CN115814102A - 一种定向递送的siRNA载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及siRNA载体技术领域，具体涉及一种定向递送的siRNA载体的制备方法。通过壳聚糖溶液对纳米二氧化硅复配改性，而后在通过过界面改性剂使类酯产物负载于改性后的纳米二氧化硅上，即获得定向递送的siRNA载体。本发明壳聚糖溶液在与纳米二氧化硅复配改性后，优化纳米二氧化硅的表面性能，便于对类酯产物进一步的结合，同时纳米二氧化硅具有高效的比表面积，能够承载，从而进行高效、精准的定向递送，通过界面改性剂配合后，界面改性剂以硬脂酸钙经过研磨处理，细化粒径，再通过分散后，活性度增强，从而将类酯产品与纳米二氧化硅复合壳聚糖液进一步的高效接触，提高界面性能，优化改进的产品能够提高承载、定向递送效果。
Description
技术领域
本发明涉及siRNA载体技术领域，具体涉及一种定向递送的siRNA载体的制备方法。
背景技术
血清白蛋白(包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鲑鱼血清白蛋白、蟾血清白蛋白等)是脊椎动物血浆中含量最丰富的蛋白质，具有安全无毒、无免疫原性、生物可降解、生物相容性好等优点。早在2005年，美国FDA批准由美国生命科学公司开发的、以白蛋白为载体的紫杉醇蛋白纳米粒注射液就已经上市。此外，Kremer等研究发现，与血清白蛋白共价结合后，抗叶酸氨喋棂的毒性降低一倍，表现出更强的抗肿瘤活性。
现有技术中制备的siRNA载体定向效率低，载体负载功能差，基于此，本发明对其进一步的改进优化处理，提供一种定向递送的siRNA载体的制备方法。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种定向递送的siRNA载体的制备方法。
为实现上述目的，本发明解决技术问题采用如下技术方案：
一种定向递送的siRNA载体的制备方法，通过壳聚糖溶液对纳米二氧化硅复配改性，而后在通过过界面改性剂使类酯产物负载于改性后的纳米二氧化硅上，即获得定向递送的siRNA载体。
具体：
步骤一：将经改性的纳米二氧化硅、壳聚糖溶液按照重量比1:(5-7)进行混合，混合时间为30-40min，混合转速为500-1000r/min，混合温度为45-55℃，混合结束，得到纳米二氧化硅复合壳聚糖液；
步骤二：环二赖氨和三氟甲基1,2环氧十二烷按照1:(6-8)的摩尔比混合，并加入过量的甲醇，于75-85℃下反应，最后旋蒸，得到类酯产物；
步骤三：随后将类酯产物、纳米二氧化硅复合壳聚糖液和界面改性剂按照重量比(3-4):(5-7):2复配混合；
步骤四：然后于1000-1500r/min的转速下搅拌30-40min，搅拌温度为40-45℃，搅拌结束，得到定向递送的siRNA载体。
所述经改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
S01：按重量份数计，将5-10份纳米二氧化硅加入到15-20份海藻酸钠溶液中，随后再加入1-4份磷酸、1-3份柠檬酸，先以200-300r/min的转速搅拌20-30min，得到纳米二氧化硅复合液；
S02：向纳米二氧化硅复合液中加入纳米二氧化硅复合液总重量5-10％的羟基氨基酸，搅拌混合充分，最后水洗、干燥得到经改性的纳米二氧化硅。
所述海藻酸钠溶液的质量分数为5-10％。
所述羟基氨基酸为丝氨基和/或苏氨基。
所述壳聚糖溶液的制备方法为：
按重量份数计，将5-10份壳聚糖加入到10-15份去离子水中，随后加入1-4份柠檬酸，搅拌混合充分，得到壳聚糖溶液。
所述搅拌混合充分的转速为500-1000r/min，混合时间为20-30min。
所述界面改性剂的制备方法为：
S11：将硬脂酸钙加入到研磨机中进行研磨，研磨过10-20目；
S12：将研磨的硬脂酸钙送入到其5-10倍质量的乙醇溶剂中超声分散处理，处理结束，备用；
所述S11的研磨转速为800-1200r/min；
所述超声分散的功率为350-450W，超声时间为10-20min；
所述超声分散的功率为400W，超声时间为15min。
一种所述方法制备所得定向递送的siRNA载体，按所述方法制备高承载、高定向递送效果的siRNA载体。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明的siRNA载体以类酯产物、纳米二氧化硅复合壳聚糖液和界面改性剂进行复配制成，纳米二氧化硅复合壳聚糖液将纳米二氧化硅先经过海藻酸钠溶液分散，再通过酸溶液提高活性，配合羟基氨基酸进一步的活化处理，而壳聚糖溶液以壳聚糖、柠檬酸配合，形成的壳聚糖溶液在与纳米二氧化硅复配改性后，优化纳米二氧化硅的表面性能，便于对类酯产物进一步的结合，同时纳米二氧化硅具有高效的比表面积，能够承载，从而进行高效、精准的定向递送，通过界面改性剂配合后，界面改性剂以硬脂酸钙经过研磨处理，细化粒径，再通过分散后，活性度增强，从而将类酯产品与纳米二氧化硅复合壳聚糖液进一步的高效接触，提高界面性能，优化改进的产品能够提高承载、定向递送效果，解决了现有技术中制备的siRNA载体定向效率低，载体负载功能差，提高了siRNA载体的多功能性，从而改进了应用效率，具有广泛的医药市场。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明壳聚糖溶液在与纳米二氧化硅复配改性后，优化纳米二氧化硅的表面性能，便于对类酯产物进一步的结合，同时纳米二氧化硅具有高效的比表面积，能够承载，从而进行高效、精准的定向递送，通过界面改性剂配合后，界面改性剂以硬脂酸钙经过研磨处理，细化粒径，再通过分散后，活性度增强，从而将类酯产品与纳米二氧化硅复合壳聚糖液进一步的高效接触，提高界面性能，优化改进的产品能够提高承载、定向递送效果。纳米二氧化硅的改性能够提高其分散度和活性度，增强纳米二氧化硅的改性效率。
实施例1.
本实施例的一种定向递送的siRNA载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将经改性的纳米二氧化硅、壳聚糖溶液按照重量比1:5进行混合，混合时间为30min，混合转速为500r/min，混合温度为45℃，混合结束，得到纳米二氧化硅复合壳聚糖液；
步骤二：环二赖氨和三氟甲基1,2环氧十二烷按照1:6的摩尔比混合，并加入过量的甲醇，于75℃下反应，最后旋蒸，得到类酯产物；
步骤三：随后将类酯产物、纳米二氧化硅复合壳聚糖液和界面改性剂按照重量比3:5:2复配混合；
步骤四：然后于1000r/min的转速下搅拌30min，搅拌温度为40℃，搅拌结束，得到定向递送的siRNA载体。
本实施例的经改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
S01：按质量份数计，将5份纳米二氧化硅加入到15份海藻酸钠溶液中，随后再加入1份磷酸、1份柠檬酸，先以200r/min的转速搅拌20min，得到纳米二氧化硅复合液；
S02：将纳米二氧化硅复合液中加入纳米二氧化硅复合液总重量5％的羟基氨基酸，搅拌混合充分，最后水洗、干燥得到经改性的纳米二氧化硅。
本实施例的海藻酸钠溶液的质量分数为5％。
本实施例的羟基氨基酸为丝氨基。
本实施例的壳聚糖溶液的制备方法为：
按重量份数计，将5份壳聚糖加入到10份去离子水中，随后加入1份柠檬酸，搅拌混合充分，得到壳聚糖溶液。
本实施例的搅拌混合充分的转速为500r/min，混合时间为20min。
本实施例的界面改性剂的制备方法为：
S11：将硬脂酸钙加入到研磨机中进行研磨，研磨过10目；
S12：将研磨的硬脂酸钙送入到其5倍质量的乙醇溶剂中超声分散处理，处理结束，备用；
本实施例的S11的研磨转速为800r/min。
本实施例的超声分散的功率为350W，超声时间为10min。
实施例2.
本实施例的一种定向递送的siRNA载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将经改性的纳米二氧化硅、壳聚糖溶液按照重量比1:5进行混合，混合时间为40min，混合转速为1000r/min，混合温度为55℃，混合结束，得到纳米二氧化硅复合壳聚糖液；
步骤二：环二赖氨和三氟甲基1,2环氧十二烷按照1:6的摩尔比混合，并加入过量的甲醇，于85℃下反应，最后旋蒸，得到类酯产物；
步骤三：随后将类酯产物、纳米二氧化硅复合壳聚糖液和界面改性剂按照重量比3:5:2复配混合；
步骤四：然后于1500r/min的转速下搅拌40min，搅拌温度为45℃，搅拌结束，得到定向递送的siRNA载体。
本实施例的经改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
S01：按重量份数计，将10份纳米二氧化硅加入到20份海藻酸钠溶液中，随后再加入4份磷酸、3份柠檬酸，先以300r/min的转速搅拌30min，得到纳米二氧化硅复合液；
S02：将纳米二氧化硅复合液中加入纳米二氧化硅复合液总重量10％的羟基氨基酸，搅拌混合充分，最后水洗、干燥得到经改性的纳米二氧化硅。
本实施例的海藻酸钠溶液的质量分数为10％。
本实施例的羟基氨基酸为苏氨基。
本实施例的壳聚糖溶液的制备方法为：
按重量份数计，将10份壳聚糖加入到15份去离子水中，随后加入4份柠檬酸，搅拌混合充分，得到壳聚糖溶液。
本实施例的搅拌混合充分的转速为1000r/min，混合时间30min。
本实施例的界面改性剂的制备方法为：
S11：将硬脂酸钙加入到研磨机中进行研磨，研磨过20目；
S12：将研磨的硬脂酸钙送入到10倍的乙醇溶剂中超声分散处理，处理结束，备用；
本实施例的S11的研磨转速为1200r/min。
本实施例的超声分散的功率为450W，超声时间为20min。
实施例3.
本实施例的一种定向递送的siRNA载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将经改性的纳米二氧化硅、壳聚糖溶液按照重量比1:5进行混合，混合时间为35min，混合转速为750r/min，混合温度为50℃，混合结束，得到纳米二氧化硅复合壳聚糖液；
步骤二：环二赖氨和三氟甲基1,2环氧十二烷按照1:6的摩尔比混合，并加入过量的甲醇，于80℃下反应，最后旋蒸，得到类酯产物；
步骤三：随后将类酯产物、纳米二氧化硅复合壳聚糖液和界面改性剂按照重量比3:5:2复配混合；
步骤四：然后于1250r/min的转速下搅拌35min，搅拌温度为42.5℃，搅拌结束，得到定向递送的siRNA载体。
本实施例的经改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
S01：按重量份数计，将7.5份纳米二氧化硅加入到17份海藻酸钠溶液中，随后再加入2.5份磷酸、2份柠檬酸，先以250r/min的转速搅拌25min，得到纳米二氧化硅复合液；
S02：将纳米二氧化硅复合液中加入纳米二氧化硅复合液总重量7.5％的羟基氨基酸，搅拌混合充分，最后水洗、干燥得到经改性的纳米二氧化硅。
本实施例的海藻酸钠溶液的质量分数为7.5％。
本实施例的羟基氨基酸为丝氨基。
本实施例的壳聚糖溶液的制备方法为：
按重量份数计，将7.5份壳聚糖加入到12.5份去离子水中，随后加入2.5份柠檬酸，搅拌混合充分，得到壳聚糖溶液。
本实施例的搅拌混合充分的转速为750r/min，混合时间为25min。
本实施例的界面改性剂的制备方法为：
S11：将硬脂酸钙加入到研磨机中进行研磨，研磨过15目；
S12：将研磨的硬脂酸钙送入到7.5倍的乙醇溶剂中超声分散处理，处理结束，备用；
本实施例的S11的研磨转速为1000r/min。
本实施例的超声分散的功率为400W，超声时间为15min。
实施例4.
本实施例的一种定向递送的siRNA载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将经改性的纳米二氧化硅、壳聚糖溶液按照重量比1:5进行混合，混合时间为32min，混合转速为600r/min，混合温度为47℃，混合结束，得到纳米二氧化硅复合壳聚糖液；
步骤二：环二赖氨和三氟甲基1,2环氧十二烷按照1:6的摩尔比混合，并加入过量的甲醇，于77℃下反应，最后旋蒸，得到类酯产物；
步骤三：随后将类酯产物、纳米二氧化硅复合壳聚糖液和界面改性剂按照重量比3:5:2复配混合；
步骤四：然后于1100r/min的转速下搅拌32min，搅拌温度为42℃，搅拌结束，得到定向递送的siRNA载体。
本实施例的经改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
S01：按重量份数计，将6份纳米二氧化硅加入到16份海藻酸钠溶液中，随后再加入2份磷酸、2份柠檬酸，先以210r/min的转速搅拌22min，得到纳米二氧化硅复合液；
S02：将纳米二氧化硅复合液中加入纳米二氧化硅复合液总重量6％的羟基氨基酸，搅拌混合充分，最后水洗、干燥得到经改性的纳米二氧化硅。
本实施例的海藻酸钠溶液的质量分数为6％。
本实施例的羟基氨基酸为丝氨基。
本实施例的壳聚糖溶液的制备方法为：
按重量份数计，将6份壳聚糖加入到12份去离子水中，随后加入2份柠檬酸，搅拌混合充分，得到壳聚糖溶液。
本实施例的搅拌混合充分的转速为600r/min，混合时间为22min。
本实施例的界面改性剂的制备方法为：
S11：将硬脂酸钙加入到研磨机中进行研磨，研磨过12目；
S12：将研磨的硬脂酸钙送入到6倍的乙醇溶剂中超声分散处理，处理结束，备用；
本实施例的S11的研磨转速为900r/min。
本实施例的超声分散的功率为360W，超声时间为12min。
实施例5.
本实施例的一种定向递送的siRNA载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将经改性的纳米二氧化硅、壳聚糖溶液按照重量比1:5进行混合，混合时间为38min，混合转速为800r/min，混合温度为52℃，混合结束，得到纳米二氧化硅复合壳聚糖液；
步骤二：环二赖氨和三氟甲基1,2环氧十二烷按照1:6的摩尔比混合，并加入过量的甲醇，于82℃下反应，最后旋蒸，得到类酯产物；
步骤三：随后将类酯产物、纳米二氧化硅复合壳聚糖液和界面改性剂按照重量比3:5:2复配混合；
步骤四：然后于1400r/min的转速下搅拌38min，搅拌温度为43℃，搅拌结束，得到定向递送的siRNA载体。
本实施例的经改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
S01：按重量份数计，将8份纳米二氧化硅加入到18份海藻酸钠溶液中，随后再加入2份磷酸、2份柠檬酸，先以280r/min的转速搅拌28min，得到纳米二氧化硅复合液；
S02：将纳米二氧化硅复合液中加入总量6％的羟基氨基酸，搅拌混合充分，最后水洗、干燥得到经改性的纳米二氧化硅。
本实施例的海藻酸钠溶液的质量分数为8％。
本实施例的羟基氨基酸为丝氨基。
本实施例的壳聚糖溶液的制备方法为：
按重量份数计，将9份壳聚糖加入到4份去离子水中，随后加入3份柠檬酸，搅拌混合充分，得到壳聚糖溶液。
本实施例的搅拌混合充分的转速为500-1000r/min，混合时间为28min。
本实施例的界面改性剂的制备方法为：
S11：将硬脂酸钙加入到研磨机中进行研磨，研磨过18目；
S12：将研磨的硬脂酸钙送入到8倍的乙醇溶剂中超声分散处理，处理结束，备用；
本实施例的S11的研磨转速为1100r/min。
本实施例的超声分散的功率为420W，超声时间为18min。
本发明的创新点在于：壳聚糖溶液以壳聚糖、柠檬酸配合，形成的壳聚糖溶液在与纳米二氧化硅复配改性后，优化纳米二氧化硅的表面性能，便于对类酯产物进一步的结合，同时纳米二氧化硅具有高效的比表面积，能够承载，从而进行高效、精准的定向递送，通过界面改性剂配合后，界面改性剂以硬脂酸钙经过研磨处理，细化粒径，再通过分散后，活性度增强，从而将类酯产品与纳米二氧化硅复合壳聚糖液进一步的高效接触，提高界面性能，优化改进的产品能够提高承载、定向递送效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，通过壳聚糖溶液对纳米二氧化硅复配改性，而后在通过过界面改性剂使类酯产物负载于改性后的纳米二氧化硅上，即获得定向递送的siRNA载体。
2.根据权利要求1所述的定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，
步骤一：将经改性的纳米二氧化硅、壳聚糖溶液按照重量比1:(5-7)进行混合，混合时间为30-40min，混合转速为500-1000r/min，混合温度为45-55℃，混合结束，得到纳米二氧化硅复合壳聚糖液；
步骤二：环二赖氨和三氟甲基1,2环氧十二烷按照1:(6-8)的摩尔比混合，并加入过量的甲醇，于75-85℃下反应，最后旋蒸，得到类酯产物；
步骤三：随后将类酯产物、纳米二氧化硅复合壳聚糖液和界面改性剂按照重量比(3-4):(5-7):2复配混合；
步骤四：然后于1000-1500r/min的转速下搅拌30-40min，搅拌温度为40-45℃，搅拌结束，得到定向递送的siRNA载体。
3.根据权利要求2所述的定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，所述经改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
S01：按重量份数计，将5-10份纳米二氧化硅加入到15-20份海藻酸钠溶液中，随后再加入1-4份磷酸、1-3份柠檬酸，先以200-300r/min的转速搅拌20-30min，得到纳米二氧化硅复合液；
S02：向纳米二氧化硅复合液中加入纳米二氧化硅复合液总重量5-10％的羟基氨基酸，搅拌混合充分，最后水洗、干燥得到经改性的纳米二氧化硅。
4.根据权利要求3所述的定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液的质量分数为5-10％。
5.根据权利要求3所述的定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，所述羟基氨基酸为丝氨基和/或苏氨基。
6.根据权利要求1或2所述的定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的制备方法为：
按重量份数计，将5-10份壳聚糖加入到10-15份去离子水中，随后加入1-4份柠檬酸，搅拌混合充分，得到壳聚糖溶液。
7.根据权利要求6所述的定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，所述搅拌混合充分的转速为500-1000r/min，混合时间为20-30min。
8.根据权利要求1或2所述的定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，所述界面改性剂的制备方法为：
S11：将硬脂酸钙加入到研磨机中进行研磨，研磨过10-20目；
S12：将研磨的硬脂酸钙送入到其5-10倍质量的乙醇溶剂中超声分散处理，处理结束，备用。
9.根据权利要求8所述的定向递送的siRNA载体的制备方法，其特征在于，所述S11的研磨转速为800-1200r/min；
所述超声分散的功率为350-450W，超声时间为10-20min；
所述超声分散的功率为400W，超声时间为15min。
10.一种权利要求1所述方法制备所得定向递送的siRNA载体，其特征在于：按权利要求1所述方法制备定向递送的siRNA载体。
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