CN115804762B - 一种巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒、制备方法及应用 - Google Patents
一种巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒、制备方法及应用，属于药物制剂技术领域，该靶向纳米粒包括内核和包被在内核外面的M1型巨噬细胞膜；所述内核为药物纳米粒或药物脂质纳米粒，药物选自***拮抗剂和/或***合成抑制剂。该靶向纳米粒利用CCL2‑CCR2机制的天然靶向功能，靶向输送***拮抗剂和/或***合成抑制剂至异位子宫内膜病灶处，发挥局部拮抗***作用或局部降低***水平的功能，拮抗***对异位子宫内膜的生长促进作用，使异位内膜萎缩、坏死，达到治疗子宫内膜异位症的目的。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒、制备方法及应用。
背景技术
子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔以外的身体部位，如腹腔、卵巢等，是一种严重影响妇女身心健康和生活质量的妇科常见病，育龄妇女的发病率超过20％。临床表现有***、慢性盆腔疼痛、痛经、***等，是一种良性病变，但具有种植、转移、浸润和复发等恶性生物学行为，严重影响患者的生活质量，也是困扰患者和医生的难治之症。
目前临床上主要是采取手术和药物治疗子宫内膜异位症，手术切除异位内膜不能彻底根除疾病，仅能减轻患者症状，同时还会引起泌尿道、肠道、血管部位的并发症，且术后疼痛和异位内膜病灶的复发率依然非常高。
药物治疗在子宫内膜异位症的长期治疗中占主导地位，其中激素相关疗法是公认的有效治疗手段。异位内膜呈现局部高***状态，***可刺激异位内膜细胞增殖、促进异位子宫内膜的生长，加速子宫内膜异位症的进展。公认有效的激素疗法是通过降低患者***水平治疗子宫内膜异位症，采用的是性激素抑制治疗。通过降低患者全身的***水平，使异位子宫内膜萎缩、退化、坏死，达到治疗子宫内膜异位症的目的。然而，血液***水平降低，干扰全身激素依赖器官的生理机能，副作用明显，可出现潮热、盗汗、***干燥、恶心、头痛等血管舒缩症状及不可逆的骨丢失等不良反应。长期低***血症，会引起原始卵泡减少，卵泡闭锁，引起卵巢功能受损，导致***，同时也会引致骨质疏松和血脂代谢异常等症状，影响患者的生活质量。
此外，公开号为CN106539790A的中国专利文献公开了一种治疗子宫内膜异位症的化合物，该化合物的结构如下式所示：
该化合物主要可以改善盆腔局部血液循环，缓解盆腔粘连，调节其紊乱的细胞免疫功能，改善自身免疫反应的存在和异常，但是只能对子宫内膜异位症起到缓解作用；公开号为CN103169918A、CN104083551A等中国专利文献还公开了治疗子宫内膜异位症的中药组合物，但是其治疗机理尚不明确，疗效有待进一步验证。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒，该纳米粒利用CCL2-CCR2机制的天然靶向功能，靶向输送药物至异位子宫内膜病灶处，降低局部***水平，能够在不降低患者生活质量的情况下实现子宫内膜异位症的治疗。
具体采用的技术方案如下：
一种巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒，包括内核和包被在内核外面的M1型巨噬细胞膜；所述内核为药物纳米粒或药物脂质纳米粒，药物选自***拮抗剂和/或***合成抑制剂。
M1型巨噬细胞高表达趋化因子受体CCR2，异位子宫内膜高表达趋化因子配体CCL2，通过CCL2-CCR2机制，招募CCR2高表达的细胞向异位内膜部位移动，M1型巨噬细胞膜包覆药物纳米粒或药物脂质纳米粒后，可靶向输送药物至异位子宫内膜，发挥天然靶向性。
M1型巨噬细胞由M0型巨噬细胞诱导分化得到，M1型巨噬细胞膜提取自M1型巨噬细胞；可选的，M1型巨噬细胞由小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7经脂多糖刺激诱导分化形成。
内核可以是单独的所述药物组成的纳米粒，也可以是所述药物经脂质包封形成的药物脂质纳米粒，优选的，药物与脂质的重量比为1：4-10。
所述脂质包括单甘酯、卵磷脂、硬脂酸中至少一种，优选的，脂质中，单甘酯、卵磷脂和硬脂酸的质量比为1-10：0-5：0-10。
优选的，药物纳米粒或药物脂质纳米粒的粒径为50-200nm。
***拮抗剂通过拮抗异位子宫内膜部位的***的作用，发挥治疗作用，优选巴多昔芬；***合成抑制剂，通过抑制异位子宫内膜部位的***合成，降低局部***水平，发挥治疗作用，优选阿那曲唑。
优选的，M1型巨噬细胞膜中总蛋白与药物的质量比为1：0.1-1，上述参数下载药量为5％-50％，可以有效实现子宫内膜异位症模型小鼠的体内靶向。
本发明还提供了所述巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将所述药物或者所述药物与脂质的混合物通过沉淀法制备得到药物纳米粒或药物脂质纳米粒；
(2)将M1型巨噬细胞膜与药物纳米粒，或M1型巨噬细胞膜与药物脂质纳米粒通过超声法、挤出法或微流控方法制备得到巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒。
优选的，药物纳米粒的制备方法为：将阿那曲唑溶于乙醇，配成浓度10-50mg/ml的药物溶液，60℃加热搅拌条件下，将阿那曲唑的乙醇溶液快速注入到10倍体积的水中，持续搅拌0-5min，冷却至室温，得到药物纳米粒。
优选的，药物脂质纳米粒的制备方法为：将巴多昔芬与脂质按照一定比例在加热条件下溶于乙醇，60℃加热搅拌条件下，将巴多昔芬和脂质的乙醇溶液快速注入到10倍体积的水中，持续搅拌0-5min，冷却至室温，得到药物脂质纳米粒。
本发明还提供了所述巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒在制备用于治疗子宫内膜异位症的药物制剂中的应用。
优选的，所述用于治疗子宫内膜异位症的药物制剂为注射制剂，使用剂量为1.5mg/kg。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明采用异位子宫内膜靶向的M1型巨噬细胞膜，利用其CCL2-CCR2机制的天然靶向功能，靶向输送***受体拮抗剂巴多昔芬或***合成酶抑制剂阿那曲唑至异位子宫内膜病灶处，发挥局部拮抗***作用或局部降低***水平的功能，拮抗***对异位子宫内膜的生长促进作用，使异位内膜萎缩、坏死，达到治疗子宫内膜异位症的目的。本发明避开了现有下丘脑-垂体-卵巢轴的全身激素疗法，避免了全身激素疗法带来的全身性的激素水平变化带来的副作用，提高了患者的生活质量。
附图说明
图1为巨噬细胞膜囊泡和巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒的透射电镜图，其中，A为M0-CNVs，B为M1-CNVs，C为M1-CNVs/BAZ-SLN。
图2为Ishikawa细胞对迁移的M0-CNVs和M1-CNVs的摄取荧光照片。
图3为Dil标记的脂质纳米粒SLN、M0-CNVs和M1-CNVs在子宫内膜异位症模型动物的体内荧光分布图。
图4为巴多昔芬实验组与对照组对模型细胞的生长抑制图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1M1型巨噬细胞膜的制备
采用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7细胞，培养液中加入100ng/mL脂多糖与细胞共孵育12h，诱导形成M1型巨噬细胞。将诱导的M1型巨噬细胞和未经诱导的M0型巨噬细胞，分别用细胞刮刀刮下并重悬于低渗溶液中，置于液氮罐和37℃水浴锅中反复冻融3次，10000g离心20min，弃去沉淀，收集上清；上清液超速离心100000g 1h，收集沉淀；PBS重悬后100000g离心，重复两次。PBS重悬，分别得到M0型和M1型巨噬细胞膜。Bradford蛋白定量试剂盒测定收集细胞膜的蛋白浓度，分别为6.9mg/ml和7.7mg/ml。
将收集的巨噬细胞膜使用脂质体挤出器分别经过400nm、200nm滤膜反复挤出20次，分别得到M0型巨噬细胞膜囊泡(M0-CNVs)和M1型巨噬细胞膜囊泡(M1-CNVs)，制备样品，磷钨酸染色，透射电镜观察，形态分别如附图1中的A和B所示，制备样品干燥后，无立体形态，因此电镜中并未呈球形，而是不规则型；电镜观察纳米囊泡的粒径约50nm。
实施例2巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒的制备
阿那曲唑溶于乙醇，得到10mg/ml的药物溶液，采用水性溶剂扩散法，60℃加热搅拌条件下，将阿那曲唑的乙醇溶液快速注入到10倍体积的水中，持续搅拌，冷却至室温，制备得到阿那曲唑纳米粒混悬液。
将实施例1制得的M1型巨噬细胞膜与阿那曲唑纳米粒混悬液按照细胞膜中总蛋白与药物质量比1:1充分混合，使用冰水浴超声400w，60次，2s/次，制备得到巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒(M1-CNVs/ANA)。
实施例3巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒的制备
巴多昔芬溶于乙醇，加入巴多昔芬10倍质量的单甘酯，得到巴多昔芬浓度10mg/ml的巴多昔芬和脂质的混合溶液，60℃加热混合均匀，采用水性溶剂扩散法，将巴多昔芬和脂质的混合溶液注入到60℃的热水中，持续搅拌，冷却至室温，制备得到巴多昔芬脂质纳米粒混悬液。
将实施例1制得的M1型巨噬细胞膜与巴多昔芬脂质纳米粒混悬液按照细胞膜中总蛋白与药物质量比1:1充分混合，使用冰水浴超声400w，60次，2s/次，制备得到载有巴多昔芬脂质纳米粒的巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒(M1-CNVs/BAZ-SLN)，如图1中的C所示，纳米粒呈类圆形，粒径约为50-200nm，有立体结构，可能与细胞膜包覆了巴多昔芬脂质纳米粒有关，药物脂质纳米粒起到支撑作用，有立体形态。
实施例4巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒的制备
本实施例与实施例2的区别仅在于，将实施例1制得的M1型巨噬细胞膜与阿那曲唑纳米粒混悬液按照细胞膜中总蛋白与药物质量比1:0.1充分混合，制备得到巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒(M1-CNVs/ANA)。
实施例5巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒的制备
本实施例与实施例3的区别仅在于，巴多昔芬脂质纳米粒的制备过程中，药物与脂质的重量比为1:5；巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒的制备过程中，将实施例1制得的M1型巨噬细胞膜与巴多昔芬脂质纳米粒混悬液按照细胞膜中总蛋白质与药物质量比1:0.2充分混合，制备得到载有巴多昔芬脂质纳米粒的巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒(M1-CNVs/BAZ-SLN)。
实施例6体外模型测定M1-CNVs的异位子宫内膜靶向性
采用膜孔径0.4μm的Transwell小室，下室种植子宫内膜癌Ishikawa细胞，细胞贴壁后，添加浓度为200μg/L的CCL2趋化因子，上室加入Dil标记的M1-CNVs，放入细胞培养箱，0.5h、1h和4h后，甲醛固定细胞，Hoechst 33342对细胞核染色，激光共聚焦显微镜观察M0-CNVs和M1-CNVs的转移。结果如图2所示，M1-CNVs组迁移到小室下方的荧光强度高于M0-CNVs，表明M1-CNVs在CCL2的趋化作用下，可主动迁移，具有靶向性。
实施例7M1-CNVs的子宫内膜异位症模型小鼠靶向分布研究
子宫内膜异位症模型动物建立：雌性成年小鼠，戊巴比妥钠麻醉，取右下腹开腹行手术，距子宫交接处0.5cm外切断右侧子宫，纵向切开后再切成4块等长片段，浸泡于DMEM/12培养液中。其中两片子宫内膜对腹膜面缝合于小鼠右侧腹膜，自腹部切口处向左侧皮下各放一块子宫内膜小片，常规手术关腹。3周后小鼠皮下和腹膜出现种植结节，镜下组织学观察，若结节内均含有子宫内膜腺体及间质，其形态和在位内膜一致，则建模成功。
细胞膜红外荧光探针DiR标记M1-CNVs、M0-CNVs和空白脂质纳米粒SLN，尾静脉注射入模型动物体内，采用小动物活体成像仪，观察不同时间模型动物全身的荧光分布情况。激发波长设置为704nm，发射波长范围为740nm至950nm，滤光片为NIR。48h的模型动物的体内荧光分布图如图3所示，脂质纳米粒和M0-CNVs主要聚集在肝脏部位，M1-CNVs可迁移至子宫内膜的异位病灶处，表明M1-CNVs在体内有病灶趋向性，可主动靶向至异位内膜。
实施例8M1-CNVs/BAZ-SLN的子宫内膜异位症模型细胞药效研究
原代的异位子宫内膜细胞提取和培养困难，而子宫内膜癌Ishikawa细胞为体外永生化的子宫内膜癌细胞，高表达***受体，***可刺激Ishikawa快速增殖。因此，采用子宫内膜癌Ishikawa细胞体外模拟原代的异位子宫内膜细胞，考察巴多昔芬脂质纳米粒BAZ-SLN、M0-CNVs/BAZ-SLN和实施例3的M1-CNVs/BAZ-SLN对异位子宫内膜细胞的生长抑制作用。
取对数生长期的Ishikawa细胞，按照1万个细胞每孔的密度接种于96孔板中，细胞培养箱中，37℃孵育过夜，使细胞贴壁。设置组别：空白组、***组、***+巴多昔芬脂质纳米粒BAZ-SLN、***+M0-CNVs/BAZ-SLN、***+M1-CNVs/BAZ-SLN，***浓度为2μg/ml,巴多昔芬的浓度为10μmol/L，每个样品三个复孔。加入药物后，细胞在细胞培养箱中继续培养24h。加入10mg/ml的MTT溶液20μL/孔，继续孵育4h，弃去培养液，二甲基亚砜溶解紫色沉淀，利用酶标仪560nm下测定吸光度。比较不同组别细胞的生长情况，结果如图4所示，巴多昔芬脂质纳米粒BAZ-SLN、M0-CNVs/BAZ-SLN、M1-CNVs/BAZ-SLN均可拮抗***对模型细胞Ishikawa促进生长作用，发挥拮抗***的功能。
以上所述实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒，其特征在于，包括内核和包被在内核外面的M1型巨噬细胞膜；所述内核为药物纳米粒或药物脂质纳米粒，药物选自***拮抗剂和/或***合成抑制剂；所述***拮抗剂为巴多昔芬；所述***合成抑制剂为阿那曲唑；
M1型巨噬细胞膜中总蛋白与药物的质量比为1：0.1-1。
2.根据权利要求1所述巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒，其特征在于，M1型巨噬细胞由M0型巨噬细胞诱导分化得到，M1型巨噬细胞膜提取自M1型巨噬细胞。
3.根据权利要求1所述巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒，其特征在于，药物脂质纳米粒由所述药物经脂质包封形成，药物与脂质的重量比为1：4-10。
4.根据权利要求1所述巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒，其特征在于，药物纳米粒或药物脂质纳米粒的粒径为50-200nm。
5.根据权利要求1-4任一所述巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述药物或者所述药物与脂质的混合物通过沉淀法制备得到药物纳米粒或药物脂质纳米粒；
(2)将M1型巨噬细胞膜与药物纳米粒，或M1型巨噬细胞膜与药物脂质纳米粒通过超声法、挤出法或微流控方法制备得到巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒。
6.根据权利要求1-4任一所述巨噬细胞膜包覆的异位子宫内膜靶向纳米粒在制备用于治疗子宫内膜异位症的药物制剂中的应用。
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