CN115820728A - 一种基因编辑的方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,特别是涉及一种基因编辑的方法和用途,所述方法包括利用碱基编辑***对目的多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基,以在目的基因编码区引入终止密码子或点突变起始密码子;所述碱基编辑***包括:(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸,所述融合蛋白中包括Cas9片段和脱氨酶片段;(b)引导核苷酸或其编码多核苷酸,其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述靶C碱基和/或靶A碱基。所述方法通过安全高效的碱基编辑技术敲除目的基因。本发明所提供的方法可望开发成为治疗老年性黄斑变性等疾病的药物,具有广阔的临床应用前景和开发价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别是涉及一种基因编辑的方法和用途。
背景技术
基因测序技术使得我们读出了基因组序列,而基因编辑技术,特别是CRISRP/Cas9技术使得我们更加容易改造基因组序列。2020年诺贝尔化学奖授予埃马纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)、詹妮弗·杜德纳(Jennifer A.Doudna),以表彰她们开发了一种基因组编辑的方法。经过十余年的发展,基因编辑技术已经在基因功能研究、遗传疾病治疗、肿瘤治疗等多个领域展现出了巨大的价值。
老年性黄斑变性(Age-related macular degeneration,AMD)是导致老年群体不可逆转失明的主要因素。据预测,到2040年,AMD将影响接近3亿人口。AMD在临床上分为干性(dry)和湿性(wet)两种类型。湿性AMD临床进展表现为脉络膜血管新生(choroidalneovascularization,CNV),而CNV的发生是导致患者快速失明的主要原因。研究表明,血管内皮细胞生长因子(VPF)在CNV过程中起到重要作用,Nozaki等通过对AMD病人的视网膜和脉络膜组织检查,发现活化补体能上调局部组织中VPF的表达。靶向VPF已经成为治疗湿性AMD的方法。目前靶向VPF的药物有贝伐单抗,兰尼单抗,阿柏西普,布洛赛珠单抗等,这些药物均是靶向VPF蛋白。但抗体药物存在一定的缺陷,比如要频繁注射,这样一是增加并发症的风险,二是对患者并不友好,也增加了患者的经济负担。利用基因治疗的方式直接破坏VPF的表达将是一种潜在的高效治疗方式。
CRISPR/Cas9基因编辑技术基于Cas9蛋白对DNA双链进行切割,断裂的DNA双链在修复时可引入***或缺失突变,从而对靶基因进行敲除。然而研究表明,这种以DNA双链断裂(DSB)为基础的遗传操作存在重大缺陷,可能导致百万碱基级别的染色体缺失,对人类细胞基因组造成全局性破坏。另外,双链断裂可引起p53诱导的细胞凋亡,阳性编辑的细胞更倾向于富集p53突变的细胞,这种编辑的细胞注射到体内无疑增加了癌变风险。碱基编辑技术是在CRISPR/Cas技术上融入了脱氨酶,通过对碱基脱氨在原位实现碱基编辑的目的。此种编辑方式不需要引入DNA双链断裂,理论上更加安全。目前使用最广的是胞嘧啶碱基编辑(Cytosine base editing,CBE)与腺嘌呤碱基编辑(Adenine base editing,ABE),分别可以实现C到T的转换或者A到G的转换。另外一些类型的碱基颠换编辑器也可以实现C到G(C:Gto G:C Base Editors,CGBE)或者A到C的颠换,这无疑增加了碱基编辑的类型。碱基编辑技术的提出迅速成为基因编辑领域炙手可热的工具。胞嘧啶碱基编辑可以作用于表达基因的基因编码区(Coding sequence,CDS),通过靶向CAA、CAG、CGA或TGG,产生终止密码子达到敲除基因的目的。CGBE可以通过靶向TAC、TCA产生终止密码子。除此之外,胞嘧啶碱基编辑、腺嘌呤碱基编辑和CGBE编辑器均可以通过靶向起始密码子ATG或者CTG达到敲除基因的目的。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种编辑VPF基因的方法和用途,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种编辑VPF基因的方法,所述方法包括利用碱基编辑***对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基,以在VPF基因编码区引入终止密码子或点突变起始密码子;所述碱基编辑***包括:
(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸,所述融合蛋白中包括Cas9片段和脱氨酶片段;
(b)引导核苷酸或其编码多核苷酸,其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述靶C碱基和/或靶A碱基。
本发明还提供所述编辑VPF基因的方法获得的细胞。
所述细胞为体细胞或生殖细胞。所述细胞例如为RPE细胞或Muller细胞。
本发明还提供所述细胞在制备预防或治疗VPF过表达相关疾病产品中的用途。
如上所述,本发明的编辑VPF基因的方法和用途,具有以下有益效果:利用碱基编辑技术,通过点突变的方式沉默掉VPF的表达,达到治疗疾病的目的,克服了CRISPR/Cas技术引起的DNA双链所造成的有害影响。本发明所优选使用的将脱氨酶嵌合到Cas9蛋白中间的碱基编辑***在DNA与RNA水平的脱靶与野生型细胞相比无明显差异,表明了该方法对于基因治疗产品的安全性。通过该方法可以为建立碱基编辑技术治疗遗传病、基因异常疾病提供新的选择,还可以为新的有效基因靶点的研究提供支持,同时为相关疾病治疗的研究奠定坚实的技术基础。
附图说明
图1显示为不同碱基编辑***敲除基因模式图,(A)诱导产生终止密码子;(B)破坏起始密码子。
图2显示为诱导终止密码子突变在RPE细胞系中的效率检测结果。
图3显示为诱导终止密码子突变在Muller细胞系中的效率检测结果。
图4显示为起始密码子突变(14与15位点)在RPE细胞系中的效率检测结果。
图5显示为利用腺嘌呤碱基编辑器突变起始密码子(16位点)在RPE细胞系中的效率检测结果。
图6显示为起始密码子突变(14与15位点)在Muller细胞系中的效率检测结果。
图7显示为利用腺嘌呤碱基编辑器突变起始密码子(16位点)在Muller细胞系中的效率检测结果。
图8显示为不同类型突变细胞系的VPF表达水平。
图9显示为不同突变细胞系检测到的snp数量。
具体实施方式
本发明提供一种编辑VPF基因的方法,所述方法包括利用碱基编辑***对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基,以在VPF基因编码区引入终止密码子或点突变起始密码子;所述碱基编辑***包括:
(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸,所述融合蛋白中包括Cas9片段和脱氨酶片段;
(b)引导核苷酸或其编码多核苷酸,其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述靶C碱基和/或靶A碱基。
所述VPF基因的Gene ID为7422。
所述VPF多核苷酸包含编码链和互补链;所述编码VPF蛋白的多核苷酸包含编码区和非编码区。
所述VPF多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式选自cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA,可以是单链的或是双链的;DNA可以是编码链或非编码链。
对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基会导致VPF多核苷酸中C转化至T,或A转化至G,或C转化至G。在一些实施方式中,C至T转化,和/或A至G转化,和/或C至G转化发生在所述VPF多核苷酸的编码序列中。在一些实施方式中,C至T转化,和/或A至G转化,和/或C至G转化导致VPF蛋白中的突变;VPF蛋白中的突变是功能丧失突变或非编码突变。所述功能丧失突变在所述VPF编码序列中引入终止密码子,导致截短的或非功能性的VPF蛋白产生。所述非编码突变是通过使所述VPF编码序列的起始密码子突变,其导致消除VPF表达。在一些实施方式中,将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变引入到所述VPF多核苷酸中。
在一些实施方式中,所述终止密码子是TAA,TAG或者TGA。例如,所述终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAA至TAA转化生成;所述终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAG至TAG转化生成;所述终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CGA至TGA转化生成;所述终止密码子经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从TGG至TGA转化生成;所述终止密码子经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从TAC至TAG转化生成;所述终止密码子经由所述互补链上的第二个C的脱氨基从TCA至TGA转化生成。
所述起始密码子为ATG或CTG。所述起始密码子突变经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从ATG至ATA转化生成;所述起始密码子突变经由所述互补链上的第二个A的脱氨基从ATG至ACG转化生成;所述起始密码子突变经由所述编码链上的第一个A的脱氨基从ATG至GTG转化生成。所述起始密码子突变经由所述编码链上的第三个G的脱氨基从ATG至ATC转化生成。
在本发明的某些实施方式中,可以直接将所述融合蛋白或其变体直接递送至待编辑对象如宿主细胞中;或以信使RNA(mRNA)分子的形式递送,其在递送进入宿主细胞之后被翻译成所述融合蛋白或其变体;或以表达载体的形式递送,所述表达载体包含编码一个或多个基因以表达融合蛋白或其变体的脱氧核糖核酸(DNA)序列。
在本发明的一些实施方式中,可以直接将所述引导核苷酸递送至待编辑对象如宿主细胞中。
在一些实施方式中,所述引导核苷酸可以以表达载体的形式递送,所述表达载体上包含编码一个或多个拷贝的引导核苷酸。
在本发明的某些实施方式中,所述融合蛋白选自胞嘧啶融合蛋白、腺嘌呤融合蛋白或胞嘧啶颠换融合蛋白中的一种或多种。相应的,所述碱基编辑***为胞嘧啶碱基编辑***、腺嘌呤碱基编辑***、CGBE碱基编辑***。所述脱氨酶片段可以为胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。
所述胞嘧啶脱氨酶选自以下中的一个或多个:APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、激活诱导的脱氨酶(AID)或pmCDA1。
所述腺嘌呤脱氨酶选自野生型tadA、突变型tadA,或者两者组成的复合物wtTadA-TadA*。在本发明的某些优选实施方式中,所述腺嘌呤脱氨酶为wtTadA-TadA*。
在本发明的某些实施方式中,所述Cas9片段和脱氨酶片段之间通过链接肽链接。
在本发明的某些实施方式中,所述胞嘧啶融合蛋白的结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[链接肽]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[UGI肽段]-[UGI肽段]-[核定位信号]-COOH;优选地,所述胞嘧啶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。
在本发明的某些实施方式中,所述腺嘌呤融合蛋白的结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas片段]-[链接肽]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[核定位信号]-COOH;优选地,所述腺嘌呤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示。
在本发明的某些实施方式中,所述胞嘧啶颠换融合蛋白自N端至C端依次包括第一Cas9片段、嵌合***片段、第二切口酶片段,所述嵌合***片段包含脱氨酶片段和尿嘧啶DNA结合蛋白片段。优选地,所述胞嘧啶颠换融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。
在本发明的某些实施方式中,所述融合蛋白的变体为所述融合蛋白的片段、衍生物或类似物,其可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白,或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。根据本发明的定义,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在一些实施方式中,所述融合蛋白的变体是指与所述融合蛋白的氨基酸序列具有75%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性,且具有所述融合蛋白相同或相似功能的蛋白。上述75%或75%以上同一性,可为75%、80%、85%、90%或95%以上的同一性;具体地可为75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。上述90%或90%以上同一性,可为91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性。所述相似功能是指保留原蛋白的75%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高的功能。
在本发明的某些实施方式中,所述引导核苷酸的靶向序列为SEQ ID No.21-SEQID No.62内可利用脱氨酶形成终止密码子或/和破坏起始密码子的序列。
所述胞嘧啶碱基编辑***中,所述引导核苷酸的靶向序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.10,SEQ ID NO.14,SEQ ID NO.15至少任一所示。优选地,所用靶向序列为SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.10,SEQ ID NO.14。
所述腺嘌呤碱基编辑***中,所述引导核苷酸的靶向序列如SEQ ID NO.14,SEQID NO.15,SEQ ID NO.16所示。优选地,所用靶向序列为SEQ ID NO.14,SEQ ID NO.16。
所述CGBE碱基编辑***中,所述引导核苷酸的靶向序列如SEQ ID NO.11-SEQ IDNO.15所示。优选地,所用靶向序列为SEQ ID NO.12,SEQ ID NO.14。
本发明所述方法中,所述引导核苷酸序列与融合蛋白的质量比为1:(2~20);可以是1:(2~4)、1:(2~6)、1:(2~8)、1:(2~10)、1:(2~12)、1:(2~14)、1:(2~16)、1:(2~18)、1:(2~20)、(4~6)、1:(4~8)、1:(4~10)、1:(4~12)、1:(4~14)、1:(4~16)、1:(4~18)、1:(4~20)、1:(8~10)、1:(8~12)、1:(8~14)、1:(8~16)、1:(8~18)、1:(8~20)、1:(10~12)、1:(10~14)、1:(10~16)、1:(10~18)、1:(10~20)、1:(12~14)、1:(14~16)、1:(16~18)、1:(18~20);优选地,为1:(2~8)。
本发明所述方法中,所述VPF多核苷酸与(a)、(b)分别接触,或与(a)和(b)形成的RNP复合物接触。
本发明所述方法适用的基因编辑的对象没有特别的限制,可以在体外或体内实施。
利用碱基编辑***对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基的步骤为:将包含编码融合蛋白或其变体的多核苷酸的表达载体、包含编码引导核苷酸的多核苷酸的表达载体递送至待编辑对象中;优选的,通过脂质体转染、电穿孔、病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化中的一种或多种方法将所述表达载体递送至待编辑对象中。
在一些实施方式中,所述方法在培养的细胞中实施,即所述待编辑对象为细胞,所述细胞可以为体细胞或生殖细胞,可以是动物细胞或人细胞;进一步优选地,所述细胞为RPE细胞或Muller细胞。
在一些实施方式中,可以使用基因递送载剂递送本文所述的多核苷酸至细胞或组织。本文所用“基因递送”、“基因转移”、“转导”等,其指代将外源性多核苷酸导入宿主细胞,如载体介导的基因转移(通过,例如,病毒感染/转染,或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物)以及协助“裸”多核苷酸递送的技术(如电穿孔,“基因枪”递送以及用于导入多核苷酸的各种其他技术)。导入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常需要导入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者纳入到宿主细胞的复制子,诸如染色体外复制子(例如,质粒)或核或线粒体染色体。许多“载体”已知能够介导基因向哺乳动物细胞的转移,如本领域已知和本文所述。
本发明所述方法在体内实施,可以作用于体细胞或生殖细胞,优选地,所述方法在哺乳动物中实施;进一步优选地,所述哺乳动物是啮齿动物;更进一步优选地,所述哺乳动物是人。进一步优选地,所述方法靶向哺乳动物的老年性黄斑变性疾病相关细胞。
本发明还提供所述编辑VPF基因的方法获得的细胞。
所述细胞为体细胞或生殖细胞。所述细胞例如为RPE细胞或Muller细胞。
本发明还提供所述细胞在制备预防或治疗VPF过表达相关疾病产品中的用途。
所述VPF过表达相关疾病例如为癌症或眼科疾病。所述癌症例如为肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、血管瘤。所述眼科疾病例如为黄斑变性。在一种实施方式中,所述黄斑变性为老年性黄斑变性。
本发明还提供一种预防或治疗VPF过表达相关疾病的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述方法中的碱基编辑***或如上所述的细胞。
所述VPF过表达相关疾病例如为癌症或眼科疾病。所述癌症例如为肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、血管瘤。所述眼科疾病例如为黄斑变性。在一种实施方式中,所述黄斑变性为老年性黄斑变性。
本发明中,所述的碱基编辑***或细胞还可以与其他药物联用。
本发明所提供的用途中,所述碱基编辑***可以是单一有效成分,也可以与其他活性组分进行组合,构成联合制剂。组合物中活性组分的含量通常为安全有效量,所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的,例如,所述活性成分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。实施例1:碱基编辑***突变VPF产生终止密码子
1.sgRNA设计与载体构建
利用碱基编辑敲除基因的sgRNA设计需要考虑多个因素:一是可形成终止密码子的核苷酸CAA、CAG、CGA、TGG、TCA、TAC必须位于同一个三联体密码;二是编辑碱基要位于编辑***的窗口内;三是核酸酶识别的问区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)不同。表1罗列出了可以诱导成终止密码子或/和突变起始密码子所在序列,后续的sgRNA设计均是参考这42条序列获得。此处仅展示靶向为PAM序列为NGG的核酸酶(图1所示)。针对胞嘧啶碱基编辑***,可以诱导终止密码子的靶位点共有10个,相应的序列号分别为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10。针对CGBE***,可以诱导终止密码子的靶位点共有3个,相应的序列,分别命名为SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.13。不同编辑***敲除VPF所设计sgRNA如表2所示。
表1可诱导成终止密码子或/和突变起始密码子所在序列
可诱导终止密码子以及起始密码子所在序列位置(5′-3′) | 最终目的 | 序列编号 |
Tcgcactgaaacttttcgtc<u>caa</u>cttctgggctgttctcgctt* | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.21 |
ttatgcggatcaaacctcac<u>caa</u>ggccagcacataggagagat | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.22 |
caaagaaagatagagcaaga<u>caa</u>gaaaagtaagtggccctgac | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.23 |
ttcgaggaaagggaaagggg<u>caa</u>aaacgaaagcgcaagaaatc | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.24 |
ggagaaagcatttgtttgta<u>caa</u>gatccgcagacgtgtaaatg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.25 |
cagtcgcgctgacggacaga<u>cag</u>acagacaccgcccccagccc | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.26 |
acgcggcggcgagccgcggg<u>cag</u>gggccggagcccgcgcccgg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.27 |
gctcgggccgggaggagccg<u>cag</u>ccggaggagggggaggagga | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.28 |
aggaagaggagagggggccg<u>cag</u>tggcgactcggcgctcggaa | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.29 |
ctccagccgcgcgcgctccc<u>cag</u>gccctggcccgggcctcggg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.30 |
ctttctgtcctcagtggtcc<u>cag</u>gctgcacccatggcagaagg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.31 |
ccatggcagaaggaggaggg<u>cag</u>aatcatcacgaaggtgagtc | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.32 |
tgaagttcatggatgtctat<u>cag</u>cgcagctactgccatccaat | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.33 |
agaccctggtggacatcttc<u>cag</u>gagtaccctgatgagatcga | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.34 |
aggagtccaacatcaccatg<u>cag</u>gtgggcatctttgggaagtg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.35 |
ggatcaaacctcaccaaggc<u>cag</u>cacataggagagatgagctt | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.36 |
taggagagatgagcttccta<u>cag</u>cacaacaaatgtgaatgcag | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.37 |
atttgtttgtacaagatccg<u>cag</u>acgtgtaaatgttcctgcaa | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.38 |
actcgcgttgcaaggcgagg<u>cag</u>cttgagttaaacgaacgtac | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.39 |
aggagagggggccgcagtgg<u>cga</u>ctcggcgctcggaagccggg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.40 |
ggggaggaagagtagctcgc<u>cga</u>ggcgccgaggagagcgggcc | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.41 |
catcctgtgtgcccctgatg<u>cga</u>tgcgggggctgctgcaatga | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.42 |
gacaagaaaaaaaatcagtt<u>cga</u>ggaaagggaaaggggcaaaa | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.43 |
gaaagggaaaggggcaaaaa<u>cga</u>aagcgcaagaaatcccggta | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.44 |
aagaggagagggggccgcag<u>tgg</u>cgactcggcgctcggaagcc | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.45 |
gcgctcggaagccgggctca<u>tgg</u>acgggtgaggcggcggtgtg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.46 |
ccatgaactttctgctgtct<u>tgg</u>gtgcattggagccttgcctt | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.47 |
ttctgctgtcttgggtgcat<u>tgg</u>agccttgccttgctgctcta | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.48 |
tgctctctttctgtcctcag<u>tgg</u>tcccaggctgcacccatggc | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.49 |
agaaatcccggtataagtcc<u>tgg</u>agcgtgtacgttggtgcccg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.50 |
cccgctgctgtctaatgccc<u>tgg</u>agcctccctggcccccagta | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.51 |
tcggcgctcggaagccgggc<u>tca</u>tggacgggtgaggcggcggt | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.52 |
tttttttattttccagaaaa<u>tca</u>gttcgaggaaagggaaaggg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.53 |
gcagtccctgtgggccttgc<u>tca</u>gagcggagaaagcatttgtt | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.54 |
acaccgcccccagccccagc<u>tac</u>cacctcctccccggccggcg | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.55 |
ggagccttgccttgctgctc<u>tac</u>ctccaccatgccaaggtaag | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.56 |
tggatgtctatcagcgcagc<u>tac</u>tgccatccaatcgagaccct | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.57 |
tggtggacatcttccaggag<u>tac</u>cctgatgagatcgagtacat | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.58 |
agtaccctgatgagatcgag<u>tac</u>atcttcaagccatcctgtgt | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.59 |
Ggtataagtcctggagcgtg<u>tac</u>gttggtgcccgctgctgtct | 产生终止密码子 | SEQ ID NO.60 |
Cccgcagctgaccagtcgcg<u>ctg</u>acggacagacagacagacac | 破坏起始密码子 | SEQ ID NO.61 |
ccggtcgggcctccgaaacc<u>atg</u>aactttctgctgtcttgggt | 破坏起始密码子 | SEQ ID NO.62 |
注:表1中下划线代表可以形成终止密码子的三联体密码子或起始密码子
表2利用不同碱基编辑***针对VPF基因设计的敲除sgRNA
针对设计的靶向位点合成相应的oligo序列,上下游序列通过程序(95℃,5min;95℃-85℃at-2℃/s;85℃-25℃at-0.1℃/s;hold at 4℃)退火,连接到经过BsaI(NEB:R0539L)线性化的PGL3-U6-sgRNA-GFP载体上。连接体系如下:T4连接buffer(NEB:M0202L)1μL,线性化载体20ng,退火的oligo片段(10μM)5μL,T4连接酶(NEB:M0202L)0.5μL,ddH2O补齐到10μL。16℃连接过夜。连接的载体通过转化,挑菌,鉴定,鉴定引物为U6载体为上游序列:5’-TTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO.17),下游序列为相应oligo的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene:AP-MN-P-250G)测定浓度备用。
2.RPE细胞系或Muller细胞系的培养与转染
商业化的RPE细胞(ARPE-19)与Muller细胞(MIO-M1)接种培养于添加10%FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B),其中含penicillin(100U/m1)和streptomycin(100μg/ml)。转染前分至6孔板中,待密度达到70%-80%时进行转染。转染前两个小时换成无抗生素的培养基。转染以脂质体转染为例,按照LipofectamineTM 2000TransfectionReagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册,将2μg碱基编辑蛋白质粒(即胞嘧啶融合蛋白质粒或CGBE融合蛋白质粒)与1μg pGL3-U6-sgRNA-GFP质粒混匀,共转染至每孔细胞中,6-8小时后换液,72小时后流式分选阳性细胞。每种类型的碱基编辑器分别选择两个,一种是常规设计的胞嘧啶融合蛋白质粒A3A-BE4max(addgene:#157943),和常规设计的CGBE融合蛋白质粒CGBE-A3A(序列参考申请号为202210415558.0专利中SEQ ID NO.18);另一种选择可以显著降低脱靶的,将脱氨酶嵌合到Cas9中间位置的编辑器,胞嘧啶融合蛋白质粒为:CE-A3A-BE4max(氨基酸序列如SEQ ID No.18所示),CGBE融合蛋白质粒CE-CGBE-A3A(氨基酸序列如SEQ ID NO.20)。
3.编辑效率的测定
将收集到的细胞通过裂解鉴定基因型,裂解液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl2,10mM Tris pH 8.0,0.5%Nonidet P-40,0.5%Tween 20,100μg/ml protease K。PCR扩增出含有靶位点的片段后深度测序。
通过对测序数据分析,发现在RPE细胞系中针对13个可以诱导成终止密码子的位点,利用两种类型的胞嘧啶碱基编辑器均能有效实现编辑。同时,发现VPF_1,VPF_3,VPF_7,VPF_10,VPF_12这5个位点的编辑效率达到了50%以上(图2所示)。
在Muller细胞系,针对13个可以诱导成终止密码子的位点,利用两种类型的胞嘧啶碱基编辑器同样能有效实现编辑。相比于RPE细胞系,在Muller细胞系的编辑效率有所降低,同样的VPF_1,VPF_3,VPF_7,VPF_10,VPF_12这5个位点的效率也是相对高效。
实施例2:碱基编辑***突变VPF破坏起始密码子
1.sgRNA设计与载体构建
起始密码子位置固定,所设计的sgRNA数量有限,其中sgRNA名称为VPF_14和VPF_15两种适合胞嘧啶碱基编辑***、腺嘌呤碱基编辑***以及CGBE碱基编辑***,相应的序列为SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.15。VPF_16只适合于腺嘌呤碱基编辑***,序列为SEQ IDNO.16。不同编辑***敲除VPFA基因示意图如图1所示。
针对设计的靶向位点合成相应的oligo序列,上下游序列通过程序(95℃,5min;95℃-85℃at-2℃/s;85℃-25℃at-0.1℃/s;hold at 4℃)退火,连接到经过BsaI(NEB:R0539L)线性化的PGL3-U6-sgRN-GFP载体上。连接体系如下:T4连接buffer(NEB:M0202L)1μL,线性化载体20ng,退火的oligo片段(10μM)5μL,T4连接酶(NEB:M0202L)0.5μL,ddH2O补齐到10μL。16℃连接过夜。连接的载体通过转化,挑菌,鉴定,鉴定引物为U6载体为上游序列:5’-TTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO.17),下游序列为相应oligo的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene:AP-MN-P-250G)测定浓度备用。
2.RPE细胞系或Muller细胞系的培养与转染
商业化的RPE细胞(ARPE-19)与Muller细胞(MIO-M1)接种培养于添加10%FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B),其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。转染前分至6孔板中,待密度达到70%-80%时进行转染。转染前两个小时换成无抗生素的培养基,转染以脂质体转染为例。按照LipofectamineTM2000 TransfectionReagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册,将2μg碱基编辑蛋白质粒(即胞嘧啶融合蛋白质粒、腺嘌呤融合蛋白质粒或CGBE融合蛋白质粒)与1μg pGL3-U6-sgRNA-GFP质粒混匀,共转染至每孔细胞中,6-8小时后换液,72小时后流式分选阳性细胞。每种类型的碱基编辑器选择各选择一个常规设计的和可以显著降低脱靶的,常规设计的三个分别为:A3A-BE4max(addgene:#157943),ABEmax(addgene:#164415),CGBE-A3A(序列参考申请号为202210415558.0专利中SEQ ID NO.18)。另一种可以显著降低脱靶的,将脱氨酶嵌合到Cas9中间位置的编辑器,分别为:CE-A3A-BE4max(氨基酸序列如SEQ ID NO.18),CE-ABE(氨基酸序列如SEQ ID NO.19),CE-CGBE-A3A(氨基酸序列如SEQ ID NO.20)。
3.编辑效率的测定
将收集到的细胞通过裂解鉴定基因型,裂解液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl2,10mM Tris pH 8.0,0.5%Nonidet P-40,0.5%Tween 20,100μg/ml protease K。PCR扩增出含有靶位点的片段,送深度测序。
通过对测序数据分析发现,在RPE细胞系,针对3种碱基编辑***均能靶向的位点VPF_14和VPF_15均能有效编辑,其中VPF_14位点的编辑效率高于VPF_15(图4所示)。针对VPF_16位点,两种类型的腺嘌呤碱基编辑器均能高效实现编辑(图5所示)。
在Muller细胞系,针对3种***均能靶向的位点VPF_14和VPF_15均能有效编辑,其中VPF_14位点的编辑效率高于VPF_15(图6所示)。针对VPF_16位点,两种类型的腺嘌呤碱基编辑器均能高效实现编辑(图7所示)。
实施例3:酶联免疫吸附实验检测突变后VPF表达水平
1.单克隆细胞的筛选
如实施例1和2的介绍,转染后的RPE细胞经过流式分选阳性细胞,将单个细胞接种到96孔板中,等两周以后,取部分细胞通过裂解鉴定基因型,裂解液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl2,10mM Tris pH 8.0,0.5%Nonidet P-40,0.5%Tween 20,100μg/mlprotease K。挑选纯合突变的细胞株扩大培养。针对诱导成终止密码子的位点,选择VPF_7,VPF_12两个位点。针对突变起始密码子,选择VPF_16位点。
2.酶联免疫吸附测定VPF表达
对挑选的纯合敲除RPE细胞株,进行扩大培养。利用酶联免疫吸附实验测定VPF的表达(ELISA)。简要步骤如下:从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条,未用的板条和干燥剂放回铝箔袋内压实自封条,密封口袋,放回4℃。空白孔加标准品&标本通用稀释液,其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔),用封板胶纸封住反应孔,37℃恒温箱,避光孵育90分钟。提前20分钟准备生物素化抗体工作液。洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液,其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔,37℃恒温箱,避光孵育60分钟。提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25℃)放置。洗板5次。空白孔加酶结合物稀释液,其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔,37℃恒温箱,避光孵育30分钟。打开酶标仪电源,预热仪器,设置好检测程序。洗板5次。加入显色底物(TMB)100ul/孔,37℃恒温箱,避光孵育15分钟。加入反应终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板框,以备下次或者今后试验使用。
通过对数据分析,不同类型的碱基编辑细胞系均能实现VPF蛋白的敲除(图8所示)。
实施例4:碱基编辑VPF基因的安全性分析
对于实施例3获得的细胞系,利用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取纯合突变细胞株基因组DNA,送北京安诺优达进行全基因组测序,测序深度在25-30x。测序的原始数据通过BWAv0.7.16比对到人的参考基因组上(GRCh38/hg38)。SNP位点通过GATK HaplotypeCaller软件进行分析。
通过对测序数据分析,发现使用嵌合型的胞嘧啶碱基编辑器(CE-A3A-BE4max,CE-CGBE-A3A)所产生的SNP与野生型接近,远远低于常规类型的碱基编辑器(A3A-BE4max,CGBE-A3A)。提示利用嵌合型的编辑器对后续的临床应用具有更大的价值。对于腺嘌呤碱基编辑器,两种类型的编辑器所产生的SNP数量远低于胞嘧啶碱基编辑器,这与腺嘌呤碱基编辑器在DNA水平较少脱靶相关(图9所示)。
综上所述可见:本发明所述的方法利用引导核苷酸(sgRNA)和碱基编辑蛋白,以脂质体转染或电穿孔转染的方式将sgRNA/BE蛋白复合物(RNP)导入RPE细胞系或Muller细胞系,可以高效敲除VPF基因,同时利用嵌合型的碱基编辑器在DNA与RNA水平均没有检测到明显脱靶,可以更加安全的实现敲除的目的。因此本发明所述的利用碱基编辑技术敲除VPF基因,结合病毒载体与注射等方式,将对AMD疾病提供安全有效的治疗手段或有望开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂,具有明显的应用前景和临床应用价值。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (13)
1.一种编辑VPF基因的方法,其特征在于,所述方法包括利用碱基编辑***对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基,以在VPF基因编码区引入终止密码子或点突变起始密码子;所述碱基编辑***包括:
(a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸,所述融合蛋白中包括Cas9片段和脱氨酶片段;
(b)引导核苷酸或其编码多核苷酸,其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述靶C碱基和/或靶A碱基。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,引入的终止密码子为TAA,TAG或者TGA;和/或,所述起始密码子为ATG或CTG。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述融合蛋白选自胞嘧啶融合蛋白、腺嘌呤融合蛋白或胞嘧啶颠换融合蛋白中的一种或多种;各融合蛋白相应的所述碱基编辑***为胞嘧啶碱基编辑***、腺嘌呤碱基编辑***、CGBE碱基编辑***。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述脱氨酶片段为胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶;优选的,所述胞嘧啶脱氨酶选自以下中的一个或多个:APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、激活诱导的脱氨酶或pmCDA1;
和/或,所述腺嘌呤脱氨酶选自野生型tadA、突变型tadA,或者两者组成的复合物wtTadA–TadA。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Cas9片段和脱氨酶片段之间通过链接肽链接。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,还包括以下中的任一项或多项:
1)所述胞嘧啶融合蛋白的结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[链接肽]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[UGI肽段]-[UGI肽段]-[核定位信号]-COOH;优选地,所述胞嘧啶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示;
2)所述腺嘌呤融合蛋白的结构为NH2-[核定位信号]-[第一nCas片段]-[链接肽]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[链接肽]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[核定位信号]-COOH;优选地,所述腺嘌呤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示;
3)所述胞嘧啶颠换融合蛋白自N端至C端依次包括第一Cas9片段、嵌合***片段、第二切口酶片段,所述嵌合***片段包含脱氨酶片段和尿嘧啶DNA结合蛋白片段;优选地,所述胞嘧啶颠换融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述引导核苷酸的靶向序列选自SEQ IDNo.21-SEQ ID No.62。
8.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,还包括以下中的任一项或多项:
1)所述胞嘧啶碱基编辑***中,所述引导核苷酸的靶向序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.10,SEQ ID NO.14,SEQ ID NO.15至少任一所示;
2)所述腺嘌呤碱基编辑***中,所述引导核苷酸的靶向序列如SEQ ID NO.14,SEQ IDNO.15,SEQ ID NO.16所示;
3)所述CGBE碱基编辑***中,所述引导核苷酸的靶向序列如SEQ ID NO.11-SEQ IDNO.15所示。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,利用碱基编辑***对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基的步骤为:将包含编码融合蛋白或其变体的多核苷酸的表达载体、包含编码引导核苷酸的多核苷酸的表达载体递送至待编辑对象中;优选的,通过脂质体转染、电穿孔、病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化中的一种或多种方法将所述表达载体递送至待编辑对象中。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法在体外实施;和/或,所述待编辑对象为培养的细胞;优选地,所述细胞为RPE细胞或Muller细胞。
11.权利要求1-10任一所述的编辑VPF基因的方法获得的细胞。
12.权利要求11所述的细胞在制备预防或治疗VPF过表达相关疾病产品中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途,其特征在于,所述VPF过表达相关疾病为癌症或眼科疾病;优选的,所述眼科疾病为黄斑变性;更优选的,所述黄斑变性为老年性黄斑变性。
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