CN115770235A - 一种溴酚化合物在抗肿瘤新生血管生成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋藻来源的化合物双‑(2,3,6‑三溴‑4,5‑二羟基苄基)醚(BTDE)在抑制肿瘤新生血管生成中的应用。本发明经试验证实，BTDE在体外对人静脉内皮细胞HUVECs增殖无影响，但可显著抑制其迁移与侵袭。进一步实验证明，BTDE在体外能够抑制HUVECs血管拟态生成，但对既存血管无影响。此外，我们进一步探究发现BTDE抑制HUVECs基质金属蛋白酶9活力，但不影响AKT，ERK蛋白分子及其磷酸化水平表达。体内斑马鱼胚胎实验显示BTDE抑制斑马鱼胚胎背部节间血管生成。BTDE可以从海洋藻类中获得，易分离提取，同时可用化学合成途径大量制备，是一种非常有应用前景的抗肿瘤新生血管生成先导化合物。
Description
一、技术领域
本发明是涉及一种新型的海洋藻类来源的化合物双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚(BTDE)在***新生血管生成中的应用，属于化学药领域。
二、背景技术
癌症作为全球致死率第二大疾病，严重威胁人类生命健康。目前，全球每年癌症患者以3％-5％的速度增加且逐渐向低龄人群转移，癌症死亡率依旧呈上升趋势。二十世纪七十年代初就已提出肿瘤生长赖以血管生成的概念。近十年随着血管生成相关因子和信号通路的深入研究，以及血管生成对肿瘤生长、浸润转移，特别是对肿瘤早期发生重要影响的不断探究，肿瘤新生血管生成已是治疗癌症的一大研究热点。目前上市肿瘤治疗药物中就包括以抑制血管生成为主要靶点的抗癌药物。如表皮生长因子抑制剂吉非替尼，血管内皮生长因子、β-成纤维细胞生长因子抑制剂沙立度胺以及重组人血管内皮抑素恩度。这些药物均特异性靶向血管生成从而发挥抗癌作用。然而，临床数据显示一些血管生成抑制剂通常导致内皮细胞功能障碍并出现耐药性，寻求更安全有效的肿瘤新生血管生成抑制剂依然是癌症治疗的重要手段。
目前已有多项研究表明，海洋溴酚化合物除了具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化和抗病毒活性外，还有良好的抑制血管生成作用。例如源自红藻Rhodomela confervoides的溴酚化合物双-(2,3-二溴-4,5-二羟基苯基)甲烷和双-(2,3-二溴-4,5-二羟基苄基)醚，通过靶向多种受体激酶和VEGF信号通路而发挥抗血管生成作用。因此，从海洋溴酚中寻找具有抑制血管生成活性的先导化合物，是一种有前景的抗肿瘤新生血管生成制剂研发策略。
BTDE是从红藻Symphyocladia latiuscula中分离得到的一种溴酚类化合物。近年来研究指出，BTDE具有良好的抗氧化、抗糖尿病、抑制神经退行性疾病和多种酶抑制作用，但其在血管生成方面的作用还未报道。因此，我们研究了BTDE对人脐静脉内皮细胞HUVECs的迁移，侵袭和小管生成影响；及其对斑马鱼胚胎背部节间血管生成影响，试图从体内及体外水平评价BTDE的抗血管生成作用。
本发明以前并没有BTDE在抑制肿瘤新生血管生成方面的应用，BTDE能够红藻中分离提取，易获得，能够对HUVECs迁移、侵袭和血管生成产生抑制作用，易合成，是一种非常有前途的抗肿瘤血管生成药物。
双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚Bis(2,3,6-tribromo-4,5-dihydroxybenzyl)ether(BTDE)化学结构式见图1。
三、发明内容
本发明的目的之一是发现了BTDE的抗血管生成作用。
本发明的目的之二是探究了BTDE体外对HUVECs增殖，迁移及侵袭的影响。
本发明的目的之三是探究了BTDE体外对HUVECs血管拟态生成和既存血管的影响。
本发明的目的之四是探究了BTDE对HUVECs基质金属蛋白酶活性的影响。
本发明的目的之五是探究了BTDE体内对斑马鱼胚胎背部节间血管生成的影响。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
采用MTT技术，检测BTDE对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖影响。
采用平板划痕和Transwell migration技术，检测BTDE在体外对HUVECs迁移影响。
采用Transwell invasion技术，检测BTDE对HUVECs侵袭影响。
采用Tube formation技术，检测BTDE对HUVECs血管拟态生成和既存血管影响。
采用明胶酶谱技术，检测BTDE对HUVECs基质金属蛋白酶活性的影响。
采用Tg(flk1:EGFP)转基因斑马鱼，体内检测BTDE对斑马鱼胚胎背部节间血管生成影响。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明证明了BTDE的体外及体内抗血管生成作用，发现其在体外对HUVECs的迁移，侵袭和血管拟态生成有抑制作用，且能在体内抑制斑马鱼胚胎背部节间血管生成。我们进一步研究还发现了BTDE可以抑制HUVECs基质金属蛋白酶9活性。这些均说明BTDE有良好的抑制血管生成作用，在抗肿瘤血管生成方面具有广泛应用前景。
四、附图说明
图1表明本发明中BTDE的化学结构。
图2表明本发明中BTDE能够在体外抑制HUVECs迁移及侵袭；但不影响HUVECs增殖。
图3表明本发明中BTDE能够在体外抑制HUVECs血管拟态生成，但对HUVECs既存血管无影响。
图4表明本发明中BTDE能够抑制HUVECs基质金属蛋白酶9活性；但不影响AKT，ERK蛋白分子本底及其磷酸化水平表达。
图5表明本发明中BTDE能够在体内抑制斑马鱼胚胎背部节间血管生成。
五、具体实施方式
下面结合附图和试验例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
试验例1
探究了BTDE在体外对人脐静脉内皮细胞HUVECs的增殖，迁移及侵袭影响。
细胞及材料：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：BTDE；MTT；阿霉素；基质胶；DMSO；Transwell小室；0.1％结晶紫染液；33％醋酸。
仪器：CO2培养箱；倒置显微镜；酶标仪；超净工作台。
实验方法MTT法：取处在对数生长期的HUVECs接种到96孔板中，细胞贴壁后实验组加入不同浓度BTDE，对照组加入等比例稀释的DMSO，设置阿霉素为阳性对照。置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养36h。培养结束后在每个孔中加入20μL的MTT溶液，继续置于培养箱中孵育4h。孵育结束后弃掉上清，每孔加入150μL DMSO，置于37℃烘箱中孵育10min后使用酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度，计算细胞活力。
实验方法平板划痕法：取对数生长期HUVECs，每孔1×104个细胞接种于96孔板中，置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养。达到90％融合度后，10μL枪头垂直板底在每孔中央划线，PBS清洗细胞两次后更换含1％FBS培养液，用倒置生物显微镜进行0h拍照(4×)。之后实验组加入不同浓度BTDE，对照组加入等量无菌水，置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养36h后拍照。Image J软件处理图片计算划痕愈合率。
实验方法Transwell migration法：取对数生长期HUVECs，调整细胞密度为1×105个/mL，重悬于含1％FBS，不同浓度BTDE的DMEM中，取100μL体积种于Transwell小室。24孔板内加入500μL含10％FBS，不同浓度BTDE的DMEM。小室轻放于24孔板中避免气泡产生，置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养24h。培养结束后弃去小室内培养液，PBS洗三次，甲醇固定细胞30min。弃去固定液，PBS洗三次，倒扣小室使膜适当风干。0.1％结晶紫染色10min，弃去染液，PBS洗三次，棉签轻柔擦拭小室上表面未迁移细胞，倒置生物显微镜(10×)选随机视野拍照。拍照结束后用33％醋酸脱色，吸取每孔脱色液，酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度。
实验方法Transwell invasion法：Transwell小室铺基质胶(200μg/mL)，37℃培养箱放置1h使其凝为薄层。后续实验步骤同Transwell migration法。
根据图2结果发现，BTDE能够抑制HUVECs迁移和侵袭。2.5-10μM BTDE处理HUVECs细胞36h对HUVECs增殖无影响，但明显抑制其迁移，划痕愈合率分别为67.7，59.1和55.2％。同时，Transwell migration实验也证明了不同浓度BTDE作用24h后，HUVECs迁移受到明显抑制。Transwell invasion实验结果显示，在BTDE作用HUVECs细胞24h后，穿透基质胶侵袭至膜下表面的HUVECs数目降低，说明BTDE抑制HUVECs侵袭，且具有浓度依赖性。以上结果表明，BTDE在2.5-10μM浓度下不影响HUVECs增殖，但抑制HUVECs迁移和侵袭。
试验例2
探究了BTDE对HUVECs细胞血管拟态生成和既存血管影响。
细胞及材料：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：BTDE；基质胶。
仪器：CO2培养箱；倒置显微镜；超净工作台。
实验方法Tube formation实验：取预冷96孔板铺基质胶(10mg/mL)，每孔50μL，于37℃放置45min使其凝固。不同浓度BTDE预先处理HUVECs 24h，每孔1×104个细胞种于铺好胶的96孔板中，置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养20h。倒置生物显微镜(4×)选随机视野拍照，Image J软件分析生成血管总长度。
实验方法既存血管实验：取预冷96孔板铺基质胶(10mg/mL)，每孔50μL，于37℃放置45min使其凝固。HUVECs以每孔1×104个细胞种于铺好胶的96孔板中，置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养8h使管状结构形成，之后给予不同浓度BTDE处理，作用6h后倒置生物显微镜(4×)选随机视野拍照，Image J软件分析生成血管总长度。
根据图3实验结果发现，BTDE明显抑制HUVECs血管拟态生成，但对既存血管无影响。在2.5-10μM浓度下，血管生成总长度相较于对照组为58.1，36.3和4.9％。此外，BTDE对HUVECs既存血管影响实验结果显示，BTDE并不影响HUVECs已经形成的管状结构。以上结果表明BTDE能够体外抑制HUVECs血管拟态生成，但对既存血管无影响。
试验例3
探究了BTDE对HUVECs细胞基质金属蛋白酶活力和AKT、ERK蛋白分子表达的影响。
细胞及材料：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：BTDE；蛋白电泳液；转膜液；1×Loading Buffer；4×上层浓缩胶缓冲液；4×下层分离胶缓冲液；明胶；2.5％Triton X-100；1μM ZnCl2/50mM Tris-HCl；0.05％考马斯亮蓝R250染液；30％甲醇/10％乙酸脱色液；APS；硝酸纤维素膜；蛋白预染Marker；ECL发光试剂盒；
仪器：CO2培养箱；超净工作台；高速冷冻离心机；蛋白电泳仪；摇床；ST-Ⅱ型转移电泳槽；FluorChemE多功能成像分析***；Bio-Red凝胶成像分析***。
实验方法明胶酶谱法：将处在对数生长期的HUVECs细胞，重悬于DMEM，接种在6孔板中(每孔8.5×105个细胞)，并用不同浓度的BTDE处理24h。收集上清，4℃以1200rpm离心5min，之后4℃以12000rpm离心5min，去除上清中细胞及碎片残存，保存于-80℃。贴壁细胞按Western Blot法收集蛋白样品，用以检测内参。在含有1mg/mL明胶的8％SDS-PAGE胶通过电泳分离上清中的蛋白成分。电泳结束后2.5％Triton X-100洗涤蛋白胶，置于1μM ZnCl2/50mM Tris-HCl孵育液中于37℃摇床孵育48h。0.05％考马斯亮蓝R250染液染色30min，利用30％甲醇/10％乙酸脱色液进行脱色，至出现明显负染条带，使用Bio-Red凝胶成像分析***显影拍照。
实验方法Western Blot法：将处在对数生长期的HUVECs细胞接种在6孔板中(每孔1.5×105个细胞)，并用不同浓度的BTDE处理24h。然后收集细胞，PBS洗两次，用1×LoadingBuffer在4℃裂解45min。裂解完成后，煮沸15min，并保存在-20℃。在8％SDS-PAGE胶上通过电泳分离蛋白质样品，并转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。剪切目标条带后，将NC膜用5％脱脂牛奶密封1h，并在4℃下与目的条带的一抗孵育过夜。然后将NC膜与二抗在室温下孵育1h，并通过显影仪进行化学发光检测。
根据图4实验结果发现，BTDE抑制HUVECs细胞基质金属蛋白酶9的活性。基质金属蛋白酶作为一种可降解细胞外基质的蛋白酶，在内皮细胞迁移，侵袭和血管生成中起重要作用。明胶酶谱实验结果发现BTDE能够抑制HUVECs细胞基质金属蛋白酶9的活性。AKT和ERK蛋白分子是调节细胞生长，分化和血管生成的关键信号分子。Western Blot实验结果发现BTDE并不影响HUVECs细胞AKT，ERK蛋白分子本底及其磷酸化水平表达。以上结果说明BTDE抑制HUVECs细胞基质金属蛋白酶9的活性，但对AKT，ERK蛋白分子本底及其磷酸化水平表达无影响。
试验例4
探究了BTDE体内对斑马鱼胚胎背部节间血管生成影响。
细胞及材料：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，购自中国科学院上海细胞库；Tg(flk1:EGFP)转基因斑马鱼胚胎由上海交通大学惠赠，中国海洋大学分子医学生物学实验室保存和传代。
试剂：BTDE；DMSO；三卡因溶液；2％甲基纤维素凝胶
仪器：全自动水循环***；胚胎培养箱；超净工作台；DM6000倒置荧光显微镜。
实验方法斑马鱼胚胎法：取健康性成熟Tg(flk1:EGFP)杂合鱼与野生型鱼置于配鱼盒两侧，等待一段时间后收获胚胎，于胚胎培养箱中28.5℃恒温孵育。观察胚胎发育至16hpf时，挑选发育时期完全相同且健康饱满胚胎，移入24孔培养板中，每孔10枚胚胎。给药组加入不同浓度BTDE，对照组加入等比例稀释DMSO，置于胚胎培养箱中继续培养24h。培养结束后将胚胎吸出放至96孔板，挑选具有血管荧光个体，剥膜，适量三卡因溶液麻醉，放置于2％甲基纤维素凝胶中摆正位置，倒置荧光显微镜下观察拍照，Image J软件处理图片计算各组斑马鱼胚胎背部节间血管长度。
根据图5结果发现，BTDE体内抑制斑马鱼胚胎背部节间血管生成。对照组斑马鱼胚胎背部节间血管均匀纵向排列，完整无缺失；在2.5-10μΜBTDE处理下，背部节间血管均出现明显缺失现象，血管长度相较于对照组为90.1，40.3和31.2％，这说明BTDE能够显著抑制斑马鱼胚胎背部节间血管生成。
Claims (8)
1.双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚及其衍生物在抑制肿瘤新生血管生成中的应用。其化学结构式为：
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤新生血管生成的作用，其特征在于所说的内皮细胞为：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，人脐静脉细胞融合细胞(Ea.hy926)，人微血管内皮细胞(HMEC-1)等。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤新生血管生成方面的应用，其特征在于：所述的双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚可以制作抑制肿瘤新生血管生成的药物。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤新生血管生成方面的应用，其特征在于：所述的双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚可以在体外有效地抑制HUVECs细胞的迁移。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤新生血管生成方面的应用，其特征在于：所述的双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚可以在体外有效地抑制HUVECs细胞的侵袭。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤新生血管生成方面的应用，其特征在于：所述的双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚可以在体外有效地抑制HUVECs细胞的血管拟态生成。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤新生血管生成方面的应用，其特征在于：所述的双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚可以抑制HUVECs细胞基质金属蛋白酶9活性。
8.根据权利要求1所述的抗肿瘤新生血管生成方面的应用，其特征在于：所述的双-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)醚可以在体内抑制斑马鱼胚胎背部节间血管生成。
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