CN115770297A - TGFβ信号激动剂和抑制剂在制备促进或抑制破骨细胞分化和骨吸收药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及TGFβ信号激动剂和抑制剂在制备促进或抑制破骨细胞分化和骨吸收药物中的应用，属于医学技术领域。本发明在体外实验证实了激活骨细胞Wnt信号促进自身TGFβ信号增加，进而促进野生小鼠骨髓来源单核巨噬细胞向破骨细胞分化并增强其骨吸收能力，这证明了骨细胞Wnt信号促进骨吸收功能增加，可以为骨硬化症的治疗，以及为骨质疏松的防治提供了新的研究方向与思路。本发明还发现骨细胞Wnt信号通过TGFβ直接转录激活RANKL启动子活性，调控破骨细胞分化，这一新的机制研究在探索骨相关疾病防治的新的靶点的研究中具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及破骨细胞功能活性改变导致的骨硬化症或骨丢失治疗领域，具体而言，涉及TGFβ信号激动剂和抑制剂在制备促进或抑制破骨细胞分化和骨吸收药物中的应用。
背景技术
破骨细胞来源于骨髓中的造血干细胞，是由单核细胞/巨噬细胞通过多种方式融合形成具有骨吸收功能的多核巨细胞，通过分泌酸和蛋白水解酶溶解胶原蛋白和其他基质蛋白从而降解骨。其生理分化需要TNF超家族成员NF-kB配体受体激活剂(ReceptorActivator of Nucler Factor-κB ligand，RANKL)的介导,RANKL与破骨前体细胞膜上的κB受体活化因子(Receptor Activator of Nucler Factor-κB，RANK)结合，通过衔接NF-κB通路导致破骨细胞生成关键转录因子NFATc1的诱导和激活，调控破骨细胞生成和分化。RANKL主要由骨细胞和成骨细胞分泌，与促进破骨前体细胞增殖的巨噬细胞集落刺激因子(Macropha ge colony-stimulating factor，M-CSF)联合使用可以在体外诱导出具有骨吸收能力的破骨细胞。破骨细胞功能活性增强或不足都会导致严重的骨稳态失衡。
骨质疏松是全世界面临的主要慢性疾病之一，其主要表现于骨密度降低，微结构改变，骨折风险增加。研究表明老年和绝经后妇女等骨质疏松患者成骨细胞活性不足，破骨细胞数量增加，骨吸收活性增强，从而导致骨量减少。此外，目前临床广泛使用的抗骨质疏松药物双膦酸盐，主要通过抑制破骨细胞骨吸收功能，但研究表明长期使用双膦酸盐，会导致骨量降低，骨折风险增加。骨骼的正常更新需要破骨细胞吸收旧骨，成骨细胞合成新骨，所以破骨细胞在骨稳态中同样发挥着重要的作用。
以石骨症为代表的骨硬化症主要临床表现为骨密度增加，病理上主要表现为破骨细胞活性代谢紊乱导致的。目前骨科治疗药物只有促骨形成、抗骨吸收和综合型三类，还没有促进破骨细胞分化及骨吸收的药物。骨细胞在骨中占比高达90％以上，具有庞大的数量优势，此外它又是RANKL的主要来源，所以成为调控破骨细胞分化的关键因素。也有实验证实骨细胞可促进破骨细胞分化，但这背后的机制还需要进一步研究。
此外，近年来骨修复生物活性材料成为修复骨缺损的研究热点，但是普遍研究都旨在单一的促进成骨细胞活性或抑制破骨细胞活性，少有双功能齐全，维持正常骨代谢需要成骨细胞与破骨细胞的功能动态平衡。
Wnt信号是骨稳态的关键调节因子，骨细胞在骨中具有数量优势，其Wnt信号激活在体外和动物实验中均证实促进骨量增加，并增强骨吸收，呈现出骨生理活性状态。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供Wnt信号激动剂、TGFβ激动剂和抑制剂在制备促进或抑制破骨细胞分化和骨吸收药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用具体技术方案如下：
第一方面，通过骨细胞的分离培养以及和骨髓巨噬细胞的共培养，发现原代Wnt信号激活的骨细胞促进破骨细胞分化，所述方法包括：
步骤一：原代骨细胞的提取、培养及鉴定；
步骤二：Wnt信号激活骨细胞Wnt下游靶基因的鉴定及破骨细胞分化因子RANKL表达的检测；
步骤三：骨细胞与野生小鼠BMM在体外共培养并连续观察，TRAP染色及qPCR实验检测骨细胞对破骨细胞分化的调控作用。
第二方面，通过采用传统的骨磨片吸收坑法检测发现Wnt信号激活骨细胞对破骨细胞骨吸收功能具有促进作用。所述方法包括:
步骤一：新鲜牛骨用电锯和砂纸打磨成100μm厚的骨磨片，并通过70％酒精和紫外线消毒杀菌；
步骤二：骨细胞与野生小鼠BMM共培养在骨磨片上，TRAP染色及甲苯胺蓝染色检测破骨细胞及骨吸收坑形成情况；
步骤三：OsteoMetrics软件对骨吸收坑面积量化。
第三方面，通过小干扰RNA(siRNA)下调骨细胞中RANKL基因的表达，检测发现Wnt信号激活骨细胞通过增加RANKL表达促进破骨细胞分化。所述方法包括：
步骤一：构建RANKL小干扰RNA；
步骤二：RANKL小干扰RNA转染入骨细胞中，qPCR检测其对RANKL表达的抑制情况；
步骤三：siRNA抑制Wnt信号激活骨细胞的RANKL表达后与BMM共培养，TRAP染色破骨细胞分化情况。
第四方面，通过小鼠原代骨细胞RNA基因转录组分析，探究发现TGFβ信号与骨细胞Wnt信号促进破骨细胞分化有关。所述方法包括：
步骤一：小鼠原代骨细胞RNA基因转录组分析显示Tgfb2在Wnt信号激活骨细胞中表达上调
步骤二：原代骨细胞RNA检测证实Tgfb1和Tgfb2 mRNA在Wnt信号激活骨细胞中高表达；
第五方面，小分子Wnt信号激动剂处理野生型骨细胞，验证Wnt信号激动剂与基因结构激活结果一致。所述方法包括：
步骤一：Wnt信号激动剂CHIR99021作用于野生小鼠原代骨细胞，免疫荧光检测β-catenin入核现象，qPCR检测Wnt信号下游靶基因；
步骤二：qPCR检测骨细胞中Tgfb1和Tgfb2的表达与Wnt信号的关系。
步骤三：Wnt信号激动剂CHIR99021作用于野生小鼠原代骨细胞，然后与BMM共培养，TRAP染色检测破骨细胞分化情况。
第五方面，通过TGFβ信号激动剂SRI激活野生小鼠原代骨细胞TGFβ信号，共培养实验与双荧光素酶实验证实，TGFβ可直接刺激RANKL启动子的激活，增加RANKL表达促进破骨细胞分化。所述方法包括：
步骤一：SRI处理野生小鼠原代骨细胞48h，Western Blot检测TGFβ信号激活情况，qPCR检测TGFβ信号激活后RANKL表达变化；
步骤二：SRI处理野生小鼠原代骨细胞48h后与野生小鼠BMM共培养，TRAP染色检测破骨细胞分化；
步骤三：构建了RANKL启动子质粒，双荧光素酶实验检测SRI对RANKL启动子转录激活的影响。
第六方面，通过TGFb信号抑制剂ITD-1处理Wnt信号激活骨细胞后与BMM共培养，结果证实抑制Wnt信号激活骨细胞中的TGFβ信号降低其促破骨细胞分化能力。所述方法包括：
步骤一：ITD-1和/或CHIR99021处理野生小鼠原代骨细胞48h，Western Blot检测TGFb信号表达情况，qPCR检测TGFb信号改变后RANKL表达变化；
步骤二：ITD-1和/或CHIR99021处理野生小鼠原代骨细胞48h后与野生小鼠BMM共培养，TRAP染色检测破骨细胞分化；
步骤三：构建了RANKL启动子质粒，双荧光素酶实验检测SRI对RANKL启动子转录激活的影响。
第七方面，通过TGFb信号抑制剂ITD-1处理Wnt信号激活骨细胞后与BMM共培养，结果证实抑制Wnt信号激活骨细胞中的TGFβ信号降低其促破骨细胞分化能力。所述方法包括：
步骤一：ITD-1和/或C91处理野生小鼠原代骨细胞48h，Western Blot检测TGFb信号表达情况，qPCR检测TGFb信号改变后RANKL表达变化；
步骤二：ITD-1和/或C91处理野生小鼠原代骨细胞48h后与野生小鼠BMM共培养，TRAP染色检测破骨细胞分化；
第八方面，通过Cre-loxp技术将小鼠骨细胞TGFβRⅡ敲除，阻断骨细胞TGFβ信号，检测破骨细胞数量和骨吸收能力。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次发现骨细胞Wnt信号通过TGFβ促进RANKL转录激活，进而促进破骨细胞分化和骨吸收功能；并提供一种方法通过抑制TGFβ信号可高效低风险地治疗、预防因破骨细胞分化和骨吸收增强而导致的骨丢失或者骨质疏松；此外也提供了两种方法即Wnt信号激动剂或TGFβ激动剂的药物来治疗或减缓破骨细胞活性降低导致的骨硬化症。具体地，TGFβ激动剂和抑制剂增强或降低骨细胞TGFβ信号(Wnt激动剂)，改变RANKL的表达，进而调控骨髓单核-巨噬细胞破骨分化功能。本发明为临床寻找治疗破骨细胞活性紊乱导致的骨质疏松或骨硬化症提供实验数据和研究方向，具有较好的应用前景。
附图说明
图1中A-C为实施例1中原代骨细胞鉴定结果；D为实施例1中daCOt和WTOt细胞的观察结果图；E为实施例1中骨细胞Wnt下游靶基因检测结果；F为实施例1中破骨细胞分化相关因子表达水平；G为实施例1中daCOt条件培养基中RANKL蛋白的表达水平；H、I分别为实施例1中共培养TRAP染色和计数结果；J为实施例1中共培养破骨细胞标志基因检测结果。
图2中A为实施例2中TRAP染色和甲苯胺蓝染色结果；B为实施例2中TRAP染色计数结果；C为实施例2中骨吸收坑面积量化结果。
图3中A为实施例3的siRNA转染效率图；B为实施例3中RANKL与OPG表达检测结果；C、D分别为共培养TRAP染色和计数结果。
图4中A为实施例4的转录组分析结果；B为实施例4中Tgfb1和Tgfb2的mRNA检测结果；C为实施例4中Wnt下游靶基因检测结果；D为实施例4中Tgfb1、Tgfb2和Tgfb3的mRNA检测结果；E为实施例4中RANKL和Opg的mRNA检测结果。
图5中A为实施例5中p-Smad2/3蛋白表达检测；B为实施例5中RANKL与OPG表达检测结果；C为实施例5中共培养TRAP染色和计数结果；D、E为实施例5中双荧光素酶检测结果。
图6中A为实施例6中细胞p-Smad2/3蛋白表达检测结果；B为实施例6中RANKL与OPG表达检测结果；C、D分别为实施例6中共培养TRAP染色和计数结果。
图7中A为实施例7中股骨TRAP染色；B为实施例7中破骨细胞组织形态学分析；C为实施例7中RANKL的mRNA检测结果；D为实施例7中RANKL免疫组化染色。
具体实施方式
实施例1
1.1细胞的提取与培养
表1原代细胞来源动物信息
从daβcatOt小鼠提取的骨细胞命名为daCOt,从control小鼠中提取的骨细胞命名为WTOt，从TGFβRⅡflfl小鼠提取的骨细胞命名为OtΔTGFβRⅡ。
1.1.1骨细胞的提取
选取2-4月龄C57/BL6小鼠，小鼠脱颈处死，喷洒酒精消毒全身，在超净工作台内无菌条件下用无菌手术剪和手术镊解剖出小鼠双侧股骨和胫骨放入含有1％FBS的无菌α-MEM中，剪去骨两端的骨骺端(生长板)，用1mL无菌注射器***并用力冲洗骨髓腔，直到骨干中的红色骨髓腔全部被冲出。将冲洗骨髓腔后的小鼠股骨与胫骨转移到新的含有1％FBS的无菌PBS中，用无菌手术剪去除骨周围软组织及骨膜，将骨干剪成1～2mm大小的碎片，α-MEM清洗一次后将骨碎片置于6孔板中。
骨碎片孔中加入1mg/mL I型胶原酶溶液1mL于80rpm，37℃摇床孵育15min，吸弃酶解液，加入1mL完全培养基(含10％胎牛血清的α-MEM)于冰中静止5min，吸弃完全培养基，清洗骨碎片一次。重复以上一型胶原酶酶解三次。
然后将4mM EDTA溶液1mL加入骨碎片后于80rpm，37℃摇床孵育5min，再更换I型胶原酶孵育15min，以上EDTA与一型胶原酶交替处理步骤重复三次。酶解消化后的骨碎片置于六孔板中培养，每孔加3mL完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱内培养，每2天更换培养液，第34天即可观察到从骨碎片中逐步长出的骨细胞贴壁生长，呈三角形或梭形，形体较小(图1A)。
1.1.2成骨细胞提取
选取1月龄左右C57/BL6小鼠，小鼠脱颈处死，喷洒酒精消毒全身，在超净工作台内无菌条件下用无菌手术剪和手术镊解剖出小鼠顶骨，用无菌手术剪去除骨周围软组织，将骨干剪成1～2mm大小的碎片，α-MEM清洗一次后将骨碎片置于6孔板中。
骨碎片孔中加入1mg/mL I型胶原酶溶液1mL于80rpm，37℃摇床孵育15min，吸弃酶解液，加入1mL完全培养基(含10％胎牛血清的α-MEM)于冰中静止5min，吸弃完全培养基，清洗骨碎片一次。重复以上一型胶原酶酶解三次。
收集三次酶解液，200g,l离心5min,弃上清，然后用完全培养基重悬，将其培养于六孔板中，每孔加3mL完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱内培养，根据成骨细胞生长状态更换培养基，第7-8天即可观察到成骨细胞贴壁生长，形体远大于骨细胞(图1A)。
1.1.3骨髓巨噬细胞的提取
选取2-4月龄C57/BL6小鼠，小鼠脱颈处死，喷洒酒精消毒全身，在超净工作台内无菌条件下用无菌手术剪和手术镊解剖出小鼠双侧股骨和胫骨放入含有1％FBS的无菌PBS中，剪去骨两端的骨骺端(生长板)，用1mL无菌注射器***并用力冲洗骨髓腔，直到骨干中的红色骨髓腔全部被冲出，将冲出的骨髓细胞轻轻吹打混匀，用300μm过滤器过滤，200g离心4min，收集细胞沉淀用5mL完全培养液重悬计数，以1.5x107个细胞/15mL完全培养液/T75培养瓶于37℃,5％CO2培养箱内培养，72h后收集非粘附细胞,200g离心4min,弃上清，接种于新的含有30ng/mL M-CSF重组蛋的培养液中继续培养72h，通过0.25％胰酶消化法获取贴壁细胞即骨髓巨噬细胞(BMM)，作为破骨前体细胞使用。
1.2qPCR检测成骨细胞和骨细胞标志基因表达情况
1.2.1检测野生型成骨细胞和骨细胞中标志基因表达水平(图1B-C)。
1.2.2检测从骨细胞Wnt信号特异性激活小鼠(daβcatOt)长骨提取的骨细胞Wnt靶基因表达情况(图1D-E)。
1.2.3细胞RNA提取和qPCR方法如下：
(1)细胞总RNA的提取
1)吸弃培养基，加入TRIzol 150μL/孔裂解细胞(24孔板)，用枪头宽口刮下细胞，转移至无菌无酶EP管中。加入1/5TRIzol体积的氯仿，旋涡振荡10s，室温放置2min后12000g，4℃离心15min，吸取上层透明水相转移至新的无菌无酶EP管中。加入等体积异丙醇，轻柔地上下颠倒混匀，置于-20℃冰箱冷冻3h以上。15000g，4℃离心15min，
2)15000g，4℃离心15min，加入DEPC水配制的75％冷乙醇300μL/EP管，轻柔地上下颠倒润洗。10000g，4℃离心5min。弃去上清，超净台中风干5～10min。根据RNA体积加入适量10～30μL DEPC水溶解，
3)充分溶解RNA后用nano drop仪器测定RNA浓度，进行cDNA逆转录。
(2)逆转录反应
此部分操作全在冰上进行，保持低温。按反应数+2的标本数配制试剂混合液，分装至每管，以保证每管反应液的准确性。
1)去除基因组DNA
反应体系如下：
表2
42℃水浴反应2min。
2)反转录反应
反应体系如下：
表3
37℃15min，85℃15s，4℃forever。
反应液5倍稀释后进行qPCR或-20℃冻存。
(3)qRT-PCR
此部分操作全在冰上进行，保持低温，避光。按反应数+2的标本数配制试剂混合液，分装至每管，以保证每管反应液的准确性。
1)qRT-PCR反应体系配制如下：
表4
2)qRT-PCR反应程序操作如下
表5
3)qPCR实验所用基因引物
表6引物序列
1.3采用qPCR检测daCOt中破骨细胞分化相关因子RANKL、Opg、MCSF表达水平，qPCR方法同1.2.3。
1.4根据酶联免疫实验(Elisa)试剂盒说明书(睿信生物科技有限公司)检测骨细胞培养上清中RANKL和Opg的蛋白含量。方法如下：
1)将来自WTOt和daCOt的上清液样品以1200xg离心5分钟以去除细胞碎片。
2)根据试剂盒说明书(睿信生物科技有限公司)检测上清中RANKL和Opg的蛋白含量。
3)通过微孔板读取器(Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，CA，USA)测量450nm处的吸光度。使用试剂盒内的RANKL标准从标准曲线计算结果。
1.5骨细胞与骨髓巨噬细胞共培养
共培养实验：即将两种细胞接种于同一个孔板中，检测一种细胞对另外一种细胞的生长、增殖、分化等的影响。为查明骨细胞Wnt信号激活对BMMs破骨分化的影响，骨细胞以5x104个/孔，BMM以2x104个/孔的密度混匀接种于48孔板(所用比例为实验室前期实验筛选，文章待发表)，加入重组蛋白M-CSF(30ng/mL)或M-CSF(30ng/mL)+RANKL(50ng/mL)于共培养体系中。培养液每3天更换一次，5～9天后，显微镜普通光源镜检。
1.6破骨细胞的鉴定
1.6.1 TRAP染色(图1H-I)
孔板中加入PBS轻轻冲洗一次后加入10％甲醛溶液200μL/孔室温固定细胞10min，用ddH2O冲洗后放置于室温彻底晾干细胞。染色之前根据TRAP染色试剂盒说明书混匀染色液(染色液配置方法如下表2.A和表3.B)，250μL/孔覆盖细胞37℃孵育10～20min。显微镜镜检每孔内TRAP阳性细胞和多核破骨细胞数量(3个以上核的TRAP阳性细胞定义为破骨细胞)。
骨磨片用10％甲醛溶液室温固定细胞10min后进行TRAP染色，染色方法同孔板培养细胞TRAP染色，显微镜普通光源镜检即可观察骨磨片上TRAP阳性细胞破骨细胞，计数拍照。
表2.A液配置
混匀A液30秒，室温放置2分钟。
表3.B液配置
| dH<sub>2</sub>O | 1.8ml | 3.6ml | 5.63ml | 11.25ml | 22.5ml |
| naphthol | 20ul | 40ul | 62ul | 125ul | 250ul |
| acetate | 80ul | 160ul | 250ul | 500ul | 1ml |
| tartrate | 40ul | 80ul | 125ul | 150ul | 500ul |
将A液与B液混匀，37℃预热5分钟。
1.6.2qPCR检测破骨细胞分化标志基因，方法同前1.2.3(图1J)。
实施例2
本实施例与实施例1的区别是：将骨细胞与BMM共培养体系建立在骨磨片上，检测骨吸收坑的形成能力，结果参见图2。
2.1制备骨磨片及骨吸收坑试验
购买新鲜牛股骨干，洗净骨髓，用电锯将骨段横向切割打磨成100μm厚的小骨片，并用70％酒精浸泡杀菌后紫外线照射消毒，然后转入无菌PBS 37℃过夜置换出骨磨片中的酒精。
将PBS浸泡过夜的骨片置于48孔板(1片/孔)中，加入含有30ng/mL M-CSF和50ng/mL RANKL重组蛋白的完全培养液，骨细胞以0.5x104个/孔，BMM以2x104个/孔的密度混匀接种于骨片顶部，每3天更换一次培养液。另设一组无骨磨片的BMM培养组用以镜下观察破骨细胞的形成，该组破骨细胞形成时间较骨磨片上破骨细胞形成时间早1～2天。
2.2骨吸收坑甲苯胺蓝染色
用湿棉签擦除骨磨片上的细胞，用含有1％硼酸钠的0.1％甲苯胺蓝染液对骨磨片染色30s，蒸馏水冲洗，风干，显微镜普通光源镜检拍照，通过骨量测量高分辨率数字视频***(OsteoMetrics)计算骨吸收坑面积与骨面积之比。
实施例3
本实施例与实施例1的区别是：daCOt的RANKL表达被siRNA抑制,siRNA敲降daCOt骨细胞中的RANKL后，降低其促进破骨细胞分化能力。
3.1小干扰RNA转染实验
(1)RANKL小干扰RNA：三组RANKL-siRNA
RANKL1-siRNA(SEQ ID NO.33)：GGATGAAACAAGCCTTTCA；
RANKL2-siRNA(SEQ ID NO.34)：CAGACTATCTTCAGCTGAT；
RANKL3-siRNA(SEQ ID NO.35)：CATGACGTTAAGCAACGGA。
上述小干扰RNA构建于RIBOBIO公司，溶解于无菌ddH2O至终浓度20μM。
(2)转染细胞
1)细胞铺板：daCOt细胞消化计数后接种到24孔板中，待细胞汇合度到60～80％左右。
2)转染混合液制备：1.5μL的Zeta Life转染试剂与1.5μL的20μM siRNA质粒以1:1比例混，室温静止10～15min，然后加入到500μl转染体系中。
3)将混合液加入细胞培养板并轻轻晃匀，放入培养箱中持续培养。转染24h后对细胞进行正常换液，48h后通过荧光显微镜检测Cy3-siRNA转染细胞的转染效率，结果参见图3A。
(3)RANKL-siRNA转染后的骨细胞进行RNA检测，siRNA显著降低了RANKL的表达，结果参见图3B。
(4)RANKL-siRNA转染后的骨细胞(daCOt)，与BMM共培养，siRNA敲降RANK组骨细胞促进破骨细胞分化功能显著降低，结果参见图3C-D。
实施例4
本实施例与实施例1的区别是：收集daCOt和WTOt细胞的RNA用于RNA-seq,筛选出与破骨细胞分化有关的差异表达基因。
4.1提取原代daCOt和WTOt细胞的RNA
分别收集3份WTOt和3份daCOt的RNA，方法同1.2.3，然后送公司进行基因测序。
4.2提取原代daCOt和WTOt细胞的RNA，采用qPCR验证差异表达基因，方法同1.2.3。
4.3Wnt信号激动剂CHIR99021(C91)激活WTOt中的Wnt信号，并促进了TGFβ的表达。
(1)WTOt细胞以2X104个/孔铺入24孔板中，用含有10％胎牛血清的α-MEM培养基培养。用C91处理48小时。
(2)提取C91处理48小时后的野生型骨细胞的总RNA，qPCR检测Wnt信号靶基因Axin2、Lef1、Smad6、Bmp4，方法同1.2.3，结果参见图4C。
(3)5μM的C91处理野生型骨细胞后Tgfb1/2/3随着时间变化的表达水平，方法同1.2.3，结果参见图4D。
(4)5μM的C91处理野生型骨细胞后RANKL和Opg随着时间变化的表达水平，方法同1.2.3，结果参见图4E。
实施例5
本实施例与实施例1的区别是：TGFβ激动剂SRI促进野生型骨细胞RANKL的表达，进而促进破骨细胞分化。
6.1Western blo检测不同剂量SRI处理野生型骨细胞后的p-Smad2/3水平，5μM的SRI显著增加p-Smad2/3水平，激活TGFβ信号，参见图6A。
6.2不同剂量SRI处理野生型骨细胞后，提取总RNA，qPCR检测到RANKL、Opg和RANKL/Opg转录增加，参见图6B。
6.3 5μM的SRI处理野生型骨细胞48小时后，与BMM共培养，SRI处理组显著促进破骨细胞分化，参见图6C。
6.4TGFβ信号促进RANKL启动子转录激活
6.4.15μM的的SRI处理野生型骨细胞不同时间RANKL的转录水平，在6小时就显著增加。(图6D)
6.4.2构建的RANKL启动子报告基因质粒在TGFβ激动剂SRI作用下，迅速转录激活。(图6E)，方法如下：
6.4.2.1质粒扩增
(1)细菌肉汤培养基及琼脂平板配制
1)肉汤培养基：LB Broth Base(invitrogen)4g加入200mL ddH2O，121℃灭菌15min，4℃储存备用。
2)Amp配制：天根Amp粉末0.25g加入2.5mL ddH2O配制成100mg/μL，0.5mL/管分装，-20℃保存备用。
3)琼脂平板：LB Agar(invitrogen)6.4g加入200mL ddH2O，121℃灭菌15min，待冷却至45～50℃后加入0.1％天根氨苄青霉素溶液(Amp)混匀，倒入平板(10～15mL/平板)冷却直至凝固后倒置，封口膜(parafilm)密封保水后可放在塑料袋中4℃长期保存(一个月)备用。
(2)质粒扩增步骤
1)无菌枪头戳取公司构建的质粒穿刺菌后于琼脂平板上划板，37℃培养过夜。
2)分装15mL肉汤培养基于50mL无菌离心管中，加入0.1％Amp。从琼脂平板上挑取单个菌落接种于肉汤离心管中，37℃、225rpm旋转振荡培养12～16h。
3)3000g、10min离心菌液，尽量弃去上清，细菌沉淀根据质粒提抽试剂盒说明书(天根)提抽质粒。
4)质粒浓度测定，-20℃保存备用。
6.4.2.2双荧光素酶实验
(1)实验样准备
1)质粒：pGL3-RANKL质粒穿刺菌构建于北京六合华大基因科技有限公司，分别扩增质粒后-20℃保存。海肾质粒PRL-null由实验室前期构建。
2)双荧光素酶检测试剂：试剂盒购自Promega公司。
3)5×Passive Lysis Buffer：裂解细胞，4℃保存，用ddH2O现配现用。
4)LuciferaseAssay Reagent：检测萤火虫荧光，用
Luciferase Buffer溶解冻干粉
Luciferase Substrate，分装，-80℃保存。
5)Stop&
海肾荧光素的反应液以及荧火虫荧光素的终止液，作为内参使用。0.2mL 50x Stop&
Stop&Glo Buffer，分装，-80℃保存。
(2)实验步骤：
293T细胞以2.5x103个/孔铺板于48孔板，待细胞贴壁，根据ZETA Life转染试剂说明书配置转染混合液(ZETA Life：启动子质粒：PRL-null质粒＝1μL:1ng:0.1ng)，静止10～15min后加入孔板。
1)转染24h后，更换培养液，加入药物刺激24h。
2)荧光检测：
a.PBS清洗细胞3遍，每孔加入100μL 1xPLB细胞裂解液，室温下震荡裂解15min。充分吹打并收集细胞裂解液4℃，13000rpm离心收集细胞上清。
b.取25μL细胞裂解液加入荧光检测96孔板，并加入25μL Luciferase AssayReagent充分混匀，立刻置于酶标仪中通过化学发光法检测萤火虫荧光活性。
c.机器读数后立刻加25μL Stop&
检测海肾荧光活性。计算萤火虫荧光与海肾荧光的比值，用于标准化。
实施例6
TGFβ抑制剂ITD-1抑制Wnt激动剂CHIR99021增加的TGFβ信号后，抑制其促破骨细胞分化能力。
7.15μM的CHIR99021和不剂量的ITD-1处理野生型骨细胞后，检测p-Smad2/3蛋白水品，ITD-1显著降低p-Smad2/3蛋白水品，抑制TGFβ信号，参见图7A。
7.25μM的CHIR99021和不剂量的ITD-1处理野生型骨细胞后，提取总RNA，qPCR检测到ITD-1显著抑制RANKL、Opg和RANKL/Opg的表达，方法同1.2.3，参见图7B。
7.3将5μM的CHIR99021或5μM的CHIR99021和10μM的ITD-1处理后的野生型骨细胞与BMM共培养，TRAP染色后发现ITD-1显著抑制了CHIR99021促进破骨细胞分化的效果，参见图7C-D。
实施例7
小鼠骨细胞TGFβRⅡ敲除后，破骨细胞数量减少，骨细胞RANKL表达降。
7.1将TGFβRⅡflfl小鼠与DMP1-8kb-cre小鼠杂交，以获得骨细胞TGFβRⅡ特异性敲除小鼠模型(TGFβRⅡΔOt)。
7.2收获8周龄骨细胞TGFβRⅡ特异性敲除小鼠股骨骨样，进行TRAP染色，然后进行组织形态学分析破骨细胞数量，参见图7A-B。
7.3提取TGFβRⅡflfl小鼠原代骨细胞(OtΔTGFβRⅡ)，体外转染载有cre基因重组酶腺病毒，然后进行RANKL的mRNA检测，方法同1.1.1和1.2.3，参见图7C。
7.4将骨细胞TGFβRⅡ特异性敲除小鼠股骨石蜡切片进行RANKL免疫组化染色，参见图7D.
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.TGFβ或Wnt信号激动剂在制备预防或治疗骨硬化症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TGFβ激动剂为SRI-011381，所述Wnt信号激动剂为CHIR99021。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述骨硬化症是指破骨细胞数量减少、破骨细胞分化或骨吸收功能障碍导致的骨量异常增多。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是SRI-011381或CHIR99201通激活骨细胞TGFβ信号，进而挽救破骨细胞分化功能障碍导致的骨硬化症。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述骨硬化症的表现为如下至少一种的症状：骨量异常增加、破骨细胞分化功能障碍、破骨细胞骨吸收功能障碍、骨细胞TGFβ信号降低。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述TGFβ信号包括p-Smad2/3蛋白水平。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，出现破骨细胞分化功能障碍表现为如下的至少一种标志物的表达量降低：Nfatc1、Rank、Ctsk、Dcstamp；所述骨吸收功能障碍表现为：破骨细胞体外骨表面吸收坑面积减少。
8.TGFβ抑制剂在制备治疗破骨细胞骨吸收功能活跃导致的骨质疏松的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述TGFβ抑制剂为ITD-1。
10.根据权利要求1-2、4-9任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括小分子药物、蛋白质、多肽，还包括药学上可接受的添加剂或辅料；所述药物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾或针剂。
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