CN115806952A

CN115806952A - 可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体及其制备方法和应用

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Publication number: CN115806952A
Application number: CN202211116546.4A
Authority: CN
Inventors: 舒正玉; 李欢; 贾文敬; 张晨露
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2022-09-14
Filing date: 2022-09-14
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2042-09-14
Also published as: CN115806952B

Abstract

本发明涉及生物技术和绿色化工领域，具体公开了一种可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶（MsAcT）突变体及其制备方法和应用。所述MsAcT突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明制备的MsAcT突变体对氧化氢的亲和力较野生型MsAcT提高了50倍，可高效催化芳樟醇的环氧化，产业化前景良好。

Description

可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和绿色化工领域，尤其是涉及一种可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

过氧乙酸（Peracetic acid，PAA），化学式为CH3COOOH。作为一种重要的化工原料，过氧乙酸可作为漂白剂应用于纺织品及造纸制浆的漂白工艺中；可作为氧化剂应用于有机合成中；可作为灭菌剂应用于对被病菌病毒污染的医疗器械及医疗废水的灭菌处理。过氧乙酸作为灭菌剂具有广谱高效的特点，对包括细菌、真菌、芽孢和病毒等在内的微生物均具有较强的灭菌作用，因此，还被广泛应用于对畜牧养殖业饲养场地的消毒。全世界每年市场销售额逾6亿美元。

过氧乙酸当前的主流生产工艺为化学合成法：即以浓硫酸作为强氧化剂，以过氧化氢和乙酸（或乙酸酯等）作为原料，合成过氧乙酸。该生产工艺中，浓硫酸和过氧化氢为强氧化剂，有强烈的腐蚀性，因此对生产设备具有较高的要求；同时，该生产工艺存在严重的安全隐患（浓硫酸属于危险品类化学试剂；特别是过氧乙酸在浓度大于70%（v/v）时容易***）。稀释后的低浓度过氧乙酸又极不稳定，货架半衰期短。在未加稳定剂的情况下，低浓度的过氧乙酸两个月内浓度将下降超过20%；常用的稳定剂，又多为有毒化合物（如致癌物8-羟基喹啉等）。为克服过氧乙酸贮存和运输过程中的困难，市场零售的过氧乙酸产品，常采用原位合成法。即销售商提供两种溶液（溶液Ⅰ和溶液Ⅱ），分别含有一定浓度的硫酸/过氧化氢和乙酸酯，由客户按照需要自行以一定比例混合，从而制备出低浓度的过氧乙酸。这种合成工艺，难以实现标准化生产，产品质量也难以控制，导致其应用效果受到很大的消极影响。

酶法制备过氧乙酸是利用某些生物催化剂的过水解活性，即在常温常压下，催化乙酸乙酯（或乙酸等）与过氧化氢反应，合成过氧乙酸的催化活性（反应式如下）。在酶蛋白作用下，推动反应向右进行合成过氧乙酸的催化活性，即为过水解活性。

过氧乙酸是一种强氧化剂，其对酶蛋白稳定性产生消极影响，因此过氧乙酸的酶法合成反应常常与过氧乙酸的原位化学氧化反应（In Situ Chemical Oxidation，ISCO）相串联：即将待氧化处理的还原剂（或合成反应中的还原性底物）同时加入到酶法制备过氧乙酸的反应体系中，过氧乙酸一旦生成就立即与反应体系中的还原性物质（如合成反应中含烯键或炔键的原料；印染废水中的染料；医疗废水中的病原微生物等）发生反应而被消耗。酶法合成过氧乙酸—过氧乙酸原位化学氧化串联的生产工艺，反应条件温和，反应过程易于控制，不仅能实现标准化生产，而且过氧乙酸的产率和产量均可精准调控；合成的过氧乙酸在原位即可进行氧化反应而被消耗掉，因而不会出现***等情形。作为一种绿色生产工艺，该工艺已成功应用于纤维素的预处理、木质素的降解、纸浆漂白、油脂深加工（环氧化）、印染物的漂白脱色、洁牙、污水处理、消毒等诸多领域，并表现出良好的应用效果。

在已发现的各种具有过水解催化活性的酶蛋白中，仅耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)产生的酰基转移酶(Acyl transferase)（本申请材料中缩写为MsAcT）的P/H值大于1（即催化过水解反应的速率（P）大于催化水解反应的速率(H)）。MsAcT是到目前为止，已发现的过水解活性最高的酶蛋白，其催化过水解反应的反应速率是脂解酶的50倍。MsAcT催化过氧乙酸合成-过氧乙酸原位化学氧化串联反应工艺，可以解决产物过氧乙酸（强氧化剂）对酶蛋白稳定性产生的消极影响。但反应体系中，依然存在另外一种强氧化剂：底物过氧化氢。过水解活性是MsAcT蛋白的多功能活性（Promiscuousactivity），MsAcT对过氧化氢的亲和力较小，因此反应体系中必须存在高浓度的过氧化氢，才能推动串联反应向合成过氧乙酸的方向高效进行（实际使用过程中，过氧化氢的浓度常常大于10 mmol/L）。如何有效解决反应体系中高浓度过氧化氢对酶蛋白稳定性产生的消极作用，科技工作者尝试了多种方法：(1)利用蛋白质工程技术提高酶蛋白对过氧化氢的耐受性。但考虑到①过氧化氢对蛋白质多肽链中的多种氨基酸残基(如甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸等)、二硫键等均有破坏作用；影响蛋白质的二级结构或高级结构的构象；②对某些合成反应而言，反应体系中存在的高浓度过氧化氢，将严重影响体系中其他化合物（底物、中间产物或终产物）的稳定性。因此，本策略的应用效果和范围还存在一定的局限性。（2）建立过氧化氢的合成反应与消耗反应串联的反应工艺。众所周知的辣根过氧化物酶酶活分析方法和胆固醇氧化酶酶活分析方法，均应用到了此串联反应（即利用葡萄糖氧化酶催化产生的过氧化氢，分别作为辣根过氧化物酶或胆固醇氧化酶的底物）。双（多）酶催化的串联反应工艺，可最大限度地降低不稳定或具有毒副作用的中间产物对酶蛋白产生的消极作用。

利用葡萄糖氧化酶(GOD)与耻垢分枝杆菌酰基转移酶(MsAcT)偶联，催化葡萄糖和乙酰乙酸酯转化为过氧乙酸。过氧乙酸可原位氧化某些化合物的脱色、杀菌、某些烯烃的环氧化等。该偶联工艺，可应用于美白等日化产品、有机合成、医疗用品的消毒、污水处理等领域。具体技术路线如下：

。

然而，在上述工艺路线中，由于耻垢分枝杆菌酰基转移酶对过氧化氢的亲和力较低，因此为维持该催化工艺的高效运行，反应体系中需要加入大量的葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶与耻垢分枝杆菌酰基转移酶的酶活比例需要达到50:1。而过量使用葡萄糖氧化酶，一方面增加了该工艺的运行成本；另外一方面，反应体系中将积累过量的过氧化氢，同样会致酶蛋白变性失活，影响该反应体系的操作稳定性。

因此，为了更好地优化上述偶联催化体系，需要利用蛋白质工程技术，改良MsAcT蛋白，提高其对过氧化氢的亲和力，降低偶联体系中葡萄糖氧化酶与耻垢分枝杆菌酰基转移酶的酶活比例。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供了一种对过氧化氢具有高亲和性的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln，所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提供了一种编码上述的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

本发明MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln还提供了一种包含上述编码耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的基因的重组载体。

本发明还提供了一种包含上述重组载体的重组菌株。

本发明还提供了一种获得上述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的方法，具体为通过定点突变获得所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln。

本发明还提供了一种上述的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的应用，具体为将所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser54Ile/Leu119Gln应用在葡萄糖氧化酶的偶联反应中。

本发明还提供了另一种上述的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser54Ile/Leu119Gln的应用，具体为将所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser54Ile/Leu119Gln应用在芳樟醇的合成中。

本发明的显著优点在于：

1、本发明提供的MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln对过氧化氢的亲和力较野生型MsAcT提高了50倍；

2、最优GOD-MsAcT偶联体系中的葡萄糖氧化酶与耻垢分枝杆菌酰基转移酶的酶活比例，较GOD-MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln偶联体系中的酶活比例，由50:1降低到5:1；

3、本发明利用优化后的GOD-MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln偶联体系，可以高效催化芳樟醇的环氧化。

附图说明

图1：重组表达质粒 pET28a-act及其基因表达盒。

图2：MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln蛋白质的3D结构及其突变氨基酸残基在蛋白质3D结构上的位置。

图3：不同浓度的GOD和0.015 U·mL^-1 MsAcT或突变体在40分钟内消耗MCD的摩尔浓度。a-h：相同字母标示的实验组之间无显著性差异。A：U_GOD:U_{MsAcT/mutants}=1:1；B：U_GOD:U_{MsAcT/mutants}=5:1；C：U_GOD:U_{MsAcT/mutants}=10:1；D：U_GOD:U_{MsAcT/mutants}=50:1；1：GOD-MsAcT cacadesystem；2：GOD-MsAcT-L¹¹⁹Q cacade system；3：GOD-MsAcT-S⁵⁴I cacade system；4：GOD-MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q cacade system。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1：对过氧化氢亲和力提高的MsAcT蛋白潜在突变热点位点的筛选

步骤（1）：基于已解析的MsAcT蛋白的3D结构，确定活性中心关键氨基酸残基

对MsAcT蛋白3D结构深入分析，确定其活性中心关键结构部位的氨基酸残基组成，分别为：距离MsAcT蛋白活性中心催化三联体Ser¹¹侧链羟基氧原子12Å范围内的氨基酸残基（Gly⁹，Asp¹⁰，Leu¹²，Thr¹³，Trp¹⁴，Gly¹⁵，Trp¹⁶，Val¹⁷，Pro¹⁸，Gly²²，Ala²³，Thr²⁵，Glu²⁶，Arg²⁷，Gly⁵²，Leu⁵³，Ser⁵⁴，Ala⁵⁵，Arg⁵⁶，Thr⁵⁷，Leu⁶⁸，Met⁹⁰，Leu⁹¹，Gly⁹²，Thr⁹³，Asn⁹⁴，Asp⁹⁵，Thr⁹⁶，Lys⁹⁷，Pro¹³⁹，Leu¹⁴²，Thr¹⁸⁸，Gly¹⁹⁰，Asp¹⁹²，Gly¹⁹³，Ile¹⁹⁴，His¹⁹⁵和Phe¹⁹⁶）；活性中心底物结合口袋的氨基酸残基（Val¹⁷，Pro¹⁸，Val¹⁹，Glu²⁰，Asp²¹，Gly²²，Ala²³，Pro²⁴，Thr²⁵，Glu²⁶，Arg²⁷，Asn⁵⁹，Ile⁶⁰，Asp⁶¹，Asp⁶²，Pro⁶³，Thr⁶⁴，Asp⁶⁵，Pro⁶⁶，Arg⁶⁷，Leu⁶⁸，Asn⁶⁹，Leu¹⁴²，Ala¹⁴³，Pro¹⁴⁴，Met¹⁴⁵，Pro¹⁴⁶，His¹⁴⁷，Pro¹⁴⁸，Trp¹⁴⁹，Phe¹⁵⁰，Gln¹⁵¹，Leu¹⁵²，Ile¹⁵³，Phe¹⁵⁴，Glu¹⁵⁵，Gly¹⁵⁶，Ala¹²²，Gly¹²³，Gly¹²⁴，Val¹²⁵，Gly¹²⁶，Thr¹²⁷，Thr¹²⁸，Tyr¹²⁹，Pro¹³⁰）；活性中心疏水性底物通道的氨基酸残基(Trp¹⁶，Ala²³，Pro²⁴，Ala⁵⁵，Trp¹⁴⁹，Phe¹⁵⁰，Ile¹⁵³，Phe¹⁵⁴，Ala¹²²，Gly¹²³，Gly¹²⁴，Val¹²⁵，Gly¹²⁶，Leu¹⁰⁵，Leu¹⁰⁹，Thr¹¹⁶，Val¹¹⁸，Leu¹¹⁹，Phe¹⁷⁴，Met¹⁷⁵和Val¹⁷⁷)。合并上述氨基酸残基，组成候选突变位点文库。

步骤（2）：MsAcT祖先蛋白的推断及突变位点的进一步筛选

以MsAcT的蛋白质多肽链氨基酸序列为原始出发序列（SEQ ID NO.3），从NCBI非冗余蛋白序列（Non-redundant protein sequences）数据库中，检索其同源蛋白质序列（Position-Specific lterated BLAST，PSI-BLAST）；对搜索到的同源序列，利用CD-HIT软件中去除序列相似性超过80%的序列；剩余序列利用Mega构建***发育树；继而利用FastML在线服务器（http://fastml.tau.ac.il/）获得系列MsAcT蛋白的祖先蛋白序列（共11条多肽链）。

上述获得的11条MsAcT蛋白的祖先蛋白序列，与MsAcT蛋白的多肽序列，利用BioEdit软件进行序列比对分析，筛选出差异性的位点及其对应的氨基酸残基。筛选结果如下：

表1：初步筛选出的MsAcT突变热点

步骤（3）：MsAcT蛋白突变位点的确定

比较步骤(1)和步骤(2)获得的MsAcT蛋白活性中心关键氨基酸残基位点及类型和MsAcT突变热点，取上述两个分析数据的交集，最终筛选出10个突变位点，分别为E²⁶T、S⁵⁴N、A⁵⁵G、I⁶⁰V、R¹⁰¹N、R¹⁰¹H、L¹⁰⁵F、L¹⁰⁹T、T¹¹⁶G和L¹¹⁹Q。后续将利用基因工程手段，构建MsAcT突变体。

实施例2：MsAcT蛋白候选突变体编码基因的构建

以携带MsAcT蛋白编码基因act（SEQ ID NO.4）的质粒pET28a-act作为模板（质粒pET28a-act的图谱见图1），以表2中的引物对作为引物，进行PCR扩增，实现对MsAcT蛋白的相应位点分别进行定点突变。PCR扩增体系为：无菌ddH₂O 10.8 µL，4 µL 5×PrimeSTARBuffer (Mg²⁺ Plus)，2 µL dNTP Mixture (2.5 mmol·L^-1)，0.2 µL PrimeSTAR HS DNAPolymerase (2.5 U·µL^-1)，10 µm·L^-1的上、下游引物各1 µL，1 U·µL^-1pET28a-act模板（30-50 ng）。PCR扩增体系的运行程序为：94℃进行5 min；94℃下反应30 s；以表2中退火温度退火30 s；72℃下反应6.05 min；步骤2、3、4循环25次；在72℃下终延伸7 min。

表2 PCR扩增引入突变氨基酸残基的引物对及其退火温度

将PCR产物取2 µL进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定后，将剩余的PCR产物按每17.5 µL加入2 µL 10×QuickCut Buffer以及0.5 µL QuickCut™ DpnІ过夜酶切12 h。实验组酶切产物全部进行琼脂糖凝胶电泳，随后利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒胶回收实验组目标PCR产物。

实施例3：MsAcT蛋白及其突变体的功能验证

（1）MsAcT蛋白及其突变体对过氧化氢亲和力的酶学动力学参数的测定

将上述经DpnІ酶切并纯化后的PCR扩增产物，转入E. coli BL21 (DE₃)感受态细胞。经测序验证正确后，将携带突变基因的重组菌株，利用IPTG诱导目标基因表达；离心收集重组菌株、超声裂解菌体、离心收集裂解液上清液；利用亲和色谱柱分离纯化目标蛋白；对收集到的电泳纯的重组蛋白，分别测定其对过氧化氢的酶学动力学常数。实验结果如表3。从表3可以看出，筛选出来的突变体对过氧化氢的亲和力均有不同程度的提高（K _m均有不同程度的降低）。其中，MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q表现出的突变效应最为理想。MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q的的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其3D结构如图2所示。

表3 MsAcT及其突变体对过氧化氢亲和性的酶动力学参数

（2）野生型MsAcT及其突变体MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q分别与GOD偶联催化效果比较

按照酶活比为1:1、5:1、10:1、50:1的比例，构建GOD与MsAcT突变体MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q的偶联体系。体系总体积为3 mL，包含终浓度为15 mmol·L^-1三乙酸甘油酯，终浓度为50 mmol·L^-1葡萄糖，终浓度为150 mmol·L^-1 溴化钠，以及终浓度为94 μmol·L^-1 MCD，加入的过水解酶（MsAcT或其突变体）酶活均为0.015 U·mL^-1，在不同酶活比下测定GOD与MsAcT及突变体级联体系单位时间消耗MCD的摩尔浓度。偶联催化体系实验结果见图3。从图3可以看出，GOD-MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q偶联***中， GOD与MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q的酶活比例仅为5:1时就可以达到GOD-MsAcT偶联体系中酶活比例为50:1的催化效果。

实施例3：GOD-MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q偶联***催化芳樟醇的环氧化工艺

在GOD-MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q酶活单位比为5:1的比例下构建GOD与MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q的偶联体系。偶联催化体系总体积为1 mL，包含终浓度为15 mmol·L^-1三乙酸甘油酯，终浓度为50 mmol·L^-1葡萄糖，以及终浓度为15 mmol·L^-1芳樟醇，加入的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体酶活为1 U·mL^-1，在Tris-Hcl缓冲液(50 mmol·L^-1, pH8.0)缓冲溶液中，于37℃反应3小时，反应后用800 μL正己烷进行萃取分层，上层液进行GC-MS检测。检测结果见表4。从表4可以看出：GOD-MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q偶联体系可以有效催化芳樟醇的环氧化反应，转化率接近50%。

表4 GOD-MsAcT偶联体系与GOD-MsAcT-S⁵⁴I/L¹¹⁹Q偶联体系催化芳樟醇氧化反应

C(%) = 被氧化的芳樟醇的摩尔浓度*100/初始芳樟醇摩尔浓度

S(%) = 氧化产物成分A的摩尔数*100/被氧化的芳樟醇的摩尔数

Y(%) = 氧化产物成分A摩尔数*100/初始芳樟醇的摩尔数

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种对过氧化氢具有高亲和性的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln，其特征在于：所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包含权利要求2所述基因的重组载体。

4.包含权利要求3所述重组载体的重组菌株。

5.获得权利要求1所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的方法，其特征在于：通过定点突变获得所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln。

6.权利要求1所述的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的应用，其特征在于：将所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln应用在葡萄糖氧化酶的偶联反应中。

7.权利要求1所述的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln的应用，其特征在于：将所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT-Ser⁵⁴Ile/Leu¹¹⁹Gln应用在芳樟醇的合成中。