CN115803454A - 空间转录组学转移模式 - Google Patents
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Abstract
本文提供用于利用电泳分析物转移模式确定生物样品中一种或多种分析物的位置的方法和***。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月4日提交的美国临时专利申请第63/019,719号的优先权。该申请的全部内容通过引用方式纳入本文。
背景技术
对象组织内的细胞由于不同细胞内的不同分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)而在细胞形态和/或功能上存在差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响，例如，细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为以及与组织中其它细胞的信号转导和串扰。
空间异质性先前被研究过，所述研究使用的技术仅提供完整组织或部分组织中的少量分析物的数据，或提供单细胞的大量分析物数据，但无法提供有关单细胞在亲本生物样品(例如，组织样品)中位置的信息。
主动捕获方法，例如电泳，有助于空间捕获生物样品中的分析物。可以使生物样品中存在的分析物能够被多组学评估的方式实现通过主动捕获方法进行的分析物空间捕获。
发明内容
主动捕获方法，例如电泳，有助于空间捕获生物样品中的分析物。可以使生物样品中存在的分析物能够被多组学评估的方式实现通过主动捕获方法进行的分析物空间捕获。本公开的特征在于，用于空间捕获一种或多种半多孔材料中的分析物的方法，这些材料可以即刻或后续被进一步处理。
因此，本文提供了用于确定生物样品中一种或多种分析物的位置的方法，所述方法包括：提供包括多个捕获探针的阵列，其中多个捕获探针中的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获域；提供一种或多种半多孔材料，其中一种或多种半多孔材料设置在生物样品和阵列之间；向生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿阵列的方向迁移，其中捕获探针的捕获域能特异性结合至一种或多种分析物中的第一分析物；和，确定(i)空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置。
在一些实施方式中，捕获探针还包括以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。在一些实施方式中，第一分析物是mRNA。
在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的图像。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料中的第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料包括多个分析物结合部分，其中多个中的分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第二分析物中的第二分析物。
在一些实施方式中，分析物结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，第二分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，所述方法包括确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置。在一些实施方式中，确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括使用免疫荧光染色。在一些实施方式中，确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括：获得第一半多孔材料的图像，并将第一半多孔材料的图像中的免疫荧光染色与生物样品的图像相关联。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括第二半多孔材料，其中第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第二半多孔材料包括针对一种或多种第三分析物的多个分析物结合部分。在一些实施方式中，多个分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第三分析物中的第三分析物。在一些实施方式中，第三分析物是核酸。在一些实施方式中，核酸是miRNA。在一些实施方式中，所述方法包括确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置。在一些实施方式中，确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置包括使用原位杂交。在一些实施方式中，确定第三分析物的位置包括：获得第二半多孔材料的图像并将第二半多孔材料的图像中的原位杂交与生物样品的图像相关联。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料将一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括水凝胶。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括渗透性膜。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料中的至少一种具有不均匀的孔径。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料中的至少一种具有基本上均匀的孔径。在一些实施方式中，电场被施加到生物样品的离散区域。在一些实施方式中，电场被施加到阵列的离散区域。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括一种或多种基准标志物(fiducial marker)，其将一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对齐。
在一些实施方式中，生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列与缓冲液直接接触。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物至第一半多孔材料。在一些实施方式中，所述方法包括将一种或多种第三分析物与第二半多孔材料交联。在一些实施方式中，所述方法包括在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料。在一些实施方式中，所述方法包括在第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物之后移出第二半多孔材料。
在一些实施方式中，所述方法包括：在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料；和将第二半多孔材料设置于生物样品与阵列之间。
在一些实施方式中，在移出第一半多孔材料并在生物样品和阵列之间布置第二半多孔材料之后施加电场。
在一些实施方式中，第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。在一些实施方式中，所述方法包括固定生物样品的步骤。
在一些实施方式中，所述方法包括使生物样品透化的步骤。
本文还提供了用于确定生物样品中一种或多种分析物的位置的方法，所述方法包括：(a)提供包括多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包括(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；(b)提供半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间；(c)向生物样品、半多孔材料和第一阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿第一阵列的方向迁移，其中第一捕获域能特异性结合至一种或多种分析物的第一分析物，其中半多孔材料保留一种或多种分析物的第二分析物；(d)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置；(e)提供包含多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；(f)向半多孔材料和第二阵列施加电场，其中电场促进第二分析物沿第二阵列的方向迁移，其中第二捕获域能特异性结合至第二分析物；和(g)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定第二分析物在生物样品中的位置。
在一些实施方式中，捕获探针还包括以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。在一些实施方式中，第一分析物是mRNA。
在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的图像。在一些实施方式中，半多孔材料包括一种或多种分析物结合部分。在一些实施方式中，一种或多种分析物结合部分能特异性结合至核酸。在一些实施方式中，其中核酸是miRNA。在一些实施方式中，半多孔材料保留来自生物样品的一种或多种分析物。在一些实施方式中，半多孔材料包括水凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料包括渗透性膜。在一些实施方式中，半多孔材料具有不均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
在一些实施方式中，电场被施加到生物样品的离散区域。在一些实施方式中，电场被施加到第一阵列的离散区域。在一些实施方式中，电场被施加到第二阵列的离散区域。在一些实施方式中，半多孔材料包括一种或多种基准标志物，其将半多孔材料与生物样品的图像对准。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，生物样品、半多孔材料和第一阵列与缓冲液直接接触。在一些实施方式中，在步骤(f)中，半多孔材料和第二阵列与缓冲液直接接触。
在一些实施方式中，所述方法包括将第二分析物与半多孔材料交联。
在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，生物样品是***固定和石蜡包埋的。在一些实施方式中，所述方法包括固定生物样品的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括使生物样品透化的步骤。
本文还提供了用于确定生物样品中一种或多种分析物的位置的方法，所述方法包括：(a)提供包括多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包括(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；(b)提供半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间，其中半多孔材料包括分析物捕获剂，所述分析物捕获剂包含(i)分析物结合部分，(ii)分析物结合部分条形码，和(iii)分析物捕获序列；(c)对生物样品、半多孔材料和第一阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿第一阵列的方向迁移，其中第一捕获域能特异性结合至一种或多种分析物的第一分析物，并且其中分析物结合部分能特异性结合至一种或多种分析物的第二分析物，并且半多孔材料保留第二分析物；(d)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列确定生物样品中第一分析物的位置；(e)提供包括多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包括(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；(f)向半多孔材料和第二阵列施加电场，其中所述电场促进第二分析物沿第二阵列的方向迁移，其中第二捕获域能特异性结合至分析物捕获序列；(g)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)分析物结合部分条形码的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定第二分析物在生物样品中的位置。
在一些实施方式中，第一捕获探针和第二捕获探针之一或两者还包括裂解域、功能域和独特分子标识符中的一个或多个。在一些实施方式中，第一分析物是mRNA。
在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的图像。
在一些实施方式中，分析物捕获剂与半多孔材料交联。在一些实施方式中，第二分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，分析物结合部分包括抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，半多孔材料将一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。在一些实施方式中，半多孔材料包括水凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料包括渗透性膜。在一些实施方式中，半多孔材料具有不均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料具有基本上均匀的孔径。在一些实施方式中，电场被施加到生物样品的离散区域。在一些实施方式中，电场被施加到第一阵列的离散区域。在一些实施方式中，电场被施加到第二阵列的离散区域。
在一些实施方式中，半多孔材料包括一种或多种基准标志物，其将半多孔材料与生物样品的图像对准。
在一些实施方式中，在步骤(c)期间，生物样品、半多孔材料和第一阵列与缓冲液直接接触。在一些实施方式中，在步骤(f)期间，半多孔材料和第二阵列与缓冲液直接接触。
在一些实施方式中，所述方法包括将第二分析物与半多孔材料和分析物捕获剂之一或两者交联。
在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，生物样品是***固定和石蜡包埋的。在一些实施方式中，所述方法包括固定生物样品的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括使生物样品透化的步骤。
此外，本文还提供了***，其包括：(a)包含多个捕获探针的阵列，其中多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域；(b)置于生物样品和阵列之间的一种或多种半多孔材料；和(c)电场，其中电场促进一种或多种分析物沿阵列的方向迁移，其中捕获探针的捕获域能结合至一种或多种分析物的第一分析物。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料中的第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料包括多个分析物结合部分，其中多个分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第二分析物中的第二分析物。在一些实施方式中，分析物结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，第二分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，所述方法包括确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置。在一些实施方式中，所述方法包括确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括免疫荧光染色。
在一些实施方式中，确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括：获得第一半多孔材料的图像，并将第一半多孔材料的图像中的免疫荧光染色与生物样品的图像相关联。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括第二半多孔材料，其中第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第二半多孔材料包括针对一种或多种第三分析物的多个分析物结合部分。在一些实施方式中，多个分析物结合部分中的分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第三分析物中的第三分析物。在一些实施方式中，第三分析物是核酸。在一些实施方式中，核酸是miRNA。
在一些实施方式中，所述方法包括确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置。在一些实施方式中，确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置包括使用原位杂交。在一些实施方式中，确定第三分析物的位置包括：获得第二半多孔材料的图像并将第二半多孔材料的图像中的原位杂交与生物样品的图像相关联。
在一些实施方式中，所述方法包括将一种或多种第三分析物与第二半多孔材料交联。在一些实施方式中，所述方法包括将一种或多种第二分析物与第一半多孔材料交联。在一些实施方式中，所述方法包括在第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物之后移出第二半多孔材料。
在一些实施方式中，所述方法包括：在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料；将第二半多孔材料设置于生物样品与阵列之间。
在一些实施方式中，在移出第一半多孔材料并在生物样品和阵列之间布置第二半多孔材料之后施加电场。
在一些实施方式中，第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
在一些实施方式中，捕获探针还包括以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。
在一些实施方式中，所述方法包括对生物样品进行成像。
在一些实施方式中，第一分析物是mRNA。
在一些实施方式中，半多孔材料包括水凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料包括渗透性膜。在一些实施方式中，半多孔材料具有不均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括一种或多种基准标志物，其将一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对齐。
在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。在一些实施方式中，所述方法包括固定生物样品的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括使生物样品透化的步骤。
在一些实施方式中，第二分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，电场被施加到生物样品的离散区域。在一些实施方式中，电场被施加到阵列的离散区域。在一些实施方式中，生物样品、半多孔材料和阵列与缓冲液直接接触。在一些实施方式中，所述***还包括确定(i)空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并且利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置。
本文还提供了***，其包括：(a)包含多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包含(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；(b)半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间；(c)第一电场，其中第一电场促进一种或多种分析物沿第一阵列的方向迁移，其中第一捕获域能特异性结合至一种或多种分析物的第一分析物，其中半多孔材料保留一种或多种分析物的第二分析物；(d)包含多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包括(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；(e)第二电场，其中第二电场促进第二分析物沿第二阵列的方向迁移，其中第二捕获域能特异性结合至第二分析物；和(f)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，和利用(i)和(ii)的序列来确定第二分析物在生物样品中的位置。
在一些实施方式中，捕获探针还包括以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。在一些实施方式中，第一分析物是mRNA。
在一些实施方式中，该***还包括获得生物样品的图像。
在一些实施方式中，半多孔材料包括水凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料包括渗透性膜。在一些实施方式中，半多孔材料具有不均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括一种或多种基准标志物，其将一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对齐。
在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。在一些实施方式中，所述方法包括固定生物样品的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括使生物样品透化的步骤。
在一些实施方式中，半多孔材料保留来自生物样品的一种或多种分析物。
在一些实施方式中，将第一电场、第二电场或两者施加到生物样品的离散区域。在一些实施方式中，第一电场被施加到第一阵列的离散区域。在一些实施方式中，第二电场被施加到第二阵列的离散区域。
在一些实施方式中，生物样品、半多孔材料和第一阵列与缓冲液直接接触。在一些实施方式中，生物样品、半多孔材料和第二阵列与缓冲液直接接触。在一些实施方式中，半多孔材料将一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。在一些实施方式中，半多孔材料包括一种或多种分析物结合部分。
在一些实施方式中，一种或多种分析物结合部分能结合核酸。在一些实施方式中，核酸是miRNA。在一些实施方式中，分析物结合部分与半多孔材料交联。
在一些实施方式中，半多孔材料包括一种或多种分析物捕获剂。在一些实施方式中，一种或多种分析物捕获剂包括(i)分析物结合部分，(ii)分析物结合部分条形码，和(iii)分析物捕获序列。在一些实施方式中，第二分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，分析物捕获剂与半多孔材料交联。
在一些实施方式中，分析物结合部分包括抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，分析物结合部分条形码识别分析物捕获剂。在一些实施方式中，分析物捕获序列结合第二捕获探针的第二捕获域。
在一些实施方式中，该***还包括：(a)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置；和(b)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)分析物结合部分条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第二分析物的位置。
本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利、专利申请或信息条目专门和单独地通过引用纳入本文那样。对于通过引用纳入的出版物、专利、专利申请和信息项目与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。
在以范围来描述值的情况下，应当理解的是，该描述包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及在该范围内的特定数值的公开，而不管是否明确地说明了特定数值或特定子范围。
术语“每个”提及一组物品时，意在鉴别该集合中的一个单独物品，但不一定指该集合中的每一项物品，除非另有明确说明，或除非用法的上下文另有明确说明。
本文描述了本发明的特征的各种实施方式。然而，应当理解，这些实施方式仅作为示例提供，并且在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以作出许多变化、改变和替换。还应理解，本文所描述的特定实施方式的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图说明了本发明的特征和优点的某些实施方式。这些实施方式无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中的相同附图标记表示相同的元素。
图1是示出如本文所述的条码化捕获探针的示例的示意图。
图2是示例性分析物捕获剂的示意图。
图3是描绘特征固定的(feature-immobilized)捕获探针324和分析物捕获剂326之间的示例性相互作用的示意图。
图4A显示了使用本文描述的方法迁移分析物的示例性设置。
图4B显示了显示使用本文描述的方法的实例的分析物迁移的图。
图4C显示使用图4B中描述的示例性方法迁移分析物的结果。
图5显示了空间转移分析物的示例示意性工作流程，其中半多孔材料用作过滤器。
图6显示了空间转移分析物的示例示意性工作流程，其中半多孔材料用作分子筛。
图7A显示了用于空间转移分析物的示例示意性工作流程，其中半多孔材料具有孔径的不连续性。
图7B显示了用于空间转移分析物的示例示意性工作流程，其中半多孔材料具有孔径梯度。
图8显示了用于空间转移分析物的示例示意性工作流程，其中不连续的缓冲液用于等速电泳(ITP)。
图9显示了用于空间转移分析物的示例性示意性工作流程，其中缓冲液仅接触生物样品的第一区域，从而只有来自第一区域的分析物被转移至捕获探针。
具体实施方式
本文所述的空间分析方法和组合物能以高空间分辨率提供生物样品内大量分析物和/或各种各样分析物的表达数据，同时保留天然空间背景信息。空间分析方法和组合物可以包括，例如，使用包括空间条形码(例如，提供关于分析物在细胞或组织样品(例如哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置或方位的信息的核酸序列)的捕获探针，和能够与细胞产生和/或其中存在的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)结合的捕获域。空间分析方法和组合物还可包括使用具有捕获域的捕获探针，其捕获用于间接检测分析物的中间物(intermediate agent)。例如，中间物可以包括与中间物相关联的核酸序列(例如，条形码)。因此，中间物的检测指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析的方法和组合物的非限制性方面描述于美国专利号10,774,374，10,724,078，10,480,022，10,059,990，10,041，949，10,002,316，9，879,313，9,783,841，9,727,810，9,593,365，8,951,726，8,604,182，7,709,198，美国专利申请公开号2020/239946，2020/080136，2020/0277663，2020/024641，2019/330617，2019/264268，2020/256867，2020/224244，2019/194709，2019/161796，2019/085383，2019/055594，2018/216161，2018/051322，2018/0245142，2017/241911，2017/089811，2017/067096，2017/029875，2017/0016053，2016/108458，2015/000854，2013/171621，WO 2018/091676，WO2020/176788，Rodriques等，Science 363(6434)：1463-1467，2019；Lee等，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；Trejo等，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；Chen等，Science348(6233)：aaa6090，2015；Gao等，BMC Biol.15：50，2017；和Gupta等，NatureBiotechnol.36：1197-1202，2018；Visium空间基因表达试剂盒用户指南(VisiumSpatial Gene ExpressionReagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial Tissue Optimization Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年7月)，两者均可得于10x基因组学有限公司(10x Genomics)支持文档网站，可以任意组合使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其它非限制性方面。
可以在本公开中使用的一些通用术语可以见于WO2020/176788的第(I)(b)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。通常，“条形码”是一种标签或标识符，它传递或能够传递信息(例如，关于样品中分析物、珠和/或捕获探针的信息)。条形码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接于分析物。特定条形码相对于其它条形码可能是独特的。就本发明而言，“分析物”可包括任何待分析的生物物质、结构、部分或组分。术语“靶标”可以类似地指感兴趣的分析物。
分析物可大致分为两类：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的示例包括但不限于脂质、碳水合合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体，蛋白质泛素化变体、蛋白质硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒附件、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，分析物可定位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、内吞囊泡、排出囊泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方式中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的其它示例可见于WO2020/176788第(I)(c)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。在一些实施方式中，分析物可被间接检测，例如通过中间物的检测，例如连接产物或分析物捕获剂(例如，寡核苷酸偶联的抗体)，例如本文所述的那些。
通常从对象处获取“生物样品”，以使用各种技术中的任一种进行分析，包括但不限于活检、手术和激光捕获显微镜(LCM)，并且通常包括来自对象的细胞和/或其它生物材料。在一些实施方式中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方式中，生物样品可以是固定和/或染色的生物样品(例如，固定和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性示例包括组织染色剂(例如，苏木精和/或伊红)和免疫染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方式中，可以对生物样品(例如，固定和/或染色的生物样品)成像。生物样品也描述于WO2020/176788第(I)(d)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些实施方式中，生物样品用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可以促进分析物的捕获。示例性透化剂和条件描述于WO2020/176788的第(I)(d)(ii)(13)部分或示例性实施方式部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列，其中各特征与阵列上的独特空间位置相关联。转移分析物的后续分析包括确定分析物的相同性以及生物样品中分析物的空间位置。分析物在生物样品中的空间位置是基于阵列中分析物所结合(例如，直接或间接)的特征以及特征在阵列上的相对空间位置来确定的。
“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针可包括裂解域和/或功能域(例如，引物结合位点，例如用于下一代测序(NGS))。参见例如WO2020/176788的第(II)(b)部分(例如，第(i)-(vi)小节)和/或美国专利申请公开号2020/0277663。捕获探针的产生可以通过任何合适的方法来实现，包括在WO2020/176788的第(II)(d)(ii)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的那些。
在一些实施方式中，可采用任何合适的多重化技术(例如，描述于WO2020/176788的第(IV)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663)来检测(例如同时或依次检测)来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)。
在一些实施方式中，可以使用一种或多种分析物捕获剂进行一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指某一物质，其与分析物(例如，生物样品中的分析物)以及与捕获探针(例如，连接至基材或特征的捕获探针)相互作用以鉴别分析物。在一些实施方式中，分析物捕获剂包括：(i)分析物结合部分(例如，其能结合至分析物)，例如抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)分析物捕获序列。如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分相关联或以其它方式鉴别分析物结合部分的条形码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”是指被配置为杂交到捕获探针的捕获域、结合到捕获探针的捕获域、耦合到捕获探针的捕获域或以其它方式与捕获探针的捕获域相互作用的区域或部分。在一些情况中，分析物结合部分条形码(或其部分)可能能够从分析物捕获剂去除(例如，裂解)。分析物捕获剂的其它描述可见于WO2020/176788的第(II)(b)(ix)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(viii)部分。
图2是由分析物结合部分204和捕获剂条形码结构域208构成的示例性分析物捕获剂202的示意图。分析物结合部分204是能够结合到分析物206并与空间条码化捕获探针相互作用的分子。分析物结合部分可以高亲和力和/或高特异性结合到分析物206。分析物捕获剂可包括捕获剂条形码结构域208、核苷酸序列(例如，寡核苷酸)，其可与捕获探针的捕获结构域的至少部分或全部杂交。分析物结合部分204可包括多肽和/或适体(例如，结合到特定目标分析物的寡核苷酸或肽分子)。分析物结合部分204可包括抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
图3是描绘特征固定的(feature-immobilized)捕获探针324和分析物捕获剂326之间的示例性相互作用的示意图。特征固定的捕获探针324可以包括空间条形码308以及一个或多个功能序列306和310，如本文别处所述。捕获探针还可以包括能够结合到分析物捕获剂326的捕获域312。分析物捕获剂326可以包括功能序列318、捕获剂条形码结构域316和能够结合到捕获探针324的捕获域312的分析物捕获序列314。分析物捕获剂还可以包括接头320，其使捕获剂条形码结构域316耦合到分析物结合部分322。
存在将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联的至少两种方法，从而使得空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容标识为与特定空间位置相关联。一种方法是促进分析物或分析物代用物(proxy)(例如，中间物)移出细胞并朝向空间条码化阵列(例如，包括空间条码化捕获探针)。另一种方法是从阵列裂解空间条码化捕获探针，并促进空间条码化捕获探针朝向生物样品和/或至生物样品中或至生物样品上。
图1是示出如本文所述的示例性捕获探针的示意图。如图所示，捕获探针102任选地通过例如二硫键接头的裂解域103耦合到特征101。捕获探针可以包括对后续处理有用的功能序列104。功能序列104可以包括全部或部分测序仪特异性流动池附连序列(例如P5或P7序列)、全部或部分测序引物序列(例如R1引物结合位点、R2引物结合位点)或其组合。获探针还可以包括空间条形码105。捕获探针还可以包括独特分子标识符(UMI)序列106。虽然图1显示空间条形码105位于UMI序列106上游(5′)，但应理解的是，其中UMI序列106位于空间条形码105上游(5′)的捕获探针也适合使用在本文所述的任何方法中。捕获探针还可以包括捕获域107以促进目标分析物的捕获。在一些实施方式中，捕获探针包含一个或多个额外的功能序列，其可以位于例如空间条形码105和UMI序列106之间、UMI序列106和捕获域107之间或在捕获域107之后。捕获域可以具有与核酸分析物序列互补的序列。捕获域可以具有与本文所述连接的探针互补的序列。捕获域可以具有与分析物捕获剂中存在的捕获柄(handle)序列互补的序列。捕获域可以具有与夹板(splint)寡核苷酸互补的序列。这种夹板寡核苷酸除了具有与捕获探针捕获域互补的序列外，还可具有核酸分析物的序列、与本文所述连接的探针的部分互补的序列和/或本文所述的捕获柄序列。
通常可选择功能性序列以与各种不同测序***中的任何一种兼容，例如离子激流质子(Ion Torrent Proton)或PGM、Illumina测序仪、PacBio、牛津纳米孔(OxfordNanopore)等及其要求。在一些实施方式中，可选择功能性序列以与非商业化测序***兼容。可使用适当功能性序列的此类测序***和技术的示例包括(但不限于)离子激流质子或PGM测序、Illumina测序、PacBio SMRT测序和牛津纳米孔测序。此外，在一些实施方式中，可以选择功能性序列以与其它测序***(包括非商业化测序***)兼容。
在一些实施方式中，空间条形码105和功能序列104对于所有与给定特征附接的探针都是共同的。在一些实施方式中，附接给定特征的捕获探针的UMI序列106与附接给定特征的不同捕获探针的UMI序列是不同的。
在一些情况下，捕获探针可以用于从模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物(例如，连接产物或分析物捕获剂)，或其一部分)，或其衍生物，引发、复制并由此产生任选条码化的延伸产物(参见，例如，WO2020/176788的第(II)(b)(vii)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663，关于延伸的捕获探针)。在一些情况下，捕获探针可以用于与模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物，或其部分)形成连接产物，由此产生用作模板代用物的连接产物。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指具有添加到捕获探针末端(例如，3′或5′端)的附加核苷酸从而延伸捕获探针总长度的捕获探针。例如，“延伸的3′端”表示附加的核苷酸被添加到捕获探针的最3′核苷酸以延伸的捕获探针的长度，例如，通过用于延伸的核酸分子的聚合反应，包括通过聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方式中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3′末端添加与特异性结合捕获探针的捕获域的分析物或中间物的核酸序列互补的核酸序列。在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种DNA聚合酶延伸。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码序列。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以用于下游分析(例如通过DNA测序)的量。在一些实施方式中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
在WO2020/176788的第(II)(a)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述了空间分析方法的其它变化形式，在一些实施方式中包括成像步骤。捕获的分析物(和/或中间物或其部分)的分析，例如，包括样品移出、捕获探针的延伸、测序(例如，裂解的延伸捕获探针和/或与延伸的捕获探针互补的cDNA分子的测序)、阵列上测序(例如，使用例如原位杂交或原位连接方法)、时域分析和/或邻近捕获，描述于WO2020/176788的第(II)(g)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。一些质量控制措施也描述于WO2020/176788的第(II)(h)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
空间信息可以提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断、预后和/或用于确定治疗功效)；确定用于治疗疾病或病症的候选药物靶标；将对象鉴定(例如，诊断)为患有疾病或病症；鉴定对象的疾病或病症的阶段和/或预后；将对象鉴定为具有增加的发展疾病或病症的可能性；监测对象的疾病或病症的进展；确定治疗对象的疾病或病症的功效；确定治疗对疾病或病症有效的患者亚群；对患有疾病或病症的对象的治疗的修改；选择参加临床试验的对象；和/或为患有疾病或病症的对象选择治疗。
空间信息可以提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达谱(例如，在健康和/或患病组织中)；近距离鉴别多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中上调和/或下调的基因和/或蛋白质；肿瘤微环境的表征；肿瘤免疫反应的表征；细胞类型的表征及其在组织中的共定位；组织内遗传变异的鉴定(例如，基于与特定疾病或障碍生物标志物相关联的基因和/或蛋白质表达谱)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基材起到支持捕获探针直接或间接附接到阵列特征的作用。“特征”是一个实体，作为空间分析中使用的各种分子实体的支持或存储库。在一些实施方式中，阵列中的一些或全部特征被功能化以用于分析物捕获。示例性基材描述于WO2020/176788的第(II)(c)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。阵列的示例性特征和几何属性可以在WO2020/176788的第(II)(d)(i)、(II)(d)(iii)和(II)(d)(iv)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中找到。
通常，当将生物样品与包括捕获探针的基材(例如，具有嵌入、点样、印刷、制造在基材上的捕获探针的基材，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基材)接触时，分析物和/或中间物(或其部分)可被捕获。如本文所用，使生物样品“接触”基材指任何接触(例如，直接或间接)，使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价或非共价结合(例如，杂交))。捕获可以主动(例如，使用电泳)或被动(例如，使用扩散)实现。分析物捕获进一步描述于WO2020/176788的第(II)(e)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况中，可以通过将具有条形码(例如空间条形码)的分子(例如肽、脂质或核酸分子)附连和/或引至生物样品(例如，引至生物样品中的细胞)来进行空间分析。在一些实施方式中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞))用于空间分析。在一些实施方式中，在将具有条形码的分子附连和/或引至生物样品之后，可以将生物样品物理分离(例如，解离)成单细胞或细胞群以进行分析。一些这样的空间分析方法描述于WO2020/176788的第(III)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况中，空间分析可以通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来进行。在一些情况中，例如，可以使用RNA模板连接(RTL)进行空间分析。RTL的方法之前已经描述过。参见例如Credle等，Nucleic Acids Res.2017年8月21日；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，例如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在一些情况中，寡核苷酸是DNA分子。在一些情况中，寡核苷酸之一在3′末端包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一寡核苷酸在5′末端包括磷酸化核苷酸。在一些情况中，两个寡核苷酸之一包括捕获域(例如，聚(A)序列、非均聚序列)。在与分析物杂交后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生连接产物。在一些情况中，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在一些情况中，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸寡核苷酸之一。连接后，连接产物从分析物释放出来。在一些情况下，利用核酸内切酶(例如，RNA酶H)释放连接产物。释放的连接产物然后可以被阵列上的捕获探针(例如，代替分析物的直接捕获)捕获，任选地被扩增和测序，从而确定生物样品中分析物的位置和任选地丰度。
在空间信息分析期间，获得与分析物相关联的空间条形码的序列信息，并且该序列信息可用于提供关于分析物在生物样品中的空间分布的信息。可以使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方式中，特定捕获探针和它们捕获的分析物与基材上特征阵列中的特定位置相关联。例如，特定空间条形码可以在阵列制造之前与特定阵列位置相关联，并且空间条形码的序列可以与特定阵列位置信息一起存储(例如，在数据库中)，从而使得每个空间条形码唯一地映射到特定的阵列位置。
或者，特定空间条形码可以在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置，从而使得在每个位置，仅存在一种类型的空间条形码，由此空间条形码与阵列的单个特征独特地相关联。必要时，可以使用本文所述的任何方法对阵列进行解码，以便空间条形码与阵列特征位置独特地相关联，并且可以如上所述存储该映射。
当在空间信息分析期间获得捕获探针和/或分析物的序列信息时，可以通过参考存储的将每个空间条形码与阵列特征位置独特关联的信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。以此方式，特定捕获探针和捕获分析物与特征阵列中的特定位置相关联。各阵列特征位置表示相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标志物)的位置。因此，各特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
一些示例性空间分析工作流程描述于WO2020/176788的示例性实施方式部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。参见例如WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的以“在本文描述的工作流程的一些非限制性示例中，可以将样品浸入......”开头的示例性实施方式。还参见，例如，Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial TissueOptimization Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年7月)。
在一些实施方式中，可以使用专用硬件和/或软件来进行空间分析，例如WO2020/176788的第(II)(e)(ii)和/或(V)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的任何***，或在WO2020/123320的用于成像的控制载玻片、使用控制载玻片和基材的方法、使用用于成像的控制载玻片和基材的***和/或样品和阵列对齐装置和方法、信息标签中描述的任何一种或多种装置或方法。
用于进行空间分析的合适***可以包括部件，例如用于容纳生物样品的室(例如，流动池或可密封的流体密封室)。生物样品可以被固定在例如生物样品容器中。一个或多个流体室可以通过流体导管连接到室和/或样品容器，并且可以通过流体泵、真空源或连接到流体导管的其它装置(产生压强梯度以驱动流体流)将流体递送到室和/或样品容器中。一个或多个阀也可以连接到流体导管以调节试剂从储器到室和/或样品容器的流动。
***可以任选地包括控制单元，该控制单元包括一个或多个电子处理器、输入接口、输出接口(例如显示器)和存储单元(例如固态存储介质，例如但不限于，磁性、光学或其它固态、持久性、可写和/或可重写存储介质)。控制单元可以任选地通过网络连接到一个或多个远程设备。控制单元(及其组件)通常可以进行本文描述的任何步骤和功能。在***连接到远程设备的情况下，远程设备(或多个设备)可以进行本文描述的任何步骤或特征。该***可以任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。***还可以任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED、基于二极管、激光器)、具有特征的基材、来自捕获在基材上的生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
***可以可选地包括在一种或多种有形存储介质和硬件组件(例如专用集成电路)中编码和/或实现的软件指令。软件指令在由控制单元(尤其是电子处理器)或集成电路执行时，可以使控制单元、集成电路或其它执行软件指令的组件执行本文所述的任何方法步骤或功能。
在一些情况中，本文描述的***可以检测(例如配准图像)阵列上的生物样品。检测阵列上的生物样品的示例性方法描述于PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请序列号16/951,854。
在将分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列之前，可以将生物样品与阵列对齐。生物样品和包括捕获探针的特征阵列的对齐可以促进空间分析，这可以用于检测生物样品中不同位置内分析物存在和/或水平的差异，例如，生成分析物的存在和/或水平的三维图。用于生成分析物存在和/或水平的二维和/或三维图的示例性方法描述于PCT申请号2020/053655中，空间分析方法一般描述于WO2020/061108和/或美国专利申请序列号16/951,864中。
在一些情况下，可以使用一个或多个基准标志物将分析物存在和/或水平的图与生物样品的图像对齐，例如，放置在成像***视野中的物体出现在产生的图像中，如WO2020/123320的基材属性部分、用于成像的控制载玻片部分、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请序列号16/951,843中所述。基准标志物可被用作对准的参考点或测量标度(例如，以对准样品和阵列、以对准两个基材、以确定基材上样品或阵列相对于基准标志物的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
空间转移分析物和多组学空间分析
本文提供了用于空间确定分析物(例如，本文所述的任何示例性分析物)在生物样品(例如，本文所述的任何示例性生物样品)中的位置的方法，所述方法包括提供阵列(例如，本文描述的任何阵列)，所述阵列具有多个捕获探针，其中多个捕获探针中的第一捕获探针具有(i)空间条形码和(ii)捕获域(例如，本文描述的任何示例性捕获域)，提供一种或多种半多孔材料(例如，本文所述的任何示例性半多孔材料)，其中一种或多种半多孔材料设置在生物样品和阵列之间，将电场施加至生物样品、一种或多种多孔材料和阵列，其中电场促进一种或多种分析物沿阵列方向迁移，其中捕获探针的捕获域能特异性结合至一种或多种分析物中的第一分析物；和，确定(i)空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，和利用(i)和(ii)的序列来确定第一分析物在生物样品中的位置。
在一些实施方式中，当一种或多种分析物沿阵列的方向迁移时，生物样品和阵列之间的一种或多种半多孔材料可以保留一种或多种第二分析物。如本文所用，词语“保留”表示保留的分析物在半多孔材料中迁移较慢(例如，与另一种分析物相比或与进入半多孔材料之前的相同分析物相比)或在进入半多孔材料后被阻止迁移通过半多孔材料。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的一种或多种半多孔材料可以基于物理化学性质(如电荷、尺寸(例如，长度、回转半径、有效直径等)、疏水性/亲水性、分子结合(例如免疫亲和性)或其任何组合，来非特异性地保留一种或多种第二分析物。例如，生物样品和阵列之间的一种或多种半多孔材料可以含有多种分析物捕获剂(例如，本文所述的任何示例性分析物捕获剂)。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的一种或多种半多孔材料含有多种分析物捕获剂，其包括分析物结合部分(例如，本文所述的任何示例性分析物结合部分)，其中各分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第二分析物中的第二分析物。
在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，生物样品是***固定且石蜡包埋的生物样品。在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括固定生物样品。在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括透化生物样品。在一些实施方式中，一种或多种分析物(例如，第一分析物和/或第二分析物)可以是RNA、DNA、蛋白质、miRNA、siRNA、rRNA、mtRNA、snoRNA和本文描述的任何其它类型的分析物。在一些实施方式中，捕获探针还可包括以下的一种或多种：裂解域、一种或多种功能域、独特分子标识符或其组合。
在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括获得生物样品的图像。在一些实施方式中，生物样品由固定缓冲液固定。在一些实施方式中，生物样品被透化缓冲液透化。在一些实施方式中，生物样品在其成像之前被H＆E(苏木精和曙红)染色。在一些实施方式中，本文所述的方法还可以包括用显微镜获得生物样品的图像。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包含一种或多种基准标志物，其将一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对齐。在一些实施方式中，一种或多种分析物可以在迁移通过一种或多种半多孔材料期间成像。
本文所述方法的一些实施方式可包括一种或多种分析物的主动迁移。例如，可以对阵列、生物样品或两者施加电场以促进分析物的迁移。在一些实施方式中，可以将电场施加到阵列、生物样品和一种或多种半多孔材料。在一些实施方式中，分析物迁移到一种或多种半多孔材料中。在一些实施方式中，电场可以施加到生物样品的离散区域(例如，生物样品中的感兴趣区域)。本文描述的方法的一些实施方式还可以包括识别生物样品中的感兴趣区域。在一些实施方式中，可以将电场施加到阵列的离散区域。
在一些实施方式中，在生物样品和阵列之间的一种或多种半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后，可以移出包含保留的第二分析物的一种或多种半多孔材料用于进一步分析。在一些实施方式中，本文所述的方法还可以包括在移出包含保留的第二分析物的一种或多种半多孔材料之后提供一种或多种新的半多孔材料并施加新的电场，从而使新的电场促进一种或多种第三分析物沿阵列方向上的迁移。在一些实施方式中，一种或多种新的半多孔材料可以保留一种或多种第三分析物。
a)基材保持器(substrate holder)
在一些实施方式中，生物样品被放置在基材保持器上或基材保持器(例如，盒)中。例如，生物样品可被放置在基材上(例如，本文所述的任何基材)，然后可以将其放置在基材保持器(例如，盒)上或基材保持器中。
基材保持器，例如盒，可用于确保在样品制备和/或分析方案期间均匀且一致地控制基材和支撑在基材表面上的任何生物样品和/或试剂的温度。在此类方案中，加热不均会导致样品制备失败。此外，即使样品加热相对均匀，接触样品的冷凝也可能会损害作为方案部分的某些反应，或以其它方式影响发生的化学反应。在各种实施方式中，基材保持器提供加热和/或产生基材的多个表面的电场(例如，在载玻片盒或基材保持器中)，并且可以包括促进从加热元件到基材的热传递的特征，并且可以减少或防止在基材的某些区域(例如，在基材表面上的样品孔或区域中)形成冷凝。在一些实施方式中，基材保持器(例如，盒)用于产生电场(例如，第一电场、第二电场)以促进分析物从生物样品迁移到阵列(例如，第一个阵列，第二个阵列)。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料设置在生物样品和阵列(例如，第一阵列、第二阵列)之间，并且生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列可以被加热和/或可以产生电场以促进一种或多种分析物从生物样品迁移到阵列。
在一些实施方式中，生物样品被放置在导电基材上。在一些实施方式中，生物样品被放置在半多孔基材上。在一些实施方式中，生物样品被放置在半多孔膜上。在一些实施方式中，生物样品被放置在硝酸纤维素膜上。在一些实施方式中，生物样品被放置在载玻片上。在一些实施方式中，生物样品被放置在病理学载玻片上。在一些实施方式中，生物样品被放置在导电板上。在一些实施方式中，生物样品被放置在涂有氧化铟锡(ITO)的载玻片上。在一些实施方式中，生物样品被放置在涂有ITO的聚赖氨酸载玻片上。
在一些实施方式中，阵列放置在基材保持器上。例如，具有多个捕获探针的阵列包括基材(例如，本文所述的任何基材)上的捕获探针，然后可以将其放置在基材保持器上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列包括基材上的特征(例如，本文描述的任何特征)上的捕获探针。在一些实施方式中，阵列位于导电基材上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列被放置在半多孔基材上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列被放置在半多孔膜上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列被放置在硝酸纤维素膜上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列被放置在载玻片上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列被放置在病理学载玻片上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列被放置在导电板上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列被放置在被覆有ITO的载玻片上。在一些实施方式中，具有多个捕获探针的阵列被放置在基材的离散区域中。
在一些实施方式中，在阵列和生物样品之间存在间隙(例如，空间)。在一些实施方式中，阵列和生物样品之间的间隙填充有一种或多种溶液。在一些实施方式中，包含阵列的基材和生物样品之间的一种或多种溶液可以包括透化缓冲液(例如，本文所述的任何透化缓冲液)。在一些实施方式中，阵列和生物样品之间的一种或多种溶液可以包括电泳缓冲液。例如，电泳缓冲液是能够促进电流并将pH值保持在相对恒定值的缓冲液。
在一些实施方式中，生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列都与缓冲液(例如透化缓冲液、电泳缓冲液)直接接触。在一些实施方式中，生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列都与透化缓冲液直接接触。在一些实施方式中，生物样品与电极直接接触。在一些实施方式中，阵列与电极直接接触。在一些实施方式中，生物样品通过缓冲液(例如透化缓冲液、电泳缓冲液)与电极分开。在一些实施方式中，阵列通过缓冲液(例如透化缓冲液、电泳缓冲液)与电极分开。
在一些实施方式中，可将生物样品放置在第一基材支架(例如，本文所述的基材支架)中。在一些实施方式中，空间条码化捕获探针阵列(例如，捕获探针，条码化阵列)可放置在第二基材支架(例如，本文所述的基材支架)上。在一些实施方式中，可将生物样品放置在也包含捕获探针的第一基材支架中。在一些实施方式中，第一基材支架、第二基材支架或两者均可导电(例如，本文所述的任何导电基材)。在一些实施方式中，包括生物样品的第一基材保持器、包括具有捕获探针的阵列的第二基材保持器或两者可与透化试剂(例如，透化缓冲液)和/或电泳缓冲液接触，并且分析物可利用电场从生物样品迁移到阵列。
在一些实施方式中，电泳可在与透化缓冲液接触时应用于阵列上的生物样品。在一些实施方式中，电泳可在与电泳缓冲液接触时应用于阵列上的生物样品。在一些实施方式中，电泳可在与电泳缓冲液(例如缺乏透化试剂的缓冲液)接触时应用于阵列上的生物样品。在一些实施方式中，可在所需时间量后用电泳缓冲液替换透化缓冲液。在一些实施方式中，电泳可与透化缓冲液和/或电泳缓冲液同时施加。在一些实施方式中，可在生物样品与透化缓冲液和/或电泳缓冲液之间的所需接触时间后施加电泳。
在一些实施方式中，第一基材保持器和第二基材保持器可促进生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列彼此对准。在一些实施方式中，生物样品与一种或多种半多孔材料直接接触。在一些实施方式中，阵列与一种或多种半多孔材料直接接触。在一些实施方式中，生物样品和阵列均与一种或多种半多孔材料直接接触。
b)半多孔材料
在一些实施方式中，本文所述的方法可以包括将分析物转移到生物样品和阵列之间的半多孔材料中。在一些实施方式中，本文描述的方法可以包括在生物样品和阵列之间使用两种、三种、四种或更多种半多孔材料(例如，相同的或不同的半多孔材料)。
在一些实施方式中，本文所述的方法可以包括生物样品和阵列之间的一种半多孔材料。在一些实施方式中，半多孔材料可以是渗透膜。在一些实施方式中，半多孔材料可以是水凝胶或有机凝胶。例如，半多孔材料可以是SDS-PAGE凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料可具有基本上均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料可具有不均匀的孔径。例如，半多孔材料可以是梯度凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料可包含一种或多种透化试剂(例如，一种或多种本文所述的任何示例性透化试剂)(例如，透化缓冲液、干燥的透化试剂)。在一些实施方式中，半多孔材料可含有电泳缓冲液。在一些实施方式中，来自生物样品的一种或多种第一分析物(例如，核酸、DNA、RNA或本文描述的任何其它示例性分析物)可以用电场转移通过半多孔材料(例如，未保留在半多孔材料中的一种或多种第一分析物)并特异性结合(例如，杂交)至阵列上的捕获探针。
在一些实施方式中，半多孔材料可以将一种或多种分析物与来自生物样品的其它分子分离。这里，术语“分子”是指来自生物样品的任何分子。在一些实施方式中，以非限制性方式，来自生物样品的分子包括蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物和小分子如水、三磷酸腺苷、盐、有机酸、金属离子等。例如，半多孔材料可以根据分子大小将核酸与蛋白质分离。在一些实施方式中，半多孔材料可以将较短的核酸(例如，miRNA)与较长的核酸(例如，mRNA)分开。
在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料可作为过滤器以将分析物(例如，感兴趣的分析物)与生物样品中存在的其它分子或分析物分离。在一些实施方式中，分析物(例如，感兴趣的分析物)是RNA转录物(例如，mRNA)。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料可以作为过滤器以将mRNA与其它分子(例如，分析物)例如蛋白质、脂质和/或其它核酸分离。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料可以作为过滤器以基于物理化学性质分离分析物和其它分子。在一些实施方式中，分析物可以基于性质如电荷、大小(例如，长度、回转半径、有效直径等)、疏水性、亲水性、分子结合(例如，免疫亲和性)或其组合来分离。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料可以将分析物与其它分子分开，以减少捕获探针附近的非特异性结合，并因此改善分析物和阵列的捕获探针之间的结合，从而提高后续的检测性能。
在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料可以用作用于电泳分析物分离的分子筛基质。例如，分析物的分离可基于物理化学性质，例如电荷、大小(例如，长度、回转半径和有效直径等)、电泳迁移率、ζ电位、等电点、疏水性、亲水性、分子结合(例如，免疫亲和性)，及其组合。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料可以具有均匀的孔径。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料可以具有孔径的不连续性，如通常用于不同的凝胶电泳方案。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料可以具有孔径梯度。例如，半多孔材料(例如，水凝胶)可具有孔径梯度，从而使得当分析物迁移至阵列时梯度分离分析物。
在一些实施方式中，生物样品中的不同分子(包括分析物)以不同速率移动通过半多孔材料。例如，较小的分子相对于较大的分子可以更快地移动通过半多孔材料。在一些实施方式中，在施加电场一定时间后，只有一种或多种分析物或分析物类型(例如，mRNA)可以移动通过一种或多种半多孔材料到达阵列，而其它分子则保留在半多孔材料中。在一些实施方式中，通过控制施加电场的时间长度，一种或多种分析物可以选择性地迁移通过半多孔材料并特异性结合(例如，杂交)至阵列的捕获探针。在一些实施方式中，可以通过改变施加到生物样品的电场强度或改变半多孔材料来控制生物样品中分子的迁移(例如，迁移速率)。在一些实施方式中，控制电场的强度和施加电场的时间，一种或多种分析物可以选择性地迁移通过半多孔材料。在一些实施方式中，在一种或多种分析物(例如，mRNA)已经迁移通过半多孔材料之后去除电场。在一些实施方式中，在一种或多种分析物(例如，mRNA)已经迁移通过半多孔材料之后移出半多孔材料。
在一些实施方式中，半多孔材料可以保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，半多孔材料通过特异性结合保留一种或多种第二分析物。例如，半多孔材料可包含多种分析物捕获剂(例如，本文所述的任何示例性分析物捕获剂)，其包括分析物结合部分(例如，本文所述的任何示例性分析物结合部分))，其中各分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第二分析物中的第二分析物。在一些实施方式中，分析物结合部分可以是抗体或其抗原结合片段(例如，Fab)。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物可以是蛋白质(例如，本文所述的任何示例性蛋白质)。在一些实施方式中，分析物结合部分能特异性结合至某些核酸或某些类型的核酸。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物是核酸。在一些实施方式中，半多孔材料在其保留一种或多种第二分析物之后被移出。在一些实施方式中，在半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后去除电场。在一些实施方式中，分析物结合部分与半多孔材料交联。在一些实施方式中，分析物结合部分通过光反应***联剂与半多孔材料交联。光反应***联剂的非限制性示例包括芳基叠氮化物(苯基叠氮化物)和二氮杂环丙烷。光反应***联剂的其它示例是本领域已知的。
在一些实施方式中，半多孔材料可以非特异性地保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，半多孔材料可基于物理化学性质(例如电荷、尺寸(长度、回转半径、有效直径等)、疏水性/亲水性、分子结合(例如，免疫亲和力)，或其任何组合)来保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，半多孔材料可保留大于阈值分子大小(例如，1kDa，2kDa，3kDa，4kDa，5kDa，6kDa，8kDa，10kDa，12kDa，14kDa，16kDa，18kDa，20kDa，25kDa，30kDa，35kDa，40kDa，45kDa，50kDa，55kDa，60kDa，65kDa，70kDa，75kDa，80kDa，85kDa，90kDa，95kDa，或100kDa)的所有分子。在一些实施方式中，半多孔材料可保留长于阈值核苷酸数量(例如，25个核苷酸，50个核苷酸，100个核苷酸，150个核苷酸，200个核苷酸，250个核苷酸，300个核苷酸，350个核苷酸，400个核苷酸，500个核苷酸，750个核苷酸，1,000个核苷酸，2,000个核苷酸，4,000个核苷酸，6,000个核苷酸，8,000个核苷酸，10,000个核苷酸，15,000个核苷酸，20,000个核苷酸，25,000个核苷酸，30,000个核苷酸，35,000个核苷酸，40,000个核苷酸，45,000个核苷酸，或50,000个核苷酸)的所有核酸。在一些实施方式中，生物样品中的不同分子以不同速率迁移通过半多孔材料。在一些实施方式中，在施加电场一段时间(例如，约5分钟至约10小时)后，一种或多种第二分析物保留在半多孔材料中，而其它分析物可能已经移动通过半多孔材料和/或尚未进入半多孔材料。在一些实施方式中，通过控制施加电场的时间长度，一种或多种第二分析物可以选择性地保留在半多孔材料中。在一些实施方式中，分子在生物样品和/或半多孔材料中的迁移(例如，迁移速率)可以通过改变施加到生物样品、半多孔材料和阵列的电场强度来控制。在一些实施方式中，通过控制电场强度和施加电场的时间，一种或多种第二分析物可以选择性地保留在半多孔材料中。在一些实施方式中，在半多孔材料保留一种或多种感兴趣的第二分析物之后去除电场。在一些实施方式中，可以在半多孔材料保留一种或多种感兴趣的第二分析物之后去除半多孔材料。在一些实施方式中，半多孔材料可以通过非特异性和通过特异性结合来保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，半多孔材料可包括交联至半多孔材料的分析物结合部分。在一些实施方式中，分析物结合部分通过光反应***联剂(例如，本文所述的任何示例性光反应***联剂)与一种半多孔材料交联。
c)确定一种或多种分析物的位置
在一些实施方式中，一种或多种第一分析物迁移通过半多孔材料并特异性结合(例如，杂交)至阵列的捕获探针上的捕获域。在一些实施方式中，一种或多种mRNA迁移通过半多孔材料并结合(例如，杂交)至阵列上的捕获探针上的捕获域。在一些实施方式中，确定阵列上的捕获探针的全部或部分的序列(例如，空间条形码或其部分)或其互补物，以及对应捕获的第一分析物的序列的全部或部分(或其互补物)。在一些实施方式中，生物样品中一种或多种第一分析物的位置是基于阵列上捕获探针的序列的全部或部分(例如，空间条形码或其部分)，或其互补物，以及对应捕获的一种或多种第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，来确定的。在一些实施方式中，确定一种或多种第一分析物在生物样品中的位置包括，确定阵列上捕获探针的序列的全部或部分(例如，空间条形码或其部分)，或互补物，以及对应捕获的一种或多种第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并将所述序列信息与生物样品的图像相关联。这些方法的一些实施方式还包括获得生物样品的图像。
在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的半多孔材料保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，保留在半多孔材料中的一种或多种第二分析物的位置通过免疫荧光来确定。在一些实施方式中，一种或多种可检测标记物(例如，荧光团标记的抗体)与保留在半多孔材料中的一种或多种第二分析物结合，并且通过在合适条件下检测标记物来确定一种或多种第二分析物的位置。在一些实施方式中，一种或多种荧光团标记的抗体与保留在半多孔材料中的一种或多种第二分析物结合，并且通过对荧光团标记的抗体成像(此时荧光团被合适波长的光激发)来确定一种或多种第二分析物的位置。在一些实施方式中，通过将免疫荧光数据与生物样品的图像相关联来确定生物样品中一种或多种第二分析物的位置。在一些实施方式中，一种或多种核酸(例如，miRNA)保留在半多孔材料中。在一些实施方式中，保留在半多孔材料中的一种或多种第二分析物的位置通过原位杂交(例如，使用标记探针的原位杂交)来确定。在一些实施方式中，通过将原位杂交的图像与生物样品的图像相关联来确定生物样品中一种或多种第二分析物的位置。
在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括提供包含多个第二捕获探针的第二阵列。在一些实施方式中，多个第二捕获探针中的第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)能结合(例如，杂交)至第二分析物的第二捕获域。在一些实施方式中，本文所述的方法还可以包括通过将第二电场(例如，在第一电场之后施加的电场)施加到含有一种或多种第二分析物的半多孔材料和第二阵列来转移分析物，从而电场促进一种或多种第二分析物沿第二阵列的方向迁移。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物结合(例如，杂交)至第二阵列上的第二捕获探针上的第二捕获域。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物可以是miRNA或本文描述的任何其它类型的分析物。在一些实施方式中，确定第二阵列上的第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，第二空间条形码的全部或部分)或其互补物，以及对应捕获的第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物。在一些实施方式中，生物样品中一种或多种第二分析物的位置，基于第二阵列上第二捕获探针的第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，全部或部分空间条形码)，或其互补物，和对应捕获的一种或多种第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，来确定。在一些实施方式中，确定生物样品中一种或多种第二分析物的位置包括确定第二阵列上的第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，全部或部分空间条形码)，或其互补物，以及相应捕获的一种或多种第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并将所述序列信息与生物样品的图像相关联。
d)两种或更多种半多孔材料
在一些实施方式中，本文所述的方法可以包括在生物样品和阵列之间使用两种或更多种半多孔材料。在一些实施方式中，第一半多孔材料设置在生物样品和第二半多孔材料之间。在一些实施方式中，第二半多孔材料设置在第一半多孔材料和阵列之间。在一些实施方式中，两种半多孔材料中的至少一种可以将一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。在一些实施方式中，来自生物样品的一种或多种分析物沿以下方向迁移：生物样品、第一半多孔材料、第二半多孔材料和阵列。在一些实施方式中，来自生物样品的一种或多种第一分析物可移动穿过两种半多孔材料并到达阵列。
在一些实施方式中，两种半多孔材料中的至少一种可以是渗透膜。在一些实施方式中，两种半多孔材料中的至少一种可以是凝胶(例如，水凝胶或有机凝胶)。例如，两种半多孔材料中的至少一种可以是SDS-PAGE凝胶。在一些实施方式中，两种半多孔材料中的至少一种可具有基本上均匀的孔径。在一些实施方式中，两种半多孔材料中的至少一种可具有不均匀的孔径。例如，两种半多孔材料中的至少一种可以是梯度凝胶。在一些实施方式中，两种半多孔材料中的至少一种可以含有透化缓冲液。在一些实施方式中，两种半多孔材料中的至少一种可以包含电泳缓冲液。
在一些实施方式中，两种半多孔材料中的至少一种可以将一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。例如，两种半多孔材料中的至少一种可以根据分子大小将核酸与蛋白质分离。
在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的两种半多孔材料中的至少一种可以作为过滤器以将分析物(例如，感兴趣的分析物)与生物样品中存在的其它分子或分析物分离。在一些实施方式中，分析物(例如，感兴趣的分析物)是RNA(例如，mRNA)。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的两种半多孔材料中的至少一种可以作为过滤器以将RNA(例如mRNA)与其它分子(例如分析物)例如蛋白质、脂质和/或其它核酸分离。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的两种半多孔材料中的至少一种可以作为过滤器以基于物理化学性质分离分析物和其它分子。例如，分析物可以基于例如电荷、大小(例如，长度、回转半径、有效直径等)、疏水性、亲水性、分子结合(例如，免疫亲和力)或其任何组合的性质来分离。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的两种半多孔材料中的至少一种可以将分析物与其它分子分离，以减少阵列上捕获探针附近的非特异性结合，由此提高分析物和捕获探针之间的结合，从而提高后续分析性能。
在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的两种半多孔材料中的至少一种可以作为用于电泳分析物分离的分子筛基质。例如，分析物的分离可基于物理化学性质，例如电荷、大小(例如，长度、回转半径和有效直径等)、电泳迁移率、ζ电位、等电点、疏水性、亲水性、分子结合(例如，免疫亲和性)，或其任何组合。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的两种半多孔材料中的至少一种可以具有均匀的孔径。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的两种半多孔材料中的至少一种可以具有孔径的不连续性，如通常用于不同的凝胶电泳方案中。在一些实施方式中，生物样品和阵列之间的两种半多孔材料中的至少一种可以具有孔径梯度。例如，两种半多孔材料中的至少一种(例如，水凝胶或有机凝胶)可具有孔径梯度，从而使得当分析物迁移至阵列时该梯度将分析物分离。
在一些实施方式中，生物样品中的不同分子以不同速率迁移通过两种半多孔材料中的至少一种。例如，相对于较大的分子，较小的分子可以以更快的速率移动通过两种半多孔材料中的至少一种。在一些实施方式中，在施加电场一段时间后(例如，本文所述的任何示例性时间段)，只有一种或多种分析物(或一种或多种类型的分析物)可移动通过两种半多孔材料的至少一种，而其它分子(或分子类型)仍在(保留在)两种半多孔材料的至少一种中。在一些实施方式中，通过控制施加电场的时间长度，当一种或多种分析物迁移通过两种半多孔材料中的至少一种时，它们能被选择性地保留。在一些实施方式中，可以通过改变电场强度或改变两种半多孔材料中的至少一种来控制分子的迁移速率。在一些实施方式中，通过控制电场强度和施加电场的时间长度，当一种或多种分析物迁移通过两种半多孔材料中的至少一种时，它们能被选择性地保留。在一些实施方式中，在一种或多种感兴趣的分析物已经迁移通过两种半多孔材料中的至少一种之后移除电场。在一些实施方式中，在一种或多种感兴趣的分析物已经移动通过两种半多孔材料中的至少一种之后，移出两种半多孔材料中的至少一种。
在一些实施方式中，第一半多孔材料可以保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料可通过能特异性结合至保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料含有多种分析物捕获剂(例如，本文所述的任何示例性分析物捕获剂)，其包括分析物结合部分(例如，本文所述的任何示例性分析物结合部分)并且各分析物结合部分可特异性结合至一种或多种第二分析物中的第二分析物。在一些实施方式中，分析物结合部分可以是抗体或其抗原结合片段(例如，Fab)。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物可以是蛋白质。在一些实施方式中，分析物结合部分可特异性结合至某些核酸(或核酸的类别或亚类)。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物是核酸(或核酸的类别或亚类)。在一些实施方式中，第一半多孔材料可以在它保留一种或多种感兴趣的第二分析物之后被移出。在一些实施方式中，在第一半多孔材料保留一种或多种感兴趣的第二分析物之后去除电场。在一些实施方式中，分析物结合部分可以与第一半多孔材料交联。在一些实施方式中，分析物结合部分经由光反应***联剂(例如，本文所述的任何示例性光反应***联剂)与第一半多孔材料交联。
在一些实施方式中，第一半多孔材料可以非特异性地保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料可以基于例如电荷、尺寸(例如长度、回转半径、有效直径等)、疏水性/亲水性、分子结合(例如，免疫亲和力)，或其任何组合来保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料可保留所有分子，包括大于阈值分子大小(例如，本文所述的任何示例性阈值分子大小)的分析物。在一些实施方式中，半多孔材料可以保留长于阈值核苷酸数(例如，本文所述的任何示例性核苷酸阈值数)的所有核酸。
在一些实施方式中，生物样品中的不同分子以不同速度移动通过一种或多种半多孔材料。在一些实施方式中，在施加电场一段时间后(例如，本文所述的任何示例性时间段)，一种或多种第二分析物保留在第一半多孔材料中，而其它分析物已经迁移通过第一半多孔材料和/或尚未进入第一半多孔材料。在一些实施方式中，通过控制施加电场的时间段，一种或多种第二分析物可以选择性地保留在第一半多孔材料中。在一些实施方式中，分析物在生物样品中的迁移速率可以通过改变施加到生物样品、第一半多孔材料和阵列的电场强度来控制。在一些实施方式中，通过控制电场强度和施加电场的时间段，一种或多种第二分析物可以选择性地保留在第一半多孔材料中。在一些实施方式中，在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后去除电场。在一些实施方式中，在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料。在一些实施方式中，第一半多孔材料可以非特异性地和通过特异性结合而保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料包括可任选交联至第一半多孔材料的分析物结合部分(例如，本文所述的任何分析物结合部分)。在一些实施方式中，分析物结合部分可通过光反应***联剂(例如，本文所述的任何示例性光反应***联剂)交联至第一半多孔材料。
在一些实施方式中，第二半多孔材料可以保留一种或多种第三分析物(例如，本文所述的任何类型或类别的分析物)。在一些实施方式中，第二半多孔材料可通过能特异性结合至保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第二半多孔材料包含多种分析物捕获剂，其包括分析物结合部分(例如，本文所述的任何示例性分析物结合部分)并且各分析物结合部分可以特异性结合至一种或多种第三分析物的第三分析物。在一些实施方式中，分析物结合部分可以是抗体或其抗原结合片段(例如，Fab)。在一些实施方式中，一种或多种第三分析物可以是蛋白质。在一些实施方式中，分析物结合部分可特异性结合至某些核酸或核酸的亚类。在一些实施方式中，一种或多种第三分析物是核酸或核酸的亚类。在一些实施方式中，第二半多孔材料在其保留一种或多种感兴趣的第三分析物之后被移出。在一些实施方式中，在第二半多孔材料保留一种或多种感兴趣的第三分析物之后移除电场。在一些实施方式中，分析物结合部分可以与第二半多孔材料交联。在一些实施方式中，分析物结合部分可通过光反应***联剂(例如，本文所述的任何示例性光反应***联剂)与第二半多孔材料交联。
在一些实施方式中，第二半多孔材料可以非特异性地保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第二半多孔材料可以保留一种或多种第三分析物，其可基于物理化学性质(例如电荷、尺寸(例如长度、回转半径、有效直径等)、疏水性/亲水性、分子结合(例如，免疫亲和力)或其组合)来保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第二半多孔材料可保留大于阈值分子大小(例如，本文所述的任何示例性阈值分子大小)的所有分析物。在一些实施方式中，第二半多孔材料可以保留长于核苷酸阈值长度(例如，本文所述的核酸的任何示例性阈值长度)的所有核酸分析物。在一些实施方式中，生物样品中的不同分子以不同速率移动通过第二半多孔材料。在一些实施方式中，在施加电场一段时间后，一种或多种第三分析物保留在第二半多孔材料中，而其它分析物已经迁移通过第二半多孔材料和/或尚未进入第二半多孔材料。在一些实施方式中，通过控制施加电场的时间段，一种或多种第三分析物可以选择性地保留在第二半多孔材料中。在一些实施方式中，可以通过改变施加到生物样品、第二半多孔材料和阵列的电场强度来控制生物样品中分子的迁移速率。在一些实施方式中，通过控制电场强度和施加电场的时间段，一种或多种第三分析物可以选择性地保留在第二半多孔材料中。在一些实施方式中，在第二半多孔材料保留一种或多种感兴趣的第三分析物之后移除电场。在一些实施方式中，在第二半多孔材料保留一种或多种感兴趣的第三分析物之后移出第二半多孔材料。在一些实施方式中，第二半多孔材料可以非特异性地和通过特异性结合来保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第二半多孔材料可包括分析物结合部分(例如，与第二半多孔材料交联的分析物结合部分)。在一些实施方式中，分析物结合部分可通过光反应***联剂(例如，本文所述的任何示例性光反应***联剂)与第二半多孔材料交联。
在一些实施方式中，两种半多孔材料中只有一种包含分析物捕获剂(例如，本文所述的任何示例性分析物捕获剂)，其包括分析物结合部分(例如，本文所述的任何示例性分析物结合部分)。在一些实施方式中，仅第二半多孔材料包含可特异性结合至一种或多种第三分析物的分析物结合部分。在一些实施方式中，第一半多孔材料能非特异性地保留一种或多种第二分析物，并且第二半多孔材料能特异性地保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料可根据分析物的大小保留一种或多种第二分析物，并且第二半多孔材料包含能特异性结合至一种或多种第三分析物的抗体或其抗原结合片段(例如，Fab)。
在一些实施方式中，第一和第二半多孔材料均包含分析物捕获剂(例如，本文所述的任何示例性分析物捕获剂)，其包括分析物结合部分(例如，本文所述的任何示例性分析物结合部分)。在一些实施方式中，第一半多孔材料包含第一类型的分析物捕获剂并且第二半多孔材料包含第二类型的分析物捕获剂。在一些实施方式中，第一半多孔材料包含分析物捕获剂(例如抗体)，第二半多孔材料包含可特异性结合至某些核酸的分析物捕获剂。在一些实施方式中，第一半多孔材料保留蛋白质并且第二半多孔材料保留某一类型、类别或亚类的核酸。在一些实施方式中，第一半多孔材料包含第一分析物捕获剂(例如，第一抗体)并且第二半多孔材料包含第二分析物捕获剂(例如，第二抗体)。在一些实施方式中，第一半多孔材料保留第一蛋白质且第二半多孔材料保留第二蛋白质。
在一些实施方式中，第一和第二半多孔材料均不含任何分析物捕获剂(例如，本文所述的任何分析物捕获剂)。在一些实施方式中，第一半多孔材料可以根据分析物的尺寸保留一种或多种第二分析物，并且第二半多孔材料可以根据分析物的电荷保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料可以根据分析物的尺寸保留一种或多种第二分析物，并且第二半多孔材料可以根据分析物的大小保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料可保留大于第一阈值大小(例如，本文所述的任何示例性阈值大小)的分析物，并且第二半多孔材料可保留大于第二阈值大小(例如，本文所述的任何示例性阈值大小)的所有分子。在一些实施方式中，第一阈值大小大于第二阈值大小。
在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括将一种或多种第二分析物与第二半多孔材料交联。在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括通过光反应***联剂(例如，本文所述的任何示例性光反应***联剂)将一种或多种第二分析物与第二半多孔材料交联。在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括将一种或多种第三分析物与第二半多孔材料交联。在一些实施方式中，所述方法还可包括通过光反应***联剂(例如，本文所述的任何示例性光反应***联剂)将一种或多种第三分析物与第二半多孔材料交联。
在一些实施方式中，本文所述的方法可包括使用第三半多孔材料(例如，保留一种或多种第四分析物的第三半多孔材料)。在一些实施方式中，本文所述的方法可包括使用第四半多孔材料(例如，保留一种或多种第五分析物的第四半多孔材料)。
e)确定一种或多种分析物的位置
在一些实施方式中，一种或多种第一分析物穿过第一和第二半多孔材料并结合(例如，杂交)到阵列上捕获探针上的捕获域。在一些实施方式中，一个或多个mRNA穿过第一和第二半多孔材料并结合(例如，杂交)到阵列上捕获探针上的捕获域。在一些实施方式中，确定阵列上的捕获探针的序列的全部或部分(例如，捕获探针的空间条形码)或其互补物，以及相应捕获的第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物。在一些实施方式中，生物样品中一种或多种第一分析物的位置基于阵列上捕获探针的序列的全部或部分(例如，捕获探针的空间条形码)或互补物，以及相应捕获的一种或多种第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，来确定。在一些实施方式中，确定一种或多种第一分析物在生物样品中的位置包括确定阵列上捕获探针的序列的全部或部分(例如，捕获探针的空间条形码)或其互补物，以及相应捕获的一种或多种第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并将此类序列信息与生物样品的图像相关联。本文描述的方法的一些实施方式还包括获得生物样品的图像。
在一些实施方式中，第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，保留在第一半多孔材料中的一种或多种第二分析物的位置通过免疫荧光来确定。在一些实施方式中，一种或多种可检测标记物(例如，荧光团标记的抗体)与保留在第一半多孔材料中的一种或多种第二分析物结合，并且通过在合适条件下检测可检测标记物来确定一种或多种第二分析物的位置。在一些实施方式中，一种或多种荧光团标记的抗体与保留在第一半多孔材料中的一种或多种第二分析物结合，并且通过对荧光团标记的抗体成像(此时荧光团被合适波长的光激发)来确定一种或多种第二分析物的位置。在一些实施方式中，通过将免疫荧光数据与生物样品的图像相关联来确定生物样品中一种或多种第二分析物的位置。在一些实施方式中，一种或多种核酸保留在第一半多孔材料中。在一些实施方式中，保留在第一半多孔材料中的一种或多种第二分析物的位置通过原位杂交确定。在一些实施方式中，通过将原位杂交数据与生物样品的图像相关联来确定生物样品中一种或多种第二分析物的位置。
在一些实施方式中，第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物(例如，本文所述分析物的任何类别或亚类)。在一些实施方式中，保留在第二半多孔材料中的一种或多种第三分析物的位置通过免疫荧光来确定。在一些实施方式中，一种或多种可检测标记物(例如，荧光团标记的抗体)与保留在第二半多孔材料中的一种或多种第三分析物结合，并且一种或多种第三分析物的位置通过在合适的条件下检测可检测标记物来确定。在一些实施方式中，一种或多种荧光团标记的抗体与保留在第二半多孔材料中的一种或多种第三分析物结合，并且通过对荧光团标记的抗体成像(此时荧光团被合适波长的光激发)来确定一种或多种第三分析物的位置。在一些实施方式中，一种或多种第三分析物在生物样品中的位置通过将免疫荧光数据与生物样品的图像相关联来确定。在一些实施方式中，一种或多种核酸保留在第二半多孔材料中。在一些实施方式中，保留在第二半多孔材料中的一种或多种第三分析物的位置通过原位杂交确定。在一些实施方式中，生物样品中一种或多种第三分析物的位置通过将原位杂交数据与生物样品的图像相关联来确定。
在一些实施方式中，第一半多孔材料保留来自生物样品的一种或多种第二分析物并且第二半多孔材料保留来自生物样品的一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物在第一半多孔材料中的位置通过免疫荧光确定，并且一种或多种第三分析物在第二半多孔材料中的位置通过原位杂交确定。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物的位置通过将免疫荧光数据与生物样品的图像相关联来确定，并且一种或多种第三分析物的位置通过将原位杂交数据与生物样品的图像相关联来确定。
在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括提供包含多个第二捕获探针的第二阵列。在一些实施方式中，各第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)能结合(例如，杂交)至一种或多种第二分析物或分析物捕获序列的第二捕获域。在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括将第二电场施加到包含一种或多种第二分析物的第一半多孔材料和第二阵列，从而使得电场促进一种或多种第二分析物沿第二阵列方向的迁移。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物结合(例如，杂交)至第二阵列上的第二捕获探针上的第二捕获域。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物是miRNA。在一些实施方式中，确定第二阵列上的第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，全部或部分空间条形码的序列)或其互补物，以及对应捕获的第二分析物的序列的全部或部分或其互补物。在一些实施方式中，生物样品中一种或多种第二分析物的位置是基于第二阵列上第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，空间条形码的全部或部分的序列)或其互补物，以及对应捕获的一种或多种第二分析物的序列的全部或部分或其互补物来确定。在一些实施方式中，确定生物样品中一种或多种第二分析物的位置包括确定第二阵列上的第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，全部或部分空间条形码)，或其互补物，以及相应捕获的一种或多种第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并将所述序列信息与生物样品的图像相关联。在一些实施方式中，本文所述的方法还包括获得生物样品的图像。
在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括提供包含多个第三捕获探针的第三阵列。在一些实施方式中，各第三捕获探针包含(i)第三空间条形码和(ii)能结合(例如，杂交)至一种或多种第三分析物的第三捕获域。在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括将第三电场施加到包含一种或多种第三分析物的第二半多孔材料和第三阵列，从而使得电场促进一种或多种第三分析物沿第三阵列方向的迁移。在一些实施方式中，一种或多种第三分析物结合(例如，杂交)至第三阵列上的第三捕获探针上的第三捕获域。在一些实施方式中，一种或多种第三分析物可以是miRNA。在一些实施方式中，确定第三阵列上的第三捕获探针的序列的全部或部分(例如，第三捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应捕获的第三分析物的序列的全部或部分或其互补物。在一些实施方式中，生物样品中一种或多种第三分析物的位置基于第三阵列上的第三捕获探针的序列的全部或部分(例如，第三捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应捕获的一种或多种第三分析物的序列的全部或部分或其互补物来确定。在一些实施方式中，确定一种或多种第三分析物在生物样品中的位置包括确定第三阵列上第三捕获探针的序列的全部或部分(例如，第三捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应捕获的一种或多种第三分析物的序列的全部或部分或其互补物，和将所述序列信息与生物样品的图像相关联。
f)分析物捕获剂
在一些实施方式中，本文所述的方法包括提供包含多个第一捕获探针的第一阵列。在一些实施方式中，各第一捕获探针包含(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域。在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括提供包含多个第二捕获探针的第二阵列。在一些实施方式中，各第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)能结合至一种或多种分析物捕获序列的第二捕获域。
在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括在生物样品和阵列之间提供一种半多孔材料。在一些实施方式中，半多孔材料可以是渗透膜。在一些实施方式中，半多孔材料可以是凝胶(例如，水凝胶或有机凝胶)。例如，半多孔材料可以是SDS-PAGE凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料可具有基本上均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料可具有不均匀的孔径。例如，半多孔材料可以是梯度凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料可含有透化缓冲液。在一些实施方式中，半多孔材料可含有电泳缓冲液。
在一些实施方式中，半多孔材料含有多种分析物捕获剂(例如，本文所述的任何示例性分析物捕获剂)并且各分析物捕获剂含有(i)能特异性结合至第二分析物的分析物结合部分(例如，本文所述的任何示例性分析物结合部分)、(ii)分析物结合部分条形码和(iii)能特异性结合(例如，杂交)至第二阵列上的第二捕获探针的第二捕获域的分析物捕获序列。在一些实施方式中，分析物结合部分可以是抗体或其抗原结合片段(例如，Fab)。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物可以是蛋白质。在一些实施方式中，半多孔材料可以通过使用分析物捕获剂(例如，通过分析物结合部分的特异性结合)保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，分析物捕获剂可以通过应用裂解域而从半多孔材料中释放出来。
在一些实施方式中，用于确定分析物在生物样品中的位置的方法包括向生物样品、半多孔材料和第一阵列施加第一电场，从而使得第一电场促进一种或多种分析物(例如，一种或多种第一分析物)沿第一阵列方向的迁移。在一些实施方式中，一种或多种第一分析物穿过半多孔材料并结合(例如，杂交)至第一阵列上的捕获探针上的第一捕获域。在一些实施方式中，一种或多种mRNA穿过半多孔材料并结合(例如，杂交)至第一阵列上的第一捕获探针上的第一捕获域。在一些实施方式中，确定第一阵列上的第一捕获探针的序列的全部或部分(例如，第一捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应捕获的第一分析物的序列的全部或部分或其互补物。在一些实施方式中，生物样品中一种或多种第一分析物的位置基于第一阵列上的第一捕获探针的序列的全部或部分(例如，第一捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应捕获的一种或多种第一分析物的序列的全部或部分或其互补物来确定。在一些实施方式中，确定一种或多种第一分析物在生物样品中的位置包括确定第一阵列上第一捕获探针的序列的全部或部分(例如，第一捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应捕获的一种或多种第一分析物的序列的全部或部分或其互补物，和将所述序列信息与生物样品的图像相关联。
在一些实施方式中，半多孔材料可通过应用分析物捕获剂来保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，在半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后，移出半多孔材料。在一些实施方式中，在半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后，去除第一电场。在一些实施方式中，结合到分析物捕获剂的第二分析物通过应用分析物捕获剂中的裂解域而从半多孔材料释放。
在一些实施方式中，本文所述的方法还可包括将第二电场施加到包含一种或多种第二分析物的半多孔材料和第二阵列，从而使得电场促进一种或多种第二分析物沿第二阵列方向的迁移。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物通过分析物捕获剂的分析物捕获序列与第二阵列上的第二捕获探针上的第二捕获域之间的特异性结合(例如，杂交)而结合至第二阵列。在一些实施方式中，一种或多种第二分析物是蛋白质。在一些实施方式中，确定第二阵列上的第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，第二捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应分析物结合部分条形码的序列的全部或部分或其互补物(捕获的分析物捕获剂上)。在一些实施方式中，生物样品中一种或多种第二分析物的位置基于第二阵列上第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，第二捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应分析物结合部分条形码的序列的全部或部分或其互补物(捕获的分析物捕获剂上)来确定。在一些实施方式中，确定生物样品中一种或多种第二分析物的位置包括确定第二阵列上第二捕获探针的序列的全部或部分(例如，第二捕获探针的全部或部分空间条形码)或其互补物，以及对应分析物结合部分条形码的序列的全部或部分或其互补物(在捕获的分析物捕获剂上)，并将这些序列信息与生物样品的图像相关联。
图4A-C显示了空间转移分析物和多组学空间分析的示例。图4A显示了用于将分析物从生物样品空间转移到捕获探针阵列以及两种半多孔材料的示例性基材构造。在一些实例中，生物样品402(例如，组织样品)可与第二基材422接触。在一些实施方式中，生物样品402包含三种感兴趣的分析物441-43。在一些实施方式中，第一基材404可在其表面上具有一个或多个覆层(例如，本文所述的任何导电基材)。覆层的非限制性示例包括导电氧化物(例如，氧化铟锡)。在一些实施方式中，第一基材404可在其表面上具有官能化化学。在图4A-C所示的示例中，第一基材404覆有第一覆层406，并且第一覆层406(例如，导电覆层)进一步覆盖有捕获探针408。在一些实施方式中，第一涂层406是氧化铟锡(ITO)覆层。在一些实施方式中，捕获探针408是捕获探针(例如，本文所述的任何捕获探针)的阵列。在一些实施方式中，基材可包括ITO覆层。在一些实施方式中，基材可包括捕获探针或附接到基材上特征的捕获探针。在一些实施方式中，两个半多孔材料431-32放置在第一基材404和第二基材422之间。在一些实施方式中，两种半多孔材料431-32中的一种或多种是水凝胶。在一些实施方式中，两种半多孔材料431-32中的一种或多种是硝化纤维素膜。在一些实施方式中，两种半多孔材料431-32中的一种或多种用化学物质功能化以特异性或非特异性保留分析物(例如，抗体功能化以特异性捕获蛋白质分析物，特异性寡核苷酸探针功能化以特异性保留微小RNA分析物)。
图4B显示了用于空间转移分析物441-443的示例示意性工作流程。在一些实施方式中，生物样品402包括三种分析物441-443。在一些实施方式中，分析物441-443带负电。第一基材404可以包括捕获探针408的阵列，其固定或附接至第一基材404或附接至基材上的特征(例如，珠)。在一些实施方式中，捕获探针408可以包括本文公开的任何捕获探针。在一些实施方式中，第一基材402不包括特征，而是将捕获探针408直接附接到基材表面。在一些实施方式中，捕获探针408带正电。
生物样品402、两个半多孔材料431-32和捕获探针408(例如捕获探针阵列)可与缓冲液410接触。在一些实施方式中，缓冲液410可包括透化试剂。透化试剂的非限制性示例包括酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶和胶原酶)、洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚山梨酯80和聚山梨酯20)、核糖核酸酶抑制剂、电泳优化的缓冲液、透化优化的缓冲液、杂交优化的缓冲液，或其组合。透化试剂还可包括但不限于干燥透化试剂、透化缓冲液、不含透化试剂的缓冲液、透化凝胶和透化溶液。在一些示例中，生物样品(例如，组织样品)可首先透化，然后进行电泳。
在一些实施方式中，分析物441-43是蛋白质或核酸。在一些实施方式中，分析物441-43是带负电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，捕获探针408是蛋白质或核酸。在一些实施方式中，捕获探针408是带正电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，分析物443是带负电荷的转录物。在一些实施方式中，分析物443是含有多聚(A)的转录物。在一些实施方式中，捕获探针408附接至特征阵列中的特征。在一些实施方式中，缓冲液410可以与生物样品402、第一基材404、第二基材422或其任何组合接触。
如图4B所示，生物样品402可以进行电泳。在电泳期间，生物样品402经受可通过将生物样品402夹在第一基材404和第二基材422之间、将每个基材分别连接到阴极和阳极并使电流流过基材而产生的电场。电场“-E”的施加导致分析物441-443(例如，带负电的分析物)向基材404和捕获探针408迁移(例如，带正电的捕获探针)，以图4B所示的箭头方向。在一些实施方式中，分析物441-443通过透化生物样品中的一个或多个透化细胞向捕获探针408迁移(例如，从透化细胞中的原始位置到捕获探针408中或接近捕获探针408的终位置)。第二基材422可包括第一涂层406(例如，导电涂层)，从而允许产生电场“-E”。在一些实施方式中，分析物441被半多孔材料431保留。在一些实施方式中，分析物442被半多孔材料432保留。在一些实施方式中，分析物443被第一基材404上的捕获探针408捕获。
图4C显示了根据图4A中的设置空间转移分析物441-43的结果。图4B显示分析物441被半多孔材料441保留；分析物442被半多孔材料442保留；分析物443被第一基材404上的捕获探针408捕获。在一些实施方式中，分析物441是蛋白质；分析物442是微小RNA；且分析物443是mRNA。在一些实施方式中，在空间转移分析物441-43之后，对包含分析物441的半多孔材料431进行免疫荧光分析。在一些实施方式中，在空间转移分析物441-43之后，对包含分析物442的半多孔材料432进行受原位杂交分析。在一些实施方式中，在空间转移分析物441-43之后，确定捕获探针408(或其互补物)的序列和分析物443(或其互补物)的序列。
其他实施方式
图5显示了用于空间转移分析物541-543的示例示意性工作流程，其中半多孔材料531用作过滤器。在一些实施方式中，凝胶或其它类型的半多孔材料531可用作过滤器以排除不同于目标分析物543的分子。在此示例中，RNA转录物是可以通过过滤器531的目标分析物543，其它分子如蛋白质、脂质等被排除在外。在一些实施方式中，排除分子的选择可以基于物理化学性质如电荷、尺寸(长度、回转半径、有效直径等)、疏水性、亲水性、分子结合(例如，免疫亲和性)等。在一些在实施方式中，使用半多孔材料531作为过滤器可以减少捕获探针508的非特异性结合并因此提高结合特异性和测定性能。
在一些实施方式中，生物样品502包括三种分析物541-543。在一些实施方式中，分析物541-543带电(例如，正电荷或负电荷)。第一基材504可以包括固定或附接到第一基材504或附接到基材上的特征(例如，珠或孔或位置)的捕获探针508的阵列。在一些实施方式中，捕获探针508可以包括本文公开的任何捕获探针。在一些实施方式中，第一基材504不包括特征，而是将捕获探针508直接附接到基材表面。在一些实施方式中，捕获探针508带正电。
生物样品502、半多孔材料531和捕获探针508(例如，捕获探针阵列)可以与缓冲液510接触。在一些实施方式中，缓冲液510可包括透化试剂。透化试剂的非限制性示例包括酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶和胶原酶)、洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚山梨酯80和聚山梨酯20)、核糖核酸酶抑制剂、电泳优化的缓冲液、透化优化的缓冲液、杂交优化的缓冲液，或其组合。透化试剂还可包括但不限于干燥透化试剂、透化缓冲液、不含透化试剂的缓冲液、透化凝胶和透化溶液。在一些示例中，生物样品(例如，组织样品)可首先透化，然后进行电泳。
在一些实施方式中，分析物541-43是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物541-43是带负电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，捕获探针508是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针508是带正电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物543是带负电荷的转录物。在一些实施方式中，分析物543是含有多聚(A)的转录物。在一些实施方式中，捕获探针508附接到阵列上的特征。在一些实施方式中，缓冲液510可以与生物样品502、第一基材504、第二基材522或其任何组合接触。
在图5中，生物样品502可以进行电泳。在电泳过程中，生物样品502受到电场作用，该电场可以通过将生物样品502放置在第一基材504和第二基材522之间，分别将各基材连接到阴极和阳极，并对基材通电来产生。电场“-E”的施加导致分析物541-543(例如，带负电的分析物)向基材504和捕获探针508迁移(例如，带正电的捕获探针)，以图5所示的箭头方向。在一些实施方式中，分析物541-543从透化生物样品向捕获探针508迁移(例如，从透化细胞中的原始位置到捕获探针508中或捕获探针508附近的终位置)。第二基材522可包括第一涂层506(例如，导电涂层)，从而允许产生电场“-E”。在一些实施方式中，分析物541-542被半多孔材料531保留。在一些实施方式中，分析物543被第一基材508上的捕获探针504捕获。
图6显示用于空间转移分析物643-644的示例示意性工作流程，其中半多孔材料631用作分子筛。在一些实施方式中，凝胶或其它类型的半多孔材料631可用作电泳分子分离的分子筛。分离可以基于例如电荷、大小(长度、回转半径、有效直径等)、电泳迁移率、ζ电位、等电点、疏水性、亲水性、分子结合(例如免疫亲和性)等物理化学性质发生。在一些实施方式中，半多孔材料631可以具有均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料631可具有孔径的不连续性或孔径的梯度，如不同的凝胶电泳方案通常所用那样。如图6所示，基于分析物的长度分离分析物643-644，与较长的分析物644相比，较短的分析物643具有较高的电泳迁移率，因此通过半多孔材料631迁移得更远。在一些实施方式中，可以通过使用不同的半多孔材料631组合物和不同的电泳方案(例如，不同的持续时间或电压)来选择分析物643-644的特定亚级分成分(sub-fraction)。
在一些实施方式中，生物样品602包括分析物643-644。在一些实施方式中，分析物643-644带负电。第一基材604可以包括捕获探针608的阵列，其固定或附接至第一基材604或附接至基材上的特征(例如，珠)。在一些实施方式中，捕获探针608可以包括本文公开的任何捕获探针。在一些实施方式中，第一基材602不包括特征，而是将捕获探针608直接附接到基材表面。
生物样品602、半多孔材料631和捕获探针608(例如，捕获探针阵列)可以与缓冲液610接触。在一些实施方式中，缓冲液610可以包含透化缓冲液。透化试剂的非限制性示例包括酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶和胶原酶)、洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚山梨酯80和聚山梨酯20)、核糖核酸酶抑制剂、电泳优化的缓冲液、透化优化的缓冲液、杂交优化的缓冲液，或其组合。透化试剂还可包括但不限于干燥透化试剂、透化缓冲液、不含透化试剂的缓冲液、透化凝胶和透化溶液。在一些示例中，生物样品(例如，组织样品)可首先透化，然后进行电泳。
在一些实施方式中，分析物643-644可以是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物643-644是带负电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针608是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针608是带正电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物643-644是带负电荷的转录物。在一些实施方式中，分析物643-644是含有多聚(A)的转录物。在一些实施方式中，捕获探针608附接至特征阵列中的特征。在一些实施方式中，缓冲液610可以与生物样品602、第一基材604、第二基材622或其任何组合接触。
在图6中，生物样品602可以进行电泳。在电泳过程中，生物样品602受到电场作用，该电场可以通过将生物样品602放置在第一基材604和第二基材622之间，分别将各基材连接到阴极和阳极，并对基材通电来产生。电场“-E”的施加导致分析物643-644(例如，带负电的分析物)向基材604和捕获探针608迁移，沿图6所示的箭头方向。在一些实施方式中，分析物643-644从透化生物样品向捕获探针608迁移(例如，从透化细胞中的原始位置到捕获探针608中或捕获探针508附近的终位置)。第二基材622可包括第一涂层606(例如，导电涂层)，从而允许产生电场“-E”。在一些实施方式中，较短的分析物643更有效地迁移通过半多孔材料631并到达捕获探针608，而较长的分析物644要么在半多孔材料631界面处被排除，要么更缓慢地迁移通过半多孔材料631并且到达不了捕获探针608。
图7A-B显示了用于空间转移分析物743的示例示意性工作流程，其中半多孔材料731产生分子“堆叠”(例如，增加电迁移实体的浓度)。在一些实施方式中，半多孔材料731具有孔径的不连续性。图7A所示的示例中，半多孔材料731在靠近捕获探针708的部分具有较小的孔径，而在靠近生物样品702的部分具有较大的孔径。在一些实施方式中，由于孔径的不连续性，分析物743在当它们迁移通过半多孔材料731时会减慢并堆叠。在一些实施方式中，半多孔材料731具有孔径梯度。图7B所示的示例，半多孔材料731具有孔径梯度，其中在捕获探针708附近孔径较小，在生物样品702附近孔径较大。在一些实施方式中，由于孔径梯度，分析物743在它们迁移通过半多孔材料731时降低转移和堆积的速率。在一些实施方式中，这种“堆积”效应增加了分析物743到达捕获探针708时的浓度，导致有利的结合动力学和更好的测定灵敏度。在一些实施方式中，孔径的不连续性也可用于增加不同尺寸和/或长度的分子之间的分离分辨率。
在一些实施方式中，生物样品702包括分析物743。在一些实施方式中，分析物743带负电。第一基材704可以包括捕获探针708的阵列，其固定或附接至第一基材704或附接至基材上的特征(例如，珠)。在一些实施方式中，捕获探针708可以包括本文公开的任何捕获探针。在一些实施方式中，第一基材702不包括特征，而是将捕获探针708直接附接到基材表面。
生物样品702、半多孔材料731和捕获探针708(例如，捕获探针阵列)可以与缓冲液710接触。在一些实施方式中，缓冲液710可以包含透化缓冲液。透化试剂的非限制性示例包括酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶和胶原酶)、洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚山梨酯80和聚山梨酯20)、核糖核酸酶抑制剂、电泳优化的缓冲液、透化优化的缓冲液、杂交优化的缓冲液，或其组合。透化试剂还可包括但不限于干燥透化试剂、透化缓冲液、不含透化试剂的缓冲液、透化凝胶和透化溶液。在一些示例中，生物样品(例如，组织样品)可首先透化，然后进行电泳。
在一些实施方式中，分析物743可以是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物743是带负电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针708是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针708是带正电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物743是带负电荷的转录物。在一些实施方式中，分析物743是含有多聚(A)的转录物。在一些实施方式中，捕获探针708附接至特征阵列中的特征。在一些实施方式中，缓冲液710可以与生物样品702、第一基材704、第二基材722或其任何组合接触。
在图7A-B中，生物样品702可以进行电泳。在电泳期间，生物样品702经受可通过将生物样品702夹在第一基材704和第二基材722之间、将每个基材分别连接到阴极和阳极并使电流流过基材而产生的电场。电场“-E”的施加导致分析物743(例如，带负电的分析物)向基材704和捕获探针708迁移，沿图7A-B所示的箭头方向。在一些实施方式中，分析物743从透化生物样品向捕获探针708迁移(例如，从透化细胞中的原始位置到捕获探针708中或捕获探针708附近的终位置)。第二基材722可包括第一涂层706(例如，导电涂层)，从而允许产生电场“-E”。
图8显示了用于空间转移分析物843的示例示意性工作流程，其中半多孔材料831产生分子“堆叠”(增加电迁移实体的浓度)。在一些实施方式中，不连续的缓冲液可用于等速电泳(ITP)。在图8中所示的示例中，选择前导电解质和拖尾电解质缓冲液的电泳迁移率以堆积目标分析物843。在一些实施方式中，分析物843在它们电迁移通过半多孔材料831时被浓缩。在一些实施方式中，这种“堆积”效应增加了分析物843到达捕获探针808时的浓度，导致有利的结合动力学和更好的测定灵敏度。在一些实施方式中，孔径的不连续性也可用于增加不同尺寸/长度的分子之间的分离分辨率。在一些实施方式中，ITP可以与基于凝胶的分离结合使用(例如，ITP在基于尺寸的分离之前堆积)。
在一些实施方式中，生物样品802包括分析物843。在一些实施方式中，分析物843带负电。第一基材804可以包括捕获探针808的阵列，其固定或附接至第一基材804或附接至基材上的特征(例如，珠)。在一些实施方式中，捕获探针808可以包括本文公开的任何捕获探针。在一些实施方式中，第一基材802不包括特征，而是将捕获探针808直接附接到基材表面。在一些实施方式中，捕获探针808带正电。
生物样品802、半多孔材料831和捕获探针808(例如，捕获探针阵列)可以与缓冲液810接触。在一些实施方式中，缓冲液810可以包含透化缓冲液。透化试剂的非限制性示例包括酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶和胶原酶)、洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚山梨酯80和聚山梨酯20)、核糖核酸酶抑制剂、电泳优化的缓冲液、透化优化的缓冲液、杂交优化的缓冲液，或其组合。透化试剂还可包括但不限于干燥透化试剂、透化缓冲液、不含透化试剂的缓冲液、透化凝胶和透化溶液。在一些示例中，生物样品(例如，组织样品)可首先透化，然后进行电泳。
在一些实施方式中，分析物843可以是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物843是带负电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针808是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针808是带正电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物843是带负电荷的转录物。在一些实施方式中，分析物843是含有多聚(A)的转录物。在一些实施方式中，捕获探针808附接至特征阵列中的特征。在一些实施方式中，缓冲液810可以与生物样品802、第一基材804、第二基材822或其任何组合接触。
在图8中，生物样品802可以进行电泳。在电泳期间，生物样品802经受可通过将生物样品802夹在第一基材804和第二基材822之间、将每个基材分别连接到阴极和阳极并使电流流过基材而产生的电场。电场“-E”的施加导致分析物843(例如，带负电的分析物)向基材804和捕获探针808迁移，沿图8所示的箭头方向。在一些实施方式中，分析物843从透化生物样品向捕获探针808迁移(例如，从透化细胞中的原始位置到捕获探针808中或捕获探针708附近的终位置)。第二基材822可包括第一涂层806(例如，导电涂层)，从而允许产生电场“-E”。
图9显示了用于空间转移分析物943的示例示意性工作流程，其中缓冲液910仅接触生物样品902的特定区域(例如，感兴趣区域)。在一些实施方式中，缓冲液910仅接触生物样品902的第一区域，从而使得只有来自第一区域的分析物943可以转移至捕获探针908。
在一些实施方式中，生物样品902包括分析物943。在一些实施方式中，分析物943带负电。第一基材904可以包括捕获探针908的阵列，其固定或附接至第一基材904或附接至基材上的特征(例如，珠)。在一些实施方式中，捕获探针908可以包括本文公开的任何捕获探针。在一些实施方式中，第一基材902不包括特征，而是将捕获探针908直接附接到基材表面。在一些实施方式中，捕获探针908带正电。
生物样品902、半多孔材料99和捕获探针908(例如，捕获探针阵列)可以与缓冲液910接触。在一些实施方式中，缓冲液910包含透化试剂。透化试剂的非限制性示例包括酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶和胶原酶)、洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚山梨酯80和聚山梨酯20)、核糖核酸酶抑制剂、电泳优化的缓冲液、透化优化的缓冲液、杂交优化的缓冲液，或其组合。透化试剂还可包括但不限于干燥透化试剂、透化缓冲液、不含透化试剂的缓冲液、透化凝胶和透化溶液。在一些示例中，生物样品(例如，组织样品)可首先透化，然后进行电泳。
在一些实施方式中，分析物943可以是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物943是带负电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针908是蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，捕获探针908是带正电荷的蛋白质和/或核酸。在一些实施方式中，分析物943是带负电荷的转录物。在一些实施方式中，分析物943是含有多聚(A)的转录物。在一些实施方式中，捕获探针908附接至特征阵列中的特征。在一些实施方式中，缓冲液910可以与生物样品902、第一基材904、第二基材922或其任何组合接触。
在图9中，生物样品902可以进行电泳。在电泳期间，生物样品902经受可通过将生物样品902夹在第一基材904和第二基材922之间、将每个基材分别连接到阴极和阳极并使电流流过基材而产生的电场。电场“-E”的施加导致分析物943(例如，带负电的分析物)向基材904和捕获探针908迁移，沿图9所示的箭头方向。在一些实施方式中，分析物943从透化生物样品向捕获探针908迁移(例如，从透化细胞中的原始位置到捕获探针908中或捕获探针708附近的终位置)。第二基材922可包括第一涂层906(例如，导电涂层)，从而允许产生电场“-E”。
g)多重分析物捕获***
此外，本文还提供了***，其包括：(a)包含多个捕获探针的阵列，其中多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域；(b)置于生物样品和阵列之间的一种或多种半多孔材料；(c)电场，其中电场促进一种或多种分析物沿阵列的方向迁移，其中捕获探针的捕获结构域能结合至一种或多种分析物的第一分析物。
产生电场的各种方法在本领域中是已知的。向阵列(例如，在一些示例中，第一阵列、第二阵列或两者)、生物样品和一种或多种半多孔材料施加电场的任何合适的方法。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料中的第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物。在一些实施方式中，第一半多孔材料包括多个分析物结合部分，其中多个分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第二分析物中的第二分析物。在一些实施方式中，分析物结合部分是抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，第二分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，所述***包括确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置。在一些实施方式中，确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括免疫荧光染色。在一些实施方式中，确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括：获得第一半多孔材料的图像，并将第一半多孔材料的图像中的免疫荧光染色与生物样品的图像相关联。
在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括第二半多孔材料，其中第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。在一些实施方式中，第二半多孔材料包括针对一种或多种第三分析物的多个分析物结合部分。在一些实施方式中，多个分析物结合部分中的分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第三分析物中的第三分析物。在一些实施方式中，第三分析物是核酸。在一些实施方式中，核酸是miRNA。在一些实施方式中，所述***包括确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置的步骤。在一些实施方式中，确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置包括使用原位杂交。在一些实施方式中，确定第三分析物的位置包括：获得第二半多孔材料的图像并将第二半多孔材料的图像中的原位杂交与生物样品的图像相关联。在一些实施方式中，所述***包括将一种或多种第三分析物与第二半多孔材料交联的步骤。
在一些实施方式中，所述***包括将一种或多种第二分析物与第一半多孔材料交联的步骤。在一些实施方式中，在第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物之后移出第二半多孔材料。在一些实施方式中，所述***包括步骤：在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料；将第二半多孔材料设置于生物样品与阵列之间。
在一些实施方式中，在移出第一半多孔材料并在生物样品和阵列之间布置第二半多孔材料之后施加电场。在一些实施方式中，第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
在一些实施方式中，所述***包括步骤：确定(i)空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并且利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置。
在一些实施方式中，捕获探针还包括以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。
在一些实施方式中，所述***包括对生物样品进行成像。在一些实施方式中，第一分析物是mRNA。在一些实施方式中，半多孔材料包括水凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料包括渗透性膜。在一些实施方式中，半多孔材料具有不均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料具有基本上均匀的孔径。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括一种或多种基准标志物(fiducial marker)，其将一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对齐。在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。在一些实施方式中，所述***包括固定生物样品的步骤。在一些实施方式中，所述***包括使生物样品透化的步骤。在一些实施方式中，第二分析物是蛋白质。在一些实施方式中，电场被施加到生物样品的离散区域。在一些实施方式中，电场被施加到阵列的离散区域。在一些实施方式中，生物样品、半多孔材料和阵列与缓冲液直接接触。
本文还提供了其中一种或多种分析物可以被捕获在第二阵列上的***。例如，来自生物样品的分析物可以通过一种或多种半多孔材料转移并捕获在第一阵列上。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料保留一种或多种分析物。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括多个分析物结合部分(例如，针对核酸的分析物结合部分)。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括多种分析物捕获剂。在一些实施方式中，第一阵列被第二阵列替代并且保留在一种或多种半多孔材料中的分析物被捕获在第二阵列上。在一些实施方式中，第二电场促进一种或多种半多孔材料中的一种或多种分析物向第二阵列的迁移。
因此，本文提供了***，其包括：(a)包含多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包含(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；(b)半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间；(c)第一电场，其中第一电场促进一种或多种分析物沿第一阵列的方向迁移，其中第一捕获域能特异性结合至一种或多种分析物的第一分析物，其中半多孔材料保留一种或多种分析物的第二分析物；(d)包含多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包括(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；(e)第二电场，其中第二电场促进第二分析物沿第二阵列的方向迁移，其中第二捕获域能特异性结合至第二分析物；和(f)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，和利用(i)和(ii)的序列来确定第二分析物在生物样品中的位置。
在一些实施方式中，捕获探针包括以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。在一些实施方式中，第一分析物是mRNA。在一些实施方式中，该***还包括步骤：获得生物样品的图像。在一些实施方式中，半多孔材料包括水凝胶。在一些实施方式中，半多孔材料包括渗透性膜。在一些实施方式中，半多孔材料具有不均匀的孔径。在一些实施方式中，半多孔材料具有基本上均匀的孔径。在一些实施方式中，一种或多种半多孔材料包括一种或多种基准标志物(fiducial marker)，其将一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对齐。
在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。在一些实施方式中，所述***包括固定生物样品的步骤。在一些实施方式中，所述***包括使生物样品透化的步骤。在一些实施方式中，半多孔材料保留来自生物样品的一种或多种分析物。
在一些实施方式中，将第一电场、第二电场或两者施加到生物样品的离散区域。在一些实施方式中，其中第一电场被施加到第一阵列的离散区域。在一些实施方式中，第二电场被施加到第二阵列的离散区域。
在一些实施方式中，生物样品、半多孔材料和第一阵列与缓冲液直接接触。在一些实施方式中，生物样品、半多孔材料和第二阵列与缓冲液直接接触。在一些实施方式中，半多孔材料将一种或多种分析物与生物样品中的其他分子分离。
在一些实施方式中，半多孔材料包括一种或多种分析物结合部分。在一些实施方式中，一种或多种分析物结合部分结合核酸。在一些实施方式中，核酸是miRNA。在一些实施方式中，分析物结合部分与半多孔材料交联。
在一些实施方式中，半多孔材料包括一种或多种分析物捕获剂。在一些实施方式中，一种或多种分析物捕获剂包括(i)分析物结合部分，(ii)分析物结合部分条形码，和(iii)分析物捕获序列。在一些实施方式中，第二分析物是蛋白质。在一些实施方式中，分析物捕获剂与半多孔材料交联。在一些实施方式中，分析物结合部分包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，分析物结合部分条形码识别分析物捕获剂。在一些实施方式中，分析物捕获序列结合第二捕获探针的第二捕获域。
在一些实施方式中，该***包括步骤：(a)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的全部或部分序列，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置；和(b)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)分析物结合部分条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第二分析物的位置。
在一些实施方式中，***还包括基材保持器(例如盒)，其中可以放置任何基材。例如，基材保持器(例如，盒)可以将生物样品保持在基材(例如，载玻片)、第一阵列或第二阵列上。如前所述的基材保持器允许将电泳电流施加到生物样品、基材、一种或多种半多孔材料等的手段以如本文所述从生物样品分离一种或多种分析物。
在一些实施方式中，***还包括计算机和计算机程序，通过其影响电泳电流在***中的应用。
实施方式
实施方式1是一种用于确定生物样品中一种或多种分析物的位置的方法，所述方法包括：(a)提供包含多个捕获探针的阵列，其中多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域；(b)提供一种或多种半多孔材料，其中一种或多种半多孔材料设置在生物样品和阵列之间；(c)向生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿阵列的方向迁移，其中捕获探针的捕获域能特异性结合至一种或多种分析物的第一分析物；和(d)确定(i)空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，和利用(i)和(ii)的序列来确定第一分析物在生物样品中的位置。
实施方式2是实施方式1的方法，其中捕获探针还包含以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。
实施方式3是实施方式1或2的方法，其中第一分析物是mRNA。
实施方式4是实施方式1-3中任一项的方法，其中还包括获得生物样品的图像。
实施方式5是实施方式1-4中任一项的方法，其中一种或多种半多孔材料中的第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物。
实施方式6是实施方式5的方法，其中第一半多孔材料包含多个分析物结合部分，其中多个分析物结合部分的分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第二分析物中的第二分析物。
实施方式7是实施方式6的方法，其中分析物结合部分是抗体或其抗原结合片段。
实施方式8是实施方式6或7的方法，其中第二分析物是蛋白质。
实施方式9是实施方式5-8中任一项的方法，还包括确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置。
实施方式10是实施方式9的方法，其中确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括使用免疫荧光染色。
实施方式11是实施方式10的方法，其中确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括：获得第一半多孔材料的图像，并将第一半多孔材料的图像中的免疫荧光染色与生物样品的图像相关联。
实施方式12是实施方式1中任一项的方法，其中一种或多种半多孔材料包括第二半多孔材料，其中第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
实施方式13是实施方式12的方法，其中第二半多孔材料包含用于一种或多种第三分析物的多个分析物结合部分。
实施方式14是实施方式13的方法，其中多个分析物结合部分中的分析物结合部分能特异性结合至一种或多种第三分析物中的第三分析物。
实施方式15是实施方式14的方法，其中第三分析物是核酸。
实施方式16是实施方式15的方法，其中核酸是miRNA。
实施方式17是实施方式12-16中任一项的方法，还包括确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置。
实施方式18是实施方式17的方法，其中确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置包括使用原位杂交。
实施方式19是实施方式18的方法，其中确定第三分析物的位置包括：获得第二半多孔材料的图像；将第二半多孔材料的图像中的原位杂交与生物样品的图像相关联。
实施方式20是实施方式1的方法，其中一种或多种半多孔材料将一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。
实施方式21是实施方式1-20中任一项的方法，其中一种或多种半多孔材料包括水凝胶。
实施方式22是实施方式1-20中任一项的方法，其中一种或多种半多孔材料包括渗透性膜。
实施方式23是实施方式1-22中任一项的方法，其中一种或多种半多孔材料中的至少一种具有不均匀的孔径。
实施方式24是实施方式1-22中任一项的方法，其中一种或多种半多孔材料中的至少一种具有基本上均匀的孔径。
实施方式25是实施方式1-24中任一项的方法，其中电场被施加到生物样品的离散区域。
实施方式26是实施方式1-24中任一项的方法，其中电场被施加到阵列的离散区域。
实施方式27是实施方式4的方法，其中一种或多种半多孔材料包括一种或多种基准标志物，其将一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对齐。
实施方式28是实施方式1-27中任一项的方法，其中生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列与缓冲液直接接触。
实施方式29是实施方式5的方法，还包括将一种或多种第二分析物与第一半多孔材料交联。
实施方式30是实施方式12的方法，还包括将一种或多种第三分析物与第二半多孔材料交联。
实施方式31是实施方式5的方法，还包括在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料。
实施方式32是实施方式12的方法，还包括在第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物之后移出第二半多孔材料。
实施方式33是实施方式12的方法，其中所述方法还包括：在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料；和将第二半多孔材料设置于生物样品与阵列之间。
实施方式34是实施方式33的方法，其中在移出生物样品和阵列之间的第一半多孔材料和布置第二半多孔材料之后施加电场。
实施方式35是实施方式34的方法，其中第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
实施方式36是实施方式1-35中任一项的方法，其中所述生物样品是组织切片。
实施方式37是实施方式1-35中任一项的方法，其中生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。
实施方式38是实施方式1-35中任一项所述的方法，还包括固定生物样品的步骤。
实施方式39是实施方式1-35的方法，还包括透化生物样品的步骤。
实施方式40是一种用于确定生物样品中一种或多种分析物的位置的方法，所述方法包括：(a)提供包含多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包含(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；(b)提供半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间；(c)向生物样品、半多孔材料和第一阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿第一阵列的方向迁移，其中第一捕获域能特异性结合至一种或多种分析物中的第一分析物，其中半多孔材料保留一种或多种分析物中的第二分析物；(d)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置；(e)提供包含多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；(f)向半多孔材料和第二阵列施加电场，其中电场促进第二分析物沿第二阵列的方向迁移，其中第二捕获域能特异性结合至第二分析物；和(g)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列以确定第二分析物在生物样品中的位置。
实施方式41是实施方式40的方法，其中捕获探针还包含以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。
实施方式42是实施方式40或41的方法，其中第一分析物是mRNA。
实施方式43是实施方式40-42中任一项的方法，其中所述方法还包括获得生物样品的图像。
实施方式44为实施方式43的方法，其中半多孔材料包含一种或多种分析物结合部分。
实施方式45是实施方式44的方法，其中一种或多种分析物结合部分能特异性结合至核酸。
实施方式46是实施方式45的方法，其中核酸是miRNA。
实施方式47是实施方式40的方法，其中半多孔材料保留生物样品中的一种或多种分析物。
实施方式48是实施方式40-47中任一项的方法，其中半多孔材料包括水凝胶。
实施方式49是实施方式40-47中任一项的方法，其中半多孔材料包括渗透性膜。
实施方式50是实施方式40-49中任一项的方法，其中半多孔材料具有不均匀的孔径。
实施方式51为实施方式40-49中任一项的方法，其中半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
实施方式52是实施方式40-51中任一项的方法，其中电场被施加到生物样品的离散区域。
实施方式53是实施方式40-51中任一项的方法，其中电场被施加到第一阵列的离散区域。
实施方式54是实施方式40-53中任一项的方法，其中电场被施加到第二阵列的离散区域。
实施方式55是实施方式43的方法，其中半多孔材料包括一种或多种基准标志物，其将半多孔材料与生物样品的图像对准。
实施方式56为实施方式40-55中任一项的方法，其中，在步骤(c)中，生物样品、半多孔材料和第一阵列与缓冲液直接接触。
实施方式57为实施方式40-56中任一项的方法，其中，在步骤(f)中，半多孔材料和第二阵列与缓冲液直接接触。
实施方式58是实施方式40-57中任一项的方法，还包括将第二分析物与半多孔材料交联。
实施方式59是实施方式40-58的方法，其中生物样品是组织切片。
实施方式60是实施方式40-58的方法，其中生物样品是***固定石蜡包埋的。
实施方式61是实施方式40-58的方法，还包括固定生物样品的步骤。
实施方式62是实施方式40-58的方法，还包括透化生物样品的步骤。
实施方式63是一种用于确定生物样品中一种或多种分析物的位置的方法，所述方法包括：(a)提供包含多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包含(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；(b)提供半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间，其中半多孔材料包含分析物捕获剂，所述分析物捕获剂包含(i)分析物结合部分，(ii)分析物结合部分条形码，和(iii)分析物捕获序列；(c)对生物样品、半多孔材料和第一阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿第一阵列的方向迁移，其中第一捕获域能特异性结合至一种或多种分析物的第一分析物，并且其中分析物结合部分能特异性结合至一种或多种分析物的第二分析物，并且半多孔材料保留第二分析物；(d)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置；(e)提供包含多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；(f)向半多孔材料和第二阵列施加电场，其中电场促进第二分析物沿第二阵列的方向迁移，其中第二捕获域能特异性结合至分析物捕获序列；和(g)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)分析物结合部分条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第二分析物的位置。
实施方式64为实施方式63的方法，其中第一捕获探针和第二捕获探针之一或两者还包含裂解域、功能域和独特分子标识符中的一个或多个。
实施方式65是实施方式63或64的方法，其中第一分析物是mRNA。
实施方式66是实施方式63-65中任一项的方法，其中所述方法还包括获得生物样品的图像。
实施方式67是实施方式63-66中任一项的方法，其中分析物捕获剂与半多孔材料交联。
实施方式68是实施方式63-66中任一项的方法，其中第二分析物是蛋白质。
实施方式69为实施方式63-67中任一项的方法，其中分析物结合部分包含抗体或其抗原结合片段。
实施方式70是实施方式63-69中任一项的方法，其中半多孔材料将生物样品中的一种或多种分析物与其它分子分离。
实施方式71是实施方式63-70中任一项的方法，其中半多孔材料包括水凝胶。
实施方式72是实施方式63-70中任一项的方法，其中半多孔材料包括渗透性膜。
实施方式73是实施方式63-72中任一项的方法，其中半多孔材料具有不均匀的孔径。
实施方式74为实施方式63-72中任一项的方法，其中半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
实施方式75是实施方式63-74中任一项的方法，其中电场被施加到生物样品的离散区域。
实施方式76是实施方式63-75中任一项的方法，其中电场被施加到第一阵列的离散区域。
实施方式77是实施方式63-76中任一项的方法，其中电场被施加到第二阵列的离散区域。
实施方式78是实施方式66的方法，其中半多孔材料包括一种或多种基准标志物，其将半多孔材料与生物样品的图像对准。
实施方式79是实施方式63-74中任一项的方法，其中在步骤(c)期间，生物样品、半多孔材料和第一阵列与缓冲液直接接触。
实施方式80是实施方式63-75中任一项的方法，其中在步骤(f)期间，半多孔材料和第二阵列与缓冲液直接接触。
实施方式81是实施方式63-76中任一项的方法，还包括将第二分析物与半多孔材料和分析物捕获剂之一或两者交联。
实施方式82是实施方式63-81的方法，其中生物样品是组织切片。
实施方式83是实施方式63-81的方法，其中生物样品是***固定石蜡包埋的。
实施方式84是实施方式63-81的方法，还包括固定生物样品的步骤。
实施方式85是实施方式63-81的方法，还包括透化生物样品的步骤。
Claims (156)
1.一种确定生物样品中一种或多种分析物位置的方法，所述方法包括：
(a)提供包含多个捕获探针的阵列，其中多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域；
(b)提供一种或多种半多孔材料，其中一种或多种半多孔材料设置在生物样品和阵列之间；
(c)向生物样品、一种或多种半多孔材料和阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿阵列的方向迁移，其中捕获探针的捕获域能特异性结合至一种或多种分析物中的第一分析物；和
(d)确定(i)空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定第一分析物在生物样品中的位置。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针还包含以下一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一分析物是mRNA。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中还包括获得所述生物样品的图像。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种半多孔材料中的第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一半多孔材料包含多个分析物结合部分，其中所述多个分析物结合部分中的分析物结合部分能特异性结合至所述一种或多种第二分析物中的第二分析物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述分析物结合部分是抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述第二分析物是蛋白质。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，还包括确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置。
10.如权利要求9所述的方法，其中确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括使用免疫荧光染色。
11.如权利要求10所述的方法，其中确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置包括：
获得第一半多孔材料的图像；和
将第一半多孔材料的图像中的免疫荧光染色与生物样品的图像相关联。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一种或多种半多孔材料包括第二半多孔材料，其中所述第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述第二半多孔材料包含用于所述一种或多种第三分析物的多个分析物结合部分。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述多个分析物结合部分中的分析物结合部分能特异性结合至所述一种或多种第三分析物中的第三分析物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述第三分析物是核酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述核酸是miRNA。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，还包括确定所述第三分析物在所述第二半多孔材料中的位置。
18.如权利要求17所述的方法，其中确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置包括使用原位杂交。
19.如权利要求18所述的方法，其中确定所述第三分析物的位置包括：
获得第二半多孔材料的图像；和
将第二半多孔材料的图像中的原位杂交与生物样品的图像相关联。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种半多孔材料将所述一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述一种或多种半多孔材料包括水凝胶。
22.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述一种或多种半多孔材料包括渗透性膜。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述一种或多种半多孔材料中的至少一种具有不均匀的孔径。
24.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述一种或多种半多孔材料中的至少一种具有基本上均匀的孔径。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述电场被施加到所述生物样品的离散区域。
26.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述电场被施加到所述阵列的离散区域。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种半多孔材料包含一种或多种基准标志物，所述基准标志物将所述一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对准。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述生物样品、所述一种或多种半多孔材料以及所述阵列与缓冲液直接接触。
29.如权利要求5所述的方法，还包括将所述一种或多种第二分析物与所述第一半多孔材料交联。
30.如权利要求12所述的方法，还包括将所述一种或多种第三分析物与所述第二半多孔材料交联。
31.如权利要求5所述的方法，还包括在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料。
32.如权利要求12所述的方法，还包括在第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物之后移出第二半多孔材料。
33.如权利要求12所述的方法，其中，所述方法还包括：
在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料；和
将第二半多孔材料置于生物样品与阵列之间。
34.如权利要求33所述的方法，其中在移出所述第一半多孔材料并在所述生物样品和所述阵列之间布置所述第二半多孔材料之后施加所述电场。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织切片。
37.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。
38.如权利要求1-35中任一项所述的方法，还包括固定所述生物样品的步骤。
39.如权利要求1-35中任一项所述的方法，还包括使所述生物样品透化的步骤。
40.一种确定生物样品中一种或多种分析物位置的方法，所述方法包括：
(a)提供包含多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包含(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；
(b)提供半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间；
(c)向生物样品、半多孔材料和第一阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿第一阵列的方向迁移，其中第一捕获域能特异性地结合一种或多种分析物的第一分析物，其中半多孔材料保留一种或多种分析物的第二分析物；
(d)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定第一分析物在生物样品中的位置；
(e)提供包含多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；
(f)向半多孔材料和第二阵列施加电场，其中电场促进第二分析物沿第二阵列的方向迁移，其中第二捕获域能特异性结合至第二分析物；和
(g)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定第二分析物在生物样品中的位置。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述捕获探针还包含以下一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述第一分析物是mRNA。
43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得该生物样品的图像。
44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料包含一个或多个分析物结合部分。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述一个或多个分析物结合部分能特异性结合至核酸。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述核酸是miRNA。
47.如权利要求40所述的方法，其中所述半多孔材料保留来自所述生物样品的一种或多种分析物。
48.如权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料包括水凝胶。
49.如权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料包括渗透性膜。
50.如权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料具有不均匀的孔径。
51.如权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
52.如权利要求40-51中任一项所述的方法，其中电场被施加到所述生物样品的离散区域。
53.如权利要求40-51中任一项所述的方法，其中，所述电场被施加到所述第一阵列的离散区域。
54.如权利要求40-53中任一项所述的方法，其中，所述电场被施加到所述第二阵列的离散区域。
55.如权利要求43所述的方法，其中所述半多孔材料包含一种或多种基准标志物，所述基准标志物将所述半多孔材料与生物样品的图像对准。
56.如权利要求40-55中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，生物样品、半多孔材料和第一阵列与缓冲液直接接触。
57.如权利要求40-56中任一项所述的方法，其中，在步骤(f)中，所述半多孔材料和所述第二阵列与缓冲液直接接触。
58.如权利要求40-57中任一项所述的方法，还包括将所述第二分析物与所述半多孔材料交联。
59.如权利要求40-58所述的方法，其中所述生物样品是组织切片。
60.如权利要求40-58所述的方法，其中所述生物样品是***固定和石蜡包埋的。
61.如权利要求40-58中任一项所述的方法，还包括固定所述生物样品的步骤。
62.如权利要求40-58中任一项所述的方法，还包括使所述生物样品透化的步骤。
63.一种确定生物样品中一种或多种分析物位置的方法，所述方法包括：
(a)提供包含多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包含(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；
(b)提供半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间，其中半多孔材料包含分析物捕获剂，所述分析物捕获剂包含(i)分析物结合部分，(ii)分析物结合部分条形码，和(iii)分析物捕获序列；
(c)向生物样品、半多孔材料和第一阵列施加电场，其中电场促进一种或多种分析物沿第一阵列的方向迁移，其中第一捕获域能特异性地结合至一种或多种分析物的第一分析物，并且其中分析物结合部分能特异性结合至一种或多种分析物的第二分析物，并且半多孔材料保留第二分析物；
(d)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定第一分析物在生物样品中的位置；
(e)提供包含多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；
(f)向半多孔材料和第二阵列施加电场，其中电场促进第二分析物沿第二阵列的方向迁移，其中第二捕获域能特异性结合至分析物捕获序列；
(g)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)分析物结合部分条形码的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列以确定第二分析物在生物样品中的位置。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述第一捕获探针和所述第二捕获探针之一或两者还包含裂解域、功能域和独特分子标识符中的一个或多个。
65.如权利要求63或64所述的方法，其中所述第一分析物是mRNA。
66.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得该生物样品的图像。
67.如权利要求63-66中任一项所述的方法，其中所述分析物捕获剂与所述半多孔材料交联。
68.如权利要求63-66中任一项所述的方法，其中，所述第二分析物是蛋白质。
69.如权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述分析物结合部分包括抗体或其抗原结合片段。
70.如权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料将一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。
71.如权利要求63-70中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料包括水凝胶。
72.如权利要求63-70中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料包括渗透性膜。
73.如权利要求63-72中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料具有不均匀的孔径。
74.如权利要求63-72中任一项所述的方法，其中所述半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
75.如权利要求63-74中任一项所述的方法，其中，所述电场被施加到所述生物样品的离散区域。
76.如权利要求63-75中任一项所述的方法，其中，所述电场被施加到所述第一阵列的离散区域。
77.如权利要求63-76中任一项所述的方法，其中，所述电场被施加到所述第二阵列的离散区域。
78.如权利要求66所述的方法，其中所述半多孔材料包含一种或多种基准标志物，所述基准标志物将所述半多孔材料与生物样品的图像对准。
79.如权利要求63-74中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)期间，生物样品、半多孔材料和第一阵列与缓冲液直接接触。
80.如权利要求63-75中任一项所述的方法，其中，在步骤(f)期间，所述半多孔材料和所述第二阵列与缓冲液直接接触。
81.如权利要求63-76中任一项所述的方法，还包括将所述第二分析物与所述半多孔材料和所述分析物捕获剂之一或两者交联。
82.如权利要求63-81所述的方法，其中所述生物样品是组织切片。
83.如权利要求63-81所述的方法，其中所述生物样品是***固定和石蜡包埋的。
84.如权利要求63-81所述的方法，还包括固定生物样品的步骤。
85.如权利要求63-81所述的方法，还包括使所述生物样品透化的步骤。
86.一种***，其包括：
(a)包含多个捕获探针的阵列，其中多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域；
(b)置于生物样品和阵列之间的一种或多种半多孔材料；和
(c)电场，其中电场促进一种或多种分析物在阵列方向上的迁移，其中捕获探针的捕获域结合一种或多种分析物中的第一分析物。
87.如权利要求86所述的***，其中所述一种或多种半多孔材料中的第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物。
88.如权利要求86或87所述的***，其中所述第一半多孔材料包含多个分析物结合部分，其中所述多个分析物结合部分中的分析物结合部分能特异性结合至所述一种或多种第二分析物中的第二分析物。
89.如权利要求88所述的***，其中所述分析物结合部分是抗体或其抗原结合片段。
90.如权利要求88或89所述的***，其中所述第二分析物是蛋白质。
91.如权利要求87-90中任一项所述的***，还包括确定第二分析物在第一半多孔材料中的位置。
92.如权利要求91所述的***，其中确定所述第二分析物在所述第一半多孔材料中的位置包括免疫荧光染色。
93.如权利要求92所述的***，其中确定所述第一半多孔材料中的所述第二分析物的位置包括：
获得第一半多孔材料的图像；和
将第一半多孔材料的图像中的免疫荧光染色与生物样品的图像相关联。
94.如权利要求86-93中任一项所述的***，其中所述一种或多种半多孔材料包括第二半多孔材料，其中所述第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
95.如权利要求94所述的***，其中所述第二半多孔材料包含用于所述一种或多种第三分析物的多个分析物结合部分。
96.如权利要求95所述的***，其中所述多个分析物结合部分中的分析物结合部分能特异性结合至所述一种或多种第三分析物中的第三分析物。
97.如权利要求96所述的***，其中所述第三分析物是核酸。
98.如权利要求97所述的***，其中，所述核酸是miRNA。
99.如权利要求94-98中任一项所述的***，还包括确定所述第三分析物在所述第二半多孔材料中的位置。
100.如权利要求99所述的***，其中确定第三分析物在第二半多孔材料中的位置包括使用原位杂交。
101.如权利要求100所述的***，其中确定所述第三分析物的位置包括：
获得第二半多孔材料的图像；和
将第二半多孔材料的图像中的原位杂交与生物样品的图像相关联。
102.如权利要求94所述的***，还包括将所述一种或多种第三分析物与所述第二半多孔材料交联。
103.如权利要求88所述的***，还包括将所述一种或多种第二分析物与所述第一半多孔材料交联。
104.如权利要求102所述的***，还包括在第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物之后移出第二半多孔材料。
105.如权利要求102所述的***，还包括：
在第一半多孔材料保留一种或多种第二分析物之后移出第一半多孔材料；和
将第二半多孔材料置于生物样品与阵列之间。
106.如权利要求105所述的***，其中在移出所述第一半多孔材料并在所述生物样品和所述阵列之间布置所述第二半多孔材料之后施加所述电场。
107.如权利要求106所述的***，其中所述第二半多孔材料保留一种或多种第三分析物。
108.如权利要求86-107中任一项所述的***，其中捕获探针还包含以下的一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。
109.如权利要求86-108中任一项所述的***，还包括对生物样品进行成像。
110.如权利要求86-109中任一项所述的***，其中所述第一分析物是mRNA。
111.如权利要求86-110中任一项所述的***，其中所述半多孔材料包括水凝胶。
112.如权利要求86-110中任一项所述的***，其中所述半多孔材料包括渗透性膜。
113.如权利要求86-112中任一项所述的***，其中所述半多孔材料具有不均匀的孔径。
114.如权利要求86-112中任一项所述的***，其中所述半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
115.如权利要求86-114中任一项所述的***，其中所述一种或多种半多孔材料包含一种或多种基准标志物，所述基准标志物将所述一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对准。
116.如权利要求86-115中任一项所述的***，其中所述生物样品是组织切片。
117.如权利要求116中任一项所述的***，其中，所述生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。
118.如权利要求中任一项所述的***，还包括固定所述生物样品的步骤。
119.如权利要求86-118中任一项所述的***，还包括使所述生物样品透化的步骤。
120.如权利要求86-119中任一项所述的***，其中该第二分析物是蛋白质。
121.如权利要求86-120中任一项所述的***，其中电场被施加到所述生物样品的离散区域。
122.如权利要求86-120中任一项所述的***，其中，所述电场被施加到所述阵列的离散区域。
123.如权利要求86-122中任一项所述的***，其中，所述生物样品、所述半多孔材料和所述阵列与缓冲液直接接触。
124.如权利要求86-123中任一项所述的***，其中所述***还包括确定(i)空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并且利用(i)和(ii)的序列来确定生物样品中第一分析物的位置。
125.一种***，其包括：
(a)包含多个第一捕获探针的第一阵列，其中多个第一捕获探针中的第一捕获探针包含(i)第一空间条形码和(ii)第一捕获域；
(b)半多孔材料，其中半多孔材料设置在生物样品和第一阵列之间；
(c)第一电场，其中第一电场促进一种或多种分析物在第一阵列的方向上迁移，其中第一捕获域能特异性结合至一种或多种分析物中的第一分析物，其中半多孔材料保留一种或多种分析物中的第二分析物；
(d)包含多个第二捕获探针的第二阵列，其中多个第二捕获探针中的第二捕获探针包含(i)第二空间条形码和(ii)第二捕获域；
(e)第二电场，其中第二电场促进第二分析物在第二阵列方向上的迁移，其中第二捕获域能特异性结合至第二分析物；和
(f)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第二分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定第二分析物在生物样品中的位置。
126.如权利要求125所述的***，其中所述捕获探针还包含以下一种或多种：裂解域、功能域和独特分子标识符。
127.如权利要求124或125所述的***，其中所述第一分析物是mRNA。
128.如权利要求125-127中任一项所述的***，其中该***还包括获得该生物样品的图像。
129.如权利要求125-128中任一项所述的***，其中所述半多孔材料包括水凝胶。
130.如权利要求125-128中任一项所述的***，其中所述半多孔材料包括渗透性膜。
131.如权利要求125-130中任一项所述的***，其中所述半多孔材料具有不均匀的孔径。
132.如权利要求125-130中任一项所述的***，其中所述半多孔材料具有基本上均匀的孔径。
133.如权利要求125-132中任一项所述的***，其中所述一种或多种半多孔材料包含一种或多种基准标志物，所述基准标志物将所述一种或多种半多孔材料与生物样品的图像对准。
134.如权利要求125-133中任一项所述的***，其中所述生物样品是组织切片。
135.如权利要求125-134中任一项所述的***，其中，所述生物样品是***固定石蜡包埋的生物样品。
136.如权利要求125-135中任一项所述的***，还包括固定所述生物样品的步骤。
137.如权利要求125-136中任一项所述的***，还包括使所述生物样品透化的步骤。
138.如权利要求125-137中任一项所述的***，其中所述半多孔材料保留来自所述生物样品的一种或多种分析物。
139.如权利要求125-138中任一项所述的***，其中将所述第一电场、所述第二电场或两者施加到所述生物样品的离散区域。
140.如权利要求125-139中任一项所述的***，其中，所述第一电场被施加到所述第一阵列的离散区域。
141.如权利要求125-140中任一项所述的***，其中将所述第二电场施加到所述第二阵列的离散区域。
142.如权利要求125-141中任一项所述的***，其中所述生物样品、所述半多孔材料和所述第一阵列与缓冲液直接接触。
143.如权利要求125-142中任一项所述的***，其中所述生物样品、所述半多孔材料和所述第二阵列与缓冲液直接接触。
144.如权利要求125-142中任一项所述的***，其中所述半多孔材料将一种或多种分析物与生物样品中的其它分子分离。
145.如权利要求125-144中任一项所述的***，其中所述半多孔材料包含一个或多个分析物结合部分。
146.如权利要求125-145中任一项所述的***，其中所述一个或多个分析物结合部分结合核酸。
147.如权利要求146所述的***，其中，所述核酸是miRNA。
148.如权利要求145-147中任一项所述的***，其中该分析物结合部分与该半多孔材料交联。
149.如权利要求125-144中任一项所述的***，其中该半多孔材料包括一种或多种分析物捕获剂。
150.如权利要求149所述的***，其中所述一种或多种分析物捕获剂包含(i)分析物结合部分，(ii)分析物结合部分条形码，和(iii)分析物捕获序列。
151.如权利要求149或150所述的***，其中所述第二分析物是蛋白质。
152.如权利要求149-151中任一项所述的***，其中所述分析物捕获剂与所述半多孔材料交联。
153.如权利要求149-152中任一项所述的***，其中所述分析物结合部分包括抗体或其抗原结合片段。
154.如权利要求151-155中任一项所述的***，其中所述分析物结合部分条形码识别所述分析物捕获剂。
155.如权利要求149-154中任一项所述的***，其中所述分析物捕获序列结合到所述第二捕获探针的第二捕获域。
156.如权利要求125-155中任一项所述的***，其中该***还包括：
(a)确定(i)第一空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)第一分析物的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列来确定第一分析物在生物样品中的位置；和
(b)确定(i)第二空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，和(ii)分析物结合部分条形码的序列的全部或部分，或其互补物，并利用(i)和(ii)的序列以确定第二分析物在生物样品中的位置。
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