CN115772096A - 一种双通道检测的双光子荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及一种双通道检测的双光子荧光探针及其制备方法和用途,以实现在不同通道荧光成像检测细胞内的粘度和ONOO-变化,具有高选择性、高灵敏度、双光子吸收性能优良和生物毒性低的优点。
背景技术
粘度作为一个关键参数,控制着细胞内介质的传输及其他扩散过程的顺利进行。在细胞水平上,各类营养物质和代谢产物的运输与粘度有关,粘度同时也决定着分子间的相互作用以及细胞间的信号传输;当细胞内粘度水平发生变化时,不仅会干扰生理过程使细胞的功能发生紊乱,更有可能导致多种严重疾病的发生,如糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、帕金森病和阿尔茨海默症等。实时精确的检测细胞内粘度的变化对于实现疾病的早期诊断至关重要。
细胞功能的发挥离不开活性物种的参与,并受到细胞微环境的影响。强氧化性的过氧亚硝基阴离子(ONOO-)和粘度作为生物体内重要的活性氧(ROS)和微环境指标,影响着氧化应激相关的信号传导,与许多疾病的发生发展密切相关。ONOO-充当生理信号分子和氧化应激的介质,过量的ONOO-会损害细胞的关键成分,例如蛋白质、DNA、脂质、含金属离子的簇和硫代化合物,并导致许多病理问题,例如心血管疾病、神经退行性疾病、炎症性疾病、癌症和糖尿病等。内源性异常高水平ONOO-经常导致细胞凋亡或坏死。在肿瘤微环境中,ONOO-与肿瘤免疫抑制密切相关。因此,开发新型的可对细胞或生物体内粘度和ONOO-水平进行检测成像的荧光探针具有重要意义。
炎症是身体对刺激的防御反应,涉及免疫细胞、血管和分子介质。在正常情况下,炎症是有益的,是人体的自动防御反应,在许多疾病中起着重要作用。根据以前的报道,细胞免疫反应与粘度和ONOO-之间确实存在一些联系。因此,开发一种简单有效的活细胞中粘度和ONOO-监测工具具有重要意义。
与其他生物分析方法相比,小分子荧光探针逐渐受到研究人员的青睐,由于其体积小,易于化学修饰,已成为生物***研究的有力工具。到目前为止,基于分子转子的小分子荧光探针仍然是粘度成像的主流工具。近年来,随着荧光传感技术和荧光成像技术的迅速发展,荧光探针被广泛应用于生物体系中蛋白质、活性物种以及肿瘤的成像。荧光小分子探针具有渗透性高、特异性强、稳定、毒性低以及可用于细胞实时成像等优点,逐渐成为检测细胞微环境和信号分子的优良工具。双光子荧光探针具有低光毒性和光漂白性,组织穿透深度大等优点,开发有效适用于检测生物样品中粘度和ONOO-水平的双光子荧光探针尤为重要。
发明内容
本发明旨在提供一种双通道检测的双光子荧光探针的设计及其研究,所要解决的技术问题是通过分子设计得到具有可以分别响应粘度和ONOO-的有机小分子结构,以实现通过荧光成像在不同通道实时监测活细胞内粘度和ONOO-的变化,具有选择性好、灵敏度高和双光子吸收性能优良等优点,细胞毒性测试表明本发明荧光探针的细胞相容性良好。
本发明双通道检测的双光子荧光探针,简记为RONN-1,其结构式如下:
本发明双通道检测的双光子荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:称取异氟尔酮5g(0.036mol)和2.5g稍过量的丙二腈,在50mL圆底烧瓶中将它们用无水乙醇溶液(30mL)溶解。同时,加入少量的冰醋酸和哌啶作为此反应的催化剂。另外,充氮气作为保护气80℃回流12h,薄层色谱观察至反应结束后,将乙醇反应溶液旋除。随后用二氯甲烷溶解,通过薄层色谱法纯化产物,柱层析的展开剂极性选择为石油醚:二氯甲烷=10:1,v:v,对产物提取分离并收集到淡黄色的固体,产率为89%。
步骤2:将等摩尔质量的二氰基异氟尔酮和4-二乙基氨基-2-甲氧基-苯甲醛混合于50mL的圆底烧瓶中,干燥的无水乙醇为反应溶剂,加入3~4滴的四氢吡啶作为催化剂,温度大约80℃氮气保护回流反应12h。TLC观察至反应结束后,以体积比为1:10的乙酸乙酯和石油醚作为展开剂,经柱层析分离纯化产物,最终收集到***的固体,产率约为82%。
本发明双通道检测的双光子荧光探针的合成过程如下:
本发明双通道检测的双光子荧光探针及其制备方法和用途,是在检测活细胞内的粘度和ONOO-变化时作为检测试剂使用。检测方法如下:
将本发明RONN-1溶于DMSO(5mL)中制得2mM的母液,取15μLRONN-1母液加入到3mL不同配比的甲醇/甘油体系混合溶剂中,得到最终浓度为10μM的测试液。RONN-1的单光子激发波长为540nm,检测600-700nm范围内的荧光光谱变化,可以明显观察到660nm处荧光发射波长的强度随着溶剂粘度的增加而增加(粘度由甲醇的粘度1.78cP增至584cP甘油的粘度),最高粘度时的荧光强度约为粘度最低时荧光强度的16倍,溶液粘度和荧光强度呈现良好的线性关系(R2=0.9739)。
为了测试RONN-1对于ONOO-的响应情况,取15μLRONN-1母液加入到不同体积的ONOO-溶液,用缓冲液稀释至终体积为3mL,得到最终浓度为10μM的测试液。单光子激发波长同上,检测375-700nm范围内的荧光光谱变化,可以观察到样品的荧光强度随着ONOO-浓度的增加逐渐增强,RONN-1的荧光强度和ONOO-浓度之间呈正相关且具有良好的线性关系(R2=0.9962)。同时也排除了一些氨基酸及各种离子对探针RONN-1荧光的干扰,从而证明探针RONN-1对粘度的特异性响应。此外,还探究了RONN-1在HeLa细胞中的光学稳定性,利用RONN-1对细胞内粘度及ONOO-实现双检测。
本发明双通道检测的双光子荧光探针,在溶液和细胞中对粘度和ONOO-良好响应能力。细胞毒性测试表明RONN-1的细胞相容性良好,荧光显微成像实验表明RONN-1可以有效实现对细胞内粘度及ONOO-双检测,可以检测出内源性和外源性ONOO-的变化,也可以检测肿瘤细胞黏度的变化。同时用LPS诱导的炎症细胞模型,通过对粘度和ONOO-的双检测,实现对炎症的双通道检测。
附图说明
图1是RONN-1(10μM)在甘油-甲醇体系(甘油含量为0-99%)中的(a)荧光发射光谱图(b)lg(F)和lg(η)的线性关系图(η=粘度值)。
图2是RONN-1在不同ONOO-浓度溶液的(a)荧光发射光谱图(b)荧光强度和ONOO-浓度的线性关系图。
图3是RONN-1在不同离子、氨基酸、空白样品和ONOO-存在条件下的荧光强度线性图及(b)不同离子、氨基酸、空白样品和ONOO-存在条件下在660nm发射波长下探针RONN-1的荧光强度柱状图。
图4是RONN-1(10μM)和响应产物在不同pH下的稳定性(a)粘度(甘油为90%)(b)ONOO-。
图5是RONN-1在(a)不同比例的甘油-甲醇体系中和(b)在PBS缓冲溶液中ONOO-存在和不存在时的有效双光子吸收截面。
图6是在不同浓度(0μM、5μM、10μM、15μM和20μM)的RONN-1的作用下的HeLa细胞存活率图。
图7是RONN-1(10μM)的共聚焦荧光成像图,探究RONN-1的光学稳定性。
图8是RONN-1(10μM)对用ONOO-(20μM、50μM)预处理的HepG2细胞的荧光成像图。
图9是RONN-1对HepG2细胞内内源性ONOO-共聚焦荧光成像图。
图10是RONN-1(10μM)对经制霉菌素(10μM)刺激后HepG2细胞的共聚焦荧光成像图。
图11是RONN-1(10μM)对经LPS刺激后HepG2细胞的炎症的共聚焦荧光成像图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1:RONN-1的合成
将等摩尔质量的二氰基异氟尔酮和4-二乙基氨基-2-甲氧基-苯甲醛混合于50mL的圆底烧瓶中,干燥的无水乙醇为反应溶剂,加入3~4滴的四氢吡啶作为催化剂,温度大约80℃氮气保护回流反应12h。TLC观察至反应结束后,以体积比为1:10的乙酸乙酯和石油醚作为展开剂,经柱层析分离纯化产物,最终收集到***的固体,所得固体即为化合物RONN-1,产率约为82%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ:7.41(s,1H),7.26(t,J=2.5Hz,1H),6.86(d,J=16.0Hz,1H),6.70(s,1H),6.30(d,J=8.6Hz,1H),6.11(s,1H),3.89(s,1H),3.42(q,J=7.7,7.0Hz,4H),2.54(s,1H),2.46(s,2H),1.22(t,J=6.9Hz,5H),1.05(s,4H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ:169.32,160.06,156.74,150.85,133.62,129.39,123.97,120.77,114.78,113.98,112.66,105.04,93.83,77.33,74.22,55.36,44.78,43.16,39.26,32.06,28.15,12.81.ESI-MSm/z:calcd.forC24H29N3O,RONN-1,375.2310,found,375.2291.
实施例2:RONN-1的光谱测试
为了测试探针RONN-1对于环境粘度的响应情况,取15μL的RONN-1母液加入到3mL不同体积比的甲醇/甘油混合体系中,650nm处荧光发射波长的强度随着溶剂粘度的增加而增加(粘度由水的粘度1.78cP增至584cP甘油的粘度),最高粘度时的荧光强度约为粘度最低时荧光强度的16倍(图1a)。在低粘度体系中,转子可以自由转动,从而在一定程度上抑制了荧光发射。在高粘度体系中,转子的转动受到抑制,能量只能以荧光的形式释放。可以看出,随着体系中粘度的不断增加,探针RONN-1的荧光强度也在不断增强,并且具有良好的线性关系,相关性达到了0.9739(图1b),因此探针RONN-1具有成为优秀粘度探针的潜力,也为后续细胞内粘度测试提供了理论上的可行性。为了测试RONN-1对于ONOO-的响应情况,取15μL的RONN-1母液加入到不同体积的ONOO-溶液,用缓冲液稀释至终体积为3mL,得到最终浓度为10μM的测试液。检测300-700nm范围内的荧光光谱变化(图2a),可以观察到样品的荧光强度随着ONOO-浓度的增加逐渐增强,RONN-1的荧光强度和ONOO-浓度之间呈正相关且具有良好的线性关系(R2=0.9962)(图2b)。
为了检验探针RONN-1的选择性,干扰物包括K+、Na+、Br﹣、Cl﹣、HSO3﹣、NO2﹣、NO3﹣、H2PO4 ﹣、ClO﹣、S2﹣、CO3 2-、S2O3 2-、HPO4 2﹣、SO4 2﹣、H2O2、GSH、Hcy、Cys,用PBS溶液配制含有不同干扰物的溶液,干扰物的物质的量浓度为2.0×10-4mol·L-1,探针RONN-1最终的物质的量浓度为1.0×10-5mol·L-1。
随后以ONOO-和探针RONN-1配制成物质的量浓度为1.0×10-5mol·L-1的溶液如图4(a)所示,可以看出,探针RONN-1在各种离子和氨基酸的干扰实验中荧光较弱。如图4(b)所示,可以更直观地看出,探针RONN-1在ONOO-中的荧光强度明显高于其他含有干扰物体系的荧光强度,这证明了探针RONN-1在复杂环境中仍然对ONOO-具有很好的选择性。
为了讨论探针RONN-1在不同pH值下的稳定性,我们记录了探针RONN-1物质的量浓度为1.0×10-5mol·L-1在pH值为4.0~8.0的甘油(比例9:1)混合物中的荧光光谱。如图5(a)所示,可以看出探针RONN-1的荧光强度在不同pH值下几乎没有变化。如图5(b)所示,记录了探针RONN-1物质的量浓度为1.0×10-5mol·L-1在pH值为4.0~8.0的ONOO-混合物中的荧光光谱,不同pH值条件下,探针RONN-1的荧光强度也没有发生明显的变化。由此可见,探针RONN-1的荧光强度的变化与pH值无关。
综上所述,探针RONN-1选择性以及pH稳定性测试结果证实了探针RONN-1在复杂生物样品中ONOO-及粘度的双检测的适用性。
实施例3:RONN-1的双光子性能测试
探针RONN-1在甘油-甲醇混合溶剂***中在甘油量为60%时,有效双光子吸收截面(Φδ)在激发波长为720nm时数值最大,为166GM(图5a)。同样的在ONOO-存在的PBS缓冲溶液中,探针RONN-1同样表现出了优良的有效双光子吸收截面,在激发波长为760nm时,最大有效双光子吸收截面为145GM(图5b)。证明RONN-1对粘度和ONOO-的响应都具有良好的双光子吸收性能,有能力用于组织的双光子共聚焦荧光成像。
实施例4:细胞毒性测试
为了验证细胞实验的可行性,我们进行了细胞活力实验,以探究探针RONN-1的细胞毒性。选取HeLa细胞进行毒性试验,采用MTT法进行细胞活性的检测。如图6所示,当探针RONN-1以0μM、5μM、10μM、15μM和20μM的浓度添加到HeLa细胞中并培养24h时,细胞存活率均超过80%,说明该探针在低浓度下具有较低的细胞毒性和副作用,该结果验证了探针RONN-1具有良好的生物相容性,可用于进一步的研究。
实施例5:RONN-1的时间稳定性
对探针RONN-1在细胞中的长时间成像进行测试,如图7,随着照射时间的延长,无论是探针RONN-1的红色通道的荧光均保持稳定。说明探针RONN-1很稳定,是适合用于在细胞中的长时间成像的。
实施例6:RONN-1对外源性和内源性ONOO-的细胞成像实验
通过外加ONOO-处理HepG2细胞,使细胞中ONOO-的含量发生变化,探究了探针对细胞外源性ONOO-水平变化的检测情况。结果如图8所示,将实验分为3组,分别为对照组、外加20μM ONOO-和50μM ONOO-。随着ONOO-的浓度的增加,蓝色通道的荧光强度在不断的增强。这说明探针能够很好的检测外源性ONOO-。
通过用PMA(12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐,phorbol 12-myristate 13-acetate)处理HepG2细胞,使细胞中ONOO-的浓度发生变化,探究了探针对细胞内源性ONOO-含量变化的检测情况。如图9所示,用PMA孵育后的实验组中蓝色通道的细胞亮度明显增强,说明探针能够检测细胞内源性的ONOO-。
实施例7:RONN-1对细胞粘度的共聚焦成像
通过制霉菌素(Nystatin)刺激使HepG2细胞粘度发生改变,探究了探针对细胞粘度变化的检测情况。结果如图10所示,细胞分别经制霉菌素处理的细胞亮度比对照组明显的增强了,红色通道出现了明亮的荧光。细胞实验结果表明探针能够对经制霉菌素刺激下的细胞粘度变化进行监测。
实施例8:炎症模型细胞的共聚焦成像
根据报道的文献,LPS是促进细胞炎症反应的药物。通过脂多糖(LPS)刺激使HepG2细胞粘度及过氧亚硝基阴离子发生改变,探究了探针对细胞粘度及过氧亚硝基阴离子变化的检测情况。如图11所示,在HepG2细胞中,细胞分别经制霉菌素处理的细胞亮度比对照组明显的增强了,红色通道和蓝色通道出现了明亮的荧光。细胞实验结果表明LPS可以诱导细胞的炎症反应并且增加活细胞中粘度及ONOO-的表达。
Claims (5)
2.一种权利要求1所述的双通道检测的双光子荧光探针的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤1:称取5g异氟尔酮和2.5g丙二腈,在圆底烧瓶中用无水乙醇溶解,同时加入冰醋酸和哌啶作为反应的催化剂,充氮气作为保护气于80℃回流反应12h;薄层色谱观察至反应结束后,将乙醇反应溶液旋除,随后用二氯甲烷溶解,通过柱色谱法纯化产物,收集得到淡黄色的固体,即为二氰基异氟尔酮;
步骤2:将等摩尔量的二氰基异氟尔酮和4-二乙基氨基-2-甲氧基-苯甲醛混合于圆底烧瓶中,无水乙醇为反应溶剂,加入四氢吡啶作为催化剂,氮气保护下于80℃回流反应12h;TLC观察至反应结束后,通过柱色谱法分离纯化产物,最终收集到***的固体即为目标产物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤1中,通过柱色谱法纯化粗产物时的洗脱液为石油醚:二氯甲烷=10:1,v/v。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤2中,通过柱色谱法纯化粗产物时的洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=10:1,v/v。
5.一种权利要求1所述的双通道检测的双光子荧光探针的用途,其特征在于:
所述双光子荧光探针用于制备检测试剂,所述检测试剂能够分别响应粘度和ONOO-的变化,进而通过荧光成像在不同通道实时监测活细胞内粘度和ONOO-的变化。
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