CN115792022A - 一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型及其构建方法和应用，所述构建方法包括以下步骤：(1)将烟草样本提取得到一系列烟草提取物；(2)将烟草提取物萃取得到第一进样液；(3)将烟草提取物衍生化得到第二进样液；(4)将进样液进行GC‑MS检测，得到烟草提取物中滋味物质的含量；(5)对不同烟草提取物的感官品质和/或香韵风格进行评价，将烟草提取物分组；(6)采用正交偏最小二乘‑判别分析方法进行有监督鉴别分析，筛选出系列特征标志物；本发明提供的构建方法能够快速分析烟草中的挥发性成分与难挥发性成分，有效确定烟草中对感官效应存在贡献的滋味物质，能够为香烟的加香、调香提供有效地指导。

Description

一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于烟草检测领域，具体涉及一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型及其构建方法和应用，尤其涉及一种高效准确的基于感官效应的烟草中滋味物质模型及其构建方法和应用。
背景技术
烟用香精香料是卷烟生产不可缺少的原料。在改善烟草自身品质，稳定卷烟质量，满足个性化需求，提高安全性等诸多方面，香精香料都具有相当重要的作用。其中，作为天然香料主要品种之一的烟草提取物在卷烟加香中占据重要的地位。为了便于卷烟企业开展自主调香工作，有必要研究香精香料中的香味和滋味物质来提高对天然香原料的认知，同时为产品研发与升级提供可靠依据。
气相色谱-质谱联用技术是香精香料分析的重要手段，几乎所有的香味成分都能用GC-MS的某种应用形式进行分析。针对挥发性或半挥发性组分，可直接进行GC-MS分析。而对于滋味类的物质，大多都具有特定的水溶性和较高的沸点，因此多数采用高效液相色谱来实现这些物质的分离。目前，食品中呈滋味物质的检测方法大多只能同时检测一两种物质，虽具有分离好、灵敏度高等特点，但当对象基质复杂，主要呈滋味物质种类较多时，采用单一物质的测定方法无法满足需求，而采用多种检测方法将大大增加检测样品及相关试剂的消耗量且耗时较长。因此，迫切需要开发一种更高效、快捷、准确的方法，实现对烟草提取物中滋味物质的测定、筛选。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型及其构建方法和应用，尤其提供一种高效准确的基于感官效应的烟草中滋味物质模型及其构建方法和应用。本发明提供的构建方法能够快速分析烟草中的挥发性成分与难挥发性成分，有效确定烟草中对感官效应存在贡献的滋味物质，能够为香烟的加香、调香提供有效地指导。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型的构建方法，所述筛选方法包括以下步骤：
(1)将烟草样本采用不同方法提取得到一系列烟草提取物；
(2)将烟草提取物分别采用固相支持液液萃取，得到第一进样液；
(3)将烟草提取物分别衍生化，得到第二进样液；
(4)将各自烟草提取物的第一进样液和第二进样液进行GC-MS检测，结合数据库得到烟草提取物中滋味物质的含量；
(5)对不同烟草提取物的感官品质和/或香韵风格进行评价，根据评价结果确定目标感官品质和/或目标香韵风格，依据目标感官品质和/或目标香韵风格的差异将烟草提取物分组，同一组别烟草提取物中的目标感官品质和/或目标香韵风格相似，不同组别烟草提取物中的目标感官品质和/或目标香韵风格差异较大；
(6)将上述分组结果与烟草提取物中滋味物质的含量结果结合，采用正交偏最小二乘-判别分析方法(OPLS-DA)进行有监督鉴别分析，筛选出系列特征标志物，即得到所述烟草中滋味物质模型；
步骤(2)、(3)不区分先后顺序。
步骤(2)-(4)与步骤(5)不区分先后顺序。
所述烟草样本包括烟草或烟草提取物。
上述特定构建方法能够有效筛选出未知烟草样本中对于感官效应贡献突出的滋味物质，并且能够对样本中的挥发性物质和难挥发性物质同时进行分析，具有高效、准确、快捷的效果。
优选地，步骤(2)所述固相支持液液萃取的具体过程包括以下步骤：将烟草提取物与内标、乙醇水溶液混合稀释，之后进行固相支持液液萃取。
优选地，所述内标包括正十七烷，所述内标的浓度为500-1000mg/L。
优选地，所述乙醇水溶液的体积分数为40-60％。
优选地，所述固相支持液液萃取柱采用ProElut LLE+硅藻土固相萃取柱。
优选地，所述混合在涡旋下进行，所述涡旋的转速为1500-2000r/min，时间为15-20min。
其中，内标的浓度可以是500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L或1000mg/L等，乙醇水溶液的体积分数可以是40％、45％、50％、55％或60％等，涡旋的转速可以是1500r/min、1600r/min、1700r/min、1800r/min、1900r/min或2000r/min等，时间可以是15min、16min、17min、18min、19min或20min等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤(3)所述衍生化的具体步骤为：将烟草提取物与内标溶液、甲醇水溶液混合，之后干燥，与甲氧氨盐酸盐溶液混合，接着与衍生化试剂混合温育，得到第二进样液。
优选地，所述内标包括1,4-丁二醇，所述内标溶液的浓度为800-1200mg/L；
优选地，所述甲醇水溶液的体积分数为60-80％。
优选地，所述甲氧氨盐酸盐溶液中甲氧氨盐酸盐的浓度为20-30mg/L。
优选地，所述衍生化试剂包括N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)。
优选地，所述温育的时间为30-90min，温育温度为35-37℃。
其中，内标溶液的浓度可以是800mg/L、900mg/L、1000mg/L、1100mg/L或1200mg/L等，甲醇水溶液的体积分数可以是60％、65％、70％、75％或80％等，甲氧氨盐酸盐溶液的浓度可以是20mg/L、21mg/L、22mg/L、23mg/L、24mg/L、25mg/L、26mg/L、27mg/L、28mg/L、29mg/L或30mg/L等，温育的时间可以是30min、40min、50min、60min、70min、80min或90min等，温育温度可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤(5)所述感官品质包括香气质、香气量、烟气浓度、杂气、劲头、透发性、细腻柔和、残留、刺激或圆润中任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(5)所述香韵风格包括烤烟烟香、晾晒烟香、清香、甜香、膏香、焦香、木香、药草香、豆香、青滋香、辛香或其余香韵中任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(6)的具体步骤为：以感官品质和香韵风格评价结果为依据结合烟草提取物中滋味物质的含量结果进行监督性正交偏最小二乘-判别分析，并开展变量权重重要性排序VIP值排序，选用VIP>1.0的变量为重要特征标志物，并对潜在特征标志物进行t检验，以统计值P<0.01为标准，验证这些变量在组间是否存在统计学差异，并筛选出系列特征标志物。
第二方面，本发明提供了如上所述的构建方法构建得到的基于感官效应的烟草中滋味物质模型。
第三方面，本发明还提供了一种基于感官效应的烟草中滋味物质的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：将待测烟草样品以如上所述的构建方法构建得到的基于感官效应的烟草中滋味物质模型，之后以系列特征标志物为自变量，以目标感官品质和/或目标香韵风格为因变量，使用偏最小二乘回归算法进行分析，筛选得到所述对烟草感官属性具有贡献的滋味物质。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型的构建方法，通过采用特定步骤能够有效筛选出未知烟草样本中对于感官效应贡献突出的滋味物质，并且能够对样本中的挥发性物质和难挥发性物质同时进行分析，具有高效、准确、快捷的效果。
附图说明
图1是#1-#5烟草提取物的感官品质雷达图；
图2是#6-#10烟草提取物的感官品质雷达图
图3是#1-#5烟草提取物香韵风格雷达图；
图4是#6-#10烟草提取物香韵风格雷达图
图5是10种烟草提取物的OPLS-DA得分图；
图6是OPLS-DA模型置换验证图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供了一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型的方法及其应用，具体步骤如下：
(1)样品收集及感官评价
选取0.2g卷烟加香用的烟草提取物(来自江苏中烟香精香料实验室)作为研究对象，加入10g水-乙醇混合溶剂(其中乙醇体积分数分别为40％、50％、60％、70％、80％)进行渗透汽化膜分离处理，截留液分别命名为#1、#3、#5、#7和#9，透过液分别命名为#2、#4、#6、#8和#10。
以空白卷烟为对象，采用定量描述法对样品进行感官评价。评价小组由7名成员组成。感官评价前，评价人员根据ISO 8589(2007)标准培训，尽可能多地描述出样品感官属性，综合整理评定结果，经讨论、筛选后确定感官品质(香气质、香气量、烟气浓度、杂气、劲头、透发性、细腻柔和、残留、刺激和圆润等10个指标)和香韵特征(烤烟烟香、晾晒烟香、清香、甜香、膏香、焦香、木香、药草香、豆香、青滋香、辛香和其他等12个指标)为样品感官评价指标。指标强度采用5分制打分(感官品质范围是-10到10，香韵风格范围是0～10，正值代表正向作用，负值代表负向作用)，记录各评价人员的评价结果。每个样品重复评价3次。感官评价结果如图1-4所示。由图1-2共10种烟草提取物感官品质雷达图和图3-4共10种烟草提取物香韵风格雷达图可以看出，4#和8#两个样品整体上较为突出，与其它烟草提取物的感官差异较大，尤其在烤烟烟香和焦香(确定二者为目标香韵风格)上较为明显，因此将4#和8#分为2组，其余为1组。
(2)挥发物组样品前处理
称取0.2g烟草提取物样品于5mL离心管中，再准确移入50μL浓度为1 000μg/mL的正十七碳烷的乙醇溶液；加入含50％水的乙醇溶剂，使用涡旋混匀器于1500r/min条件下分散20min，得样品萃取液。
对ProElut LLE+硅藻土固相萃取柱进行活化，即用10mL甲醇去杂质，排干液体；然后将样品萃取液全部转入已活化过的固相萃取柱，同时用浓缩瓶接收洗脱液，待上样溶液全部流入小柱上筛板后，静置平衡5min；随即用30mL二氯甲烷分3次对固相萃取柱进行淋洗，并收集所有淋洗液；最后在50℃、常压条件下，将淋洗液浓缩至1mL左右，再将其转移至2mL色谱瓶中进行GC-MS分析。
(3)难挥发物组样品前处理
称取0.1g烟草提取物样品，置于10mL离心管中。分别准确加入0.3mL浓度为1020μg/mL的1,4丁二醇的甲醇内标溶液和5mL50％甲醇水溶液，涡旋振荡10min。稀释液过0.45μm有机相滤膜，取100μL稀释液用氮吹吹干。然后加入80μL 20mg/mL的甲氧氨盐酸盐的吡啶溶液，涡旋1min后在37℃下温育90min，再加入100μL BSTFA，涡旋30s后在37℃下温育30min。最后将衍生后的溶液转入微量进样装置进行GC-MS分析。
(4)样品溶液质谱检测
使用气相色谱-质谱联用仪，对不同样品进样液进行质谱分析，采集样品指纹图谱，色谱柱选择为Agilent HP-5ms(60m×0.25mm×0.25μm)色谱。其仪器条件分别为：
挥发组分：气相色谱的测试条件：载气：氦气；进样口温度：250℃；恒流模式：1.0mL/min；分流模式：分流，分流比为20:1；程序升温：初始温度5℃，保持2min，以3℃/min的速率升温至280℃，保持10min。
质谱条件：传输线温度：250℃；电离方式：电子轰击源(EI)；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；溶剂延迟时间：3min；全扫描监测模式，扫描范围为30amu～400amu；
难挥发组分：气相色谱的测试条件：载气：氦气；进样口温度：290℃；恒流模式：1.0mL/min；分流模式：分流，分流比为20:1；程序升温：初始温度70℃，保持2min，以5℃/min的速率升温至310℃，保持10min。
质谱条件：传输线温度：310℃；电离方式：电子轰击源(EI)；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；溶剂延迟时间：11min；全扫描监测模式，扫描范围为50amu～500amu；
(5)样品全组分数据分析
对样品图谱进行解卷积识别，结合数据库和保留指数，对样品挥发物进行非靶向分析，获取样品挥发物组和难挥发物组成分信息；
采用组分在质谱库NIST17和FLAVOR2中匹配度≥85％的方法进行定性分析，同时计算保留指数，并与文献资料相关化合物保留指数进行比对(通过webbook.nist.gov、www.flavornet.org以及标准谱库等进行查找)，将绝对值相差20以内的确定为同一化合物；
采用内标法定量，通过内标物的峰面积和样品溶液中各组分的峰面积比值，按公式计算各个组分的相对质量浓度：
Figure BDA0003987426920000081
式中：Ci为待测组分的质量浓度，μg/mL；Ai和As为待测组分i和内标化合物的色谱峰面积；V为待测样品溶液的体积，mL；Ws为加入内标化合物的质量，μg。本实验中假定各待测组分i的相对校正因子均为1。
利用Agilent MassHunter Unknowns Analysis软件解卷积处理质谱原始数据，导出转换为cef格式文件，再导入到Agilent MassHunter Mass Profiler(MPP)软件中进行峰识别、峰对齐、过滤(在所有样品中出现50％以上)、归一化等操作有效提取样品离子信息，获取高质量的样品挥发物组和难挥发组的数据矩阵。
(6)特征组分物质筛选
采用SIMCA 14.1软件将分组结果与烟草提取物中滋味物质的含量结果结合，进行正交偏最小二乘判别分析，来寻找1组和2组之间的特征差异组分，结果如图5所示(图中1#和2#代表两次重复)。R2X、R2Y、Q2用于评估OPLS-DA模型的有效性，R2X、R2Y、Q2值越接近1，说明所构建的模型越好。由图5计算可知，R2X、R2Y、Q2值分别为0.795，0.85，0.395，1组与2组样品在95％置信椭圆内分别处于第1主成分正负轴两侧，说明1组与2组样品的挥发性、半挥发性成分得到了有效区分，在种类和相对含量上存在差异。进一步将建立OPLA-DA模型时定义分类Y的变量顺序随机排列200次以验证该OPLS-DA模型的可靠性，结果如图6所示。由图6可知，R2＝0.552，Q2＝-0.906，Q2于Y轴的截距是负值，说明此模型没有过拟合现象，表明该OPLS-DA模型具有良好的预测能力，可用于后续的特征标志成分寻找。
变量重要性投影值(VIP值)越大，说明其在判别过程中贡献越大，在样品之间的差异越显著(通常认为VIP＞1的变量是模型的重要特征标志物)。其中8个VIP值大于1的挥发性、难挥发性化合物在判别中具有重要作用。方差分析结果表明，丝氨醇、乳酸乙酯、γ-丁内酯、肉桂酸乙酯、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、烟碱为系列特征标志物。
(7)具有贡献的滋味物质研判：以上8个系列特征标志物为自变量(X)，感官属性(感官品质和香韵风格)为因变量(Y)，运用PLSR(多因变量)对样品的滋味与感官效应进行相关性分析。分析结果表明，葡萄糖、蔗糖与焦香具有显著正相关，烟碱与烤烟烟香呈显著正相关，其它组分与感官特征不具有显著相关性。
上述方法对未知烟草样本有效构建了一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型，对挥发性、难挥发性化合物均进行了有效判别，最终筛选得到葡萄糖、蔗糖和烟碱三种对于焦香和烤烟烟香具有贡献，能够凸显相应的感官特征。基于此结果可以指导后续该烟草产品中焦香和烤烟烟香的调香、加香物质选择。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的基于感官效应的烟草中滋味物质模型的筛选方法及其应用及其构建方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种基于感官效应的烟草中滋味物质模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)将烟草样本采用不同方法提取得到一系列烟草提取物；
(2)将烟草提取物分别采用固相支持液液萃取，得到第一进样液；
(3)将烟草提取物分别衍生化，得到第二进样液；
(4)将各自烟草提取物的第一进样液和第二进样液进行GC-MS检测，结合数据库得到烟草提取物中滋味物质的含量；
(5)对不同烟草提取物的感官品质和/或香韵风格进行评价，根据评价结果确定目标感官品质和/或目标香韵风格，依据目标感官品质和/或目标香韵风格的差异将烟草提取物分组，同一组别烟草提取物中的目标感官品质和/或目标香韵风格相似，不同组别烟草提取物中的目标感官品质和/或目标香韵风格差异较大；
(6)将上述分组结果与烟草提取物中滋味物质的含量结果结合，采用正交偏最小二乘-判别分析方法进行有监督鉴别分析，筛选出系列特征标志物，即得到所述烟草中滋味物质模型；
步骤(2)、(3)不区分先后顺序；
步骤(2)-(4)与步骤(5)不区分先后顺序。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述固相支持液液萃取的具体过程包括以下步骤：将烟草提取物与内标、乙醇水溶液混合稀释，之后进行固相支持液液萃取。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述内标包括正十七烷，所述内标的浓度为500-1000mg/L；
优选地，所述乙醇水溶液的体积分数为40-60％；
优选地，所述固相支持液液萃取柱采用ProElut LLE+硅藻土固相萃取柱。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述混合在涡旋下进行，所述涡旋的转速为1500-2000r/min，时间为15-20min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述衍生化的具体步骤为：将烟草提取物与内标溶液、甲醇水溶液混合，之后干燥，与甲氧氨盐酸盐溶液混合，接着与衍生化试剂混合温育，得到第二进样液。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述内标包括1,4-丁二醇，所述内标溶液的浓度为800-1200mg/L；
优选地，所述甲醇水溶液的体积分数为60-80％；
优选地，所述甲氧氨盐酸盐的吡啶溶液中甲氧氨盐酸盐的浓度为20-30mg/L；
优选地，所述衍生化试剂包括N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺；
优选地，所述温育的时间为30-90min，温育温度为35-37℃。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述感官品质包括香气质、香气量、烟气浓度、杂气、劲头、透发性、细腻柔和、残留、刺激或圆润中任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(5)所述香韵风格包括烤烟烟香、晾晒烟香、清香、甜香、膏香、焦香、木香、药草香、豆香、青滋香、辛香或其余香韵中任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(6)的具体步骤为：以感官品质和香韵风格评价结果为依据结合烟草提取物中滋味物质的含量结果进行监督性正交偏最小二乘-判别分析，并开展变量权重重要性排序VIP值排序，选用VIP>1.0的变量为重要特征标志物，并对潜在特征标志物进行t检验，以统计值P<0.01为标准，验证这些变量在组间是否存在统计学差异，并筛选出系列特征标志物。
9.一种根据权利要求1-8中任一项所述的构建方法构建得到的基于感官效应的烟草中滋味物质模型。
10.一种基于感官效应的烟草中滋味物质的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：将待测烟草样品以权利要求1-8中任一项所述的构建方法构建得到的基于感官效应的烟草中滋味物质模型，之后以系列特征标志物为自变量，以目标感官品质和/或目标香韵风格为因变量，使用偏最小二乘回归算法进行分析，筛选得到所述对烟草感官属性具有贡献的滋味物质。
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