDMR；
S6、通过Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChiP(450K甲基化芯片检测技术)分别获取非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据；
S7、基于S6收集的非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据，利用统计学方法得到非小细胞肺癌样本的差异DNA甲基化位点(DMC1)和正常肺组织样本间的差异DNA甲基化位点(DMC2)；基于步骤S5筛选得到的eDMR，筛选出基因组位置位于eDMR内的差异DNA甲基化位点作为候选标志物；
S8、利用Lasso方法，以S7中得到的候选标志物差异DNA甲基化位点的甲基化程度作为自变量，以S6中收集的非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据中样本类型作为因变量，在S6中收集的非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据上建立线性回归模型，保留模型中系数不等于0的差异DNA甲基化位点作为最终的标志物；
S9、利用450K甲基化芯片检测技术分别获取非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据集(非S6中的数据集)，或者从已经公开发表的数据库(例如中国国家基因组科学数据中心NGDC)中分别下载非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据集(非S6中的数据集)；利用获取的数据集构建逻辑斯蒂回归模型，
利用逻辑斯蒂回归模型评估步骤S8得到标志物对于非小细胞肺癌诊断的效能。
进一步地，所述步骤S2中，差异DNA甲基化区域(DMR)的基因组位置信息的筛选标准如下：
差异DNA甲基化区域(DMR)的差异甲基化程度：大于等于0.25且小于等于1或者大于等于-1且小于等于-0.25，多重检验FDR小于0.05且大于0。
再进一步地，所述步骤S8中，样本类型设定为：
正常肺组织样本编码为0，非小细胞肺癌样本编码为1。
再进一步地，所述步骤S8中，最终的标志物为四种，分别为cg00787780、cg16434331、cg21862081和cg24327132。
再进一步地，所述步骤S9中，逻辑斯蒂回归模型的方程为：
Y＝26.671–10.644X1–4.376X2–15.556X3–11.790X4；
其中，X1为cg00787780，X2为cg16434331，X3为cg21862081，X4为cg24327132；
Y为指样本患非小细胞肺癌的概率，0≤Y≤1。
再进一步地，所述步骤S9中，逻辑斯蒂回归模型分类性能标准如下：
当0.5＜分类准确率≤1且0.5＜AUC≤1，则说明标志物有效(分类准确率和AUC均越接近1，则说明标志物分类性能越好)；
当分类准确率≤0.5或AUC≤0.5时，则说明标志物无效。
本发明还提供了一种上述的方法筛选得到的DNA甲基化标志物，所述标志物为cg00787780，cg16434331，cg21862081，cg24327132。
本发明还提供了一种检测样本中上述的DNA甲基化标志物的试剂盒在制备诊断和预测非小细胞肺癌产品中的应用。
本发明的重要词语解释：
1.WGBS指全基因组重亚硫酸盐测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing)，可以在全基因组范围内精确地检测所有单个胞嘧啶碱基(C碱基)的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。
2.Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChiP指450K甲基化芯片技术，它可以检测人类全基因组中大约45万个DNA甲基化位点，是一种比较常用的经济实惠的DNA甲基化检测技术。
3.DNA甲基化是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化状态，作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制。基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉默，因此它与肿瘤的***密切。异常甲基化包括抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。
4.ChIA-PET指配对末端标签测序分析染色质相互作用(Chromatin InteractionAnalysis with Paired-End-Tag sequencing)的技术，是一种整合了免疫共沉淀(ChIP)、染色质邻近连接(chromatin proximity ligation)、双末端标签(Paired-End Tags)以及高通量测序技术、研究基因组范围内染色质远程交互的技术。
5.启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于基因转录起始点的上游。启动子本身不被转录。
6.增强子是DNA上一小段可与蛋白质结合的区域，与蛋白质结合之后，基因的转录作用将会加强。增强子可能位于基因上游，也可能位于下游。且不一定在基因组上线性接近所要作用的基因，这是因为染色质的缠绕结构，使序列上相隔很远的位置也有机会在空间上相互接触。
7.RNAPOL2指RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II，亦被称为RNAPⅡ或PolⅡ)是一个多种蛋白质复合体。它是在真核生物细胞核中发现的三种RNA聚合酶之一。它催化DNA的转录，以合成mRNA、大多数snRNA和微小RNA的前体。RNA聚合酶Ⅱ是一个550kDa的12个亚基复合物，是研究最多的RNA聚合酶类型。它需要多种转录因子才能与上游基因启动子结合并开始转录。
8.特异性是指没有特定临床疾病的患者样本被检测为阴性的比率。
9.灵敏度是指患有明确临床疾病的患者样本被检测为阳性的比率。
10.AUC(Area Under Curve)被定义为ROC下与坐标轴围成的面积，这个面积的数值在0到1之间。AUC越接近1，检测方法真实性越高。
11.ROC(receiver operating characteristic curve)指接收者操作特征曲线，是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标。
12.FDR指Bonferroni校正：如果在同一数据集上同时检验N个独立的假设，那么用于每一假设的统计显著水平，应为仅检验一个假设时的统计显著水平的1/N。
本发明的有益效果：
1.本发明的非小细胞肺癌标志物筛选方法，是基于与基因启动子区域存在染色质三维交互的增强子区域的异常DNA甲基化，来进行DNA甲基化标志物筛选的一种方法。这一方法具有精准、快速、高通量的优点。通过该方法，可拓展目前该领域用于非小细胞肺癌诊断DNA甲基化标志物的筛选范围。并且增强子区域与启动子区域或基因内部区域异常DNA甲基化导致癌症的机理不同，该方法也有望与常规的DNA甲基化标志物筛选方法互为补充，更好地提高非小细胞肺癌的检出率。
2.DNA甲基化标志物具有极高的灵敏度和特异度，与蛋白质和基因突变等其他生物标志物相比，DNA甲基化的改变非常稳定，并且在癌症的早期阶段就会出现，有助于非小细胞肺癌的早期筛查。另外，基于增强子异常DNA甲基化的非小细胞肺癌标志物筛选方法可以得到更多可信度高的癌症诊断标志物，有助于推动DNA甲基化标志物的临床应用，最终实现准确、高效、经济、无创的癌症早期筛查，提高人们的生活质量。
附图说明
图1为基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌DNA甲基化标志物筛选方法的流程图。
图2为17个样本中eDMR的甲基化程度热图。每行代表一个eDMR，每列代表一个样本。NC代表正常肺组织样本，TC代表非小细胞肺癌样本，热图颜色代表甲基化程度的zscore值。
图3为标志物在正常肺组织以及非小细胞肺癌样本各个阶段的甲基化水平分布图。显著性检验方法为Wilcoxon sum rank检验。
图4为正常肺组织以及非小细胞肺癌样本训练集的ROC曲线图。AUC代表ROC曲线下面积。分类阈值为0.743时，特异性为0.972，敏感性为0.988。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法，包括以下步骤：
S1、利用WGBS测序技术分别获得8个非小细胞肺癌样本的全基因组DNA甲基化数据和9个正常肺组织样本的全基因组DNA甲基化数据，具体信息见下表1。
表1.WGBS甲基化信息统计
S2、利用BatMeth2软件，对非小细胞肺癌样本的全基因组DNA甲基化数据和正常肺组织样本的全基因组DNA甲基化数据进行DNA甲基化差异分析，得到差异DNA甲基化区域(DMR)的基因组位置信息；其中，差异DNA甲基化区域(DMR)的基因组位置信息的筛选标准如下：
差异DNA甲基化区域(DMR)的差异甲基化程度：大于等于0.25且小于等于1或者大于等于-1且小于等于-0.25，多重检验FDR小于0.05且大于0。
S3、通过EnhancerAtlas 2.0数据库获取非小细胞肺癌组织相关细胞系A549的基因组增强子区域的基因组位置信息，结合步骤S2中获得的差异DNA甲基化区域(DMR)的基因组位置信息，保留与增强子区域的基因组位置存在交集的DMR，即得到增强子区域差异DNA甲基化区域(eDMR)。这里一共得到2595个增强子区域差异DNA甲基化区域(eDMR)，它们在各个样本中的甲基化信息见图2，图中颜色代表eDMR甲基化程度的标准化值。
S4、利用配对末端标签染色质远程交互测序(ChIA-PET)技术获取非小细胞肺癌相关细胞系A549的RNAPOL2 ChIA-PET数据，利用ChIA-PET Tool V3软件，得到A549的全基因组RNAPOL2三维染色质交互信息。
S5、基于前面的2595个eDMR区域，获得一端位于基因启动子，一端位于eDMR区域的eDMR区域-基因启动子交互对信息，从而得到与基因启动子有三维染色质交互的eDMR。；
S6、从TCGA数据库获取正常肺组织和非小细胞肺癌样本的450K甲基化芯片数据集(非小细胞肺癌样本数：807，正常样本数：71)。
S7、利用统计学方法得到450K甲基化芯片数据集中的差异DNA甲基化位点(DMC)信息，结合S5中得到的与基因启动子有三维染色质交互的eDMR，保留基因组位置位于这些eDMR区域中的DMC作为候选的DNA甲基化标志物，我们获取到14个候选的标志物，具体结果见表2，表2中的14个CpG位点即为候选的DNA甲基化标志物，它们均位于基因组增强子区域。
表2.增强子DNA甲基化候选标志物
*基因组的位置以人类参考基因组版本hg38为参考。
S8、利用表2中的14个CpG位点对878个非小细胞肺癌(n＝807)和正常肺组织样本(n＝71)建立Lasso回归模型进行特征筛选，删除模型中系数等于0的CpG位点，最后得到4个CpG位点，即为最终的非小细胞肺癌增强子DNA甲基化标志物位点，如表3所示。
表3.所选择的4个非小细胞肺癌增强子DNA甲基化标志物位点
为了验证DNA甲基化标志物的有效性，我们查看了这些标志物在正常肺组织样本和各个病理阶段的非小细胞肺癌样本中的DNA甲基化程度，这4个CpG位点都展示出了异常的DNA甲基化，并且在Stage I阶段也表现出了显著的差异性。具体结果见图3，图中利用Wilcoxon sum rank进行统计学检验，样本数n＝878。
S9、对非小细胞肺癌增强子DNA甲基化标志物进行效能评估。利用这4个CpG位点的甲基化信息，对TCGA中878个样本建立逻辑斯蒂回归模型，模型的方程为：
Y＝26.671–10.644X1–4.376X2–15.556X3–11.790X4其中，X1为cg00787780，X2为cg16434331，X3为cg21862081，X4为cg24327132；
Y为指样本患非小细胞肺癌的概率，0≤Y≤1。
以P＝0.743为Y的筛选阈值，Y大于等于P则判定样本患有非小细胞肺癌，否则判定样本为正常样本。训练集(TCGA中878个样本)中的敏感度为0.972，特异度为0.988。标志物在训练集中的ROC曲线见图4，其中AUC值为0.996，由此可知，这4个增强子区域的DNA甲基化标志物具有很好的分类性能。另一方面，我们在其它两个测试集数据中对这4个甲基化标志物建立的分类模型进行了性能评估，同时也比较了其它3个已经报道过的启动子区域的DNA甲基化标志物的分类性能。结果表明，增强子区域的DNA甲基化标志物具有更稳定、更好的分类性能。具体结果见表4和表5。
表4.在两个独立数据集上验证增强子区域DNA甲基化标志物性能
注：Data Set数据集；Tumor癌症样本数；Normal正常肺组织样本数；TP真阳性；TN真阴性；FP假阳性；FN假阴性
表5.与先前报道的肺癌DNA甲基化标志物分类性能的比较
注：AUC为ROC曲线下面积；Accuracy为分类准确度。先前报道的肺癌DNA甲基化标志物对应文献为：
1.Li M,Zhang C,Zhou L,Li S,Cao YJ,Wang L,Xiang R,Shi Y&Piao Y(2020)Identification and validation of novel DNA methylation markers for earlydiagnosis of lung adenocarcinoma.Mol Oncol 14,2744-2758.
2.Diaz-Lagares A,Mendez-Gonzalez J,Hervas D,Saigi M,Pajares MJ,GarciaD,Crujerias AB,Pio R,Montuenga LM&Zulueta J(2016)A Novel Epigenetic Signaturefor Early Diagnosis in Lung CancerEpigenetic Signature for Lung CancerDiagnosis.Clin Cancer Res 22,3361-3371.
3.Dong S,Li W,Wang L,Hu J,Song Y,Zhang B,Ren X,Ji S,Li J&Xu P(2019)Histone-related genes are hypermethylated in lung cancer and hypermethylatedHIST1H4F could serve as a pan-cancer biomarker.Cancer Res 79,6101-6112.
实施例2检测样本中上述的DNA甲基化标志物的试剂盒
该试剂盒检测被试活检样本或血液中这四个标志物的甲基化程度，代入上述模型方程，按照上述阈值判断被试是否患有非小细胞肺癌。另一方面，也可以利用这几个标志物，在更大规模的非小细胞肺癌临床队列中构建新的、更精准的模型方程，应用于非小细胞肺癌的早期诊断和筛查。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、利用WGBS测序技术分别获得非小细胞肺癌样本的全基因组DNA甲基化数据和正常肺组织样本的全基因组DNA甲基化数据；
S2、利用BatMeth2软件，对非小细胞肺癌样本的全基因组DNA甲基化数据和正常肺组织样本的全基因组DNA甲基化数据进行DNA甲基化差异分析，得到差异DNA甲基化区域的基因组位置信息；
S3、通过EnhancerAtlas 2.0数据库分别获取肺组织基因组增强子区域的基因组位置信息或者非小细胞肺癌组织相关细胞系基因组增强子区域的基因组位置信息，结合步骤S2中获得的差异DNA甲基化区域DMR的基因组位置信息，保留与增强子区域的基因组位置存在交集的DMR，即得到增强子区域差异DNA甲基化区域eDMR；
S4、利用配对末端标签测序技术获取肺组织的RNAPOL2ChIA-PET数据或非小细胞肺癌相关细胞系的RNAPOL2 ChIA-PET数据，利用ChIA-PET Tool V3软件，得到肺组织RNAPOL2全基因组三维染色质交互信息或非小细胞肺癌相关细胞系的RNAPOL2全基因组三维染色质交互信息，结合步骤S3得到的增强子区域差异DNA甲基化区域，获得一端位于增强子区域差异DNA甲基化区域，另一端位于基因启动子的全基因组增强子区域差异DNA甲基化区域-基因启动子染色质交互信息；
S5、利用步骤S4中获得的全基因组增强子区域差异DNA甲基化区域-基因启动子交互对信息，筛选得到与基因启动子有染色质交互的eDMR；
S6、通过Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChiP分别获取非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据；
S7、基于S6收集的非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据，利用统计学方法得到非小细胞肺癌样本的差异DNA甲基化位点和正常肺组织样本间的差异DNA甲基化位点；基于步骤S5筛选得到的eDMR，筛选出基因组位置位于eDMR内的差异DNA甲基化位点作为候选标志物；
S8、利用Lasso方法，以S7中得到的候选标志物差异DNA甲基化位点的甲基化程度作为自变量，以S6中收集的非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据中样本类型作为因变量，在S6中收集的非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据上建立线性回归模型，保留模型中系数不等于0的差异DNA甲基化位点作为最终的标志物；
S9、利用450K甲基化芯片检测技术分别获取非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据集，或者从已经公开发表的数据库中分别下载非小细胞肺癌样本的DNA甲基化数据和正常肺组织样本的DNA甲基化数据集；利用获取的数据集构建逻辑斯蒂回归模型，利用逻辑斯蒂回归模型评估步骤S8得到标志物对于非小细胞肺癌诊断的效能。
2.根据权利要求1所述基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法，其特征在于：所述步骤S2中，差异DNA甲基化区域(DMR)的基因组位置信息的筛选标准如下：
差异DNA甲基化区域(DMR)的差异甲基化程度：大于等于0.25且小于等于1或者大于等于-1且小于等于-0.25，多重检验FDR小于0.05且大于0。
3.根据权利要求1所述基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法，其特征在于：所述步骤S8中，样本类型设定为：
正常肺组织样本编码为0，非小细胞肺癌样本编码为1。
4.根据权利要求1所述基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法，其特征在于：所述步骤S8中，最终的标志物为四种，分别为cg00787780、cg16434331、cg21862081和cg24327132。
5.根据权利要求1所述基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法，其特征在于：所述步骤S9中，逻辑斯蒂回归模型的方程为：
Y＝26.671–10.644X1–4.376X2–15.556X3–11.790X4；
其中，X1为cg00787780，X2为cg16434331，X3为cg21862081，X4为cg24327132；Y为指样本患非小细胞肺癌的概率，0≤Y≤1。
6.根据权利要求1或4所述基于增强子甲基化差异的非小细胞肺癌标志物筛选方法，其特征在于：所述步骤S9中，效能标准如下：
当0.5＜分类准确率≤1且0.5＜AUC≤1，则说明标志物有效；
当分类准确率≤0.5或AUC≤0.5时，则说明标志物无效。
7.一种权利要求1所述的方法筛选得到的DNA甲基化标志物，其特征在于，所述标志物为cg00787780，cg16434331，cg21862081，cg24327132。
8.检测样本中权利要求7所述的DNA甲基化标志物的试剂盒在制备诊断和预测非小细胞肺癌产品中的应用。
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