CN115772497A - 一种靶向g12v突变kras的树突状细胞疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向G12V突变Kras蛋白的树突状细胞疫苗，同时提供了靶向G12V突变Kras蛋白的树突状细胞疫苗。本发明将靶向G12V突变KRAS蛋白受体的相关抗原在树突状细胞内合成，然后递呈给T淋巴细胞，避免了小分子化疗负作用大，以及CAR‑T治疗成本高和细胞因子风暴等问题。

Description

一种靶向G12V突变KRAS的树突状细胞疫苗

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别涉及一种新颖的表达G12V突变Kras蛋白的树突细胞以及其用途。

背景技术

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是人体内功能最强的专职抗原提呈细胞，它能激活CD8+细胞毒性T细胞(CTL)和CD4+辅助性T细胞(Th)，在抗肿瘤、抗病毒等免疫应答过程中发挥重要作用。大多数研究表明体内肿瘤抑制了DC的成熟而非直接抑制DC的功能。研究发现，恶性肿瘤组织内树突状细胞的数量、功能与肿瘤组织原发灶、转移灶中瘤细胞向周围组织浸润的程度以及患者的临床分期呈负相关，而大部分实体肿瘤内浸润树突状细胞的数量越多则患者的预后越好(J Surg Oncol,2007,95(2):123-128)。肿瘤患者体内的树突状细胞存在分化成熟障碍，导致其在表达细胞因子、表面抗原、激活T细胞增殖并诱导CTL生成等方面均存在不同程度的功能缺陷，包括CD8+T细胞增加、CD4+T细胞降低、CD4+/CD8+比例降低以及自然杀伤细胞数量下降等。所以体外诱导功能性DC用于免疫治疗有着重要的临床应用价值。

DC广泛分布与人体多个部位，如血液以及肝脾、***、肺、肾、胃肠道等组织间质，约占外周血单个核细胞总数0.5-1％。DC亚群分类复杂，骨髓源DC(mDC)和淋巴源DC(pDC)是外周血DC的两种主要类型。DC可以经由单核细胞分化生成，分离PBMC中的单核细胞体外培养，GM-CSF和IL-4诱导生成未成熟DC(Curr Protoc Immunol 2005；Chapter 22:Unit22F 4)。未成熟DC可以通过不同的成熟诱导成分分化成熟，DC的成熟状态是决定DC疫苗有效性的一个关键因素。未成熟DC致敏T细胞能力有限，并且还可能诱导T细胞耐受。另外成熟DC的迁移能力更强，能更有效的迁移至次级淋巴组织的T细胞区，进而诱发免疫反应。

ras癌基因参与细胞生长和分化的调控，参与多种肿瘤的形成与发展，Kras是ras基因家族的一员，与人类肿瘤相关另两个ras基因是Hras和Nras。Kras蛋白由188(b型)或189(a型)个氨基酸组成。Kras未突变时，就像分子开关，可以正常控制调控细胞生长的路径。但Kras发生突变后，导致细胞增殖异常，胞内细胞信号传导絮乱，从而产生癌变。Kras蛋白的突变主要发生在氨基酸序列的12位、13位、62位或146位(Swiss Med Wkly,2010,140:w13112)，12位或13位的突变比较常见，其中12位的突变比例最高，约占85％，包括G12D、G12V、G12C、G12A、G12S和G12R等，而G12D的突变在Kras突变中占的比例约占35％。Kras蛋白突变在结直肠癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、卵巢癌和子宫内膜癌中较为常见。其中结直肠癌病人里Kras蛋白突变的人数占30％-60％。

针对Kras突变的治疗，现有的研究包括通过小分子的抑制剂(The New Englandjournal of medicine,2020,383:1207 -1217)，通过抗体药物中的anti-EGFR单克隆抗体抑制Kras的激活(Cell Commun Signal,2020,18:115)，TCR-T细胞治疗(Yi Chuan,2020,42:599-612)等。然而通过负载Kras突变抗原的树突状细胞疫苗，到达治疗目的的方法仍未有报道。

发明内容

针对上述治疗方法的缺陷或者为KRAS基因突变癌症患者提供多一种的选择，本发明提供了靶向G12V突变Kras蛋白的树突状细胞疫苗。本发明将靶向G12V突变KRAS蛋白受体的相关抗原在树突状细胞内合成，然后递呈给T淋巴细胞。如此可以避免小分子化疗负作用大，以及CAR-T治疗成本高和细胞因子风暴等问题。

因此，本发明的一方面提供了能够表达G12V突变Kras蛋白的树突细胞。

本发明的另一方面提供一种靶向G12V突变Kras蛋白阳性肿瘤的预防性和/或治疗性疫苗。示例性地，本发明所述的预防性和/或治疗性疫苗包含该能够表达G12V突变Kras蛋白的树突细胞。优选地，利用慢病毒感染树突状细胞使其表达G12V突变Kras蛋白，进而使得G12V突变KRAS蛋白抗原表位负载到树突状细胞中。

本发明第三方面提供了一种治疗或者预防表达G12V突变Kras蛋白的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗或预防有效量的能表达G12V突变Kras蛋白的树突细胞或包含其的疫苗。

本发明第四方面提供了能表达G12V突变Kras蛋白的树突细胞在制备用于治疗或者预防表达G12V突变Kras蛋白的癌症的疫苗中的用途。

在一些癌种中，G12V突变KRAS蛋白受体在癌性细胞表面上过表达。因此，本发明中的癌症例如可以为结直肠癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、卵巢癌和子宫内膜癌等。

本发明还提供了一种刺激和活化树突细胞的方法，其包括将能表达G12V突变Kras蛋白的载体和待活化的树突细胞接触的步骤，进而使得所述树突细胞负载肿瘤特异性G12V突变Kras蛋白。

示例性地，本发明所提供的树突细胞是分离的活化的树突细胞，所述细胞表面呈递G12V突变KRAS蛋白受体，G12V突变KRAS蛋白-HLA复合物或多肽-MHC复合物。示例性地，所述分离的树突细胞是通过将本发明中表达G12V突变Kras蛋白的载体(例如病毒载体，例如慢病毒)和待活化的树突细胞接触并培养而得。

本发明还提供了一种经本发明的树突细胞活化的T细胞。

本发明还提供了能表达G12V突变Kras蛋白的载体(例如病毒载体，例如慢病毒)的用途，用于活化树突细胞。

本发明还提供了本发明能表达G12V突变Kras蛋白的载体、活化的树突细胞或活化的T细胞的用途，例如用于制备预防或治疗癌症的药物。

本发明还提供了一种药物组合物或药物，所述组合物或药物含有药学上可接受的载体以及本发明所述能表达G12V突变Kras蛋白的载体、分离的活化细胞(例如树突细胞或T细胞)。

示例性地，所述药物或者所述药物组合物为疫苗。

本发明还提供了一种预防或治疗疾病(例如癌症)的方法，包括给需要的对象施用有效量的本发明所述能表达G12V突变Kras蛋白的载体、分离的活化细胞(例如树突细胞或T细胞)。

本发明还提供了一种特异性针对表达G12V突变Kras蛋白的癌症的细胞毒性T细胞(CTL)，其包括将本发明的负载了G12V突变KRAS蛋白的树突细胞与T细胞共培养，进而得到特异性靶向表达G12V突变Kras蛋白的癌症的细胞毒性T细胞(CTL)。

本发明还提供了细胞组合物，其包括本发明活化的树突细胞和T细胞或CTL细胞。

本发明还提供了另外一种细胞组合物，其包括本发明活化的树突细胞和CIK细胞。

由于本发明活化的树突细胞能够呈递G12V突变KRAS蛋白分子靶标，因此，其能够作为针对表达G12V突变Kras蛋白的癌症的治疗性或者预防性疫苗。因此，本发明还提供了一种针对表达G12V突变Kras蛋白的癌症的治疗性或者预防性疫苗，其包括本发明所述的肽分离的细胞(例如活化的树突细胞)，以及任选的佐剂。

进一步地，本发明还提供了一种预防或者治疗表达G12V突变Kras蛋白的癌症的方法，其包括将本发明的疫苗施用至受试者体内。

进一步地，本发明还提供了一种刺激和活化树突细胞的方法，其包括将G12V突变KRAS蛋白在待活化的树突细胞中表达的步骤，进而使得所述树突细胞负载表达的G12V突变KRAS蛋白。

本发明还提供了一种活化的树突细胞，其是通过将本发明中表达G12V突变Kras蛋白的载体(例如病毒载体，例如慢病毒)和待活化的树突细胞接触并培养而得。

本发明还提供了一种特异性针对表达G12V突变Kras蛋白的癌症的细胞毒性T细胞(CTL)，其包括将本发明的负载了G12V突变KRAS蛋白分子靶标的树突细胞与淋巴细胞共培养，进而得到特异性靶向G12V突变KRAS蛋白的细胞毒性T细胞。

本发明还提供了细胞组合物，其包括本发明活化的树突细胞和免疫细胞。

本发明还提供了另外一种细胞组合物，其包括本发明活化的树突细胞和CIK细胞。

同样的，由于本发明活化的树突细胞能够呈递表达G12V突变Kras蛋白的癌症特异性分子靶标，因此，其能够作为针对表达G12V突变Kras蛋白的癌症的治疗性或者预防性疫苗。因此，本发明还提供了一种针对表达G12V突变Kras蛋白的癌症的治疗性或者预防性疫苗，其包括本发明活化的树突细胞。

进一步地，本发明还提供了一种预防或者治疗表达G12V突变Kras蛋白的癌症的方法，其包括将活化的本发明的树突细胞或本发明的细胞组合物施用至受试者体内。

在本发明的具体实施方式中，本发明活化的DC细胞经检测，其负载阳性率高。进一步地，且被活化的DC细胞上表达CD80、CD86、CD83、HLA-DR，并呈递T淋巴细胞，成为特异性的识别表达G12V突变Kras蛋白的癌症细胞的CTL细胞。离体试验数据表明，通过本发明的树突细胞刺激并熟化的CTL能显著抑制表达G12V突变Kras蛋白的肿瘤细胞(相对不表达G12V突变Kras蛋白的肿瘤细胞)。

进一步地，本发明还提供了一种树突细胞的制备方法，其包括用表达G12V突变Kras蛋白的慢病毒感染树突细胞，进而使得树突细胞能够表达G12V突变Kras蛋白。

进一步地，本发明中制备树突细胞的方法还包括对所制备的树突细胞进行熟化的步骤。具体而言，将未熟化的树突细胞在含有IFN-γ和LPS进行诱导培养以促进DC分化成熟。示例性地，所述IFN-γ和LPS的含量分别为10-100ng/mL和10-100EU/mL，优选地，所述IFN-γ和LPS的含量分别为50ng/mL和50EU/mL。

进一步地，在熟化培养过程中，引入低温静置，例如在-4℃至10℃(例如-4℃至4℃，或-4℃至-2℃)下静置然后进行常温培养，例如静置0.5-4.0小时，然后逐渐升温至37℃，继续常温培养。

本发明还提供了一种特异性针对G12V突变KRAS蛋白的CTL，其通过如下方法制备：

将本发明熟化的CD细胞和T淋巴细胞共培养，以制备特异性针对G12V突变KRAS蛋白的CTL。示例性地，所述T细胞是CD3+T细胞。

本发明所述治疗性或者预防性疫苗可以通过滴注或注射的方式施用，例如瘤内或者静脉注射或肌肉注射进而通过作用于免疫***，增强机体的免疫应答，最终延长患者生存期，提高生存质量。

治疗性疫苗：在感染病原微生物或患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的生物制品。

CTL(Cytotoxic T Lymphocyte):细胞毒性T细胞

DC(Dendritic Cell)：树突状细胞

CIK(Cytokine-Induced Killer)：细胞因子诱导的杀伤细胞

PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)：外周血单个核细胞

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。在此不再一一累述。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是流式细胞仪检测DC表面分子标志物CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达量的结果。

图2是流式分析扩增培养的CD3+CTL细胞的结果图。

图3是CTL针对G12V突变KRAS蛋白表达水平不同的肿瘤细胞的杀伤效果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或紊乱的药物量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状。在药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以是抑制细胞的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，可通过例如评估疾病进展时间(TTP)和/或测定响应速率(RR)来测量功效。

术语“预防有效量”指在哺乳动物中有效预防疾病或紊乱的药物量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少受试者罹患癌症的风险，使其终生不罹患癌症或者推迟、延缓癌症的发生。

术语“癌症”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于表达G12V突变Kras蛋白的鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜癌、肝癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌、以及头和颈癌等等。

在细胞免疫过程中，抗原通常与MHC复合物一起递呈到细胞表面。因此，本发明还提供了一种分离的细胞，所述细胞能够递呈G12V突变KRAS蛋白或G12V突变KRAS蛋白-MHC复合物到其表面。示例性地，所述细胞为免疫细胞，例如APC，例如DC(树突细胞)，或B细胞，或T2细胞。优选地，呈递G12V突变KRAS蛋白或G12V突变KRAS蛋白-MHC复合物的细胞是分离的。递呈本发明所述多肽-MHC复合物的细胞可用于分离T细胞和T细胞受体，所述T细胞由所述多肽或复合物激活并进一步被分选出来，体外增殖后用于回输受试者体内。

本发明还提供了所述的细胞的用途，例如用于制备预防或治疗癌症的药物。

本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及所述的细胞。

对于本发明所述药物组合物，其剂型可以是适用于任何适当的给药途径，如注射(包括皮下，肌肉，腹腔或静脉注射)、吸入或口服、或经鼻、或经***等途径。所述组合物可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如在无菌条件下，通过将活性成分与载体或赋形剂混合。

本发明的细胞可以以疫苗组合物的形式提供。所述疫苗组合物可以用于治疗或预防癌症，其中所述疫苗组合物中可以进一步含有佐剂。

在本发明中，所述细胞优选为抗原提呈细胞(APC)，例如选自单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)，优选为DC细胞。

主要组织相容性复合物(MHC)是编码人类白细胞抗原(HLA)基因的基因复合物。HLA基因被表达为在人类细胞表面上展示给循环T细胞的蛋白质异二聚体。HLA基因是高度多态性的，允许其微调适应性免疫***。

MHC分子有三类：MHC I、MHC II和MHC III。MHC I类分子由一条α重链和β-2-微球蛋白组成；MHC II类分子由一条α和一条β链组成。MHC分子结构中包含一个结合槽，用于与抗原进行非共价相互作用；MHCⅢ主要编码补体成分，例如肿瘤坏死因子(TNF)和热休克蛋白70(HSP70)等。

大部分有核细胞上表达MHC-I类分子。他们主要呈递内源性的蛋白、缺陷核糖体产物(DRIP)和较大肽裂解生成的肽。然而，外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。MHCII类分子主要发现于抗原呈递细胞(APC)上，并且主要呈递，例如，在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。

G12V突变KRAS蛋白和MHC I类的复合体由负载相应T细胞受体(TCR)的CD8阳性T细胞进行识别，而G12V突变KRAS蛋白和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。

CD4⁺T辅助细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重要作用。在肿瘤部位，T辅助细胞维持着对细胞毒性T细胞(CTL)有益的细胞因子环境并吸引效应细胞，如CTL、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和粒细胞。

在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫***细胞，尤其是抗原提呈细胞(APC)。在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHC II类分子的表达。

术语

术语“分离”表示一物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然***中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。

CD3+T淋巴细胞

CD3是T淋巴细胞表面的一类抗原，CD3+是成熟T淋巴细胞表面标志。CD3具有五种肽链，即γ链、δ链、ε链、ζ链和η链，这五种链均为跨膜蛋白。CD3分子的跨膜区通过盐桥与TCR两条肽链的跨膜区连接，形成TCR-CD3复合体，最常见的TCR/CD3复合物的组成形式是TCRα-β/CD3γδεεζζ，共同参与T细胞对抗原的识别。TCR识别抗原所产生的活化信号由CD3转导至T细胞内。

CD4+细胞是人体免疫***中的一种重要免疫细胞，主要由辅助性T细胞(Th)表达，是Th细胞TCR识别抗原的受体，与MHCⅡ类分子的非多肽区结合，参与Th细胞TCR识别抗原过程，CD4+是调控免疫反应最重要的枢纽细胞。

CD8分子是一种白细胞分化抗原，为部分T细胞表面所具有的一种糖蛋白，用以辅助T细胞受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导，又称为TCR的共受体。表达CD8的T细胞(CD8+T细胞)通常在活化后分化为细胞毒性T细胞(CTL)，能够特异性地杀伤靶细胞。细胞毒性T细胞，是免疫反应中的直接杀伤性细胞。

CD4+/CD8+比值，可作为判断人体免疫功能紊乱的临床诊断敏感指标。

DC表面分子标志物

CD80是T淋巴细胞活化时必需的膜抗原。T淋巴细胞活化时，T淋巴细胞的TCR/CD3和APC的MHC结合。CD80在活化B淋巴细胞、活化T淋巴细胞、人类T淋巴细胞白血病病毒-1(human T cell leukemia virus-1,HTLV-1)阳性T淋巴细胞、受IFN-γ刺激的单核细胞、树突状细胞上均有表达，而非活化B淋巴细胞、红细胞、粒细胞及核细胞上不表达。

CD83属于免疫球蛋白超家族，是树突状细胞的特异性标志，参与抗原呈递和淋巴细胞活化。

CD86属于免疫球蛋白超家族，别名为B7.2，表达于树突状细胞、单核细胞、记忆T淋巴细胞等细胞表面。

HLA-DR是MHC-II类分子，含有2个分子量分别为36kD和27kD的亚基(α亚基和β亚基)。HLA-DR表达于B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化T淋巴细胞、活化NK淋巴细胞和人祖细胞上。它也表达于胸腺上皮细胞、脾和***的B淋巴细胞依赖区及B淋巴细胞淋巴瘤。HLA-DR与CD1a共同表达于表皮朗格汉斯细胞。

通过流式细胞术检测CD80/CD83/CD86/HLA-DR可以体现DC细胞的活化状态，可用于检测树突状细胞的抗原呈递功能，在CIK细胞治疗前后检测周血中含量境界免疫状态机治疗效果，还可用于评估CIK治疗方案中细胞培养状态。

白细胞介素

IL-7是由骨髓基质细胞分泌的糖蛋白，分子量为25KD，其基因位于第8号染色体，由152个氨基酸组成。IL-7主要由骨髓基质细胞产生，它的主要生物学功能是促进T、B细胞的前体细胞的增殖和分化。

IL-15与IL-2具有类似的生物学功能，IL-15与IL-2共用γc受体亚单位，这两种细胞因子均能诱导T细胞、B细胞和自然杀伤细胞(NK cell)的分化以及促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖。目前，IL-15常与IL-2联用进行T细胞或NK细胞体外扩增培养。

IL-15在免疫治疗中的另一个特性是维持记忆性T细胞，从而对长期抗肿瘤活性中起到重要作用。IL-15作为一种多效细胞因子，在免疫、肿瘤发生、过敏性反应及自身免疫疾病中均发挥着重要作用。

树突状细胞疫苗

本发明采用上述技术手段，将G12V突变KRAS蛋白相关抗原负载到树突状细胞中，制备得到针对G12V突变KRAS蛋白抗原表位的树突状细胞。对所获得的疫苗进行表面分子CD80，CD83，CD86和HLA-DR的表达水平检测和体外肿瘤细胞杀伤效果检测。

本发明设计基因修饰的慢病毒致敏DC(活化DC)，可使肿瘤抗原得到有效的识别、加工、处理，并将抗原提呈至T细胞激发更强的抗原特异性的T细胞免疫反应。

本发明制备的树突状细胞疫苗是一种有效、无副作用、靶向性强的一类疫苗，该疫苗应用范围较广，可以用于G12V突变KRAS蛋白阳性的肿瘤疾病治疗(但不局限于)包括结直肠癌、胰腺癌、胃癌等。也可用于肿瘤辅助性治疗，联合化疗及其他肿瘤治疗手段对肿瘤疾病进行相关治疗。

细胞毒性T淋巴细胞

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)又称杀伤性T淋巴细胞，是白细胞的亚部，为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。因此它是机体抗肿瘤机制的重要环节，也是肿瘤免疫过继疗法主要效应细胞之一。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.负载G12V突变KRAS蛋白相关抗原的慢病毒的制备

一种经修饰的树突状细胞，慢病毒载体负载G12V突变KRAS蛋白相关抗原感染树突状细胞，使目的抗原序列整合至树突状细胞基因组中。

1.G12V突变KRAS蛋白相关抗原慢病毒表达载体构建

将G12V突变KRAS蛋白的氨基酸残基对应的DNA序列构建到慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen1-Puro中，其中使用限制性内切酶的位点EcoR I和Not I。

2.慢病毒的包装和提取

2.1 293FT细胞经Trypsin消化收集，10cm培养皿以5×10⁶细胞量布板，每10cm培养皿加入细胞重悬后的9mL培养基。

2.2准备两个5mL离心管，分为a管和b管，a管和b管分别加入1.5mL无血清Opti-MEM培养基，a管中加入8μg混合包装辅助质粒和6μg包装目的质粒，轻柔混匀；b管中加入36μL的Lipofectamine 2000试剂，轻柔混匀。

2.3混匀好的b管溶液轻柔加入a管中，轻柔混匀，室温孵育10min使形成DNALipofectamine 2000复合物。

2.4将孵育好的DNA-Lipofectamine 2000复合物逐滴回旋加入10cm培养皿，轻柔回旋混匀。37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。

2.5培养过夜后，移去旧培养基，细胞比较容易脱落，沿壁小心加入12mL的DMEM+2％FBS病毒制备培养基，37℃、10％CO₂培养箱培养过夜。

2.6转染后40h收集细胞培养上清，1500rpm离心5min，去除细胞碎片。上清经0.45μm PES滤器过滤。10cm培养皿沿壁小心添加12mL新鲜的DMEM+2％FBS制备培养基，37℃、10％CO₂培养箱培养过夜。

2.7转染后62h收集细胞培养上清，2000rpm离心5min，去除细胞碎片。上清经0.45μm PES滤器过滤。

3.病毒滴度检测

3.1收集对数生长期HT1080细胞铺布96孔板，6×10³/孔细胞量布板，每孔100μLDMEM+10％FBS完全培养基。

3.2第二天用DMEM无血清培养基对荧光表达病毒液进行10倍梯度稀释，每个梯度重复3次。具体操作为：准备9个无菌离心管，制备8个梯度使用梯度，第一个离心管加入80μL的DMEM，取待测样本10μL，混匀。其后每个梯度离心管加入360μL的DMEM，依次取上一稀释梯度40μL样本加入，混匀。每个梯度依次以加入病毒原液量标记为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。

3.3依次吸出各梯度孔90μL培养基，加入相应梯度稀释好的各梯度病毒液90μL。37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。

3.4 24h后加入DMEM+10％FBS完全培养基100μL。

3.5感染72h后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释梯度倍数增加而较少，梯度间细胞数同稀释倍数差一致。计数可见荧光的最大稀释倍数的上一稀释梯度的荧光细胞数，以此计算荧光表达病毒滴度。并以此滴度为参照检测目的序列病毒滴度。

3.6收集对数生长期HT1080细胞铺布6孔板，布板细胞数量为2×10⁵/孔，每孔2mLDMEM+10％FBS完全培养基。

3.7第二天用目的病毒液和荧光表达病毒液感染，荧光表达病毒液使用5μL和1μL两个梯度，目的病毒液使用1μL，分别使用1mL的无血清DMEM培养基稀释，混匀。从各细胞孔吸出1mL培养基，将稀释好的病毒液分别加入相应细胞孔，轻轻晃动混匀，37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。

3.8感染48h后，胰酶消化收集各细胞孔细胞，冷的PBS漂洗，收集细胞沉淀。

3.9收集细胞沉淀按照动物细胞基因组DNA抽提试剂盒步骤提取基因组DNA。

3.10使用5μL荧光表达病毒液感染细胞基因组DNA为标准品，按5倍梯度稀释6个梯度，并以未感染细胞基因组DNA补足稀释后模板量的变化。QPCR检测慢病毒LTR序列在基因组DNA上的整合拷贝数变化，计算目的病毒液滴度。

实施例2.DC的转染、成熟诱导和特异性CTL的制备

1)DC转染及成熟诱导：采集志愿者外周血，利用Ficoll-Hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度分离法分离自体血浆(56℃30min灭活，4℃保存)和外周血单个核细胞PBMC，将此PBMC用无血清x-vivo15以5-7×107个细胞量铺于T75培养瓶，1h后收集悬浮细胞用于分离CD3+T淋巴细胞，贴壁细胞换含IL-4(100ng/mL)、GM-CSF(100ng/mL)和自体血浆(2％)的1640培养基刺激诱导单核细胞向DC分化。

第3天用如实施例1中已制备好的慢病毒感染24孔板中悬浮未成熟的DC。致敏24小时后更换为新鲜DC诱导培养基并加入IFN-γ(50ng/mL)和LPS(50EU/mL)以促进DC分化成熟。

第7天可通过显微镜观察DC的成熟状态，流式细胞仪检测DC表面分子标志物CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达量。

如图1所示的结果显示，DC经转染和诱导培养后，第7天DC表面的CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表达量显著增强，说明培养的DC已成熟，抗原递呈能力增强。

作为对比，第3天用如实施例1中已制备好的慢病毒感染24孔板中悬浮未成熟的DC。致敏24小时后更换为新鲜DC诱导培养基并加入IFN-γ(50ng/mL)和LPS(50EU/mL)后，在-4℃下静置半小时或者在2℃下静置2小时，然后逐渐升温至37摄氏度，继续常温培养，以促进DC分化成熟。

第7天可通过显微镜观察DC的成熟状态，流式细胞仪检测DC表面分子标志物CD83和HLA-DR表达量显著高于未进行低温静置而进行熟化的树突细胞，同时CD80和CD86的表达量相当，无显著差异。

2)抗原特异性CTL的制备：PBMC铺瓶1h后收集的悬浮细胞，采用磁珠负选法分离CD3+T淋巴细胞，计数并冻存至液氮，待第7天DC诱导成熟时复苏此T淋巴细胞，负载抗原的成熟DC和CD3+T细胞按照1:10的比例共培养从而致敏T淋巴细胞，培养基是含IL-7(10ng/mL)、IL-15(10ng/mL)及自体血浆(10％)的KBM581，共致敏2次，每次共培养4天；致敏2轮结束后，每隔两天用扩增培养液(含500U/mL IL-2的KBM581)进行一次补液，当第14天时细胞增殖到相当数量取细胞进行流式分析。

如图2所示，扩增培养的CD3+CTL细胞具有较高的纯度。

实施例3.抗原特异性CTL的肿瘤细胞杀伤实验

为了验证抗原特异性CTL对结直肠癌细胞系的特异性杀伤效果，本实施例靶细胞为Kras基因产生了K12V突变的SW480细胞系，并用Kras基因未突变的HT29细胞系作对照，同时使用其他突变的Kras作为靶向性的参照，进行抗原特异性CTL的体外杀伤验证实验。在T淋巴细胞特异性扩增第14天将肿瘤靶细胞和CTL(E:T)分别以1:1,1:5和1:10加入96孔板中共同孵育16小时后，加入CCK8试剂盒试剂孵育1h，用酶标仪检测各组细胞OD值，最后计算CTL对细胞株的特异性杀伤效率。

如图3所示的结果显示，相对细胞系HT-29的杀伤效果而言，如实施例2中制备的靶向G12V突变Kras蛋白的CTL对细胞系SW480具有较好的杀伤效果及较强的特异性，而靶向G12D突变Kras蛋白的CTL的对细胞系SW480和HT-29的杀伤效果都很一般，但比空载抗原的CTL杀伤效果略好，可能原因是其对Kras蛋白其他位点具有一定的识别性。该免疫治疗方法很有希望进入结直肠癌的临床治疗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种树突细胞，其能够表达G12V突变Kras蛋白。

2.根据权利要求1所述的树突细胞，其是通过含有编码G12V突变KRAS蛋白核苷酸的载体(例如慢病毒)感染树突状细胞使其表达G12V突变Kras蛋白，进而使得G12V突变KRAS蛋白抗原表位负载到树突状细胞而制得。

3.根据权利要求2的所述的树突细胞，其为进一步经过熟化诱导培养而制得的熟化的树突细胞。

4.根据权利要求3所述的树突细胞，其中所述熟化诱导培养是在含有IFN-γ和LPS的培养基上进行诱导培养，以促进DC分化成熟。

5.一种用于预防或治疗癌症的疫苗，其含有权利要求1-4中任一项所述的树突细胞。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其还进一步含有T细胞(如CD3+T细胞)。

7.权利要求1-4中任一项所述树突细胞在制备用于治疗或者预防表达G12V突变Kras蛋白的癌症的疫苗中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、或***癌。

9.活化的T细胞或CTL，其通过与权利要求1-4中任一项所述树突细胞共培养而制备。

10.细胞组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的树突细胞和T细胞。

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