CN115818700B - 一种表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶的制备方法及其应用，该纳米酶是通过等离子技术将富勒烯C60形成表面带负电的具有缺陷态的载体，然后GeO量子点在静电吸附作用下附着于富勒烯表面上，金属离子与富勒烯发生静电作用和配位作用以离子形式固定在C60表面。本发明提供的制备方法适用于多种单离子位点的纳米酶的制备，该制备方法简单易行，制得的纳米酶具有丰富的活性位点。实验结果表明，本发明制得的纳米酶在GeO量子点的红外光热效应帮助下具有增强的类过氧化物酶活性，在肌红蛋白、心肌肌钙蛋白Ι、C反应蛋白等免疫分析领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及功能材料技术领域，具体涉及一种表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶的制备方法及其应用。
背景技术
纳米酶因其催化效率高、反应条件温和等优点广泛应用于生物医学检测领域中。但大多数纳米酶处于游离状态，其稳定性较差。目前，固定化酶技术主要有共价结合法、吸附法、交联法、接枝法等，但仍然存在制备方法复杂、酶固载量小、结合能力低、酶活性降低等问题。富勒烯由于其特殊的理化性质以及其独特的笼状结构所产生的特定化学反应被选为纳米酶固定化优异的载体。近年来，富勒烯以其独特的结构和性质受到研究人员们广泛关注，已成功应用于物理、化学、材料及生命科学研究领域。开发具有高活性的富勒烯纳米酶对拓宽纳米酶的应用十分重要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶，酶活性较高。
本发明的目的之二是提供上述表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶的制备方法，以提高该纳米酶的催化性能。
本发明的目的之二是提供上述表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶在免疫分析中的应用。
本发明所提供的带负电的富勒烯C60表面负载有GeO量子点和单离子位点的纳米酶的方案，包括以下方面：
第一方面，本发明提供一种表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶，是通过等离子技术将富勒烯C60形成表面带负电的具有缺陷态的载体，然后GeO量子点在静电吸附作用下附着于富勒烯表面上，金属离子与富勒烯发生静电作用和配位作用以离子形式固定在C60表面。
第二方面，本发明提供一种表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将块状的Ge原材料放入球磨机，每个球磨罐加入与原材料同等质量的磨球，磨成具有纳米尺寸的GeO量子点；
步骤2，将富勒烯C60原料放入等离子表面处理机中的等离子体反应室中，调节反应压力保持低真空状态，用射频电源产生等离子体激发富勒烯C60表面使其形成表面带负电的具有缺陷态的碳载体；加入有机溶剂，配制成浓度为1.5～15mg·mL-1的含C60的溶液B；
步骤3，将步骤2得到的产物溶解于有机溶剂中配制成浓度为1.5～15mg·mL-1的含C60的溶液A，将步骤1得到的产物分散于去离子水中配制成浓度为15～375mg·mL-1的含Ge量子点的分散液B，将两者混合，在80～150℃条件下加热搅拌反应，再超声使之充分反应；
步骤4，向步骤3得到的悬浊液中滴加浓度为0.06～0.9mol·L-1的过渡金属离子溶液C，直至悬浊液颜色发生改变，再将悬浊液转移至离心管中，用有机溶剂在转速为8000～12000r/min的离心机中离心洗涤3～5次，放入70～120℃的烘箱中干燥12～24h，取出研磨10～30min，得到表面同时附着有GeO量子点和金属离子的富勒烯C60纳米酶，其中滴加速度控制在0.1～1mL·min-1；
步骤5，利用GeO量子点的红外光热转换效应通过将步骤4所得的纳米酶在红外光照射下升高温度并在金属离子的协同作用下以增强纳米酶的过氧化物酶活性。
优选地，步骤1中球磨方式为正转运行30～40min，停5min，反转运行30～40min交替进行，球磨速率250～400r/min，总球磨时间60～84h。
优选地，步骤1中所述GeO量子点的平均直径不超过10nm。
优选地，步骤2中等离子体为氩气、氧气、氮气的一种；等离子体反应室的反应压力为0.01～0.6MPa。
优选地，步骤3所述C60和GeO量子点的质量比为1～4:10～60，混合后总体积为100mL，搅拌转速200～1000r/min，搅拌反应时间为4～6h，超声时间45～60min。
优选地，步骤3中所述有机溶剂选自含苯环有机溶剂，步骤4中所述有机溶剂选自醇类有机溶剂。
更优选地，步骤3中所述有机溶剂选自间二甲苯、异丙苯、甲苯、苯或氯苯的一种；步骤4中所述有机溶剂选自甲醇、水或乙醇的一种或多种。
优选地，步骤4中所述过渡金属离子溶液选自SnCl2溶液、Bi(NO3)3溶液、TiCl2溶液、FeCl3溶液、ZnCl2溶液、CuCl2溶液中的一种或多种。
优选地，步骤5中所述红外光照射5～30min，升温至30～60℃。
第三方面，本发明提供上述纳米酶在免疫分析中的应用。
本发明制备的带负电的富勒烯C60表面负载有GeO量子点和单离子位点的纳米酶具有一定的类过氧化物酶活性，而由于GeO量子点所特有的光热转换效应，使得上述纳米酶的酶活性提高，能够催化过氧化氢(H2O2)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)之间的氧化反应，加速产生氧化态TMB(ox-TMB)，反应体系从无色变成蓝色，在652nm附近产生强烈的光吸收。基于抗原抗体反应的特异性以及酶对底物高效催化作用，本发明将纳米酶用于酶联免疫分析中，从而建立蓝色强度值与体系中待测标志物(肌红蛋白、心肌肌钙蛋白Ι、C反应蛋白)浓度之间的标准曲线，然后实现对未知浓度标志物的量化检测。
与现有技术相比，本发明提供的制备方法适用于多种单离子位点的纳米酶的制备，该制备方法简单易行，制得的纳米酶具有丰富的活性位点。实验结果表明，本发明制得的纳米酶在GeO量子点的红外光热效应帮助下具有增强的类过氧化物酶活性，在肌红蛋白、心肌肌钙蛋白Ι、C反应蛋白等免疫分析领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是纳米酶反应机理图；
图2是GeO量子点的扫描电镜图；
图3是Sn2+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图；
图4是Bi3+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图；
图5是Fe3+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图；
图6是Zn2+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图；
图7是Cu2+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图；
图8是Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图；
图9为不同纳米酶在不同金属离子吸附量、不同红外光照射时间下的酶活性曲线；
图10是Sn2+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+10％ Sn2+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(10min)；
图11是Bi3+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+10％ Bi3+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(30min)；
图12是Fe3+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+6％ Fe3+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(20min)；
图13是Zn2+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+8％ Zn2+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(20min)；
图14是Cu2+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+10％ Cu2+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(30min)；
图15是Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+8％ Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(30min)；
图16是免疫分析示意图；
图17是Fe3+-GeO@C60纳米酶检测肌红蛋白的标准曲线；
图18是Fe3+-GeO@C60纳米酶检测心肌肌钙蛋白Ι的标准曲线；
图19是Fe3+-GeO@C60纳米酶检测C反应蛋白的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明所述的技术方案作进一步详细说明。
本发明提供一种在带负电的富勒烯C60表面负载有GeO量子点和单离子位点的纳米酶，通过等离子技术将富勒烯C60形成表面带负电的具有缺陷态的载体，然后GeO量子点在静电吸附作用下附着于富勒烯表面上，金属离子与富勒烯发生静电作用和配位作用以离子形式固定在C60表面。其反应机理如图1所示。
实施例1：Sn2+-GeO@C60纳米酶的制备
(一)GeO量子点的制备
打开球磨机，取1.3g块状Ge原材料分别置于4个球磨罐中，并且在每个球磨罐中加入等质量的磨球。设置球磨方式为正转运行30min，停5min，反转运行30min交替进行，研磨速率300r/min，总研磨时间72h，得到具有纳米尺度均匀球状的GeO量子点。
图2是GeO量子点的扫描电镜图。
(二)富勒烯C60的等离子化
将富勒烯C60原料放入等离子表面处理机中的等离子体反应室中，调节反应压力保持低真空状态，向等离子体反应室中通入氮气，用射频电源产生稳定的氮气等离子体激发富勒烯C60表面使其形成表面带负电的具有缺陷态的碳载体。其结构如图1所示。
(三)Sn2+-GeO@C60纳米酶的制备
将0.5g等离子化的富勒烯溶解于40mL甲苯中，得到0.017mol·L-1的富勒烯溶液(溶液A)；将5.0g GeO量子点分散于60mL去离子水中，得到分散液B；称取1.2g SnCl2粉末溶解于80mL其离子水中，得到0.08mol·L-1的SnCl2前驱液(溶液C)。
先将溶液A和分散液B置于250mL的烧瓶中，在90℃油浴锅中加热搅拌反应4h，然后将其转移至超声浴中超声45min，得到表面负载GeO量子点的富勒烯悬浊液。再将溶液C置于滴液漏斗中，通过调节滴加速率将其滴入上述装有悬浊液的烧瓶中，继续在常温搅拌反应，直至悬浊液颜色改变停止反应。滴速设置为0.2mL·min-1、0.4mL·min-1、0.6mL·min-1、0.8mL·min-1、1mL·min-1，五个不同流速分别对应2％、4％、6％、8％、10％的Sn2+负载量。将得到的悬浊液转移至离心管中，用甲醇离心洗涤5次，再在80℃烘箱中干燥12h，然后将其取出并研磨30min，得到Sn2+-GeO@C60纳米酶。
图3是Sn2+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图。
实施例2：Bi3+-GeO@C60纳米酶的制备
配制0.015mol·L-1的富勒烯溶液(溶液A)，GeO量子点分散液(分散液B)，0.06mol·L-1的Bi(NO3)3前驱液(溶液C)。步骤同实施例一类似。
先将溶液A和分散液B置于250mL的烧瓶中，在90℃油浴锅中加热搅拌反应4h，然后将其转移至超声浴中超声45min，得到表面负载GeO量子点的富勒烯悬浊液。再将溶液C置于滴液漏斗中，通过调节滴加速率将其滴入上述装有悬浊液的烧瓶中，继续在常温搅拌反应，直至悬浊液颜色改变停止反应。滴速设置为0.2mL·min-1、0.4mL·min-1、0.6mL·min-1、0.8mL·min-1、1mL·min-1，五个不同流速分别对应2％、4％、6％、8％、10％的Bi3+负载量。将得到的悬浊液转移至离心管中，用甲醇离心洗涤5次，再在80℃烘箱中干燥12h，然后将其取出并研磨30min，得到Bi3+-GeO@C60纳米酶。
图4是Bi3+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图。
实施例3：Fe3+-GeO@C60纳米酶的制备
配制0.02mol·L-1的富勒烯溶液(溶液A)，GeO量子点分散液(分散液B)，0.10mol·L-1的FeCl3前驱液(溶液C)。步骤同实施例一类似。
先将溶液A和分散液B置于250mL的烧瓶中，在90℃油浴锅中加热搅拌反应4h，然后将其转移至超声浴中超声45min，得到表面负载GeO量子点的富勒烯悬浊液。再将溶液C置于滴液漏斗中，通过调节滴加速率将其滴入上述装有悬浊液的烧瓶中，继续在常温搅拌反应，直至悬浊液颜色改变停止反应。滴速设置为0.2mL·min-1、0.4mL·min-1、0.6mL·min-1、0.8mL·min-1、1mL·min-1，五个不同流速分别对应2％、4％、6％、8％、10％的Fe3+负载量。将得到的悬浊液转移至离心管中，用甲醇离心洗涤5次，再在80℃烘箱中干燥12h，然后将其取出并研磨30min，得到Fe3+-GeO@C60纳米酶。
图5是Fe3+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图。
实施例4：Zn2+-GeO@C60纳米酶的制备
配制0.02mol·L-1的富勒烯溶液(溶液A)，GeO量子点分散液(分散液B)，0.10mol·L-1的ZnCl2前驱液(溶液C)。步骤同实施例一类似。
先将溶液A和分散液B置于250mL的烧瓶中，在90℃油浴锅中加热搅拌反应4h，然后将其转移至超声浴中超声45min，得到表面负载GeO量子点的富勒烯悬浊液。再将溶液C置于滴液漏斗中，通过调节滴加速率将其滴入上述装有悬浊液的烧瓶中，继续在常温搅拌反应，直至悬浊液颜色改变停止反应。滴速设置为0.2mL·min-1、0.4mL·min-1、0.6mL·min-1、0.8mL·min-1、1mL·min-1，五个不同流速分别对应2％、4％、6％、8％、10％的Zn2+负载量。将得到的悬浊液转移至离心管中，用甲醇离心洗涤5次，再在80℃烘箱中干燥12h，然后将其取出并研磨30min，得到Zn2+-GeO@C60纳米酶。
图6是Zn2+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图。
实施例5：Cu2+-GeO@C60纳米酶的制备
配制0.015mol·L-1的富勒烯溶液(溶液A)，GeO量子点分散液(分散液B)，0.06mol·L-1的CuCl2前驱液(溶液C)。步骤同实施例一类似。
先将溶液A和分散液B置于250mL的烧瓶中，在90℃油浴锅中加热搅拌反应4h，然后将其转移至超声浴中超声45min，得到表面负载GeO量子点的富勒烯悬浊液。再将溶液C置于滴液漏斗中，通过调节滴加速率将其滴入上述装有悬浊液的烧瓶中，继续在常温搅拌反应，直至悬浊液颜色改变停止反应。滴速设置为0.2mL·min-1、0.4mL·min-1、0.6mL·min-1、0.8mL·min-1、1mL·min-1，五个不同流速分别对应2％、4％、6％、8％、10％的Cu2+负载量。将得到的悬浊液转移至离心管中，用甲醇离心洗涤5次，再在80℃烘箱中干燥12h，然后将其取出并研磨30min，得到Cu2+-GeO@C60纳米酶。
图7是Cu2+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图。
实施例6：Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶的制备
配制0.017mol·L-1的富勒烯溶液(溶液A)，GeO量子点分散液(分散液B)，含0.10mol·L-1的FeCl3和0.06mol·L-1的CuCl2的溶液(溶液C)。步骤同实施例一类似。
先将溶液A和分散液B置于250mL的烧瓶中，在90℃油浴锅中加热搅拌反应4h，然后将其转移至超声浴中超声45min，得到表面负载GeO量子点的富勒烯悬浊液。再将溶液C置于滴液漏斗中，通过调节滴加速率将其滴入上述装有悬浊液的烧瓶中，继续在常温搅拌反应，直至悬浊液颜色改变停止反应。滴速设置为0.2mL·min-1、0.4mL·min-1、0.6mL·min-1、0.8mL·min-1、1mL·min-1，五个不同流速分别对应2％、4％、6％、8％、10％的Fe3+/Cu2+总负载量。将得到的悬浊液转移至离心管中，用甲醇离心洗涤5次，再在80℃烘箱中干燥12h，然后将其取出并研磨30min，得到Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶。
图8是Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶的透射电镜图。
实施例7：纳米酶类活性的评价
首先将纳米酶置于红外光下照射20min，使其温度上升至50℃，以增强纳米酶的类酶活性。配制摩尔浓度为200mM，pH值为3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶解于二甲基亚砜得到0.1mM的TMB溶液，将30wt％的过氧化氢溶液稀释成摩尔浓度为1mM，将纳米酶分散在缓冲溶液中，超声5min，得到1mg·mL-1的纳米酶分散液。在离心管中依次加入1680μL缓冲液，100μL酶分散液，200μL过氧化氢溶液以及20μL TMB溶液，将反应液置于红外光下经照射孵育不同时间(0min、10min、20min、30min)后，用紫外分光光度计测量其在不同照射时间下的吸收情况。并与无纳米酶添加的空白体系进行吸光度值的比较。
图9为不同纳米酶在不同金属离子负载量、不同红外光照射时间下的酶活性曲线。
图10是Sn2+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+10％ Sn2+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(10min)。
图11是Bi3+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+10％ Bi3+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(30min)。
图12是Fe3+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+6％ Fe3+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(20min)。
图13是Zn2+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+8％ Zn2+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(20min)。
图14是Cu2+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+10％ Cu2+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(30min)。
图15是Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢的吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+8％ Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶的吸收曲线(30min)。
上述实验结果表明，本发明提供的纳米酶具有良好的类过氧化物酶活性，并且不同元素在不同金属离子负载量和不同红外光照射时间的条件下的纳米酶活性有差异：
图9a表示Sn2+-GeO@C60纳米酶在相同红外光照射时间下的活性大小：10％>8％>6％>4％>2％，相同Sn2+负载量下的活性大小：10min>20min>30min>0min；
图9b表示Bi3+-GeO@C60纳米酶在相同红外光照射时间下的活性大小：10％>8％>6％>4％>2％，相同Bi3+负载量下的活性大小：30min>20min>10min>0min；
图9c表示Fe3+-GeO@C60纳米酶在相同红外光照射时间下的活性大小：6％>8％>4％>10％>2％，相同Fe3+负载量下的活性大小：20min>30min>10min>0min；
图9d表示Zn2+-GeO@C60纳米酶在相同红外光照射时间下的活性大小：8％>10％>6％>4％>2％，相同Zn2+负载量下的活性大小：20min>30min>10min>0min；
图9e表示Cu2+-GeO@C60纳米酶在相同红外光照射时间下的活性大小：10％>8％>6％>4％>2％，相同Cu2+负载量下的活性大小：30min>20min>10min>0min。
图9f表示Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶在相同红外光照射时间下的活性大小：8％>10％>6％>4％>2％，相同Fe3+/Cu2+总负载量下的活性大小：30min>20min>10min>0min；
从图11-图16可以得出在相应最优条件不同元素的活性从强至弱依次为：Fe3+-GeO@C60纳米酶、Fe3+/Cu2+-GeO@C60纳米酶、Cu2+-GeO@C60纳米酶、Sn2+-GeO@C60纳米酶、Zn2+-GeO@C60纳米酶、Bi3+-GeO@C60纳米酶。
实施例8：Fe3+-GeO@C60纳米酶模拟过氧化物酶在免疫分析中的应用
首先分别将标准的肌红蛋白抗原、心肌肌钙蛋白Ι抗原、C反应蛋白抗原包被在T1、T2、T3线上，二抗固定在C线上。其次将三种抗体(肌红蛋白抗体、心肌肌钙蛋白Ι抗体、C反应蛋白抗体)修饰后的纳米酶预埋在结合区中。然后在样品区加入一系列不同浓度梯度的被检测物质(肌红蛋白、心肌肌钙蛋白Ι、C反应蛋白)，最后加入显色反应混合溶液(含最终浓度为1mM的TMB和10mM的过氧化氢)，在红外光照射20min后用智能手机拍摄图像并用ImageJ软件读取T线上的蓝色强度，根据不同浓度对应不同的蓝色强度值，得出相应被检测物质浓度-蓝色强度的标准线性方程。
图16为免疫分析示意图。
图17-图19依次为Fe3+-GeO@C60纳米酶应用于检测肌红蛋白(Myoglobin)、心肌肌钙蛋白Ι(Cardiac troponinΙ)、C反应蛋白(C reactive protein)的标准曲线。
肌红蛋白的标准曲线方程为：Y＝-0.609X+0.395，R2＝0.99；
心肌肌钙蛋白Ι的标准曲线方程为：Y＝-0.018X+0.388，R2＝0.99；
C反应蛋白的标准曲线方程为：Y＝-0.008X+0.360，R2＝0.99。
本发明以Fe3+-GeO@C60纳米酶为催化剂，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺为显色剂和过氧化氢混合溶液为底物，能够对体系中所含肌红蛋白、心肌肌钙蛋白Ι、C反应蛋白浓度进行快速检测，非常适宜于监管部门现场检测和即时监测。
Claims (9)
1.一种表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶，其特征在于，是通过等离子技术将富勒烯C60形成表面带负电的具有缺陷态的载体，然后GeO量子点在静电吸附作用下附着于富勒烯表面上，金属离子与富勒烯发生静电作用和配位作用以离子形式固定在C60表面。
2.一种权利要求1所述的表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将块状的Ge原材料放入球磨机，每个球磨罐加入与原材料同等质量的磨球，磨成具有纳米尺寸的GeO量子点；
步骤2，将富勒烯C60原料放入等离子表面处理机中的等离子体反应室中，调节反应压力保持低真空状态，用射频电源产生等离子体激发富勒烯C60表面使其形成表面带负电的具有缺陷态的碳载体；所述等离子体为氩气、氧气、氮气的一种；等离子体反应室的反应压力为0.01~0.6 MPa；
步骤3，将步骤2得到的表面带负电的具有缺陷态的碳载体溶解于有机溶剂中配制成浓度为1.5~15 mg·mL-1的含C60的溶液A，将步骤1得到的GeO量子点分散于去离子水中配制成浓度为15~375 mg·mL-1的含Ge量子点的分散液B，将两者混合，在80~150 ℃条件下加热搅拌反应，再超声使之充分反应，得到表面负载GeO量子点的富勒烯悬浊液；
步骤4，向步骤3得到的表面负载GeO量子点的富勒烯悬浊液中滴加浓度为0.06~0.9mol·L-1的过渡金属离子溶液C，直至悬浊液颜色发生改变，再将悬浊液转移至离心管中，用有机溶剂在转速为8000~12000 r/min的离心机中离心洗涤3~5次，放入70~120 ℃的烘箱中干燥12~24 h，取出研磨10~30 min，得到表面同时附着有GeO量子点和金属离子的富勒烯C60纳米酶，其中滴加速度控制在0.1~1 mL·min-1；
步骤5，利用GeO量子点的红外光热转换效应通过将步骤4所得的纳米酶在红外光照射下升高温度并在金属离子的协同作用下以增强纳米酶的过氧化物酶活性。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中球磨方式为正转运行30~40min，停5min，反转运行30~40 min交替进行，球磨速率250~400 r/min，总球磨时间60~84 h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述GeO量子点的平均直径不超过10nm。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述C60和GeO量子点的质量比为1~4 : 10~60，混合后总体积为100 mL，搅拌转速为200~1000r/min，搅拌反应时间为3~6h，超声时间30~75min。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述有机溶剂选自含苯环有机溶剂，步骤4中所述有机溶剂选自醇类有机溶剂。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述过渡金属离子溶液选自SnCl2溶液、Bi(NO3)3溶液、TiCl2溶液、FeCl3溶液、ZnCl2溶液、CuCl2溶液中的一种或多种。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤5中所述红外光照射5~30min，升温至30~60℃。
9.权利要求1所述的表面负载GeO量子点和单离子位点的富勒烯纳米酶在免疫分析中的检测应用。
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