CN115803432A

CN115803432A - 用于重靶向的具有经修饰的糖蛋白gH的重组单纯疱疹病毒及其用途

Info

Publication number: CN115803432A
Application number: CN202180038257.4A
Authority: CN
Inventors: 权熙忠; 白贤贞; 朱显兪
Original assignee: Giselle Virtue
Current assignee: Giselle Virtue
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2023-03-14
Also published as: KR102418528B1; CA3181153A1; US20220305066A1; AU2021287536A1; AU2021287122A1; EP4166657A1; CN115843313A; JP2023523102A; JP7460850B2; KR20210155337A; EP4166656A1; JP2023523101A; CA3181143A1; WO2021251588A1; US20220305067A1; WO2021251589A1; KR102311895B1

Abstract

公开了用于重靶向的具有经修饰的糖蛋白gH的重组单纯疱疹病毒及其用途。特别地，重组单纯疱疹病毒能够感染具有靶分子的靶细胞，由于该靶分子被糖蛋白gH中存在的细胞靶向结构域特异性识别并结合，因此可用于抗癌治疗或基因治疗。

Description

用于重靶向的具有经修饰的糖蛋白gH的重组单纯疱疹病毒及其用途

技术领域

本公开涉及用于重靶向(retargeting)的具有经修饰的糖蛋白gH的重组单纯疱疹病毒及其用途。

背景技术

在癌症的治疗中，手术疗法、抗癌化疗(anticancer chemotherapy)、放射疗法(radiotherapy)等已被广泛应用，但是这些疗法中的大部分存在副作用，不完全的治疗效果以及诸如癌症复发和转移的问题。因此，需要不断开发新的和有效的癌症疗法，近年来，在抗癌免疫疗法领域已经取得了快速进展，其例子包括溶瘤病毒疗法、嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR-T)细胞疗法等。

在抗癌免疫疗法中，溶瘤病毒是一种通过操作活病毒的基因并在癌细胞中选择性繁殖而被赋予裂解癌细胞能力的病毒，并且其在正常细胞中的增殖是有限的。癌细胞裂解释放的病毒能够连续感染周围的癌细胞，从而提供连续和协同的治疗效果。此外，溶瘤病毒能够通过在裂解癌细胞的过程中释放免疫原性肿瘤抗原来刺激人体的免疫应答，从而增加抗癌作用。此外，可以通过人工操作来增强这种抗癌效果，从而表达细胞因子、趋化因子等。

目前开发的溶瘤病毒可分为10种或更多种类型，包括腺病毒、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、牛痘病毒(vaccinia virus)等。其中，单纯疱疹病毒是一种含有152kb大小的线性双链DNA的具有包膜的二十面体病毒体，包括HSV-1和HSV-2型。HSV具有许多非必需基因，并且其基因组很大，使得易于用于操作或运输外部基因，并且其复制周期短，此外，HSV具有高感染效率，理想地能够通过容易操作与细胞附着和感染的糖蛋白而表现出改善的癌细胞靶向效率。

HSV是一种具有包膜的病毒，HSV进入细胞是通过涉及其包膜中存在的gD、gB、gH/gL和gC糖蛋白的复杂相互作用实现的。首先，当gB和gC连接到细胞表面的3-O-S HS(3-O-硫酸化的硫酸乙酰肝素)上时，gD与细胞受体例如HVEM(疱疹病毒入侵介质，HveA)、连接蛋白-1(nectin-1)(HveC)和连接蛋白-2(HveB)中的至少一种受体结合，从而诱导病毒和细胞膜之间的融合，由此HSV进入细胞(Hiroaki Uchida等人，疱疹病毒入侵介质(HVEM)-限制性单纯疱疹病毒1型突变病毒的产生：HVEM表达细胞的抗性和拯救连接蛋白-1识别的突变的鉴定，J.Virol.2009年4月；83(7):2951-61)。

T-VEC(Talimogene laherparepvec，产品名：Imlygic)于2015年10月获得美国FDA批准，是一种利用HSV-1的恶性黑色素瘤的溶瘤病毒治疗剂。T-VEC是一种减毒的HSV-1病毒，其中ICP34.5和ICP47基因被删除以减弱其致病性，并且其表达GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)以促进人类免疫反应。然而，T-VEC的缺点在于其有限的病毒增殖导致治疗效果低，这是由于一些基因的缺失。

为了克服这种限制，已经尝试通过操作参与HSV进入细胞的包膜糖蛋白gD、gB、gH和gC来执行靶向癌细胞的重靶向，而不削弱病毒。这种重靶向是将编码癌细胞靶分子的靶向结构域的外源序列引入糖蛋白gD、gB、gH或gC序列，并使用具有嵌合糖蛋白的重组病毒，其中外源序列的靶向结构域(也称为配体)***糖蛋白，而不是野生型糖蛋白。这种重组病毒能够进入具有被靶向结构域特异性识别并结合的靶分子的癌细胞。靶向结构域通常是scFvI(单链可变片段)，目前重靶向的靶分子有EpCAM(上皮细胞粘附分子)、HER2(人表皮生长因子受体2)等，并且作为糖蛋白的gB、gH、gC等已经被修饰。

本公开提供了具有用于重靶向的经修饰糖蛋白gH的重组HSV。

发明内容

技术问题

因此，本公开考虑了相关技术中遇到的问题，并且本公开的目的是提供用于重靶向的具有经修饰的糖蛋白gH的重组HSV。

本公开的另一个目的是提供一种用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物含有重组HSV作为活性成分。

本公开的再一个目的是提供一种预防或治疗癌症的方法，该方法包括给对象(例如患者)施用有效量的药物组合物。

下面将阐述本公开的其它或具体目的。

技术方案

如以下实施例中所证实的，本公开的发明人已经确定，重组HSV被构建为使得scFv，其是特异性识别并结合HER2、EpCAM或CEA(癌胚抗原)的细胞靶向结构域(特异性结合靶细胞的靶分子的外源性配体)，作为诸如癌细胞等靶细胞的靶分子的细胞靶向结构域，被***并融合到糖蛋白gH中，重新靶向并感染表达HER2、EpCAM或CEA的靶细胞，从而最终形成本公开。

考虑到上述情况，本公开的一个方面涉及通过将细胞靶向结构域***并融合到糖蛋白gH中而获得的重组HSV，所述细胞靶向结构域特异性识别并结合靶细胞的靶分子。

通常，重组HSV是指操作，与野生型HSV相比，经基因操作，能够通过引入人工突变(通过删除、取代或***一些核酸序列)而丧失或改变某些功能或表达感兴趣的靶蛋白的HSV。在本公开中，重组HSV是在糖蛋白gH中具有用于靶向靶细胞的细胞靶向结构域的HSV。

重组病毒生产技术，如病毒的基因操作和病毒体的生产是本领域众所周知的，可以参考Sandri-Goldin R.M.等人，[α疱疹病毒：分子和细胞生物学，Caister AcademicPress,2006],Robin H.Lachmann[单纯疱疹病毒基载体，国际实验病理学杂志(Int.J.Exp.Pathol.)，2004年8月；85(4):177-190]等。本说明书中引用的所有文献，包括上述文献，都被认为是本说明书的一部分。

特别地，除了将用于靶细胞中靶分子的靶向结构域引入糖蛋白gH之外，本公开的重组HSV可以进一步***作以仅通过作为进入受体的HVEM受体，而非连接蛋白-1(nectin-1)进入细胞。在本公开的以下实施例中，操作HSV包膜糖蛋白gD的序列，以允许HSV仅通过HVEM受体进入细胞。具体地，gD的第222位的精氨酸(R)和gD的第223位的苯丙氨酸(F)分别被天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)取代，从而改变gD的功能。具有如此改变的gD功能的重组HSV可以仅通过HVEM(HveA)受体进入宿主细胞(Hiroaki Uchida等人，疱疹病毒入侵介质(HVEM)限制性单纯疱疹病毒1型突变病毒的产生：表达HVEM的细胞的抗性和拯救连接蛋白-1识别的突变的鉴定。病毒学杂志(J.Virol.)，2009年4月；83(7):2951-61)。HVEM(HveA)受体很少存在于正常细胞中，仅存在于淋巴瘤等中，而连接蛋白-1通常存在于正常细胞中，因此具有改变的gD功能的重组HSV(其只能通过HVEM受体而非连接蛋白-1受体进入细胞)不感染正常细胞，因此在抗癌治疗中的安全性方面是有利的。

本公开的重组HSV可以通过删除或不删除其糖蛋白gH的一些基因，并将细胞靶向结构域的基因***gH基因作为开放阅读框来进行制备。在将细胞靶向结构域的基因***糖蛋白gH的基因中的情况下，当重组HSV以与糖蛋白gH融合的状态产生于细胞中时，细胞靶向结构域被整合到病毒体的包膜中。

当将细胞靶向结构域***并融合到gH糖蛋白中时，***并融合该结构域的位置可以是任何位置，包括gH的N-端、H1A结构域的N-端等，HSV-1的优选位置可以是gH的氨基酸序列(SEQ ID NO:1，基因库登记号(GenBank Accession No.)：ASM47773)中，氨基酸12至88区域内的位置，氨基酸116至137区域内的位置，或氨基酸209至839区域内的位置。此外，优选的位置可以是氨基酸12至49区域内的位置，或氨基酸116至137区域内的位置。此外，优选的位置可以是氨基酸12之后的位置，氨基酸22之后的位置，氨基酸23之后的位置，氨基酸29之后的位置，氨基酸83之后的位置，氨基酸116之后的位置，氨基酸209之后的位置，氨基酸215之后的位置，氨基酸225之后的位置，氨基酸277之后的位置，氨基酸386之后的位置。氨基酸437之后的位置，氨基酸447之后的位置，氨基酸472之后的位置，氨基酸636之后的位置，氨基酸637之后的位置，氨基酸666之后的位置，氨基酸731之后的位置，氨基酸763之后的位置，氨基酸764之后的位置，氨基酸775之后的位置，氨基酸806之后的位置，氨基酸824之后的位置，或氨基酸838之后的位置。这里，该位置是基于gH的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但是在gH序列有一些差异的突变菌株的情况下，它是基于与之对应的同源序列。

此外，除了糖蛋白gH的修饰之外，还可以通过修饰HSV的其他糖蛋白来操作本发明的重组HSV，以实现额外的靶向。在抗癌治疗中癌细胞的感染效率而言，这种额外的靶向可能是特别有利的，可以用于这种额外的靶向的糖蛋白可以包括gB、gC、gD等。

当细胞靶向结构域被额外***并融合到这种糖蛋白中以用于额外的靶向时，其位置可以是包括糖蛋白的N-端的任何位置，但是在HSV-1中，优选的位置可以是gB氨基酸序列(SEQ ID NO:2，基因库登记号：ASM47779)中氨基酸9至896区域内的任何位置。此外，优选的位置可以是氨基酸31至78区域内的任何位置，氨基酸80至363区域内的任何位置，或氨基酸408至896区域内的任何位置。此外，优选的位置可以是氨基酸43之后的位置，氨基酸52之后的位置，氨基酸70之后的位置，氨基酸76之后的位置，氨基酸80之后的位置，氨基酸81之后的位置，氨基酸95之后的位置，氨基酸100之后的位置，氨基酸137之后的位置，氨基酸185之后的位置，氨基酸187之后的位置，氨基酸241之后的位置，氨基酸261之后的位置，氨基酸265之后的位置，氨基酸304之后的位置，氨基酸334之后的位置，氨基酸361之后的位置，氨基酸408之后的位置，氨基酸419之后的位置，氨基酸430之后的位置，氨基酸458之后的位置，氨基酸470之后的位置，氨基酸481之后的位置，氨基酸495之后的位置，氨基酸497之后的位置，氨基酸546之后的位置，氨基酸608之后的位置，氨基酸630之后的位置，氨基酸663之后的位置，氨基酸664之后的位置，氨基酸665之后的位置，氨基酸671之后的位置，氨基酸673之后的位置，氨基酸690之后的位置，氨基酸725之后的位置，氨基酸730之后的位置，氨基酸732之后的位置，氨基酸742之后的位置，氨基酸772之后的位置，氨基酸868之后的位置，氨基酸869之后的位置，氨基酸886之后的位置，氨基酸893之后的位置，氨基酸894之后的位置，或氨基酸895之后的位置。这里，该位置是基于gB的SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但是在gB序列有一些差异的突变菌株的情况下，它是基于与其对应的同源序列。

当细胞靶向结构域被额外***并融合到gC糖蛋白中时，其位置可以是包括N-端的任何位置，但在HSV-1中，优选的位置可以是gC氨基酸序列(SEQ ID NO:3，基因库登记号：ASM47796)中氨基酸1至442区域内的任何位置，此外，优选的位置可以是氨基酸33至154区域内的任何位置。此外，优选的位置可以是gC的氨基酸33之后的位置，氨基酸82之后的位置，氨基酸148之后的位置，氨基酸149之后的位置，或氨基酸153之后的位置。这里，该位置是基于gC的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但是在gC序列有一些差异的突变菌株的情况下，它是基于与之对应的同源序列。

关于糖蛋白的优选***位点的更具体信息，可以参见：JOHN R.GALLAGHER等人，[单纯疱疹病毒gB中的功能性荧光蛋白***对执行膜融合前后gB构象的报告，PLOSPathog.，2014年9月，18,10(9):e1004373]；Gatta V.等人，[gH中新型配体的工程化赋予HSV扩增的趋向性，而与其受体的gD活化无关，PLOS Pathog.，2015年5月21日；11(5):e1004907]；Tina M.Cairns等人，[单纯疱疹病毒1型gD和gH-gL的结构-功能分析：来自gDgH嵌合体的线索，JOURNAL OF VIROLOGY，2003年6月,p.6731-6742]；E.U.Lorentzen等人，[表达自发荧光糖蛋白H融合蛋白的具有复制能力的单纯疱疹病毒1型突变体，Intervirology，2001；44:232-242]；Qing Fan等人，[单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(gB)突变对细胞融合活性的不同影响取决于gD受体或gB受体是否过表达，JOURNAL OF VIROLOGY，2009年8月，83(15):7384-7390]；Erick Lin等人，[随机连接子***诱变以识别单纯疱疹病毒1型糖蛋白B的功能结构域，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，2007年8月，104(32):13140-13145]；JuliaO.Jackson等人，[单纯疱疹病毒1型糖蛋白H的***突变会降低细胞表面表达、减缓细胞融合速率，或消除细胞融合和病毒进入的功能，JOURNAL OF VIROLOGY，2010年2月，84(4):2038-2046]；Guoying Zhou等人，[工程化的单纯疱疹病毒1依赖于IL13R*2受体进入细胞，而不依赖于糖蛋白D受体的相互作用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，2002年11月,99(23):15124-15129]；AR Frampton Jr.等人，[单纯疱疹病毒的运输和基因治疗载体的开发及其在神经***中的应用，Gene Therapy，2005,12:891-901]；Paola Grandi等人，[为特异性结合细胞表面受体而设计的HSV-1病毒体，MOLECULAR THERAPY，2004年3月，9(3):419-427]；William F Goins等人，[单纯疱疹病毒(HSV)载体的重靶向，Curr.Opin.Virol.，2016年12月，21:93-101]；Xiaodan Wang等人，[通过含有嵌合HSV-1糖蛋白C-GDNF或gC-BDNF蛋白的无辅助病毒HSV-1载体颗粒将靶向基因转移至大鼠脑中的黑质纹状体神经元，BrainRes.Mol.Brain.Res.，2005年9月，139(1):88-102]等。

当细胞靶向结构域被***并融合到糖蛋白中时，连接子肽(linker peptide)可以存在于细胞靶向结构域的N-端和C-端。连接子肽旨在确保细胞靶向结构域和糖蛋白之间的距离，使得与糖蛋白融合的细胞靶向结构域不会由于与糖蛋白融合而干扰其固有三维结构的形成。连接子肽可以是具有任何长度和任何序列的连接子肽，只要它具有特异性结合其靶细胞的靶分子的能力。考虑到柔韧性(flexibility)、溶解性和对蛋白水解的抗性，连接子优选包含选自氨基酸如Ser、Gly、Ala、Thr等中的至少一个，其长度可以是1至30个氨基酸，优选3至25个氨基酸，更优选8至20个氨基酸。

本公开的重组HSV可以突变，从而删除HSV增殖(即存活和复制)所不需要的非必需基因，或使其不显示功能(即转录或翻译中断)。非必需基因的具体示例可以包括UL3基因(例如基因库登记号：AFE62830.1)、UL4基因(例如基因库登记号：AFE62831.1)、UL14基因(例如基因库登记号：AFE62841.1)、UL16基因(例如基因库登记号：AFE62843.1)、UL21基因(例如基因库登记号：AFE62848.1)、UL24基因(例如基因库登记号：AFE62851.1)、UL31基因(例如基因库登记号：AFE62859.1)、UL32基因(例如基因库登记号：AFE62860.1)、US3基因(例如基因库登记号：AFE62891.1)、UL51基因(例如基因库登记号：AFE62880.1)、UL55基因(例如基因库登记号：AFE62884.1)、UL56基因(例如基因库登记号：AFE62885.1、US2基因(例如基因库登记号：AFE62890.1)、US12基因(例如基因库登记号：AFE62901.1；ICP47基因)、LAT基因(例如基因库登记号：JQ673480.1)、gB基因(例如基因库登记号：GU734771.1的52996和55710之间的序列)、gL基因(例如基因库登记号：AFE62828.1)、gH基因(例如基因库登记号：AFE62849.1)、gD基因(例如基因库登记号：AFE62894.1)等。

关于HSV的非必需基因的更具体的信息，可以参见：D.M.Knipe和P.M.Howley(编辑)[野地病毒学(FieldsVirology)(第2卷)Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.，2001年，2399-2460页]；Subak-Sharpe J.H.和Dargan D.J.[HSV分子生物学：单纯疱疹病毒分子生物学病毒基因概述，1998,16(3):239-251]；Travis J.Taylor和David M.Knipe[单纯疱疹病毒复制室的蛋白质组学：细胞DNA复制、修复、重组和染色质重塑蛋白与ICP8的关联，J.Virol.，2004年6月；78(11):5856-5866]等。

本公开的重组HSV可以是重组HSV-1病毒、重组HSV-2病毒、或HSV-1/HSV-2嵌合病毒(即重组HSV，其中基因组含有衍生自HSV-1的DNA和衍生自HSV-2的DNA)，优选重组HSV-1病毒，更优选衍生自HSV-1KOS株的重组HSV-1。HSV-1KOS菌株可获自ATCC(目录号(Cat No)：VR1493TM)，该菌株的整个基因组序列被完全分析并表示于基因库登记号：JQ673480.1(Stuart J.Macdonald等人，单纯疱疹病毒1型Kos株的基因组序列，J.Virol.，2012年6月，86(11):6371-2)。

HSV-1病毒的基因组由152kb的双链线性DNA组成，该双链线性DNA编码总共84个基因，并包括彼此连接的两个片段，特别是长片段(L区)和短片段(S区)。长片段(L区)约占基因组的82％，短片段(S区)约占基因组的18％，长片段和短片段经由两个IRLs(中间反向重复序列)连接，它们是连接区域，并且TRL(末端反向重复片段)存在于每个片段的末端。L区(UL)包含56个UL1-UL56基因和10个基因(UL8.5、9.5、10.5、12.5、15.5、20.5、26.5、27.5、43.5和49.5)，S区(US)包含12个US1-US12基因和2个基因(US1.5和8.5)，作为连接区的两个IRL包含4个基因(ICP4、ICP34.5、ICP0和LAT)。

在本公开的重组HSV中，细胞靶向结构域通过特异性识别和结合靶细胞的靶分子来诱导本公开的重组HSV进入靶细胞。这里，靶细胞是任何异常细胞。换句话说，异常细胞是作为疾病原因的病变细胞。

作为靶细胞的异常细胞通常是癌细胞。癌细胞可以是任何类型的癌，例如食道癌、胃癌、结肠直肠癌、直肠癌、口腔癌、鼻咽癌(pharyngeal cancer)、喉癌(laryngealcancer)、肺癌、结肠癌、乳腺癌、***、子宫内膜癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、***癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血癌等。

当本公开的重组HSV靶向作为靶细胞的癌细胞时，本公开的重组HSV充当溶瘤病毒以破坏癌细胞，从而发挥抗癌作用。

本公开的重组HSV靶向的靶细胞可以是除癌细胞之外的任何用于基因治疗的病变细胞。这里，用于基因治疗的病变细胞是具有引起疾病的异常基因或其中某个基因表达或功能异常的细胞，并通过本公开的重组HSV将遗传物质如对应于该异常基因的正常基因转移到该异常细胞中，使得该异常基因等正常表达或发挥功能，从而导致相应疾病的治疗。

这种疾病可以是阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis，ALS)、葛雷克氏症(Lou Gehrig’s disease)、骨关节炎、动脉粥样硬化、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease，COPD)、慢性创伤性脑病变、糖尿病、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、特发性震颤、弗立特里希氏共济失调、亨廷顿病、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、圆锥形角膜、球形角膜、黄斑变性、马凡综合征、多发性硬化、多***萎缩、肌营养不良、尼曼匹克病、骨质疏松症、帕金森病、进行性核上性麻痹、***炎、色素性视网膜炎、类风湿性关节炎或泰-萨病(Tay-Sachs disease)。

当本公开的重组HSV靶向这种病变细胞用于基因治疗时，本公开的重组HSV是在通过灭活其增殖所必需的基因(例如ICP27基因、ICP4基因等)而消除其细胞裂解能力之后，使用的。

在本公开的重组HSV中，被细胞靶向结构域特异性识别并结合的靶细胞的靶分子是存在于病变细胞表面上的任何抗原或任何受体，该病变细胞是异常细胞。

特别地，本公开的重组HSV可用作用于抗癌治疗的溶瘤病毒。这里，靶分子是存在于癌细胞表面上的任何抗原或任何受体。靶分子，即癌细胞的抗原或受体，优选是仅在癌细胞中表达或与正常细胞相比在癌细胞中过表达的抗原或受体。

癌细胞表面上的抗原或受体的示例可包括靶分子，例如在成胶质细胞瘤中表达的EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)；在未分化型甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤等中过表达的EGFR(表皮生长因子受体)；在***状甲状腺癌等中过表达的转移素受体(转移素受体)；在乳腺癌等中过表达的基于ErbB的受体酪氨酸激酶；在乳腺癌、膀胱癌、胆囊癌、胆管癌、食道胃交界部癌(esophagogastric junction cancer)等中过表达的HER2(人表皮生长因子受体2)；在肉瘤样肾癌等中过表达的酪氨酸激酶-18-受体(tyrosine kinase-18-receptor，c-Kit)；在食管腺癌等中过表达的HGF受体c-Met；在乳腺癌等中过表达的CXCR4或CCR7；在***癌中过表达的内皮素-A受体；在直肠癌等中过表达的PPAR-δ(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)；在卵巢癌等中过表达的PDGFR-α(血小板衍生生长因子受体α)；在肝癌、多发性骨髓瘤等中过表达的CD133；在肺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、甲状腺髓样癌等中过表达的CEA(癌胚抗原)；在肝癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌等中过表达的EpCAM(上皮细胞粘附分子)；在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等中过表达的MSLN(间皮素)；在神经母细胞瘤等中过表达的GD2(二唾液酸神经节苷脂)；在肝细胞癌等中过表达的GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)；在***癌等中过表达的PSMA(***特异性膜抗原)；在卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌等中过表达的TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)；在黑色素瘤等中度表达的GD3(二唾液酸神经节苷脂)；在血癌、实体癌等中过表达的HLA-DR(人白细胞抗原-DR)；在晚期实体癌等中过表达的MUC1(粘蛋白1)；在晚期非小细胞肺癌等中过表达的NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌1)；在鼻咽肿瘤等中过表达的LMP1(潜伏膜蛋白1)；在肺癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌等中过表达的TRAILR2(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体)；在肝细胞癌等中度表达的作为血管生成因子受体的VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)和HGFR(肝细胞生长因子受体)。此外，癌症干细胞的表面抗原，例如CD44、CD166等，可以是靶分子。与正常细胞相比，在癌细胞中过表达的许多靶分子是本领域已知的，对于除上述示例之外的其它靶分子，可以参见Anne T.Collins等人，[致瘤性***癌干细胞的前瞻性鉴定，Cancer Res.，2005年12月1日，65(23):10946-51]；Chenwei Li等人，[胰腺癌干细胞的鉴定，Cancer Res.，2007年2月1日，67(3):1030-7]；Shuo Ma等人，[CAR-T细胞治疗实体肿瘤的研究进展，Int.J.Biol.Sci.，2019年9月，7；15(12):2548-2560]；Dhaval S.Sanchala等人，[溶瘤性单纯疱疹病毒治疗：朝着选择性靶向癌细胞的方向迈进，Front Pharmacol.，2017年5月16日，8:270]等。

特别地，在本公开中，靶分子优选是HER2、EpCAM或CEA。

在本公开中，除了具有特异性结合靶分子的能力的完整抗体之外，细胞靶向结构域可以是抗体衍生物或抗体类似物。抗体衍生物是完整抗体的片段，其包括至少一个具有特异性结合靶分子的能力的抗体可变区，或者是修饰的抗体。抗体衍生物的示例可包括抗体片段，例如Fab、scFv、Fv、VhH、VH、VL等，多价或多特异性修饰的抗体，如Fab2、Fab3、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体，双scFv等。抗体类似物是一种人工肽或多肽，其具有与靶分子(如抗体)特异性结合的能力，但在结构上与抗体不同，并且通常具有比抗体更低的分子量。抗体类似物的示例可以包括ABD、Adhiron、affibodies、affilins、affimers、阿尔法体(alphabodies)、Anticalin、armadillo重复蛋白、centririns、DARPins、fynomers、Kunitz区域、ProNectin、repebody等。

本领域中已经发表了大量关于抗体、抗体衍生物、抗体类似物及其生产的文献，其示例包括Renate Kunert&David Reinhart[Readvances in recombinant antibodymanufacturing。重组抗体制造进展，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2016年4月，100(8):3451-61]；Holliger P.和Hudson P.J.[工程化抗体片段和单结构域的出现，Nat.Biotechnol.，2005年9月，23(9):1126-36]；Xiaowen Yu等人，[除了抗体作为结合配偶体：抗体模拟物在生物分析中的作用，Annual Review of Analytical Chemistry，2017,10:293-320]；Abdul Rasheed Baloch等人，[抗体模拟物：动物来源的抗体的有希望的互补剂，Critical Reviews in Biotechnology，2016,36:268-275]等。

在本公开中，细胞靶向结构域可以是天然多肽配体，以及靶分子的完整抗体、抗体衍生物或抗体类似物。天然多肽配体是这样的配体，其中配体特异性结合的靶细胞的受体是靶分子，这样的配体的示例可以包括细胞因子、趋化因子、生长因子等，特别是EPO(***)、EGF(表皮生长因子)、IL-13等。

在本公开中，细胞靶向结构域优选是scFv(单链可变片段)。scFv是一种单链抗体，其中免疫球蛋白的重链可变区(heavy-chain variable region，VH)和轻链可变区(light-chain variable region，VL)经由短连接子肽连接。在scFv中，VH的C-端与VL的N-端连接，或者VL的C-端与VH的N-端连接。在scFv中，连接子肽可以是具有任何长度和任何序列的连接子肽，只要它不干扰重链和轻链的固有三维结构，并能使重链和轻链在空间上彼此相邻，从而具有特异性结合靶分子的能力。考虑到柔韧性(flexibility)、溶解性和对蛋白水解的抗性，连接子优选包含选自氨基酸如Ser、Gly、Ala、Thr等中的至少一个，其长度可以是1至30个氨基酸，优选3至25个氨基酸，更优选8至20个氨基酸。

在本公开中，scFv靶向的靶分子是HER2、EpCAM或CEA。具体而言，HER2的scFv优选被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:5的VL经由连接子肽以VH、连接子肽和VL的顺序连接(即VH的C-端经由连接子肽连接到VL的N-端)，EpCAM的scFv优选被构建成使得SEQID NO:6的VL和SEQ ID NO:7的VH经由连接子肽以VL、连接子肽和VH的顺序连接(即，VL的C-端经由连接子肽连接到VH的N-端)。另外，CEA的scFV优选被构建成使得SEQ ID NO:8的VL和SEQ ID NO:9的VH经由连接子肽以VL、连接子肽和VH的顺序连接(即，VL的C-端经由连接子肽连接到VH的N-端)。

在本公开中，为了便于克隆，当用于细胞靶分子的scFv用作细胞靶向结构域时，可以将对应于任意限制性内切酶位点的氨基酸***scFv的VH和VL和糖蛋白附近的位点，当连接子肽位于scFv的VH和VL之间时，可以将对应于任意限制性内切酶位点的氨基酸***到scFv的VH和VL之间，或者***到VH或VL和连接子之间。例如，限制性内切酶EcoRI作用于其上的EF(碱基序列：GAATTC)，或BamHI作用于其上的GS(碱基序列：GGATCC)可以***其间。

在本公开中，当重组HSV被用作用于抗癌治疗的溶瘤病毒时，为了单独或以任何组合形式表达用于诱导或增强对癌细胞的免疫应答的因子，重组HSV可以被构建成使得相应因子的基因被***HSV基因组中。可以操作这些因子以表达细胞因子、趋化因子、免疫检查点拮抗剂(例如抗体、抗体衍生物或抗体类似物，尤其是scFv)；能够诱导免疫细胞(T细胞或NK细胞)活化的共刺激因子；能够抑制TGFβ功能的拮抗剂，其抑制对癌细胞(例如抗体、抗体衍生物或抗体类似物，尤其是scFv)的免疫应答；能够降解用于实体肿瘤微环境的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的肝素酶；能够抑制血管生成因子受体VEGFR-2(VEGF受体-2)功能的拮抗剂(例如抗体、抗体衍生物或抗体类似物，尤其是scFv)等。

作为细胞因子，例如，白介素如IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-24等，干扰素如IFNα、IFNβ、IFNγ等，肿瘤坏死因子如TNFα等，以及集落刺激因子如GM-CSF、G-CSF、FLT3L等，可以单独使用或以其两种或多种的任意组合使用，以便在重组HSV中表达。

作为趋化因子，例如，CCL2(C-C基序趋化因子配体2)、CCL5(RANTES)、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20和XCL-1(X-C基序趋化因子配体1)，可以单独或结合使用，以便在重组HSV中表达。

作为免疫检查点抗体、PD-1(程序性死亡受体1)、PD-L1(程序性死亡受体配体1)、PD-L2(程序性死亡受体配体2)、CD27(分化簇27)、CD28(分化簇28)、CD70(分化簇70)、CD80(分化簇80)、CD86(分化簇86)、CD137(分化簇137)、CD276(分化簇276)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)、GITRL(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体)和CTLA-4(溶细胞性T淋巴细胞相关抗原-4)的拮抗剂，可以单独或结合使用，以便在重组HSV中表达。

作为共刺激因子，CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、ICOS(诱导型T细胞共刺激物)、CD3γ、CD3δ和CD3ε，可以单独或结合使用，以便在重组HSV中表达。

在本公开中，可以操作重组HSV以表达一种前药活化酶，该酶将前药转化为对癌细胞显示毒性的药物。前药活化酶的示例可包括胞嘧啶脱氨酶，其将作为前药的5-FC(5-氟胞嘧啶)转化为作为药物的5-FU(5-氟尿嘧啶)；大鼠细胞色素P450(CYP2B1)，其将作为前药的CPA(环磷酰胺)转化为作为药物的PM(磷酰胺芥)；羧酸酯酶，其将作为前药的依立替康(SN-38150)转化为作为药物的SN-38；细菌硝基还原酶，其将作为前药的BC1954转化为作为DNA交联剂的4-羟胺151；分离自大肠杆菌的PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)，其将作为前药的6-甲基嘌呤-2’-脱氧核糖苷转化为作为药物的6-甲基嘌呤，等等。

此外，在本公开中，可以操作重组HSV以表达TRAIL(TNF相关的细胞凋亡诱导配体)。已知TRAIL通过与其受体结合来诱导癌细胞的死亡，该受体在癌细胞中过表达(KaoruTamura等人，多机制肿瘤靶向溶瘤病毒克服脑肿瘤中的耐药性，Mol.Ther.，2013年1月，21(1):68-77)。

关于使用因子或前药活化酶来诱导或增强这些免疫应答的更多细节，可以参见如下文献：Michele ardolino等人，[癌症免疫疗法中的细胞因子治疗，J.Oncotarget,Oncotarget.，2015年8月14日，6(23)]；Bernhard Homey等人，[趋化因子：癌症免疫治疗的试剂，Nat.Rev.Immunol.，2002年3月，2(3):175-84]；Marianela Candolfi等人，[评估在多形性胶质母细胞瘤(GBM)的免疫刺激基因治疗方法中与Flt3L结合使用的促凋亡转基因，J.FASEB J.，2008,22:107713]；Danny N Khalil等人，[癌症治疗的未来：免疫调节、CARs和联合免疫治疗，Nat.Rev.Clin.Oncol.，2016年5月，13(5):273-90]；Paul E.Hughes等人，[靶向疗法和检查点免疫疗法结合用于癌症治疗的]，Trends Immunol.，2016年7月，37(7):462-476]；Cole Peters和Samuel D.Rabkin[将疱疹病毒设计成溶瘤剂，Mol.TheOncolytics.，2015；2:15010]等。

在本公开中，用于诱导或增强免疫应答的因子或前药活化酶被构建成使得其基因的表达盒(expression cassette)(即，其中其基因与启动子序列(使其能够表达)和多聚腺苷酸化信号序列可操作地连接的构建体)被***HSV基因组中而不抑制HSV的增殖。这种***可以在不删除HSV基因组的情况下进行，或者可以***到删除了HSV基因组中一些或所有非必需基因的基因位点中。这里，在没有删除HSV基因组的情况下***时，可以在基因之间进行***，优选的***位点是例如UL3和UL4之间、UL26和UL27之间、UL37和UL38之间、UL48和UL49之间、UL53和UL54之间以及US1和US2之间。当***删除了非必需基因的基因位点或没有删除非必需基因的基因中时，如上所述，这种非必需基因可以选自任何非必需基因。

在本公开中，用于诱导或增强上述免疫应答的因子的基因表达盒被构建为使得其靶基因与启动子序列(使其能够表达)和多聚腺苷酸化信号序列可操作地连接，该多聚腺苷酸化信号序列是转录终止信号序列。这里，“可操作地连接”是指能够转录和/或翻译表达的靶基因的连接。例如，当任何启动子影响与其连接的靶基因的转录时，该启动子被认为与靶基因可操作地连接。

通常，启动子是具有控制一个或多个基因转录功能的核酸序列，位于基因转录起始位点的上游(5'侧)，并包括与DNA依赖性RNA聚合酶结合的位点、转录起始位点、转录因子结合位点等。在真核生物来源的情况下，启动子包括转录起始位点上游的TATA盒(通常位于转录起始位点(+1)的-20至-30位)、CAAT盒(通常位于转录起始位点的-75位)、增强子、转录因子结合位点等。

只要启动子能够表达与其连接的靶基因，可以使用所有组成型启动子(其在所有时间诱导基因表达)、诱导型启动子(其响应于特定外部刺激诱导靶基因的表达)、组织特异性启动子(其在特定组织或细胞中诱导基因表达)、组织非特异性启动子(其在所有组织或细胞中诱导基因表达)、内源启动子(来源于病毒感染细胞)和外源启动子(来源于病毒感染细胞以外的细胞)。许多启动子是本领域已知的，可以从中选择并使用合适的启动子。例如，有用的是CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)启动子、RSV(Rous sarcoma virus，劳斯肉瘤病毒)启动子、HSV(herpes simplex virus，单纯疱疹病毒)TK(thymidine kinase，胸苷激酶)启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒75K启动子、SV40启动子、金属硫蛋白启动子、CD45启动子(造血干细胞特异性启动子)、CD14启动子(单核细胞特异性启动子)，和癌细胞特异性启动子(肿瘤特异性启动子)，例如Survivin、Midkine、TERT、CXCR4等。特别地，当使用癌细胞特异性启动子时，仅在癌细胞中诱导靶基因的表达，从而抑制靶基因在正常细胞中的表达，从而增加了本公开的重组HSV的安全性。

表达盒被构建为包括除启动子之外的转录终止信号序列，所述转录终止信号序列是充当聚(A)添加信号(聚腺苷酸化信号)以增加转录的完整性和效率的序列。许多转录终止信号序列是本领域已知的，可以从中选择并使用合适的序列，例如SV40转录终止信号序列、HSV TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)转录终止信号序列等。

本公开的另一方面涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有上述重组HSV作为活性成分。

本公开的药物组合物对表达靶分子的癌具有抗癌作用，所述靶分子与***并融合到本公开的重组HSV的gH中的细胞靶向结构域特异性结合。癌瘤的示例如上文关于靶分子所述。

特别地，优选本公开的组合物对具有表达HER2、EpCAM或CEA的肿瘤细胞的癌具有抗癌作用。表达HER2的肿瘤细胞的示例包括乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、唾液腺肿瘤细胞等。此外，表达EpCAM的肿瘤细胞的示例包括肝癌细胞、***癌细胞、乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、胆囊癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞等。此外，表达CEA的肿瘤细胞的示例包括结肠直肠癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、直肠癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞等。

在本公开中，抗癌作用包括癌细胞的死亡、癌细胞的生存力降低、由于抑制癌细胞增殖而导致的癌症的病理学症状的抑制或延迟、抑制或延迟这种病理学症状的发作、抑制癌症转移和抑制癌症复发。

此外，本公开的药物组合物可以与批准的抗癌剂结合使用或混合使用。抗癌剂的示例可包括任何抗癌剂、任何细胞因子药物、任何抗体药物、任何免疫检查点抑制剂药物，和任何对癌细胞表现出细胞毒性的细胞治疗剂(用于嵌合抗原受体T细胞疗法(嵌合抗原受体T细胞疗法)或CAR-NK细胞疗法)，例如代谢拮抗剂、烷化剂、拓扑异构酶拮抗剂、微管拮抗剂和植物衍生的生物碱。其具体示例可包括紫杉醇、氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、顺铂、利妥昔单抗、埃罗替尼、索拉非尼、IL-2药物、IFN-α药物、IFN-γ药物、曲妥单抗、博纳吐单抗(blinatumomab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、替沙仑赛(tisagenlecleucel)(Kymriah)、阿基仑赛(axicabgene ciloleucel)(YESCARTA)等。除了示例性抗癌剂之外，本领域已知的其它抗癌剂可以可以无限制地与本公开的药物组合物结合或混合使用。

本公开的药物组合物可以包括药学上可接受的载体或赋形剂，因此可以根据给药途径通过本领域已知的典型方法制备成口服制剂或肠胃外制剂的形式。

这种药学上可接受的载体或赋形剂不会损害药物的活性或性质，并且其本身对人体没有毒性，其示例可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水(例如盐水和无菌水)、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、林格氏溶液、缓冲液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、葡聚糖、白蛋白及其任意组合。特别地，当将本公开的药物组合物配制成液体溶液的形式时，合适的载体或赋形剂可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇，其可以单独或结合使用。如果需要，可以加入并使用其它典型的药物添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。

当将本公开的药物组合物制备成口服制剂时，其可以制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式，当制备成肠胃外制剂，尤其是注射剂时，其可以制成单位剂量安瓿或多剂量形式。本公开的药物组合物还可以制备成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂等的形式。

根据制药领域的典型方法，本公开的药物组合物可以配制成适于施用至患者身体的单位剂型，并且可以通过口服给药途径或肠胃外给药途径给药，例如皮肤、病灶内、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、肺部、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、***内和直肠途径，使用本领域中常用的任何给药方法。

本公开的药物组合物的剂量(有效量)可以根据诸如配制方法、给药方式、患者的年龄、体重和性别、病理学状况、饮食、给药时间、给药途径、***率和反应敏感性等因素而变化，可以由本领域技术人员考虑这些因素而适当地确定。在一个优选的实施方式中，本公开的药物组合物被制备成单位剂型的注射剂。当制备成单位剂型的注射剂时，每单位剂量的本公开的药物组合物中包含的重组HSV的量可以为10²-10¹⁴pfu，特别是10⁴-10¹¹pfu。

本公开的又一方面涉及治疗或预防癌症(肿瘤)的方法，包括将有效量的含有上述重组HSV的药物组合物施用于对象如患者。

通过裂解和杀死具有靶分子的癌细胞，使得治疗癌症的方法成为可能，所述靶分子与***并融合到本公开的重组HSV的gH中的细胞靶向结构域特异性结合。因此，本公开的治疗方法可应用于具有这种靶分子的任何癌症。特别地，本公开的治疗方法优选地应用于表达HER2、EpCAM或CEA的癌。

本公开的治疗方法可以无限制地与上述其他癌症治疗方法结合使用。例如，如上所述，细胞毒性抗癌剂、细胞因子药物、抗体药物、免疫检查点抑制剂药物、细胞治疗剂(用于CAR-T细胞疗法或CAR-NK细胞疗法)，放射疗法、手术等，可以在施用本公开的药物组合物之前或之后使用，或者以与本公开的药物组合物组合同时施用的方式使用。

在本公开的治疗方法中，有效量是当基于医学专家的建议在给药期间将本公开的药物组合物施用于对象(例如患者)时，施用本公开的药物组合物以表现预期的医学效果(例如，癌症治疗或预防效果)的量。如上所述，这种有效量可以由本领域技术人员(例如医学专家等)适当地确定，这取决于患者的年龄、体重和性别、病理状况等，如上所述。

在本公开的治疗方法中，药物组合物优选以注射的形式以肠胃外给药的方式施用于患者，例如病灶内(肿瘤内)、静脉内、肌内或动脉内给药等。

有益效果

根据本公开，有可能提供具有用于重靶向经修饰的糖蛋白gH的重组HSV及其用途。

本公开的重组HSV能够感染具有靶分子的靶细胞，所述靶分子由于其糖蛋白gH中细胞靶向结构域的存在而特异性识别并结合细胞靶向结构域，因此可用于抗癌治疗或基因治疗。

附图简要说明

图1示意性地示出了KOS-37BAC的基因组结构；

图2示意性地示出了HVEM限制性HSV-1病毒的基因组结构；

图3示意性地示出了表达EmGFP的HVEM限制性HSV-1病毒的基因组结构；

图4显示表达EmGFP的HVEM限制性HSV-1病毒的荧光表达和具有HVEM受体的细胞的特异性感染的结果；

图5示意性地示出了具有用于靶向HER2的经修饰的糖蛋白gH的HSV-1，具有用于靶向EpCAM的经修饰的糖蛋白gH的HSV-1和具有用于靶向CEA的经修饰的糖蛋白gH的HSV-1中的每一个的基因组结构；

图6显示***到gH糖蛋白中的HER2scFv、gH-EpCAM2scFv和gH-CEAscFv配体的完整氨基酸序列和相应序列的构型；

图7显示具有用于靶向HER2的经修饰糖蛋白gH的HSV-1病毒对表达HER2的癌细胞的特异性感染和细胞死亡的结果；

图8显示了用于靶向EpCAM的具有经修饰的糖蛋白gH的HSV-1病毒对表达EpCAM的癌细胞的特异性感染和细胞死亡的结果；和

图9显示了用于靶向CEA的具有经修饰的糖蛋白gH的HSV-1病毒特异性感染表达CEA的癌细胞的结果。

最佳实施方式

通过以下实施例将更好地理解本公开。然而，这些实施例不应被解释为限制本公开的范围。

<实施例1>生产HVEM限制的HSV-1病毒

HSV-1基因由大约152kb大小的大基因组成，因此使用KOS-37/BAC(基因库登记号：MF156583)(Gierasch W.W.等人，含有HSV-1菌株17和KOS的细菌人工染色体的构建和表征，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)在特定基因位点***外源基因或突变。HSV-1KOS菌株是一种主要用于实验室的HSV-1菌株，因为其众所周知的特性及其在基因功能和病因学研究中的有用性(Smith KO.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1964.115:814-816)。通过将BAC质粒***到KOS基因组中而制备的KOS-37/BAC能够通过转化DH10B细菌(Invitrogen公司)在细菌水平进行克隆(Gierasch W.W.等人，含有HSV-1菌株17和KOS的细菌人工染色体的构建和表征，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)。在KOS-37/BAC中，BAC(细菌人工染色体)连同其两侧的LoxP位点一起***到HSV-1KOS基因组的UL37和UL38之间的基因位点中。这是为了在随后的过程中使用Cre-Lox***去除BAC基因。其示意图在图1中示出。

为了制备仅通过HVEM细胞受体进入细胞的HVEM限制性HSV-1，需要一种gD-R222N/F223I HSV-1病毒，其中HSV-1gD氨基酸序列(基因库登记号：ASM47818，SEQ ID NO:10)的第222位的精氨酸(R)和第223位的苯丙氨酸(F)分别被天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)取代。

通过突变制备的gD-R222N/F223I HSV-1病毒只能通过HVEM(HveA)，而非连接蛋白-1作为细胞进入受体来感染宿主细胞(Uchida H.等人，疱疹病毒入侵介质(HVEM)-限制性单纯疱疹病毒1型突变病毒的产生：表达HVEM的细胞的抗性和拯救连接蛋白-1识别的突变的鉴定，J.Virol.，2009.83(7):2951-2961)，因此，在安全性方面是有利的，因为它不能感染具有连接蛋白-1受体的正常细胞。

HVEM-限制性KOS-gD-R222N/F223I病毒的基因组结构示意性地显示在图2中。

KOS-gD-R222N/F223I HSV-1病毒是根据制造商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)，通过将R222N/F2231突变引入KOS37/BAC的gD位点而制备的。

具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化含有KOS-37/BAC的大肠杆菌克隆，所述RecE和RecT能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人，通过ET重组快速修饰细菌人工染色体，Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物gD-rpsL For：SEQ ID NO:11，反向引物gD-rpsL Rev：SEQ ID NO:12)制备gD-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括将突变引入gD的基因位点。gD-rpsL-neo/kan盒由位于***位点(insertion locus)的gD同源区、rpsL基因和neo/kan基因组成，其中，rpsL基因是赋予链霉素敏感性的选择性标记，neo/kan基因赋予卡那霉素抗性。当***gD-rpsL-neo/kan盒时，产生了由于rpsL基因而对链霉素抗生素具有敏感性和由于neo/kan基因而具有卡那霉素抗性的大肠杆菌。通过向含有KOS37/BAC和pRed/ET的大肠杆菌克隆中加入L-***糖(Sigma-Aldrich公司)来激活pRed/ET的功能，从而诱导RecE和RecT的表达以实现同源重组(Muyrers J.P.等人，通过ET重组快速修饰细菌人工染色体，Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)，用200ng制备的gD-rpsL-neo/kan盒进行转化。通过同源重组，将gD-rpsL-neo/kan盒***到KOS-37/BAC大肠杆菌的gD基因位点中，其中，***到KOS-37/BAC大肠杆菌的gD-rpsL-neo/kan表现出卡那霉素抗性，但是链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断gD-rpsL-neo/kan被***其中，并进行***基因的最后步骤。通过向含有KOS 37-BAC gD-rpsL-neo/kan克隆的大肠杆菌中加入L-***糖(Sigma-Aldrich公司)来激活pRed/ET的功能，从而诱导RecE和RecT的表达以实现同源重组，用100pmol的R222N_F2231_突变体(SEQ ID NO:13)，它是一种寡核苷酸，其中gD的第222和第223位的R和F分别被N和I取代。基于用***的寡核苷酸替换现有的gDrpsL-neo/kan盒时，rpsL阻断的链霉素抗性被激活的原理，在链霉素培养基中选择候选物(Heermann R.等人，使用

重组在大肠杆菌染色体中简单产生定点突变，Microb.Cell Fact.，7,14,2008)。使用DNA制备方法从选定的候选者中分离DNA(Horsburgh B.C.等人，使用细菌人工染色体对单纯疱疹病毒进行基因操作，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)，通过PCR(聚合酶链式反应)和DNA测序证实了gD的相应位置第222和第223处的N和I的取代。

接下来，为了生产病毒，使用大型构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μg DNA转染2×10⁵Cre-Vero-HVEM细胞。然后，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS(胎牛血清，Welgene公司)的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，达尔伯克改良伊格尔培养基)(Welgene公司)进行细胞培养。Cre-Vero-HVEM细胞系是通过将HVEM基因***Cre-Vero细胞系来诱导HVEM蛋白表达的细胞系(Gierasch W.W.等人，含有HSV-1菌株17和KOS的细菌人工染色体的构建和表征，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)。使用Cre-Vero-HVEM的原因是，可以使用细胞的Cre重组酶去除KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I的BAC基因，并且由于HVEM过表达而被KOS-gD-R222N/F223I病毒感染也是有效的，因此病毒的大量生产变得容易。基因导入3-4天后，确认细胞噬斑的形成，然后收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(Gierasch W.W.etal.等人，含有HSV-1菌株17和KOS的细菌人工染色体的构建和表征，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得KOS-gD-R222N/F223I病毒。

<实施例2>制备表达EmGFP的HVEM限制性HSV-1病毒

为了生产表达EmGFP的HVEM限制性HSV-1，将能够表达EmGFP(翠绿色荧光蛋白)的表达盒***实施例1(Tiffany A.等人，通过感染-转染方法工程化单纯疱疹病毒，包括通过CRISPR/Cas9核酸酶靶向重组位点，J.Virol.Methods.，2015.231:18-25)中制备的KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA的UL26/UL27基因位点中。这有助于使用EmGFP作为标记物观察病毒的产生和感染。使用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒(Invitrogen公司)制备EmGFP盒。

表达EmGFP的KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I的基因组结构示意性地示于图3中。

对于EmGFP表达，将使用pCMV作为巨细胞病毒的基因启动子和tkpA作为HSV TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)的聚腺苷酸化信号的pCMV-EmGFP-tkpA***KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA。

如实施例1，所有***方法都是根据制造商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)。

具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化含有KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I的克隆，所述pRed/ET质粒能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人，通过ET重组快速修饰细菌人工染色体，Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物UL26/27-rpsL_For：SEQ ID NO:14，反向引物UL26/27-rpsL_Rev：SEQ ID NO:15)制备UL26/27-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括在UL26和UL27之间引入靶基因的基因位点。向含有KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA和pRed/ET的克隆中加入L-***糖(Sigma-Aldrich公司)，以诱导同源重组，然后用200ng制备的UL26/27-rpsL-neo/kan盒转化。通过同源重组大肠杆菌将UL26/27-rpsL-neo/kan盒***到KOS-37/BAC的UL26/27基因位点，其中***了UL26/27-rpsL-neo/kan的同源重组大肠杆菌表现出卡那霉素抗性，但链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断gD-rpsL-neo/kan被***其中，并进行***基因的最后步骤。

向含有UL26/27-rpsL-neo/kan盒的大肠杆菌中加入激活pRed/ET的功能的L-***糖(Sigma-Aldrich公司)，从而诱导同源重组，然后用200ng的UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV盒转化。使用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒(Invitrogen公司)作为模板，正向引物UL26/27-tkpA_For(SEQ ID NO:16)和反向引物UL26/27-pCMV_Rev(SEQ ID NO:17)制备UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV盒。

在用***的UL26/27tkpA-EmGFP-pCMV替换现有的UL26/27-rpsL-neo/kan盒时，被rpsL阻断的链霉素抗性被激活，基于这一原理，在链霉素培养基中选择候选物(HeermannR.等人，使用

重组在大肠杆菌染色体中简单产生定点突变，Microb.CellFact.，7,14,2008)。使用

重组在大肠杆菌染色体中简单产生定点突变，Microb.Cell Fact.，7,14,2008)。使用DNA制备方法从选定的候选者中分离DNA(HorsburghB.C.等人，使用细菌人工染色体对单纯疱疹病毒进行基因操作，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)。通过限制性内切酶EcoRI和XhoI处理和PCR(聚合酶链式反应)证实了在UL26/27引入tkpA-EmGFP-pCMV，并通过PCR产物的测序鉴定了确切的基因序列。

对荧光蛋白的正常表达和病毒的产生进行了实验。使用大构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μg DNA转染2×10⁵Cre-Vero-HVEM细胞，以使用Cre重组酶去除BAC基因。转染3天后，用荧光显微镜观察EmGFP蛋白的表达，并通过形成Cre-Vero-HVEM细胞噬斑观察病毒的产生。在确认噬斑形成后，收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(Gierasch W.W.et al.等人，含有HSV-1菌株17和KOS的细菌人工染色体的构建和表征，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得KOS-gD-R222N/F223I病毒。

为了感染KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒及其荧光表达，使用无HVEM的细胞系(J1和J-Nectin)和表达HVEM的细胞系(J-HVEM)。J1细胞是缺乏病毒HSV-1受体HVEM和连接蛋白-1的幼仓鼠肾细胞系(Petrovic B.等人，在gB中***HER2的配体重新靶向HSV向性，并消除了激活其他进入糖蛋白的需要，2017，PLoS Pathog.，13(4):e1006352)。J-Nectin和J-HVEM细胞系是在J1细胞中分别过表达连接蛋白-1和HVEM的细胞系(Petrovic B.等人，在gB中***HER2的配体重新靶向HSV向性，并消除了激活其他进入糖蛋白的需要，2017，PLoSPathog.，13(4):e1006352)。将各细胞系在含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS(胎牛血清，Welgene公司)的DMEM(Welgene公司)中培养。用上述获得的KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒，以10MOI(感染复数)感染1×10⁴个细胞，24小时后，使用荧光显微镜观察荧光蛋白表达和病毒感染(Baek H.J.等人，双特异性接头介导的受体限制性HSV-1载体向携带CEA的肿瘤细胞的重靶向，Mol.Ther.，2011.19(3):507-514)。

其结果显示在图4中，使用荧光显微镜和光学显微镜分别拍摄其上部图像和下部图像。参见图4的上部荧光显微镜图像，可以看出JI细胞系和J-Nectin细胞系未被感染，只有J-HVEM细胞系被感染。

基于上述结果，证实了KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(GDM)的增殖如预期的那样，通过荧光蛋白的表达容易观察到，并且仅使用HVEM作为进入受体，而不使用连接蛋白-1，细胞进入成为可能。

<实施例3>生产具有靶向HER2的经修饰的糖蛋白gH的HSV-1、具有靶向EpCAM的经修饰的糖蛋白gH的HSV-1和具有靶向CEA的经修饰的糖蛋白gH的HSV-1

为了生产能够靶向在特定癌症中表达的靶分子的重靶向HSV，将识别在癌细胞中特异性表达的HER2、EpCAM或CEA的配体(scFv)***到gH氨基酸序列(基因库登记号：ASM47773,SEQ ID NO:1)的氨基酸29和30之间，gH是HSV-1的糖蛋白。将能够表达HER2scFv、EpCAMscFv或CEAscFv的基因***到KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA中的糖蛋白gH的氨基酸29和30之间，其中***了实施例2中制备的EmGFP表达盒(pCMV-EmGFP-tkpA)。

KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒、KOS-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒和KOS-gH/CEAscFv-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒的基因组结构，其中HER2scFv配体、EpCAMscFv配体和CEAscFv配体分别***到HSV-1的gH中，如图5所示，***到gH糖蛋白中的HER2scFv配体、gH-EpCAM2scFv配体或gH-CEAscFv配体的完整序列和相应序列的构型如图6所示。

这里，HER2的scFv被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:5的VL经由SEQ IDNO:18的连接子肽连接，并且SEQ ID NO:19的连接子肽和SEQ ID NO:20的连接子肽分别连接到HER2 scFv的N-端和C-端。此外，EpCAM的scFv被构建成使得SEQ ID NO:6的VL和SEQ IDNO:7的VH经由SEQ ID NO:21的连接子肽连接，并且SEQ ID NO:22的连接子肽和SEQ ID NO:23的连接子肽分别连接到EpCAM scFv的N-端和C-端。而且，CEA的scFv被构建成使得SEQ IDNO:8的VL和SEQ ID NO:9的VH经由SEQ ID NO:24的连接子肽连接，并且SEQ ID NO:25的连接子肽和SEQ ID NO:26的连接子肽分别连接到CEA scFv的N-端和C-端。

在本实施例中使用的，HER2scFv全长的氨基酸序列和基因序列分别表示在SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:28中，EpCAMscFv全长的氨基酸序列和基因序列分别表示在SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中，CEAscFv全长的氨基酸序列和基因序列表示在NO:31和SEQ ID NO:32中。

HER2scFv配体、EpCAMscFv配体或CEAscFv配体在gH中的***是根据生产商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)，如在实施例1和2中。

具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化实施例2中制备的含有KOS-37/BACEmGFP-gD-R222N/F223I DNA的大肠杆菌克隆，所述RecE和RecT能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人，通过ET重组快速修饰细菌人工染色体，Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物gH29/30-rpsL-neo_for：SEQ IDNO:33，反向引物gH29/30-rpsL-neo_rev：SEQ ID NO:34)制备gH29/30-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括在gH的氨基酸29和30之间引入靶基因的基因位点。向含有KOS37-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和pRed/ET的克隆中加入L-***糖(Sigma-Aldrich公司)以诱导同源重组，然后用200ng如上所述制备的gH29/30-rpsL-neo/kan盒转化。通过这种同源重组，将gH29/30-rpsL-neo/kan盒***KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA大肠杆菌的gH的氨基酸29和30之间的位置，***了gH29/30-rpsL-neo/kan的KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA大肠杆菌表现出卡那霉素抗性，但链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断gD-rpsL-neo/kan被***其中，并进行***基因的最后步骤。

向含有gH29/30-rpsL-neo/kan盒的大肠杆菌中加入激活pRed/ET的功能的L-***糖(Sigma-Aldrich公司)，从而诱导同源重组，然后用200ng的gH29/30-HER2scFv配体、gH29/30-EpCAMscFv配体和gH29/30-CEAscFv配体中的每一种转化。gH29/30-HER2scFv配体、gH29/30-EpCAMscFv配体和gH29/30-CEAscFv配体使用正向引物gH29/30-scFv_For(SEQID NO:35)和反向引物gH29/30-scFv_Rev(SEQ ID NO:36)制备，使用pCAGGSMCS-gH-HER2scFv质粒、pCAGGSMCS-gH-EpCAMscFv质粒和pCAGGSMCS-gH-CEAscFv质粒作为各自的模板。pCAGGSMCS-gH-HER2scFv质粒、pCAGGSMCS-gH-EpCAMscFv质粒和pCAGGSMCS-gH-CEAscFv质粒是通过将各自的scFv基因***到pCAGGSMCS质粒的MCS中来制备(Atanasiu D.等人，基于双重***蛋白的融合试验表明，单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白gB的突变改变了由HSV进入糖蛋白诱导的细胞-细胞融合的动力学，J.Virol.，2013年11月，87(21):11332-11345)。

在用上述***的gH29/30靶scFv替换常规***的gH29/30-rpsL-neo/kan盒时，被rpsL阻断的链霉素抗性被激活，基于这一原理，在链霉素培养基中选择候选物(HeermannR.等人，使用

重组在大肠杆菌染色体中简单产生定点突变，Microb.Cell Fact.，7,14,2008)。使用DNA制备方法(Horsburgh B.C.等人，使用细菌人工染色体对单纯疱疹病毒进行基因操作，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)。通过限制性内切酶EcoRI和XhoI处理和PCR(聚合酶链式反应)证实了在gH29/30处每个scFv的引入，并通过PCR产物的测序鉴定了确切的基因序列。

使用大构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA、KOS-37/BAC-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和KOS-37/BAC-gH/CEAscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μg DNA转染2×10⁵Cre-Vero-HVEM细胞，以使用Cre重组酶去除BAC基因。转染3天后，用荧光显微镜观察EmGFP蛋白的荧光表达和细胞斑的形成。在确认噬斑形成后，收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(Gierasch W.W.etal.等人，含有HSV-1菌株17和KOS的细菌人工染色体的构建和表征，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(gH-scHER2)、KOS-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(gH-scEpCAM)和KOS-gH/CEAscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(gH-scCEA)。

<实施例4>使用具有经修饰的糖蛋白gH的、靶向HER2的HSV-1病毒，对表达HER2的癌细胞的感染和细胞毒性

为了证实实施例3中制备的KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(gH-scHER2)是否由于在糖蛋白gH中表达的HER2scFv配体而诱导病毒感染到周围的癌细胞中，以及其是否诱导感染后的细胞死亡，进行了以下实验。

实验中使用的细胞系是不表达HER2的细胞系(MDA-MB-231)和表达HER2的细胞系(SK-OV-3、MCF7和MDA-MB-231)。对于乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC、HTB-26)和MCF-7(ATCC、HTB-22)和卵巢癌细胞系SK-OV-3(ATCC、HTB-77)，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS的DMEM进行培养。对于乳腺癌细胞系MDA-MB-453(ATCC、HTB-131)，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS的RPMI 1640培养基(Welgene公司)进行培养。

对于HER2-特异性病毒感染，使用2MOl的1×10⁴SK-0V-3和MDA-MB-231细胞系，并用实施例3中制备的在gH中表达HER2scFv配体的病毒(gH-scHER2)和作为对照的不表达HER2scFv配体的病毒(gDm)感染。90分钟后，用新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒。感染2天后，通过每个细胞系中的荧光表达确认病毒感染。为了测量5天的细胞死亡，使用荧光显微镜观察在用EZ-Cytox(DogenBio)试剂处理后由每种病毒引起的癌细胞系的细胞毒性。此外，为了测量感染4天后的细胞毒性，使用ELISA阅读器，并使用EZ-Cytox(DoGenBio)试剂在450nm处测量甲臜的显色程度，甲臜是仅在活细胞中形成的显色材料。对吸光度进行定量，以确定每种病毒对癌细胞系的细胞毒性。

其结果显示于图7中。从图7可以明显看出，在不表达MDA-MB-231的HER2中，在gH中表达HER2scFv配体的gH-scHER2病毒和不表达HER2scFv配体的GDM病毒都未被感染，因此没有观察到荧光。然而，可以证实表达HER2的细胞系SK-OV-3、MDA-MB-453和MCF-7被表达HER2scFv配体的gH-scHER2病毒特异性感染，因此观察到荧光。

此外，图7示出了在感染5天后观察由病毒引起的癌细胞的细胞毒性的结果。在不表达HER2的MDA-MB-231中，由于表达HER2scFv配体的gH-scHER2病毒或由于不表达HER2scFv配体的gDm病毒，细胞死亡没有发生。然而，仅由于在gH中表达HER2scFv配体的gH-scHER2病毒，观察到表达HER2的细胞系SK-OV-3、MDA-MB-453和MCF-7的细胞活力值分别为41％、61％和49％。总之，证实了在gH中表达HER2scFv配体的gH-scHER2病毒有效地诱导了表达HER2的癌细胞的特异性感染和细胞毒性。

<实施例5>使用具有经修饰的糖蛋白gH的、靶向EpCAM的HSV-1病毒，对表达EpCAM的癌细胞的感染和细胞毒性

为了证实实施例3中制备的KOS-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(gH-scEpCAM)是否由于在糖蛋白gH中表达的EpCAMscFv配体而诱导病毒感染到周围的癌细胞中，以及其诱导感染后的细胞死亡，进行了以下实验。

实验中使用的细胞系是不表达EpCAM的细胞系(Mia-PaCa-2)和表达EpCAM的细胞系(MCF-7、MDA-MB-453和BT-474)。对于乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC、HTB-22)和BT-474(ATCC、HTB-20)和胰腺癌细胞系Mia-PaCa-2(ATCC、CRL-1420)，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS的DMEM进行培养。对于乳腺癌细胞系MDA-MB-453(ATCC、HTB-131)，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS的RPMI培养基进行培养。

对于EpCAM-特异性病毒感染，使用2MOI的4.0×10⁴MCF-7、8.0×10⁴MDA-MB-453和7.0×10⁴BT-474细胞系，并用实施例3中制备的在gH中表达EpCAMscFv配体的病毒(gH-scEpCAM)和作为对照的不表达EpCAMscFv配体的病毒(gDm)感染。90分钟后，用新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒。感染2天后，通过每个细胞系中的荧光表达确认病毒感染(Baek H.J.等人，双特异性接头介导的受体限制性HSV-1载体向携带CEA的肿瘤细胞的重靶向，Mol.Ther.，2011.19(3):507-514)。为了测量5天的细胞死亡，使用荧光显微镜观察在用EZ-Cytox(DogenBio)试剂处理后由每种病毒引起的癌细胞系的细胞毒性。此外，为了测量感染5天后的细胞毒性，使用ELISA阅读器，并使用EZ-Cytox(DoGenBio)试剂在450nm处测量甲臜的显色程度，甲臜是仅在活细胞中形成的显色材料。对吸光度进行定量，以确定每种病毒对癌细胞系的细胞毒性。

其结果示于图8中。从图8可以明显看出，在不表达EpCAM的Mia-PaCa-2中，表达EpCAMscFv配体的病毒(gH-scEpCAM)和不表达EpCAMscFv配体的病毒(gDm)(作为对照)都未被感染，因此没有观察到荧光。然而，可以证实表达EpCAM的细胞系SK-OV-3、MDA-MB-453和MCF-7仅被表达EpCAMscFv配体的病毒(gH-scEpCAM)特异性感染，因此观察到荧光。

此外，图8示出了在感染5天后观察由病毒引起的癌细胞的细胞毒性的结果。在不表达EpCAM的Mia-PaCa-2中，由于表达EpCAMscFv配体的病毒(gH-scEpCAM)或由于不表达EpCAMscFv配体的病毒(gDm)(作为对照)，细胞死亡没有发生。然而，仅由于表达EpCAMscFv配体的病毒(gH-scEpCAM)，观察到表达EpCAM的细胞系，例如BT-474、MDA-MB-453和MCF-7的细胞活力值分别为35％、22％和36％。总之，证实了在gH中表达EpCAMscFv配体的病毒有效地诱导了表达EpCAM的癌细胞的特异性感染和细胞死亡。

<实施例6>使用具有经修饰的糖蛋白gH的、靶向CEA的HSV-1病毒，对表达CEA的癌细胞的感染和细胞毒性

为了证实实施例3中制备的KOS-gH/CEAscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(gH-scCEA)是否由于在糖蛋白gH中表达的CEAscFv配体而诱导病毒感染到周围的癌细胞中，进行了以下实验。

实验中使用的细胞系是不表达CEA的细胞系(CHO-K1)和表达CEA的细胞系(CHO-CEA)。用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS(胎牛血清)的HaM's F-12K培养基(Welgene公司)培养中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1和CHO-CEA(KurokiM.，J Biol.Chem.，1991，74:10132-10141)。

对于EpCAM-特异性病毒感染，使用20MOI的2.5×10⁴CHO-K1和CHO-CEA细胞系，并用实施例3中制备的在gH中表达CEAscFv配体的病毒(gH-scCEA)和作为对照的不表达EpCAMscFv配体的病毒(gDm)感染。90分钟后，用新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒。感染2天后，通过每个细胞系中的荧光表达确认病毒感染(Baek H.J.等人，双特异性接头介导的受体限制性HSV-1载体向携带CEA的肿瘤细胞的重靶向，Mol.Ther.，2011.19(3):507-514)。

其结果示于图9中。从图9可以明显看出，在不表达CEA的CHO-K1中，在gH中表达CEAscFv配体的病毒(gH-scCEA)和不表达EpCAMscFv配体的病毒(gDm)(作为对照)都未被感染，因此没有观察到荧光。然而，在表达CEA的细胞系CHO-CEA中，可以证实，由于仅用表达CEAscFv配体的病毒(gH-scCEA)特异性感染，可以观察到荧光。总之，证实了在gH中表达CEAscFv配体的病毒有效地诱导了表达CEA的细胞的特异性感染。

<110> 吉赛尔美德公司（KOREA, gencellmed）

<120> 含有表达肿瘤细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白的

表达盒的重组单纯疱疹病毒及其用途

（Recombinant Herpes Simplex Virus Containing Expression Cassette

Expressing a Fused Protein of Tumor Cell-targeting Domain and

Extracellular Damain of HVEM and Use of the Same）

<130> PP20-000

<160> 36

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 838

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gH

<400> 1

Met Gly Asn Gly Leu Trp Phe Val Gly Val Ile Leu Leu Gly Val Ala

1 5 10 15

Trp Gly Gln Val His Asp Trp Thr Glu Gln Thr Asp Pro Trp Phe Leu

20 25 30

Asp Gly Leu Gly Met Asp Arg Met Tyr Trp Arg Asp Thr Asn Thr Gly

35 40 45

Arg Leu Trp Leu Pro Asn Thr Pro Asp Pro Gln Lys Pro Pro Arg Gly

50 55 60

Phe Leu Ala Pro Pro Asp Glu Leu Asn Leu Thr Thr Ala Ser Leu Pro

65 70 75 80

Leu Leu Arg Trp Tyr Glu Glu Arg Phe Cys Phe Val Leu Val Thr Thr

85 90 95

Ala Glu Phe Pro Arg Asp Pro Gly Gln Leu Leu Tyr Ile Ser Lys Thr

100 105 110

Tyr Leu Leu Gly Arg Pro Pro Asn Ala Ser Leu Pro Ala Pro Ile Thr

115 120 125

Val Glu Pro Thr Ala Gln Pro Pro Pro Ala Val Ala Pro Leu Lys Gly

130 135 140

Leu Leu His Asn Pro Thr Ala Ser Val Leu Leu Arg Ser Arg Ala Trp

145 150 155 160

Val Thr Phe Ser Ala Val Pro Asp Pro Glu Ala Leu Thr Phe Pro Arg

165 170 175

Gly Asp Asn Val Ala Thr Ala Ser His Pro Ser Gly Pro Arg Asp Thr

180 185 190

Pro Pro Pro Arg Pro Pro Val Gly Ala Arg Arg His Pro Thr Thr Glu

195 200 205

Leu Asp Ile Thr His Leu His Asn Ala Ser Thr Thr Trp Leu Ala Thr

210 215 220

Arg Gly Leu Leu Arg Ser Pro Gly Arg Tyr Val Tyr Phe Ser Pro Ser

225 230 235 240

Ala Ser Thr Trp Pro Val Gly Ile Trp Thr Thr Gly Glu Leu Val Leu

245 250 255

Gly Cys Asp Ala Ala Leu Val Arg Ala Arg Tyr Gly Arg Glu Phe Met

260 265 270

Gly Leu Val Ile Ser Met His Asp Ser Pro Pro Val Glu Val Met Val

275 280 285

Val Pro Ala Gly Gln Thr Leu Asp Arg Val Gly Asp Pro Ala Asp Glu

290 295 300

Asn Pro Pro Gly Ala Leu Pro Gly Pro Pro Gly Gly Pro Arg Tyr Arg

305 310 315 320

Val Phe Val Leu Gly Ser Leu Thr Arg Ala Asp Asn Gly Ser Ala Leu

325 330 335

Asp Ala Leu Arg Arg Val Gly Gly Tyr Pro Glu Glu Gly Thr Asn Tyr

340 345 350

Ala Gln Phe Leu Ser Arg Ala Tyr Ala Glu Phe Phe Ser Gly Asp Ala

355 360 365

Gly Ala Glu Gln Gly Pro Arg Pro Pro Leu Phe Trp Arg Leu Thr Gly

370 375 380

Leu Leu Ala Thr Ser Gly Phe Ala Phe Val Asn Ala Ala His Ala Asn

385 390 395 400

Gly Ala Val Cys Leu Ser Asp Leu Leu Gly Phe Leu Ala His Ser Arg

405 410 415

Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Asp

420 425 430

Ser Val Phe Phe Asn Val Ser Val Leu Asp Pro Thr Ala Arg Leu Gln

435 440 445

Leu Glu Ala Arg Leu Gln His Leu Val Ala Glu Ile Leu Glu Arg Glu

450 455 460

Gln Ser Leu Ala Leu His Ala Leu Gly Tyr Gln Leu Ala Phe Val Leu

465 470 475 480

Asp Ser Pro Ser Ala Tyr Asp Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala His Leu

485 490 495

Ile Asp Ala Leu Tyr Ala Glu Phe Leu Gly Gly Arg Val Leu Thr Thr

500 505 510

Pro Val Val His Arg Ala Leu Phe Tyr Ala Ser Ala Val Leu Arg Gln

515 520 525

Pro Phe Leu Ala Gly Val Pro Ser Ala Val Gln Arg Glu Arg Ala Arg

530 535 540

Arg Ser Leu Leu Ile Ala Ser Ala Leu Cys Thr Ser Asp Val Ala Ala

545 550 555 560

Ala Thr Asn Ala Asp Leu Arg Thr Ala Leu Ala Arg Ala Asp His Gln

565 570 575

Lys Thr Leu Phe Trp Leu Pro Asp His Phe Ser Pro Cys Ala Ala Ser

580 585 590

Leu Arg Phe Asp Leu Asp Glu Ser Val Phe Ile Leu Asp Ala Leu Ala

595 600 605

Gln Ala Thr Arg Ser Glu Thr Pro Val Glu Val Leu Ala Gln Gln Thr

610 615 620

His Gly Leu Ala Ser Thr Leu Thr Arg Trp Ala His Tyr Asn Ala Leu

625 630 635 640

Ile Arg Ala Phe Val Pro Glu Ala Ser His Arg Cys Gly Gly Gln Ser

645 650 655

Ala Asn Val Glu Pro Arg Ile Leu Val Pro Ile Thr His Asn Ala Ser

660 665 670

Tyr Val Val Thr His Ser Pro Leu Pro Arg Gly Ile Gly Tyr Lys Leu

675 680 685

Thr Gly Val Asp Val Arg Arg Pro Leu Phe Leu Thr Tyr Leu Thr Ala

690 695 700

Thr Cys Glu Gly Ser Thr Arg Asp Ile Glu Ser Lys Arg Leu Val Arg

705 710 715 720

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Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe Ala Gly Leu Gly

725 730 735

Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala Val Gly Lys Val

740 745 750

Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val Ser Gly Val Ser

755 760 765

Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val Gly Leu Leu Val

770 775 780

Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg Tyr Val Met Arg

785 790 795 800

Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu Thr Thr Lys Glu

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<223> HER2scFv C-terminus Linker

<400> 19

Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HER2scFv N-terminus Linker

<400> 20

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EpCAM Linker

<400> 21

Ala Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro

1 5 10 15

Thr Ala Asn Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val

20 25

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EpCAMscFv N-terminus

<400> 22

Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 23

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EpCAMscFv C-terminus

<400> 23

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEA Linker

<400> 24

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEAscFv N-terminus Linker

<400> 25

Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEAscFv C-terminus Linker

<400> 26

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 27

<211> 268

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HER2scFv ligand whole sequence

<400> 27

Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Glu Val Gln

1 5 10 15

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

20 25 30

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

35 40 45

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

50 55 60

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

65 70 75 80

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

85 90 95

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

100 105 110

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

115 120 125

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

145 150 155 160

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp

165 170 175

Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

180 185 190

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

195 200 205

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

210 215 220

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr

225 230 235 240

Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala

260 265

<210> 28

<211> 801

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HER2scFv ligand whole sequence

<400> 28

gcggccgcca gtagtggcgg tggctctggt tccggtggag aggtgcagct ggttgaatct 60

ggcggaggac tggttcagcc tggcggatct ctgagactgt cttgtgccgc cagcggcttc 120

aacatcaagg acacctacat ccactgggtc cgacaggccc ctggcaaagg acttgaatgg 180

gtcgccagaa tctaccccac caacggctac accagatacg ccgactctgt gaagggcaga 240

ttcaccatca gcgccgacac cagcaagaac accgcctacc tgcagatgaa cagcctgaga 300

gccgaggaca ccgccgtgta ctactgttct agatggggag gcgacggctt ctacgccatg 360

gattattggg gccagggcac cctggtcaca gtttctagcg gaggcggagg ttctggcggc 420

ggaggaagtg gtggcggagg ctctgatatc cagatgacac agagccccag cagcctgtct 480

gcctctgtgg gagacagagt gaccatcacc tgtagagcca gccaggacgt gaacacagcc 540

gtggcttggt atcagcagaa gcctggcaag gcccctaagc tgctgatcta cagcgccagc 600

tttctgtaca gcggcgtgcc cagcagattc agcggctcta gaagcggcac cgacttcacc 660

ctgaccataa gcagtctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgtca gcagcactac 720

accacacctc caaccttcgg acagggcacc aaggtggaaa tcaagggtgg aggctctggt 780

tccggtggat ccgcggccgc g 801

<210> 29

<211> 280

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EpCAMscFv ligand whole sequence

<400> 29

Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met

1 5 10 15

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr

35 40 45

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

50 55 60

Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

65 70 75 80

Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

85 90 95

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro

100 105 110

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr Pro

115 120 125

Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala Asn

130 135 140

Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly

145 150 155 160

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly

165 170 175

Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser

195 200 205

Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr

210 215 220

Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

225 230 235 240

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala

275 280

<210> 30

<211> 840

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EpCAMscFv ligand whole sequence

<400> 30

gcggccgcca gtagtggcgg tggctctggt tccggtgata tccagatgac ccagtccccg 60

tcctccctga gtgcttctgt tggtgaccgt gttaccatca cctgccgttc caccaaatcc 120

ctcctgcact ccaacggtat cacctacctt tattggtatc aacagaaacc gggtaaagct 180

ccgaaacttc tgatctacca gatgtccaac ctggcttccg gtgttccgtc tcgtttctcc 240

agttctggtt ctggtaccga cttcaccctg accatctctt ctctgcagcc ggaagacttc 300

gctacctact actgcgctca gaacctggaa atcccgcgta ccttcggtca gggtaccaaa 360

gttgaactta agcgcgctac cccgtctcac aactcccacc aggttccatc cgcaggcggt 420

ccgactgcta actctggaac tagtggatcc gaagtacagc tggttcagtc cggcccgggt 480

cttgttcaac cgggtggttc cgttcgtatc tcttgcgctg cttctggtta cacgttcacc 540

aactacggca tgaactgggt caaacaggct ccgggtaaag gcctggaatg gatgggctgg 600

atcaacacct acaccggtga atccacctac gctgactcct tcaaaggtcg cttcactttc 660

tccctcgaca caagtgctag tgctgcatac ctccaaatca actcgctgcg tgcagaggat 720

acagcagtct attactgcgc ccgtttcgct atcaaaggtg actactgggg tcaaggcacg 780

ctgctgaccg tttcctcgtc ttccggtgga ggctctggtt ccggtggatc cgcggccgcg 840

840

<210> 31

<211> 262

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEAscFv ligand whole sequence

<400> 31

Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Gln

1 5 10 15

Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Thr Val

20 25 30

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp

35 40 45

Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala Lys

50 55 60

Ala Leu Ser Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly

85 90 95

Asp Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

100 105 110

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly

130 135 140

Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

145 150 155 160

Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Asp Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro

165 170 175

Gly Lys Gly Phe Lys Tyr Met Gly Trp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Glu

180 185 190

Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu

195 200 205

Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu

210 215 220

Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys Ala Lys Gly Thr Gly Thr Ser Ala Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Gln Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Ser Gly Ala Ala Ala

260

<210> 32

<211> 801

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEAscFv ligand whole sequence

<400> 32

gcggccgcca gtagtggcgg tggctctggt tccggtggag aggtgcagct ggttgaatct 60

ggcggaggac tggttcagcc tggcggatct ctgagactgt cttgtgccgc cagcggcttc 120

aacatcaagg acacctacat ccactgggtc cgacaggccc ctggcaaagg acttgaatgg 180

gtcgccagaa tctaccccac caacggctac accagatacg ccgactctgt gaagggcaga 240

ttcaccatca gcgccgacac cagcaagaac accgcctacc tgcagatgaa cagcctgaga 300

gccgaggaca ccgccgtgta ctactgttct agatggggag gcgacggctt ctacgccatg 360

gattattggg gccagggcac cctggtcaca gtttctagcg gaggcggagg ttctggcggc 420

ggaggaagtg gtggcggagg ctctgatatc cagatgacac agagccccag cagcctgtct 480

gcctctgtgg gagacagagt gaccatcacc tgtagagcca gccaggacgt gaacacagcc 540

gtggcttggt atcagcagaa gcctggcaag gcccctaagc tgctgatcta cagcgccagc 600

tttctgtaca gcggcgtgcc cagcagattc agcggctcta gaagcggcac cgacttcacc 660

ctgaccataa gcagtctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgtca gcagcactac 720

accacacctc caaccttcgg acagggcacc aaggtggaaa tcaagtcttc cggtggaggc 780

tctggttccg gtgcggccgc g 801

<210> 33

<211> 73

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gH29/30-rpsL-neo_For

<400> 33

tcgtgggggt tattcttttg ggcgttgcgt ggggtcaggt ccacgactgg ggcctggtga 60

tgatggcggg atc 73

<210> 34

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gH29/30-rpsL-neo_Rev

<400> 34

ttcgtgtcgc gccagtacat gcggtccatg cccaggccat ccaaaaacca tcagaagaac 60

tcgtcaagaa ggcg 74

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gH29/30-scFv_For

<400> 35

tcgtgggggt tattcttttg gg 22

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gH29/30_scFv_Rev

<400> 36

ttcgtgtcgc gccagtacat g 21

Claims

1.一种重组单纯疱疹病毒，被构建成特异性识别并结合靶细胞的靶分子的细胞靶向结构域***并融合到糖蛋白gH中。

2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述细胞靶向结构域被***并融合到N-端位置，位于SEQ ID NO:1的gH糖蛋白的氨基酸序列中的氨基酸12至88的区域内的位置、氨基酸116至137的区域内的位置，或氨基酸209至839的区域内的位置。

3.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述细胞靶向结构域被***并融合到N-端位置，位于SEQ ID NO:1的gH糖蛋白的氨基酸序列中的氨基酸12至49的区域内的位置，或氨基酸116至137的区域内的位置。

4.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述细胞靶向结构域被***并融合到N-端位置，位于SEQ ID NO:1的gH糖蛋白的氨基酸序列中的氨基酸12之后的位置、氨基酸22之后的位置、氨基酸23之后的位置、氨基酸29之后的位置、氨基酸83之后的位置、氨基酸116之后的位置、氨基酸209之后的位置、氨基酸215之后的位置、氨基酸225之后的位置、氨基酸277之后的位置、氨基酸386之后的位置、氨基酸437之后的位置、氨基酸447之后的位置、氨基酸472之后的位置、氨基酸636之后的位置、氨基酸637之后的位置、氨基酸666之后的位置、氨基酸731之后的位置、氨基酸763之后的位置、氨基酸764之后的位置、氨基酸775之后的位置、氨基酸806之后的位置、氨基酸824之后的位置，或氨基酸838之后的位置。

5.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒被构建成在gB、gC或gD中***额外的细胞靶向结构域。

6.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，当所述细胞靶向结构域被***并融合后，连接子肽存在于所述细胞靶向结构域的N-端和C-端，并且

所述连接子肽包含至少一个选自Ser、Gly、Ala和Thr的氨基酸。

7.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶细胞是病变细胞，并且

所述靶分子是存在于所述病变细胞表面上的抗原或受体。

8.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶细胞是癌细胞，并且

所述靶分子是存在于所述癌细胞表面上的抗原或受体。

9.根据权利要求8所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述抗原或所述受体是EGFRvIII、EGFR、metastin受体、受体酪氨酸激酶、HER2(人表皮生长因子受体2)、酪氨酸激酶-18-受体(c-Kit)、HGF受体c-Met、CXCR4、CCR7、内皮素-A受体、PPAR-δ(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)、PDGFR-α(血小板衍生生长因子受体α)、CD133、CEA(癌胚抗原)、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、MSLN(间皮素)、GD2(二唾液酸神经节苷脂)、GPC3(磷脂酰肌醇聚糖3)、PS MA(***特异性膜抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、GD3(二唾液酸神经节苷脂)、HLA-DR(人白细胞抗原-DR)、MUC1(粘蛋白1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌1)、LMP1(潜伏膜蛋白1)、TRAILR2(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体)、VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)、HGFR(肝细胞生长因子受体)、CD44或CD166。

10.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶分子是HER2，并且

所述靶向结构域是HER2的scFv，被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:5的VL以VH、连接子肽和VL的顺序经由所述连接子肽连接。

11.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶分子是EpCAM，并且

所述靶向结构域是EpCAM的scFv，被构建成使得SEQ ID NO:6的VL和SEQ ID NO:7的VH以VL、连接子肽和VH的顺序经由所述连接子肽连接。

12.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶分子是CEA，并且

所述靶向结构域是CEA的scFv，被构建成使得SEQ ID NO:8的VL和SEQ ID NO:9的VH以VL、连接子肽和VH的顺序经由所述连接子肽连接。

13.根据权利要求10所述的重组单纯疱疹病毒，其中，SEQ ID NO:19的连接子肽与scFv的N-端连接，并且SEQ ID NO:20的连接子肽与scFv的C-端连接。

14.根据权利要求11所述的重组单纯疱疹病毒，其中，SEQ ID NO:22的连接子肽与scFv的N-端连接，并且SEQ ID NO:23的连接子肽与scFv的C-端连接。

15.根据权利要求12所述的重组单纯疱疹病毒，其中，SEQ ID NO:25的连接子肽与scFv的N-端连接，并且SEQ ID NO:26的连接子肽与scFv的C-端连接。

16.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒被构建成使得SEQ ID NO:16的gD(糖蛋白D)的氨基酸序列的第222位的精氨酸(R)和第223位的苯丙氨酸(F)分别被天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)取代。

17.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒是重组HSV-1病毒、重组HSV-2病毒或HSV-1和HSV-2嵌合病毒。

18.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒是衍生自HSV-1KOS株的重组HSV-1。

19.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒被构建成使得表达盒表达选自以下的任意一种：(i)细胞因子，(ii)趋化因子，(iii)免疫检查点的拮抗剂，(iv)诱导免疫细胞活化的共刺激因子，(v)TGFβ的拮抗剂，其抑制对癌细胞的免疫应答，(vi)乙酰肝素酶，其降解用于实体肿瘤微环境的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，(vii)拮抗剂，其抑制血管生成因子受体VEGFR-2(VEGF受体-2)的功能，和(viii)前药活化酶，其将前药转化为对癌细胞显示毒性的药物，被***到单纯疱疹病毒的基因组中而不抑制单纯疱疹病毒的增殖。

20.根据权利要求19所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述细胞因子是选自以下的至少一种：白介素，包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-24；干扰素，包括IFNα、IFNβ和IFNγ；肿瘤坏死因子，包括TNFα、GM-CSF、G-CSF和FLT3L，

所述趋化因子选自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20和XCL-1中的至少一种，

所述免疫检查点选自以下的至少一种：PD-1(程序性死亡受体1)、PD-L1(程序性死亡受体配体1)、PD-L2(程序性死亡受体配体2)、CD27(分化簇27)、CD28(分化簇28)、CD70(分化簇70)、CD80(分化簇80)、CD86(分化簇86)、CD137(分化簇137)、CD276(分化簇276)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)、GITRL(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体)和CTLA-4(溶细胞T淋巴细胞相关抗原-4)，

所述共刺激因子选自以下的至少一种：CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、ICOS(诱导型T细胞共刺激物)、CD3γ、CD3δ和CD3ε，以及

所述前药活化酶是选自从大肠杆菌分离的胞嘧啶脱氨酶、大鼠细胞色素P450(CYP2B1)羧酸酯酶、细菌硝基还原酶和PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)中的至少一种。

21.一种用于治疗癌症的药物组合物，包含权利要求1-20中任一项所述的重组单纯疱疹病毒作为活性成分。