CN115768467A - 用于治疗癌症和感染的针对NKp46的抗体及其构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了以高亲和性和特异性识别人类NKp46并且不阻断NKp46与其天然配体的结合的单克隆抗体。本发明还提供了多特异性抗体、嵌合抗原受体(CAR)及其治疗疾病的用途，特别是恶性肿瘤和感染。

Description

用于治疗癌症和感染的针对NKp46的抗体及其构建体
技术领域
本发明属于免疫治疗领域，并涉及与人类自然杀伤细胞受体NKp46结合的抗体及其片段、编码这些抗体和片段的多核苷酸序列和产生它们的细胞。本发明还涉及这些抗体的多特异性和嵌合的抗原受体构建体，以及所述抗体、它们的片段和构建体在治疗疾病特别是癌症和急性感染中的用途。
背景技术
癌症免疫疗法用于产生并增强抗肿瘤免疫应答，例如通过使用特异性针对肿瘤细胞上的抗原的抗体治疗、使用抗原呈递细胞与肿瘤细胞的融合体治疗或通过抗肿瘤NK或T细胞的特异性激活。在患者中募集针对肿瘤细胞的免疫细胞的能力提供了一种对抗到目前为止被认为不可治愈的癌症类型和转移肿瘤的治疗方式。
自然杀伤(NK)细胞是先天的效应淋巴细胞，其能够在没有预先刺激的情况下杀死肿瘤细胞和被感染的细胞。到目前为止，自然杀伤(NK)细胞已成为对肿瘤转化和病毒、细菌或真菌感染的最关键的第一响应者之一。它们还参与自身免疫疾病例如I型糖尿病和类风湿性关节炎(RA)。由于其大量种系编码的激活和抑制性受体，NK细胞具有识别许多不同靶的独特能力。这些受体接收的信号的平衡最终决定了NK细胞是发挥作用以对抗给定靶细胞还是保持中性。
在NK细胞上发现的三种激活受体NKp30、NKp44和NKp46被合称为自然细胞毒性受体(NCR)。这些受体在NK细胞抗肿瘤和抗病毒防御中是关键的。NKp46已被确定为关键的激活受体，因为它几乎专门由NK细胞表达。它的配体库范围从病毒配体例如流感病毒、仙台病毒、新城疫病毒和痘病毒的血细胞凝集素(HA)和血细胞凝集素-神经氨酸酶(HN)到细菌(例如具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum))、肿瘤、脂肪细胞和人类胰腺β细胞上发现的未知配体。十多年来，已对未知配体、特别是NKp46的肿瘤配体的鉴定进行了深入研究。
美国申请号20180207290公开了抗NKp46抗体、毒素偶联物和它们的治疗性用途。
对提供单独地、作为免疫构建体的一部分或与其他药剂相组合时可以增强免疫***的细胞以攻击肿瘤细胞和/或感染性微生物的其他且更加有效、特异、安全和/或稳定的药剂，仍存在着未满足的需求。
发明内容
本发明在某些实施方式中提供了识别人类NKp46受体并适合用于治疗癌症和病毒性疾病的抗体及其片段。本发明在某些实施方式中还提供了包含本文描述的抗NKp46抗体的结合部位的嵌合抗原受体(CAR)分子以及将它们用于过继性疗法的方法。本发明在某些实施方式中还提供了对NKp46并对肿瘤细胞或感染性微生物上存在的至少一种另外的受体或抗原具有特异性的双特异性和三特异性抗体。
有利情况下，本文描述的抗NKp46抗体特异性针对NKp46近膜端结构域(D2结构域，SEQ ID No：13)，并且不阻断NKp46与其配体的相互作用。这些抗体不内化或降解NKp46受体，因此可用于在各种不同疗法中幕集NK细胞。这些抗体及其片段和构建体的特征在于具有独特的成组CDR序列，它们对人类NKp46具有高特异性和非常高的亲和性。所述抗体可用于癌症免疫疗法，并且也可用于癌症诊断。包含这些独特的成组CDR序列(即这些抗体的结合部位)的构建体，例如双特异性和多特异性抗体，也可用于治疗病毒性病症。
根据一个方面，本发明提供了一种抗体或其至少包含抗原结合部分的抗体片段，其与人类NKp46 D2结构域中的序列特异性结合并且不阻断NKp46与其配体的相互作用，所述抗体对人类NKp46具有至少5x10-9M的亲和性。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段具有至少10-10M的亲和性。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含一组6个CDR序列，其包含SEQ IDNo：7的重链(HC)可变区的三个CDR和包含选自SEQ ID No：8和SEQ ID No：12的序列的轻链(LC)可变区的三个CDR，或其与所述可变区序列具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
在本领域中已知几种用于确定给定抗体分子的CDR序列的方法，但是没有标准的明确方法。从抗体重链和轻链可变区确定CDR序列可以按照本领域中已知的任何方法来进行，包括但不限于被称为KABAT、Chothia和IMGT的方法。选择的一组CDR可以包括通过超过一种方法鉴定的序列，即例如一些CDR序列可以使用KABAT确定，并且另一些CDR可以使用IMGT确定。根据某些实施方式，所述mAb可变区的CDR序列使用IMGT方法来确定。
根据某些实施方式，所述抗体或片段包含被命名为克隆K3的单克隆抗体的CDR序列，即包含在SEQ ID No：7中阐述的重链可变区中的三个CDR序列和包含在SEQ ID No：12中阐述的轻链可变区中的三个CDR序列，或包含被命名为克隆P4的单克隆抗体的CDR序列，即包含在SEQ ID No：7中阐述的重链可变区中的三个CDR序列和包含在SEQ ID No：8中阐述的轻链可变区中的三个CDR序列。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含含有序列EYSMH(SEQ ID No：1)的重链CDR1。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含含有序列GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQID No：2)的重链CDR2。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含序列RDFHSSFDY(SEQID No：3)的重链CDR3。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含：(i)包含序列EYSMH(SEQ ID No：1)的HC CDR1；(ii)包含序列GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)的HC CDR2；和(iii)包含序列RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)的HC CDR3。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含含有序列RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)的轻链CDR1。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含含有序列YASQSIS(SEQ IDNo：5)的轻链CDR2。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含含有序列QNGHSFPLT(SEQID No：6)的轻链CDR3。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含：(i)包含序列RASQSISDYLH(SEQ IDNo：4)的LC CDR1；(ii)包含序列YASQSIS(SEQ ID No：5)的LC CDR2；和(iii)包含序列QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)的HC CDR3。
根据某些特定实施方式，所述抗体或片段包含：包含序列EYSMH(SEQ ID No：1)的重链CDR1序列，包含序列GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)的重链CDR2，包含序列RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)的重链CDR3，包含序列RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)的轻链CDR1，包含序列YASQSIS(SEQ ID No：5)的轻链CDR2，和包含序列QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)的轻链CDR3，或其在高变区(HVR)序列中包含不超过5％的氨基酸替换、缺失和/或***的类似物。
根据某些特定实施方式，所述抗体或片段包含一组6个CDR序列，其由下述序列组成：
i.具有SEQ ID No：1中阐述的序列的重链CDR1；
ii.具有SEQ ID No：2中阐述的序列的重链CDR2；
iii.具有SEQ ID No：3中阐述的序列的重链CDR3；
iv.具有SEQ ID No：4中阐述的序列的轻链CDR1；
v.具有SEQ ID No：5中阐述的序列的轻链CDR2；和
vi.具有SEQ ID No：6中阐述的序列的轻链CDR3。
根据某些实施方式，所述抗体或其片段包含SEQ ID No：7中阐述的重链可变区或其与所述重链可变区序列具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
根据某些实施方式，所述抗体或其片段包含SEQ ID No：8中阐述的轻链可变区或其与所述轻链可变区序列具有至少90％序列同一性的类似物。
根据某些实施方式，所述抗体或其片段包含SEQ ID No：12中阐述的轻链可变区或其与所述轻链可变区序列具有至少90％序列同一性的类似物。
根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID No：7中阐述的序列的重链可变区和具有SEQ ID No：8中阐述的序列的轻链可变区，或其与所述轻链和/或重链序列具有至少90％序列同一性的类似物。
根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID No：7中阐述的序列的重链可变区和具有SEQ ID No：12中阐述的序列的轻链可变区，或其与所述轻链和/或重链序列具有至少90％序列同一性的类似物。
根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID No：7中阐述的序列的重链可变区和具有SEQ ID No：8和SEQ ID No：12中阐述的序列的两个不同轻链可变区，或其与所述轻链和/或重链序列具有至少90％序列同一性的类似物。
根据某些实施方式，所述抗体是分离的单克隆抗体。
根据某些实施方式，所述抗体或其片段以至少5x10-9M的亲和性识别人类NKp46。根据其他实施方式，所述抗体或抗体片段以至少10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、10- 12M、10-13M或甚至更高的亲和性与人类NKp46结合。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段以10-9M至10-14M范围内的亲和性与人类NKp46结合。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段以10-9M至10-10M范围内的亲和性与人类NKp46结合。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段以10-10M至10-11M范围内的亲和性与人类NKp46结合。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段以10-11M至10-16M范围内的亲和性与人类NKp46结合。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段以高于10-11M的亲和性与人类NKp46结合。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段以高于10-12M的亲和性与人类NKp46结合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述抗体或其片段以至少5x10-11M的亲和性识别人类NKp46的D2结构域(SEQ ID No：13)。根据某些实施方式，所述抗体或其片段以至少5x10-13M的亲和性识别人类NKp46的D2结构域。根据某些实施方式，所述抗体或其片段以至少5x10-14M的亲和性识别人类NKp46的D2结构域。根据某些实施方式，所述抗体或其片段以至少5x10-15M的亲和性识别人类NKp46的D2结构域。根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段以10-13M至10-16M范围内的亲和性识别人类NKp46的D2结构域。
上述分离的抗体和片段的类似物和衍生物也在本发明的范围之内。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段类似物与所述参比抗体序列的高变区具有至少90％序列同一性。
根据某些实施方式，所述分离的抗体或其片段的类似物或衍生物与所述参比抗体序列的可变区具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，根据本发明的抗体或抗体片段包含SEQ IDNo：7中阐述的重链可变区或与所述序列具有至少95％序列相似性的类似物。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含SEQ ID No：8和/或SEQ ID No：12中阐述的轻链可变区或与所述序列具有至少95％序列相似性的类似物。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQID No：7并且所述轻链包含SEQ ID No：8或SEQ ID No：12。也包括所述抗体或片段的类似物，其与所述重链或轻链具有至少95％序列相似性。
根据某些实施方式，所述类似物与上述抗体轻链或重链可变区具有至少96、97、98或99％序列相似性或同一性。根据某些实施方式，所述类似物包含对所述高变区的一个或多个CDR序列、即SEQ ID Nos：1、2、3、4、5和6中阐述的CDR序列中的任一者的不超过一个氨基酸替换、缺失或添加。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据某些实施方式，所述氨基酸替换是保守替换。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含具有上文定义的轻链和重链区的高变区(HVR)，其中1、2、3、4或5个氨基酸被替换、缺失和/或添加。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含具有上文定义的轻链和重链区的HVR，其中一个氨基酸被替换。根据特定实施方式，所述抗体或抗体片段包含如上所定义的CDR，其中一个氨基酸被替换。
根据特定实施方式，所述抗体选自嵌合抗体和至少包含抗体的抗原结合部分的抗体片段。根据特定实施方式，所述抗体是嵌合抗体。根据其他实施方式，所述嵌合抗体包含人类恒定区。根据特定实施方式，所述抗体片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、dAb、分离的CDR区、单链可变区(scFV)、单链抗体(scab)、“双链抗体”和“线性抗体”。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述抗体或抗体片段包含选自下述的恒定区：小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3和人类IgG4。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些特定实施方式，所述单克隆抗体是嵌合单克隆抗体。
根据某些实施方式，所述嵌合抗体包含源自于人类的恒定区。
根据某些实施方式，所述嵌合抗体的人类恒定区选自人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3和人类IgG4。
根据某些实施方式，所述嵌合抗体的人类恒定区选自人类IgG1和人类IgG2。
本发明还提供了包含本文描述的任何mAb的一组6个CDR的人源化mAb。
根据某些实施方式，所述人源化抗体或抗体片段包含一组6个CDR，其中：重链CDR1序列包含序列EYSMH(SEQ ID No：1)，重链CDR2包含序列GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)，重链CDR3包含序列RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)，轻链CDR1包含序列RASQSISDYLH(SEQ IDNo：4)，轻链CDR2包含序列YASQSIS(SEQ ID No：5)，并且轻链CDR3包含序列QNGHSFPLT(SEQID No：6)，或其在高变区(HVR)序列中包含不超过5％的氨基酸替换、缺失和/或***的类似物。
根据某些实施方式，所述人源化抗体或抗体片段包含由下述组成的一组6个CDR序列：
i.具有SEQ ID No：1中阐述的序列的重链CDR1；
ii.具有SEQ ID No：2中阐述的序列的重链CDR2；
iii.具有SEQ ID No：3中阐述的序列的重链CDR3；
iv.具有SEQ ID No：4中阐述的序列的轻链CDR1；
v.具有SEQ ID No：5中阐述的序列的轻链CDR2；和
vi.具有SEQ ID No：6中阐述的序列的轻链CDR3。
根据某些实施方式，所述人源化抗体包含重链可变区序列SEQ IDNo：14或其与所述重链可变区序列具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
根据某些实施方式，所述人源化抗体包含选自SEQ ID No：15和SEQ ID No：16的轻链可变区序列或其与所述轻链可变区序列具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
根据某些实施方式，所述人源化抗体包含一组重链和轻链，其中所述组选自：
i.SEQ NOs：14和15；和
ii.SEQ NOs：14和16。
根据某些实施方式，提供了一种包含本文由6个CDR序列所描述的抗体或其抗体片段的偶联物。
根据本发明的抗体或其片段可以被附连到放射活性组成部分或可鉴定组成部分。
根据本发明的另一方面，提供了编码对人类NKp46具有高亲和性和特异性的抗体的多核苷酸序列，以及携带这些多核苷酸序列的载体和宿主细胞。
根据某些实施方式，提供了编码上文定义的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的多核苷酸序列。
根据某些实施方式，所述多核苷酸序列编码能够与人类NKp46蛋白中与下述抗体结合的表位结合的抗体或抗体片段或链：(i)具有SEQ ID No：7的重链可变区和SEQ ID No：8的轻链可变区的抗体(在本文中被称为克隆P4)；或(ii)具有SEQ ID No：7的重链可变区和SEQ ID No：8和/或SEQ ID No：12的轻链可变区的抗体(在本文中被称为克隆K3)。
根据某些实施方式，所述多核苷酸序列编码包含在选自下述的序列中阐述的序列的抗体或抗体片段或链：(i)SEQ ID No：7和SEQ IDNo：8；和(ii)SEQ ID No：7和SEQ ID No：12。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据其他一些实施方式，根据本发明的多核苷酸序列编码包含一组6个CDR的抗体或其抗体片段或链，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，上文定义的多核苷酸序列编码至少一个至少包含抗原结合部分的抗体链或抗体片段。
根据某些实施方式，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID No：7中阐述的序列的单克隆抗体重链可变区或其具有至少90％序列同一性的变体。
根据某些实施方式，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID No：8中阐述的序列的单克隆抗体轻链可变区或其具有至少90％序列同一性的变体。
根据某些实施方式，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID No：12中阐述的序列的单克隆抗体轻链可变区或其具有至少90％序列同一性的变体。
根据某些实施方式，所述抗体是具有两个不同轻链的单克隆抗体。根据某些实施方式，所述抗体是具有SEQ ID No：8和SEQ ID No：12中阐述的轻链的单克隆抗体。
根据某些实施方式，本发明提供了一种多肽，其包含由上文公开的至少一个多核苷酸序列编码的至少一个序列。
另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含编码根据本发明的至少一个抗体链或其片段的核酸分子。根据某些实施方式，所述核酸构建体是质粒。
根据某些实施方式，所述质粒包含在选自SEQ ID No：9、SEQ IDNo：10和SEQ IDNo：11的序列中阐述的至少一个多核苷酸序列。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
另一方面，本发明提供了一种细胞，其能够产生包含上文定义的特定CDR序列和/或特定重链和轻链可变区的抗体或抗体片段。
根据某些实施方式，提供了一种细胞，其包含至少一个上文所公开的多核苷酸序列。
根据某些实施方式，所述产生单克隆抗体的细胞是杂交瘤细胞。
根据一个方面，本发明提供了一种多特异性结合分子，其包含本文所描述的抗体或抗体片段的结合部位。
根据某些实施方式，所述多特异性分子包含含有1组6个CDR的结合部位，其中：HCCDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，所述多特异性分子还包含针对NKp46衔接分子的不同结合部位。根据某些实施方式，所述多特异性分子还包含针对NK细胞衔接分子的结合部位。根据某些实施方式，所述多特异性结合分子还包含特异性针对其他NK衔接物CD160或CD16的结合部位。
根据某些实施方式，所述多特异性结合分子还包含特异性针对肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原的结合部位。
根据某些实施方式，所述多特异性结合分子还包含特异性针对肿瘤抗原的结合部位。根据特定实施方式，多特异性结合分子还包含特异性针对包含但不限于PDL-1、CD38、BCMA或GPC3的血液或实体肿瘤的结合部位。
根据其他实施方式，所述多特异性结合分子还包含特异性针对病毒抗原的结合部位。根据特定实施方式，所述多特异性结合分子还包含特异性针对刺突蛋白1的结合部位。根据特定实施方式，所述多特异性结合分子还包含特异性针对ACE2的结合部位。
根据某些实施方式，所述真菌抗原选自Epa1、Epa6和Epa7。
根据某些实施方式，所述多特异性结合分子与细胞因子融合或偶联。根据特定实施方式，所述多特异性结合分子与选自IL-2、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFN-α、TNF-α、GM-CSF、TGF-β和VEGF的细胞因子融合或偶联。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述多特异性分子是双特异性抗体，其包含含有一组6个CDR的结合部位，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ IDNo：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LCCDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，所述双特异性抗体还包含特异性针对肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原的结合部位。
根据某些实施方式，所述双特异性抗体还包含特异性针对病毒抗原的结合部位。根据某些实施方式，所述病毒抗原是选自冠状病毒、流感病毒、人类偏肺病毒(HMPV)、人类巨细胞病毒(HCMV)、仙台病毒、新城疫病毒和痘病毒的病毒的抗原。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述病毒是哺乳动物或禽类病毒。
根据某些特定实施方式，所述哺乳动物病毒是人类病毒。
根据某些实施方式，所述冠状病毒选自SARS和MERS病毒。根据特定实施方式，所述冠状病毒是SARS-CoV-2(COVID-19)。
根据某些特定实施方式，所述哺乳动物流感病毒选自人类流感病毒和猪流感病毒。
根据某些实施方式，所述多特异性分子是三特异性抗体，其还包含针对NKp46衔接分子的结合部位。根据某些实施方式，所述多特异性分子是三特异性抗体，其还包含针对NK衔接物的结合部位。根据某些实施方式，所述多特异性分子是三特异性抗体，其还包含针对CD160或CD16的结合部位。
根据某些实施方式，所述多特异性分子是三特异性抗体，其还包含针对肿瘤、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原的结合部位。
根据某些实施方式，所述三特异性抗体与细胞因子融合。根据特定实施方式，所述三特异性抗体与IL15融合。
根据特定实施方式，所述三特异性结合分子包含下述抗体或片段的结合部位：(i)本文所描述的抗体或抗体片段；(ii)特异性针对CD160或CD16的抗体或其片段；和(iii)特异性针对肿瘤抗原的抗体或其片段。
根据某些实施方式，所述多特异性结合分子是多肽或多肽的多聚体。根据某些实施方式，每个多肽独立地选自单特异性、双特异性和三特异性多肽。
根据某些实施方式，所述三特异性结合分子由一个或多个scFv分子组成或包含一个或多个scFv分子。
根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种以高亲和性和特异性识别人类NKp46 D2结构域的抗体或其抗体片段作为活性成分，以及任选的至少一种可药用赋形剂、稀释剂、盐或载体，其中所述至少一种抗体或抗体片段不阻断NKp46与其配体的相互作用。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含至少一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含含有序列No：7中阐述的重链可变区的抗体或其片段。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含抗体或其片段，所述抗体或其片段包含具有选自SEQ ID No：8、SEQ ID No：12和两者的序列的轻链可变区。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据特定实施方式，所述药物组合物包含抗体或其片段，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID No：7中阐述的序列的重链可变区和具有SEQ ID No：8或SEQ ID No：12中阐述的序列的轻链可变区。
还提供了本发明的抗体的单链可变区(scFv)分子。所述scFv分子包含表达在一条多肽链中的所述抗体的抗原结合部位。根据某些实施方式，本发明提供了包含抗NKp46抗体的重链和轻链可变区的scFv分子。根据某些实施方式，所述scFv包含在两个可变区之间的铰链区。
根据某些实施方式，所述scFv包含NKp46结合部位，其包含一组6个CDR，其中：HCCDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，所述scFv包含SEQ ID No：14中阐述的序列或其具有至少90％序列同一性的变体。
根据某些实施方式，所述scFv包含SEQ ID No：15中阐述的序列或其具有至少90％序列同一性的变体。
根据某些实施方式，所述scFv包含SEQ ID No：16中阐述的序列或其具有至少90％序列同一性的变体。
根据某些实施方式，所述scFv包含SEQ ID No：14和SEQ ID No：15中阐述的序列。
根据某些实施方式，所述scFv包含SEQ ID No：14和SEQ ID No：16中阐述的序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含能够与NKp46结合的细胞外部分(结合结构域)，所述CAR包含含有本文中描述的任何所提供的抗体或其片段的细胞外部分。
根据某些实施方式，所述CAR包含NKp46结合部位，其包含一组6个CDR，其中：HCCDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，所述CAR包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LCCDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)；以及跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。
根据某些实施方式，提供了一种被工程化改造以表达本文描述的CAR的淋巴细胞。
根据某些实施方式，提供了一种被工程化改造以表达本文描述的CAR的T细胞，并被称为CAR-T。根据某些实施方式，提供了一种被工程化改造以表达本文描述的CAR的NK细胞，并被称为CAR-NK。
根据某些实施方式，提供了一种被工程化改造以表达本文描述的CAR的淋巴细胞的群体。根据特定实施方式，提供了一种被工程化改造以表达本文描述的CAR的T-细胞或NK-细胞的群体。
根据某些实施方式，所述CAR包含单链可变区(scFv)，其包含本文描述的抗体的重链和轻链可变区。
根据某些实施方式，所述CAR包含选自scFv序列、CD8茎结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3ζ(CD3Z，Zetta)结构域的至少一个蛋白质结构域。根据某些实施方式，所述CAR包含scFv结构域。
根据某些实施方式，所述CAR包含scFv序列，其包含本文公开的抗体的NKp46结合部位，和选自下述的至少一个结构域：CD8茎结构域，CD28 TM结构域，41BB结构域和CD3Z结构域。
根据一个方面，本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种包含本文描述的CAR的淋巴细胞。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含至少一种本文描述的抗体或其抗体片段、CAR或多特异性抗体。
根据某些实施方式，根据本发明的药物组合物用于癌症免疫疗法或用于增强针对病毒感染的免疫应答。
根据本发明的某些实施方式，所述癌症是转移癌症。根据某些实施方式，根据本发明的药物组合物用于在受试者中抑制转移肿瘤的形成或分布或减少转移肿瘤的总数。
根据本发明的某些实施方式，所述癌症选自白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、***、肾癌、肺癌、甲状腺癌、***癌、脑癌、肾癌、喉癌、咽喉癌、膀胱癌、肝癌、纤维肉瘤、子宫内膜细胞癌、胶质母细胞瘤、肉瘤和髓系肿瘤。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，实体肿瘤通过CAR-T或CAR-NK来治疗。根据特定实施方式，实体肿瘤通过CAR-T来治疗。根据其他实施方式，血液癌使用CAR-NK或CAR-T细胞来治疗。根据特定实施方式，血液癌使用CAR-NK细胞来治疗。
根据某些实施方式，所述癌症选自黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肺癌、***癌和脑癌。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据其他实施方式，所述癌症是血液癌。根据某些实施方式，所述药物组合物与人类淋巴细胞一起用于治疗癌症。
根据某些实施方式，所述人类淋巴细胞是选自T细胞、NK细胞和NKT细胞的杀伤细胞。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述杀伤细胞是自体或同种异体的。
根据又一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本文描述的抗体或其抗体片段、CAR或多特异性抗体。
所述癌症如上文所述。
根据本发明的某些实施方式，所述治疗有效量导致所述受试者中肿瘤尺寸或转移肿瘤数目的减小。
根据某些实施方式，所述治疗癌症的方法包括施用或进行至少一种另外的抗癌疗法。根据某些实施方式，所述另外的抗癌疗法是手术、化疗、放疗或免疫疗法。
根据某些实施方式，所述治疗癌症的方法包括施用至少一种本文描述的抗体、其抗体片段、三特异性结合分子、CAR或双特异性抗体和另外的抗癌药剂。根据某些实施方式，所述另外的抗癌药剂选自免疫调节剂、活化的淋巴细胞、激酶抑制剂和化学治疗剂。
根据其他实施方式，所述免疫调节剂是与人类NKp46之外的抗原结合的抗体、抗体片段或抗体偶联物。
根据某些实施方式，所述免疫调节剂是针对免疫检查点分子的抗体。根据某些实施方式，所述另外的免疫调节剂是针对选自下述免疫检查点分子的抗体：人类程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PD-L1和PD-L2、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、CD137、OX40(也被称为CD134)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、TIGIT、PVR、CTLA-4、NKG2A、GITR和任何其他检查点分子或其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据某些实施方式，所述另外的免疫调节剂是针对PD-1的抗体。根据某些实施方式，所述另外的免疫调节剂是针对CTLA-4的抗体。
根据某些实施方式，所述抗癌药剂选自：爱必妥、阿糖胞苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、吉西他滨、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、卡莫司汀、洛莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺铂、卡铂、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、噻替派、达卡巴嗪、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、依托泊苷、替尼泊苷，及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述抗癌药剂是表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。根据某些实施方式，所述EGFR抑制剂选自西妥昔单抗
Figure BDA0003981278470000171
帕尼单抗
Figure BDA0003981278470000172
和耐昔妥珠单抗
Figure BDA0003981278470000173
每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据本发明的某些实施方式，所述受试者是人类受试者。
根据本发明的某些实施方式，所述用途还包括使用下调免疫共抑制受体的活性或表达的药剂。
根据本发明的某些实施方式，所述免疫共抑制受体选自PD-1、TIGIT、PVR、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA、VISTA、B7H4、CD96、BY55(CD 160)、LAIR1、SIGLEC10和2B4。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述治疗癌症的方法包括在受试者能够预防或减少转移肿瘤的形成、生长或扩散。
根据另一方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本文描述的抗体、其抗体片段、多特异性结合分子或CAR。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述感染选自病毒感染、细菌感染和真菌感染。
根据某些实施方式，所述病毒感染是选自冠状病毒、流感病毒、人类偏肺病毒(HMPV)、人类巨细胞病毒(HCMV)、仙台病毒、新城疫病毒和痘病毒的病毒的感染。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述病毒感染由哺乳动物或禽类病毒引起。
根据某些特定实施方式，所述哺乳动物病毒是人类病毒。
根据某些实施方式，所述冠状病毒选自SARS、MERS和COVID-19。
根据某些特定实施方式，所述哺乳动物流感病毒选自人类流感病毒和猪流感病毒。
根据一个方面，本发明提供了一种在受试者中诊断或预后癌症的方法，所述方法包括使用本文描述的至少一种抗体确定所述受试者的生物样品中NKp46的表达水平。
根据另一方面，本发明还包括一种确定或定量样品中的NKp46的方法，所述方法包括将生物样品与抗体或抗体片段接触并测量复合物形成的水平，其中所述抗体或抗体片段包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，所述抗体包含一组重链和轻链，其中所述组选自：
i.SEQ NOs：14和15；和
ii.SEQ NOs：14和16。
根据某些实施方式，确定和定量方法可以体外或离体进行，或者可用于诊断与NKp46的表达相关的病症。根据本发明所述的抗体也可用于配置筛选方法。例如，可以构建酶联免疫吸附测定法(ELISA)或放射免疫测定法(RIA)以及诸如IHC或FACS的方法，使用所述抗体和本领域中已知的方法测量分泌的或细胞结合的多肽的水平。
根据某些实施方式，所述用于检测或定量细胞上表达的或分泌到生物培养基中的NKp46的存在的方法包括下述步骤：
i.将样品与本文描述的特异性针对人类NKp46的抗体或其至少包含抗原结合部分的抗体片段温育；并且
ii.使用可检测探针检测结合的NKp46。
根据某些实施方式，所述方法还包括下述步骤：
iii.将(ii)的量与从含有已知量的NKp46的参比样品获得的标准曲线进行比较；和
iv.从所述标准曲线计算所述样品中NKp46的量。
根据某些特定实施方式，所述样品是体液。
根据某些实施方式，所述方法在体外或离体进行。
根据某些实施方式，所述用于检测或诊断的抗体或抗体片段包含一组6个CDR，其中：重链CDR1序列包含序列EYSMH(SEQ ID No：1)，重链CDR2包含序列GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)，重链CDR3包含序列RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)，轻链CDR1包含序列RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)，轻链CDR2包含序列YASQSIS(SEQ ID No：5)，并且轻链CDR3包含序列QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
还提供了一种用于测量生物样品中NKp46的表达或存在的试剂盒，其包含根据本发明所述的至少一种抗体或抗体片段。根据某些实施方式，所述试剂盒包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据一个方面，本发明提供了一种用于癌症诊断或分期的试剂盒，所述诊断试剂盒包含本文中所公开的抗体或其抗体片段。
从后文中给出的详细描述，本发明的其他实施方式和完整适用性范围将变得显而易见。然而，应该理解，所述详细描述和具体实施例尽管指明了本发明的优选实施方式，但仅仅作为说明提供，因为对于本领域技术人员来说，从该详细描述，本发明的精神和范围之内的各种不同改变和修改将变得显而易见。
附图说明
图1.抗NKp46 mAb结合部位的鉴定。所述图示出了抗NKp46 mAb(商品化抗NKp46抗体(9E2)、461-G1、02、K3和P4)与NKp46 D1结构域(D1-Ig)、NKp46 D2结构域(D2-Ig)或完整NKp46蛋白-Ig(46-Ig)的结合。
图2.来自于NK细胞表面的NKp46的下调。将活化的大量NK细胞培养物与所指示的抗NKp46 mAb(9E2、461-G1、02、K3、P4)在4℃(黑色柱状图)或37℃(红色柱状图)温育8小时，然后使用第二抗体(抗m647抗体)进行FACS染色。实心灰色柱状图代表在4℃处理的细胞仅用第二抗体的染色。在37℃处理的细胞的背景相近(未示出)。所述图示出了进行的5个实验中的一个代表性实验。
图3.抗体的剂量响应。来自于两位供体NK1和NK2的原代活化大量人类NK细胞使用抗NKp46 mAb(9E2、461-G1、K3、P4)的FACS染色(彩色柱状图)。实心灰色柱状图代表仅用第二抗体染色的NK细胞。全灰色柱＝仅仅第二抗体(m-647)。呈现了不同抗体浓度(0.5μg、0.1μg、0.05μg、0.01μg、0.005μg、0.001μg、0.005μg或0.0001μg/孔)的结果(浓度越高，染色越强)。
图4A-4B.具有突变的IgG4的人源化P4(图4A)和K3(图4B)抗体与NKp46的亲和性(nM)。
图5A-5D.示出了NKp46抗体P4和K3以及人源化NKp46抗体与NKp46 D2结构域的结合亲和性。NKp46、D1结构域和D2结构域的结构分别呈现在图5A-5C中。与D2结构域的亲和性值(Kd(M))呈现在图5D中。
发明详述
本发明提供了对人类NKp46具有高亲和性和特异性的抗体。本发明还提供了包含本文描述的抗体的结合部位的多特异性结合分子和包含所述新抗体的结合部位的嵌合抗原受体(CAR)。所述抗体本身不影响带有NKp46的免疫细胞，因此可以作为构建体或多特异性分子的一部分用于将所述免疫细胞幕集到特定靶例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
当在本文中使用时，术语“NKp46”是指自然杀伤蛋白46，也被称为自然细胞毒性触发受体1(NCR1)或CD335。NKp46具有两个Ig样细胞外结构域(D1和D2)，然后是～40个残基的茎区、I类跨膜结构域和短的胞质尾区。NKp46是一种重要的NK细胞活化受体，其参与HCV和其他病毒感染的细胞的消除，并且已显示调节NK细胞与包括T细胞和树突状细胞(DC)在内的其他免疫细胞的相互作用。根据本发明所述的示例性NKp46阐述在UniPort和GenBank符号或登记号UniProtKB-O76036(NCTR1_HUMAN)和Gene ID：9437中。NKp46具有两个Ig样细胞外结构域(D1和D2)，然后是～40个残基的茎区、I类跨膜结构域和短的胞质尾区。D2结构域(或NKp46D2)包含134个氨基酸残基(对应于同型a的全长蛋白的第121-254位残基)。人类D2结构域序列的实例可以在SEQ ID No：13中找到。
根据本发明的抗体或其片段与NKp46中的表位结合。具体来说，所述抗体与NKp46蛋白的D2结构域内的表位结合。
术语“抗体”以最宽泛的意义使用，并包括单克隆抗体(包括全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体和长得足以表现出所需生物活性即与人类NKp46结合的抗体片段。
当在本文中使用时，术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原分子的与特定抗体特异性反应的区域。应用本领域中已知的方法，源自于表位的肽序列可以单独地或与载体部分联合，用于免疫动物并产生另外的多克隆或单克隆抗体。源自于表位的分离的肽可用于诊断方法中以检测抗体。
应该指出，抗体的亲和性可以使用已知方法定量，例如表面等离子体共振(SPR)(描述在Scarano S,Mascini M,Turner AP,Minunni M.，用于基于亲和性的生物传感器的表面等离子体共振成像(Surface plasmon resonance imaging for affinity-basedbiosensors)，Biosens Bioelectron.2010,25:957-66中)，并且可以使用例如解离常数Kd来计算，使得较低的Kd反映出较高的亲和性。除非另有指明，否则本公开中用于“亲和性”的任何数值均为解离常数。
当在本文中使用时，术语“抗体”可以是指包括一个或多个免疫球蛋白样抗原结合结构域的任何多肽或多肽复合物。术语“抗体”可以包括完整抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体(mAb)、多特异性抗体及其蛋白水解片段例如Fab或F(ab')2片段、单链抗体及其复合物。
免疫球蛋白包含通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链，每条轻链通过二硫键以“Y”形构型连接到相应的重链。抗体的蛋白水解消化成Fv(可变片段)和Fc(可结晶片段)结构域。抗原结合结构域Fab包括其中多肽序列变化的区域。术语F(ab')2表示通过二硫键连接在一起的两个Fab'臂。每条重链在一个末端处具有可变结构域(VH)，后面跟有多个恒定结构域(CH)。每条轻链在一个末端处具有可变结构域(VL)并在其另一个末端处具有恒定结构域(CL)，所述轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐，并且所述轻链恒定结构域与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。每对轻链和重链的可变结构域形成抗原结合部位。轻链和重链上的结构域具有相同的总体结构，并且每个结构域包含四个序列相对保守的框架区，其通过三个被称为互补决定区(CDR 1-3)的高变结构域相连。这些结构域对所述抗原结合部位的特异性和亲和性有贡献。
来自于给定重链或轻链可变序列的CDR的鉴定或确定，通常使用本领域中已知的几种方法之一来进行。例如，这种确定按照Kabat(Wu T.T和Kabat E.A.,JExp Med,1970；132:211–50)和IMGT(Lefranc M-P等，Dev Comp Immunol,2003,27:55-77)来进行。
当使用术语“具有某个序列的CDR”或类似术语时，它包括其中所述CDR包含所述指定的序列的选项以及其中所述CDR由所述指定的序列组成的选项。
抗体的抗原特异性是基于高变区(HVR)，即轻链和重链两者的一起形成抗原结合部位的独特CDR序列。
重链的同型(γ、α、δ、ε或μ)决定免疫球蛋白类别(分别为IgG、IgA、IgD、IgE或IgM)。轻链具有两种同型(κ或λ)。两种同型存在于所有抗体类别中。
本发明还提供了包含人类来源的恒定区的嵌合抗体和特异性针对人类NKp46的人源化抗体。有利的是，人源化抗体避免了针对所述抗体的不利免疫应答的风险，因此对于在人类中的体内使用来说是安全的。
抗体片段
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，通常包括所述完整抗体的抗原结合部位，并因此保留结合抗原的能力。本定义涵盖的抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab'片段，其是在CH1结构域的C-端处具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域并且在CH1结构域的C-端处具有一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段；(v)具有抗体的单一臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)由VH结构域构成的dAb片段(Ward等，Nature 1989,341,544-546)；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，其是包括在铰链区通过二硫桥相连的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird等，Science 1988,242,423-426；和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)1988,85,5879-5883)；(x)具有两个抗原结合部位的“双链抗体”，其包含在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)(参见例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90,6444-6448)；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，所述区段与互补的轻链多肽一起，形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng.,1995,8,1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
已开发了用于生产抗体片段的各种不同技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化产生(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)和Brennan等，Science,229:81(1985))。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。例如，所述抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离。或者，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌回收并化学偶联，以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab')2片段可以从重组宿主细胞培养物直接分离。用于生产抗体片段的其他技术对于专业技术人员来说将是显而易见的。在其他实施方式中，所述选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。
单链抗体可以是具有抗原结合能力并包含与免疫球蛋白轻链和重链的可变区同源或类似的氨基酸序列的单链复合多肽，即连接的VH-VL或单链Fv(scFv)。用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可以改编以适用于生产针对NKp46的单链抗体。
当在本文中使用时，术语“单克隆抗体”(mAb)是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即构成所述群体的各个抗体除了可能少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对所述抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。mAb可以通过本领域技术人员已知的方法获得。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等，Nature 1975,256,495描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。单克隆抗体也可以使用例如在Clackson等，Nature 1991,352,624-628或Marks等，J.Mol.Biol.,1991,222:581-597中描述的技术，从噬菌体抗体文库来分离。
通过功能性可变重链(VH)和可变轻链(VL)基因的快速鉴定和克隆来设计和开发源自于单克隆抗体的重组单价抗原结合分子以及被优化以用于在重组细菌中表达的合成DNA序列的设计和克隆，描述在Fields等，2013,8(6):1125-48中。
本发明的mAb可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD的任何免疫球蛋白类别。生产mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。mAb的高滴度可以通过体内生产来获得，其中将来自于个体杂交瘤的细胞腹膜内注射到原始初免的Balb/c小鼠中，以产生含有高浓度所需mAb的腹水。mAb可以使用本领域技术人员公知的方法从这些腹水或从培养上清液纯化。
也考虑到了与本发明抗体的高变区具有特异性免疫反应性的抗独特型抗体。
本发明提供了一种包含抗原结合结构域(ABD)的单克隆抗体或抗体片段，所述抗原结合结构域包含轻链的三个CDR和重链的三个CDR，其中所述ABD与包含下述链的单克隆小鼠抗体的ABD具有至少90％的序列同一性或相似性：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链和包含氨基酸序列SEQ ID No：8和/或SEQ ID No：12的可变轻链。这种抗体可以具有与抗体克隆K3或克隆P4的相应ABD具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96、至少97、至少98、至少99％序列同一性或相似性或100％序列同一性的ABD结构域。
序列同一性是两个不同序列之间精确匹配的氨基酸或核苷酸的量。序列相似性允许将氨基酸的保守替换确定为相同的氨基酸。本文描述的多核苷酸序列可以被密码子优化，以在特定细胞例如人类细胞中表达。密码子优化不改变抗体链的编码氨基酸序列，但可以例如提高在细胞中的表达。
本发明还提供了根据本发明所述的抗体分子的保守氨基酸变体。根据本发明所述的变体也可以制备成保留所编码蛋白质的总体分子结构。鉴于构成所公开的蛋白质产物的各个氨基酸的性质，专业技术人员将会认识到一些合理的替换。氨基酸替换即“保守替换”，可以例如在所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性方面的相似性的基础上做出。当在本文中使用时，术语“抗体类似物”是指从另一个抗体通过一个或多个保守氨基酸替换衍生的抗体。
当在本文中使用时，术语“抗体变体”是指包含本发明的抗体的任何分子。例如，其中所述抗体或其抗原结合片段与另一个化学实体连接的融合蛋白被认为是抗体变体。
所述抗体序列的类似物和变体也在本申请的范围之内。这些包括但不限于所述序列内氨基酸的保守和非保守替换、***和缺失。这种修饰和得到的抗体类似物或变体在本发明的范围之内，只要它们提供或甚至提高所述抗体与人类NKp46的结合即可。
本领域技术人员已知的氨基酸的保守替换在本发明的范围之内。保守氨基酸替换包括将一个氨基酸用具有相同类型的官能团或侧链(例如脂族、芳香族、带正电荷、带负电荷)的另一个氨基酸取代。这些替换可能增强口服生物可利用性、穿透性和向特定细胞群体的靶向、免疫原性等。专业技术人员将会认识到，对肽、多肽或蛋白质序列做出的改变、添加或缺失所述编码序列中的单个氨基酸或小比例氨基酸的各个替换、缺失或添加，在所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸替换的情况下，是“保守修饰的变体”。提供功能上相似的氨基酸的保守替换表在本领域中是公知的。例如，根据本领域中已知的一个表，下面的6个组各自含有彼此为保守替换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
应该强调的是，使用特异性引物通过测序方法来确定所述变体链序列。对同一序列使用不同的测序方法，由于技术问题和不同的引物，可能产生略微不同的序列，特别是在序列末端中。
当在本文中使用时，术语“具有抗体的抗原结合部分的分子”和“抗原结合片段”旨在不仅包括任何同型和通过任何动物细胞系或微生物产生的完整的免疫球蛋白分子，而且包括其抗原结合反应性部分，包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、其重链和/或轻链的可变部分、Fab微型抗体(参见例如WO 93/15210、美国专利申请08/256,790、WO 96/13583、美国专利申请08/817,788、WO 96/37621、美国专利申请08/999,554)和并入这种反应性部分的单链抗体，以及其中已物理***有这种抗体反应性部分的任何其他类型的分子。这种分子可以通过任何已知的技术包括但不限于酶切割、肽合成或重组技术来提供。
本文中的抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自于另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这种“嵌合”抗体的片段，只要它们表现出所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。此外，可以进行互补决定区(CDR)移植以改变抗体分子的某些性质，包括亲和性或特异性。CDR移植的非限制性实例公开在美国专利5,225,539中。
嵌合抗体是其不同部分源自于不同动物物种的分子，例如那些具有源自于鼠类mAb的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的分子。具有基本上来自于人类抗体(被称为受体抗体)的可变区框架残基和基本上来自于小鼠抗体(被称为供体抗体)的CDR的抗体，也被称为人源化抗体。嵌合抗体主要用于在应用中降低免疫原性和在生产中提高产率，例如在鼠类mAb具有从杂交瘤生产的更高产率但在人类中具有更高的免疫原性的情况下，使用人类/鼠类嵌合mAb。嵌合抗体和它们的生产方法在本领域中是已知的(例如PCT专利申请WO 86/01533、WO97/02671、WO 90/07861、WO 92/22653和美国专利5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101和5,225,539)。
根据某些实施方式，所述抗体是单克隆抗体。
根据某些特定实施方式，所述单克隆抗体是嵌合单克隆抗体。
根据某些实施方式，所述嵌合抗体包含源自于人类的恒定区。
根据某些实施方式，所述嵌合抗体的人类恒定区选自人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3和人类IgG4。
根据某些实施方式，所述嵌合抗体的人类恒定区选自人类IgG1和人类IgG2。
根据特定实施方式，提供了一种识别人类NKp46的嵌合单克隆抗体，其包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，所述抗体是人源化抗体。
“人源化”抗体是其中所有或基本上所有的CDR氨基酸残基源自于非人类CDR，并且所有或基本上所有的FR氨基酸残基源自于人类FR的抗体。人源化抗体任选地可以包括至少一部分源自于人类抗体的抗体恒定区。非人类抗体的“人源化形式”是指非人类抗体的已经历人源化的变体，通常降低了对人类的免疫原性，同时保留了亲本非人类抗体的特异性和亲和性。根据某些实施方式，人源化抗体中的某些FR残基被来自于非人类抗体(例如CDR残基所源自的抗体)的相应残基替换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和性。
“人类抗体”是氨基酸序列对应于由人类或人类细胞或利用人类抗体库或其他编码人类抗体的序列(包括人类抗体文库)的非人类来源产生的抗体的氨基酸序列的抗体。所述术语不包括包含非人类抗原结合区的非人类抗体(例如其中所有或基本上所有CDR是非人类的非人类抗体)的人源化形式。
药理学
在制药和药物剂型中，活性药剂优选地与一种或多种可药用载体和任选的任何其他治疗性成分一起使用。所述载体必须在与所述剂型的其他成分相容和不对其接受者过度有害的意义上是可药用的。所述活性药剂以有效实现如上所述的所需药理效果的量和适合于实现所需暴露的量提供。
通常，将本发明的抗体及其包含抗体的抗原结合部分或包含包括肽模拟物在内的另一个多肽的片段悬浮在无菌盐水溶液中，用于治疗性用途。所述药物组合物可以被可选地配制成控制活性成分(包含抗体的抗原结合部分的分子)的释放或延长它在患者***中的存在。大量适合的药物递送***是已知的，并且包括例如可植入药物释放***、水凝胶、羟甲基纤维素、微胶囊、脂质体、微乳液、微球等。受控释放制剂可以通过使用聚合物来复合或吸附根据本发明所述的分子来制备。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物的基质。根据本发明所述的分子即抗体或抗体片段从这种基质释放的速率取决于所述分子的分子量、所述基质内所述分子的量和被分散粒子的尺寸。
本发明的药物组合物可以通过任何适合的手段给药，例如静脉内、肿瘤内、口服、鼻内、皮下、肌肉内、动脉内、关节内、病灶内或肠胃外。通常，将静脉内(i.v.)给药用于递送抗体。
对于本领域普通技术人员来说显而易见的是根据本发明所述的分子的治疗有效量将尤其取决于给药计划、给药的分子的单元剂量、所述分子是否与其他治疗剂组合给药、患者的免疫状态和健康、所述给药的分子的治疗活性、它在血液循环中的持久性和主治医师的判断。
当在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物的量。在癌症的情况下，所述药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数目，减小肿瘤尺寸，抑制(即在一定程度上减缓并且优选地停止)癌细胞浸润到周围器官中，抑制(即在一定程度上减缓并且优选地停止)肿瘤转移，在一定程度上抑制肿瘤生长，和/或在一定程度上缓解与所述病症相关的一种或多种症状。在所述药物可以阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的情况下，它可能具有细胞抑制性和/或细胞毒性。对于癌症疗法来说，体内功效可以例如通过评估存活时间长度、疾病进展时间(TTP),响应率(RR)、响应持续时间和/或生活质量来测定。
适合于通过本发明治疗的癌症包括但不限于：白血病或淋巴样恶性肿瘤、上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤和肉瘤。这种癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌以及B细胞淋巴瘤(包括低等级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中等级/滤泡性NHL、中等级弥漫性NHL、高等级免疫母细胞性NHL、高等级淋巴母细胞性NHL、高等级小非裂解细胞NHL、巨大肿块NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和Waldenstrom巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性粒细胞性白血病和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)和Meigs综合征相关的异常血管增殖。根据某些实施方式，所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、***癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。适合于本发明治疗的癌性病症包括转移性癌症。
根据特定实施方式，所述癌症选自NK细胞白血病和大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病。
根据其他实施方式，根据本发明的药物组合物用于治疗以NKp46的过表达为特征的癌症。
根据其他实施方式，“治疗有效量”是指在哺乳动物中有效治疗病毒疾病或病症的药物的量。
作为活性成分的本发明的分子被溶解、分散或混合在可药用并且与所述活性成分相容的赋形剂中，这是公知的。适合的赋形剂是例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。其他适合的载体对于本领域技术人员来说是公知的。此外，如果需要，所述组合物可以含有少量辅助物质例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂。
根据本发明所述的药物组合物可以与抗肿瘤组合物一起给药。
当在本文中使用时，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施两者。需要治疗的受试者包括已经患有所述病症的受试者以及将要预防所述病症的受试者。
术语“癌症”指称或描述哺乳动物中的一种通常以不受调控的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于白血病、上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤和肉瘤。这种癌症的更具体的实例包括白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌、***癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、***、胰腺癌、骨髓癌、卵巢癌、子宫癌、肉瘤、胆管癌或子宫内膜癌。
根据某些实施方式，所述治疗癌症的方法包括施用所述药物组合物作为包括施用至少一种另外的抗癌药剂在内的治疗方案的一部分。
根据某些实施方式，所述抗癌药剂选自抗代谢物、有丝***抑制剂、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、天冬酰胺酶、烷化剂、抗肿瘤抗生素及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述抗代谢物选自阿糖胞苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、吉西他滨和羟基脲。根据某些实施方式，所述有丝***抑制剂选自长春新碱、长春碱和长春瑞滨。根据某些实施方式，所述拓扑异构酶抑制剂选自拓扑替康和伊立替康。根据某些实施方式，所述烷化剂选自白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺铂、卡铂、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、噻替派、达卡巴嗪和丙卡巴肼。根据某些实施方式，所述抗肿瘤抗生素选自博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌和普卡霉素。根据某些实施方式，所述拓扑异构酶II抑制剂选自依托泊苷和替尼泊苷。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些特定实施方式，所述另外的抗癌药剂选自贝伐单抗、卡铂、环磷酰胺、多柔比星盐酸盐、吉西他滨盐酸盐、拓扑替康盐酸盐、噻替派及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据本发明所述的单克隆抗体可以与至少一种抗癌药剂一起用作组合疗法的一部分。根据某些实施方式，所述另外的抗癌药剂是免疫调节剂、活化的淋巴细胞、激酶抑制剂或化学治疗剂。
根据某些实施方式，所述抗癌药剂是作为激动剂或拮抗剂的免疫调节剂，例如针对免疫检查点分子的抗体。
检查点免疫疗法阻断已被证明是令人兴奋的癌症治疗新场所。免疫检查点途径由一系列共刺激和抑制性分子构成，这些分子协同工作，以便维持自身耐受性并保护组织在生理条件下不受免疫***损伤。肿瘤利用某些检查点途径以便逃避免疫***。因此，抑制这些途径已成为一种有前途的抗癌治疗策略。
抗细胞毒性T淋巴细胞4(CTLA-4)抗体伊匹单抗(在2011年批准)是对癌症患者的治疗显示出益处的第一种免疫治疗剂。所述抗体干扰抗原呈递到T细胞期间的抑制性信号。抗程序性细胞死亡1(PD-1)抗体派姆单抗(在2014年批准)阻断由T细胞表达的PD-1受体的负免疫调控信号传导。另一种抗PD-1药剂在2014年提交管理部门批准，用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。积极的研究目前正在探索许多其他免疫检查点，其中包括：CEACAM1、NKG2A、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD112R、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、CD137、OX40(也被称为CD134)和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。
根据某些特定实施方式，所述免疫调节剂选自：抑制CTLA-4的抗体，抗人类程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PD-L1和PD-L2抗体，活化的细胞毒性淋巴细胞，淋巴细胞活化剂，针对CEACAM的抗体，针对TIGIT的抗体和RAF/MEK途径抑制剂。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据某些特定实施方式，所述另外的免疫调节剂选自针对PD-1的mAb、针对PD-L1的mAb、针对PD-L2的mAb、针对CEACAM1的mAb、针对CTLA-4的mAb、针对TIGIT的mAB、PVR、白介素2(IL-2)或淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。
根据其他实施方式，所述另外的抗癌药剂是化学治疗剂。可以与根据本发明所述的抗体一起或分开地给药的化学治疗剂可以包括本领域中已知的表现出抗癌活性的任何此类药剂，包括但不限于：米托蒽醌，拓扑异构酶抑制剂，来自于长春花的纺锤体毒素：长春碱、长春新碱、长春瑞滨(紫杉醇)、紫杉醇、多西他赛；烷化剂：氮芥，苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异环磷酰胺；甲氨蝶呤；6-巯基嘌呤；5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨；鬼臼毒素：依托泊苷、伊立替康、拓扑替康、达卡巴嗪；抗生素类：多柔比星(阿霉素)、博来霉素、丝裂霉素；亚硝基脲类：卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀、表柔比星、伊达比星、柔红霉素；无机离子：顺铂、卡铂；干扰素、天冬酰胺酶；激素：他莫昔芬、亮丙瑞林、氟他胺和醋酸甲地孕酮。
根据某些实施方式，所述化学治疗剂选自烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和相关抑制剂、长春花生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位络合物、蒽二酮取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质激素抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、***、抗***、雄激素、抗雄激素和***释放激素类似物。根据另一个实施方式，所述化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸(LV)、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇和多西他赛。可以使用一种或多种化学治疗剂。
根据某些实施方式，根据本发明所述的药物组合物用于治疗癌症或用于治疗感染。根据某些实施方式，所述感染是病毒感染、细菌感染或真菌感染。
根据某些实施方式，包含根据本发明所述的至少一种抗体或其片段的药物组合物和包含免疫调节剂或激酶抑制剂的药物组合物，用于通过分开给药治疗癌症。
根据另一方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明所述的单克隆抗体或抗体片段、CAR分子或多特异性结合分子。
当在本文中使用时，术语“有效量”是指当施用于受试者时具有预期治疗效果的所述单克隆抗体或抗体片段的足够的量。实现所述治疗最终结果所需的有效量可能取决于多种因素，包括例如肿瘤的具体类型和患者病症的严重性，以及所述组合是否进一步与放射共同施用。在本发明的情形中，所述活性药剂的有效量(剂量)应该足以在所述受试者中随时间实现有益治疗响应，包括但不限于肿瘤生长的抑制、肿瘤生长速率的降低、肿瘤和转移肿瘤生长的阻止和存活率提高。
本文中描述的组合物的毒性和治疗效能可以通过标准的制药程序，在细胞培养物或实验动物中确定，例如通过确定主题化合物的IC50(提供50％抑制的浓度)和最大耐受剂量。从这些细胞培养物测定法和动物研究获得的数据可用于配制在人类中使用的多种剂量。所述剂量可能尤其是随着所使用的剂型、所选的给药方案、用于治疗的药剂的组成和使用的给药途径以及其他相关因素而变。精确的剂型、给药途径和剂量可以由各个医生根据患者的状况来选择。取决于待治疗的病症的严重性和响应性，给药也可以是缓释组合物的单次给药，并且治疗过程持续数天到数周或直至实现治愈或实现疾病状态的消减。待给药的组合物的量当然取决于待治疗的受试者、患病的严重性、给药方式、处方医师的判断和所有其他相关因素。
术语将物质、化合物或药剂“施用”于受试者，可以使用本领域技术人员已知的各种不同方法之一来进行。例如，化合物或药剂可以肠内或肠胃外给药。肠内是指通过胃肠道给药，包括经口、舌下或直肠给药。肠胃外给药包括静脉内、真皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、眼、舌下、鼻内、通过吸入、脊柱内、大脑内和透皮(通过吸收，例如经皮肤导管)给药。化合物或药剂也可以适合地通过可重复装填或生物可降解聚合物装置或其他装置例如贴片和泵，或通过提供所述化合物或药剂的延长、缓慢或受控释放的剂型来引入。给药也可以进行例如一次、多次，和/或在一个或多个延长的时间段内进行。在某些实施方式中，所述给药包括直接给药(包括自我施用)和间接给药(包括开药的行动)两者。例如，当在本文中使用时，指示患者自我施用药物或由另一人施用药物的医生和/或向患者提供药物处方的医生是对所述患者施用所述药物。
抗体通常以约0.1至约20mg/kg患者体重范围内的剂量给药、通常为约0.5至约10mg/kg、通常为约1至约5mg/kg。就此而言，优选地使用循环半衰期为至少12小时、优选为至少4天、更优选长达21天的抗体。嵌合抗体预期具有长达14-21天的循环半衰期。在某些情况下，在治疗期内，施用大的负荷剂量，随后施用定期(例如每周)性维持剂量，可能是有利的。抗体也可以通过缓释递送***、泵和用于连续输注的其他已知递送***来递送。
本发明的抗体可用于基于CAR的过继性免疫疗法，其利用工程化改造的包含CAR的淋巴细胞来治疗癌症。作为非限制性实例在本文中描述了CAR-T***。
所述T细胞疗法在癌症或肿瘤的治疗中利用嵌合抗原受体(CAR)(即CAR-T细胞疗法)。CAR-T细胞疗法是一种细胞免疫疗法，其涉及向癌症患者施用遗传工程改造的T-细胞，所述T-细胞作用于肿瘤细胞并引起肿瘤细胞凋亡。所述遗传工程改造的T细胞通过使用基因转移技术在T细胞上表达具有与细胞内结构域例如CD3ζ链序列的片段组合的抗体可变区(VL和VH)的CAR来制备。CAR是其中将特异性针对肿瘤抗原的单克隆抗体的可变区的轻链和重链彼此相连，然后在C-端侧连接到T-细胞受体(TCR)链的嵌合蛋白的通用术语。
根据某些实施方式，所述CAR包含选自CD8茎结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3ζ结构域的至少一个蛋白质结构域。
根据某些实施方式，所述CAR包含源自于4-1BB(或41BB或CD137)、ICOS、OX40、CD27、KIR2DS2、MYD88–CD40或CD28的共刺激结构域。在某些实施方式中，所述CAR包含CD3ζ、41BB和CD28的信号传导结构域。
根据某些实施方式，所述CAR包含选自CD28 TM、DAP12 TM、CD8 TM、CD3ζTM、DAP10TM和ICOS TM的跨膜结构域(TM)。
根据某些实施方式，所述CAR包含铰链区序列。根据某些实施方式，所述铰链区序列源自于CD8、CD28或IgG4铰链。
根据某些实施方式，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含根据本发明所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。根据某些实施方式，提供了一种在其表面上表达CAR的遗传修饰的淋巴细胞。根据某些特定实施方式，提供了一种在其表面上表达CAR的遗传修饰的T细胞(CAR-T细胞)。
根据某些实施方式，所述CAR包含NKp46结合部位，所述结合部位包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HCCDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)，或其与所述抗体或片段具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
根据某些实施方式，所述类似物或衍生物与所述抗体或片段序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
根据某些实施方式，所述CAR包含NKp46结合部位，所述结合部位包含：包含SEQ IDNo：7的重链(HC)可变区的三个互补决定区(CDR)，和包含SEQ ID No：8或SEQ ID No：12的轻链(LC)可变区的三个CDR。
根据某些实施方式，所述CAR包含NKp46结合部位，所述结合部位包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HCCDR3是RDFHSSFDY(SEQ ID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某一方面，本发明提供了一种包含本文描述的CAR的细胞。根据某些实施方式，所述细胞表达或能够表达本发明的CAR。根据某些实施方式，所述细胞是淋巴细胞。根据某些实施方式，所述细胞选自T细胞和自然杀伤(NK)细胞。
根据某些实施方式，所述细胞例如T-细胞包含编码本发明的CAR的核酸分子。根据其他实施方式，所述细胞例如T-细胞包含含有编码本发明的CAR的核酸分子的核酸构建体。根据另一个实施方式，本发明提供了一种载体，其包含编码本发明的CAR的核酸构建体或分子。根据这些实施方式，所述T-细胞能够表达或表达本发明的CAR。
根据某些实施方式，提供了一种被工程化改造以表达本文描述的CAR的淋巴细胞。根据某些实施方式，提供了一种被工程化改造以表达本文描述的CAR的T细胞。
根据其他实施方式，提供了一种被工程化改造以表达本文描述的CAR的NK细胞。
本发明的CAR包含跨膜结构域(TM结构域)、共刺激结构域和活化结构域。根据某些实施方式，所述TM结构域是选自CD4、CD3ζ、CD28和CD8的受体的TM结构域或其与原始序列具有至少85％氨基酸同一性的类似物，和/或所述共刺激结构域选自选自CD28、4-1BB、OX40、iCOS、CD27、CD80和CD70的蛋白共刺激结构域、其与原始序列具有至少85％氨基酸同一性的类似物及其任何组合，和/或所述活化结构域选自FcRγ和CD3-ζ活化结构域。根据某些实施方式，所述CAR包含前导肽。
根据某些实施方式，本发明提供了一种细胞组合物，其包含多个本发明的细胞，例如CAR展示细胞。
根据另一方面，本发明提供了一种多特异性结合分子，其包含本文描述的抗体或抗体片段的结合部位。
根据某些实施方式，所述结合部位包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQ IDNo：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LCCDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
根据某些实施方式，所述多特异性抗体是双特异性抗体。
根据某些实施方式，所述多特异性抗体是三特异性抗体。
根据某些实施方式，所述多特异性抗体还包含针对NK细胞衔接分子的结合部位。当在本文中使用时，术语“衔接物”是指可以激活或强化免疫细胞的活性的分子。根据某些实施方式，所述多特异性抗体还包含特异性针对CD160的结合部位。根据某些实施方式，所述多特异性抗体还包含特异性针对CD16的结合部位。
CD160是一种自然杀伤细胞受体和免疫球蛋白超家族成员。它是一种27kDa的糖蛋白，其表达与具有溶细胞效应活性的外周血NK细胞和CD8 T淋巴细胞密切相关。CD160的别名尤其包括BY55、NK1、NK28。CD160的示例性序列可以在UniProt登记号O95971中找到。
根据其他实施方式，所述多特异性抗体与细胞因子融合或偶联。
根据某些实施方式，所述多特异性抗体还包含特异性针对位于癌症部位上的抗原的结合部位。
根据其他实施方式，所述多特异性抗体还包含特异性针对病毒抗原的结合部位。根据其他实施方式，所述多特异性抗体还包含特异性针对真菌抗原的结合部位。根据其他实施方式，所述多特异性抗体还包含特异性针对细菌抗原的结合部位。
根据某些实施方式，所述多特异性结合分子是多肽或多肽的多聚体。根据某些实施方式，每个多肽独立地选自单特异性、双特异性和三特异性多肽。
根据某些实施方式，所述多特异性结合分子由一个或多个scFv分子组成或包含一个或多个scFv分子。
对于至少三特异性的结合分子来说，每种结合特异性由恰好一个结合部位代表就已足够。因此，根据本发明的三特异性结合分子可以是三价分子。所述三种结合特异性也可以各自由不同数量的结合部位实现。一种结合特异性与另外两种结合特异性相比由更多结合部位代表或者两种结合特异性与第三种结合特异性相比由更多结合部位代表，可能是优选的。
根据某些实施方式，一组6个CDR是给定结合部位的优选实施方案。正如在本领域中公知的，6个CDR的组含有第一和第二组，每组由3个CDR组成。这种3个CDR的两个组可以位于同一多肽链或不同多肽链上，从而产生不同的分子结构。此外，设想了在根据本发明的给定结合分子中，一部分结合部位使得构成给定结合部位的所有6个CDR均位于单一多肽链上，而其他结合部位使得构成给定结合部位的第一和第二组3个CDR位于不同多肽上。不同多肽可以仅仅是形式上不同而在其他方面是相同的，特别是对于氨基酸序列而言。或者，不同多肽可以在氨基酸序列方面彼此不同。
术语“约”意味着对于特定值来说应该假设的可接受的误差范围，例如至多5％或10％。
诊断
本发明还公开了用于诊断和预后癌症的方法。
根据一个方面，本发明提供了一种受试者中的癌症或感染性疾病的诊断和/或预后方法，所述方法包括使用本文中所描述的至少一种抗体来确定所述受试者的生物样品中NKp46的表达水平的步骤。
术语“生物样品”涵盖了从生物体获得的可用于诊断或监测测定法的各种不同的样品类型。所述术语涵盖了生物来源的血液和其他液体样品、实体组织样品例如活检样本，或组织培养物或源自于它们的细胞及其后代。此外，所述术语可以涵盖循环的肿瘤或其他细胞。所述术语特别涵盖了临床样品，并且还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、尿液、羊水、包括用于眼部样品的房水和玻璃体液在内的生物流体和组织样品。所述术语还涵盖在采购后以任何方式操作过的样品，例如用试剂处理、增溶或富集某些组分的样品。
确定NKp46的表达水平可以通过本文中描述的标记的抗NKp46抗体来进行。确定所述表达可以例如通过ELISA进行。
本发明的方法还可以包括将所述表达水平与对照水平进行比较的步骤。
提呈下面的实施例是为了更全面地说明本发明的某些实施方式。它们绝不应该解释为限制本发明的范围。
实施例
现在将参考下述实施例，所述实施例与上面的描述一起，以非限制性方式说明本发明。
通常，本文中使用的命名法和在本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学、免疫学和重组DNA技术。这样的技术在本领域中是公知的。为了方便读者，在整个本文件中提供了涉及公知程序的其他通用参考文献。
实施例1.Nkp46抗体的产生和选择
在哺乳动物HEK 293T细胞中进行免疫原(Nkp46-Fc)表达。产生并纯化了由靶(NKp46)蛋白的胞外结构域和人类IgG1 Fc片段组成的NKp46-Fc融合蛋白。
对于免疫来说，将BALB/c小鼠用弗氏完全佐剂(CFA)中的50μg免疫原注射，然后在第一次免疫后第14天用弗氏不完全佐剂(IFA)中的50μg免疫原注射。接下来，通过ELISA分析血清的抗NKp46-Fc抗体滴度。将具有最高滴度的小鼠用PBS中的50μg免疫原加强。三天后，获取免疫小鼠的脾脏，并在红细胞裂解后，将脾细胞与SP2/0细胞系融合。将潜在的杂交瘤细胞接种在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)的20％RPMI 1640培养基中，选择稳定的杂交瘤细胞系。将上述程序重复5次，并且通过ELISA筛选了总共4600个孔的抗NKp46-Fc抗体分泌。然后对来自于其中上清液对在Nkp46-Fc包被的ELISA板上的结合测定为阳性的孔的84个细胞系，重新测试了它们的阳性。平行地在不相关Fc融合蛋白上进行了交叉反应性试验。这得到了5个杂交瘤细胞系，它们分泌特异性识别NKp46胞外结构域的抗体。在这些抗体中，对四种进一步选择了它们的IgG同型(而不是IgM同型)。然后将所有这些在ELISA中显示出特异性信号的候选者亚克隆，并如下所述测试了它们识别转染细胞系上的天然人类NKp46蛋白的能力。
首先在表达NKp46的小鼠胸腺瘤BW转染细胞(BW NKp46)上研究结合。作为对照，我们使用了可商购的抗NKp46 mAb(被称为9E2)和以前在我们实验室开发的抗NKp46 mAb即461-G1(Arnon等，2004；Mandelboim等，2001)。测试的所有抗体均与BW NKp46但不与亲代BW细胞特异性相互作用(数据未示出)。为了证实所述抗体识别由人类NK细胞天然表达的NKp46，我们将IL-2活化的原代大量人类NK细胞(活化的NK细胞)染色。所述在整个实验中使用的活化的NK细胞从PBMC分离。我们的纯化方案达到大约97％的纯度，并且我们核实了它们的身份是CD56+CD3-细胞(数据未示出)。事实上，所有抗体均阳性染色所述活化的NK细胞。使用源自于几个供体的PBMC获得了相似的结果(数据未示出)。
在此时，选择了四个不同的稳定克隆细胞系用于大规模生产和纯化。接下来进行了大规模Ab生产，并使用GE AKTA Prime Plus液相色谱***和HiTrap蛋白G柱，从无血清培养基以几毫克的量纯化了所有单克隆抗体。
为了鉴定抗NKp46 mAb的结合部位，将Ig-D1、Ig-D2和Ig-NKp46以0.1μg/孔的密度铺板。将板在4℃放置过夜。第二天进行封闭(封闭缓冲液是PBSx1、0.05％Tween-20和5％BSA)，然后添加0.1μg/孔的mAb和10μl/孔的SN抗体(两者均在封闭缓冲液中稀释到100μl的终体积)。将板在4℃放置过夜。第二天，添加生物素抗小鼠抗体(在封闭缓冲液中稀释)，然后添加链霉亲和素-POD(在封闭缓冲液中稀释)，并使用TMB在OD650nm处检测样品。如图1中所示，克隆K3和P4抗体与NKp46 D2结构域结合，而商品化抗NKp46抗体克隆02和461-G1(发表的NKp46抗体)与NKp46 D1结构域结合。
接下来我们检查了任何抗NKp46 mAb是否可以阻断NKp46与其配体的相互作用。为此，使用了表达NKp46的未知配体的BJAB、MCF7和C1R肿瘤细胞。将NKp46-Ig单独地或与各种不同的抗NKp46 mAb在冰上温育。然后，将所述温育的NKp46-Ig融合蛋白用于FACS染色所述肿瘤细胞。所述抗NKp46 mAb无一能阻断NKp46-Ig与所述细胞的结合。
实施例2.来自于NK细胞表面的NKp46下调的研究
测试了抗NKp46 mAb对NK细胞表面上NKp46表达的降低的影响。将抗NKp46 mAb与活化的NK细胞在4℃或37℃下温育8小时。然后将所述细胞用偶联的抗小鼠第二抗体进行FACS染色。只有一种mAb即02导致NKp46水平降低(图2)。其他抗体不诱导来自于NK细胞表面的NKp46的下调。这些抗体特异性结合NKp46，并且不干扰NKp46与其同源配体的结合。为了确认所述发现，在两种活化的原代NK细胞上使用这些抗体进行了剂量响应FACS染色(图3)。正如可以认识到的，K3和P4抗体浓度的降低与细胞表面上荧光信号强度的降低相一致。因此，所述K3和P4抗体表现出强烈的剂量响应，并且适用于产生在NK细胞与肿瘤细胞之间桥接的双特异性或三特异性抗体。
实施例3.人源化抗NKp46抗体、活性和亲和性
使用Macromoltek软件设计将抗NKp46抗体克隆P4和K3的亲本重链和轻链序列人源化。所述序列由结构生物学和分子建模专家确认。得到的人源化序列阐述在SEQ ID No：14(K3和P4的重链的人源化)、SEQ ID No：15(P4的轻链的人源化)和SEQ ID No：16(K3的轻链的人源化)中。制备了四个人源化克隆：B341001，B341002，B341003和B341004。
检查了带有突变的IgG4的人源化抗体与表达NKp46的细胞的结合。所述实验如下进行：
1.在3种浓度相对于3种缓冲液的基质中测试包被，以发现最佳信号。
2.使用最佳信号条件包被ELISA板，使用标准的封闭和清洗步骤。
3.施加在具有10个稀释度的浓度范围内的第一抗体(具有人源化可变区+突变的IgG4的MAb)。
4.用于检测结合的第二抗体是带有HRP的抗Huκ抗体(TMB底物)。
5.在450nm处测量吸光值。
抗原是在HEK293细胞中表达的Acro Biosystems的人类NKp46。如图4A-4B中所示，两种人源化克隆对NKp46均具有强亲和性(20.5pM和27pM)。
进一步检查了所述人源化抗体与NKp46 D2结构域的亲和性。如图5D中所示，所述人源化抗体对NKp46的D2结构域表现出格外高的亲和性。
实施例4.双特异性和三特异性抗体
制备了具有两种或三种特异性的结合分子。所述双特异性结合分子包含本文公开的抗体的结合部位和特异性针对肿瘤配体的结合部位。所述三特异性结合分子包含本文描述的抗体的结合部位、针对CD160的结合部位和针对肿瘤配体的结合部位。首先，对于所述三特异性抗体来说，进行了针对NKp46和CD160的阻断测定以确认所述抗体不阻断所述受体与它们的天然配体的结合。使用抗体克隆K3和P4和抗CD160抗体的重导向测定法用于显示抗体的结合不损害NK细胞功能。
使用不表达T、B或NK细胞的SCID/Beige小鼠进行体内测定，因为用于测试的肿瘤是人类起源的。在表达所选肿瘤抗原的小鼠中肿瘤的建立，通过皮下注射逐渐增加量的癌细胞(2x105、5x105、1x106、5x106)来进行。每两天评估小鼠的可触及肿瘤的出现，并且一旦观察到，则每天用数字游标卡尺测量以确定肿瘤体积。取决于肿瘤的类型和注射量，肿瘤通常在10-14天内出现。一旦观察到可触及肿瘤，就对小鼠进行两周的监测(肿瘤体积、小鼠体重和总体外观)。人道终点设定到肿瘤体积为1cm3或与初始体重相比体重减轻20％。两周后将小鼠处死，取出肿瘤并称重。细胞的理想工作数量定义为：在上面提到的整个研究期间维持可触及肿瘤的最小细胞量。对每个细胞系测试了每组6只小鼠。
剂量响应实验用于确定减小肿瘤尺寸所需的双特异性或三特异性抗体的安全量。一旦根据上述标准确定了细胞的理想工作数量，就将浓度逐渐增加的所述抗体和单一抗体(K3、P4、抗CD160抗体和抗肿瘤抗原抗体)注射到带有肿瘤的SCID/Beige小鼠中。
SCID/Being小鼠最初用前一节中所评估的确定数量的癌细胞注射。一旦出现可触及的肿瘤，就将它通过数字游标卡尺测量以确定肿瘤体积。随后，以逐渐增加的剂量(30μg和60μg)i.p.注射所述双特异性或三特异性和单一抗体。然后对除了PBS注射组之外的所有小鼠组也注射人类NK细胞。
前述特定实施方式的描述非常充分地揭示出本发明的总体本质，使得其他人可以通过应用当前的知识容易地修改和/或改编这些特定实施方式以适应于各种不同的应用，而无需过多的实验并且不背离所述通用概念，因此，这些改编和修改应当并且旨在被理解在所公开的实施方式的等同性的含义和范围之内。应当理解，本文中采用的短语或术语是出于描述而不是限制的目的。
序列表
<110> 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司
里耶卡医学大学
<120> 用于治疗癌症和感染的针对NKp46的抗体及其构建体
<130> Yissum/0168 PCT
<150> US 63/005457
<151> 2020-04-06
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
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<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
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ttccatagta gctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
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100 105
<210> 13
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Tyr Asp Thr Pro Thr Leu Ser Val His Pro Gly Pro Glu Val Ile Ser
1 5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Phe Tyr Cys Arg Leu Asp Thr Ala Thr Ser Met
20 25 30
Phe Leu Leu Leu Lys Glu Gly Arg Ser Ser His Val Gln Arg Gly Tyr
35 40 45
Gly Lys Val Gln Ala Glu Phe Pro Leu Gly Pro Val Thr Thr Ala His
50 55 60
Arg Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Tyr Asn Asn His Ala Trp Ser
65 70 75 80
Phe Pro Ser Glu Pro Val Lys Leu Leu Val Thr Gly Asp Ile Glu Asn
85 90 95
Thr Ser Leu Ala Pro Glu Asp Pro Thr Phe Pro Ala Asp Thr Trp Gly
100 105 110
Thr Tyr Leu Leu Thr Thr Glu Thr Gly Leu Gln Lys Asp His Ala Leu
115 120 125
Trp Asp His Thr Ala Gln
130
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Humanized antibody
<400> 14
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Phe
35 40 45
Gly Gly Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Phe His Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Humanized antibody
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Humanized antibody
<400> 16
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe
115

Claims (43)

1.与NKp46结合的抗体或其至少包含抗原结合部分的抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含：包含SEQ ID No：7的重链(HC)可变区的三个互补决定区(CDR)和包含SEQ ID No：8的轻链(LC)可变区的3个CDR，或其与所述抗体或片段序列具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其包含一组6个CDR，其中：HC CDR1是EYSMH(SEQ ID No：1)；HC CDR2是GISPNSGGTSYNQKFKG(SEQ ID No：2)；HC CDR3是RDFHSSFDY(SEQID No：3)；LC CDR1是RASQSISDYLH(SEQ ID No：4)；LC CDR2是YASQSIS(SEQ ID No：5)；并且LC CDR3是QNGHSFPLT(SEQ ID No：6)。
3.根据权利要求1或2中的任一项所述的抗体或抗体片段，其包含SEQ ID No：7中阐述的重链可变区或与所述重链可变区序列具有至少95％序列相似性的类似物。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的抗体或抗体片段，其包含SEQ ID No：8中阐述的轻链可变序列或与所述轻链可变区序列具有至少95％序列相似性的类似物。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的抗体或抗体片段，其包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID No：7并且所述轻链包含SEQ ID No：8。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的抗体片段，其中所述抗体片段是单链Fv(scFv)。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体以10-11M至10-16M的亲和性与人类NKp46结合。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是人源化抗体。
9.根据权利要求8所述的抗体或抗体片段，其中所述人源化抗体包含：包含SEQ ID No：14的重链和选自SEQ ID Nos：15和16的轻链。
10.一种多核苷酸序列，其编码根据权利要求1至7中的任一项所述的抗体或抗体片段的重链或轻链区的至少一个序列。
11.权利要求10所述的多核苷酸序列，其编码抗体重链可变区，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID No：9或其与所述序列具有至少85％同一性的变体。
12.权利要求11所述的多核苷酸序列，其编码抗体轻链可变区，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID No：10或其与所述序列具有至少85％同一性的变体。
13.一种质粒，其包含根据权利要求10至12中的任一项所述的至少一个多核苷酸序列。
14.一种细胞，其包含根据权利要求10至12中的任一项所述的多核苷酸序列。
15.一种细胞，其能够产生根据权利要求1至7中的任一项所述的抗体。
16.一种多特异性抗体，其包含根据权利要求1至7中的任一项所述的抗体的结合部位。
17.权利要求16所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体，还包含对肿瘤抗原具有特异性的结合部位。
18.权利要求16所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体，还包含对病毒、细菌或真菌抗原具有特异性的结合部位。
19.权利要求16所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是三特异性抗体，还包含特异性针对CD160或CD16的结合部位。
20.权利要求19所述的多特异性抗体，其还包含特异性针对肿瘤抗原的结合部位。
21.权利要求16所述的多特异性抗体，所述多特异性抗体与细胞因子融合或偶联。
22.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至7和16至21中的任一项所述的抗体或其片段或多特异性结合分子作为活性成分，以及可药用赋形剂、稀释剂、盐或载体。
23.权利要求22所述的药物组合物，其用于在受试者中治疗癌症。
24.权利要求22所述的药物组合物，其用于治疗感染。
25.权利要求22所述的药物组合物，其用于治疗病毒感染、细菌感染或真菌感染。
26.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求22所述的药物组合物。
27.权利要求26所述的方法，其还包括选自手术、化疗、放疗和免疫疗法的另外的抗癌疗法。
28.权利要求26所述的方法，其还包括向所述受试者施用免疫调节剂、活化的淋巴细胞、激酶抑制剂、化学治疗剂或任何其他抗癌药剂。
29.权利要求26所述的方法，其中所述免疫调节剂是针对免疫检查点分子的抗体。
30.权利要求26所述的方法，其中所述免疫调节剂是针对PD-1的抗体。
31.权利要求26所述的方法，其中所述癌症是实体癌症。
32.权利要求26所述的方法，其中治疗导致在受试者中预防或减少转移肿瘤形成、生长或扩散。
33.一种在受试者中诊断癌症的方法，所述方法包括将生物样品与根据权利要求1至7中的任一项所述的抗体或抗体片段接触。
34.一种用于在受试者中诊断癌症的药剂盒，其包含至少一种根据权利要求1至7中的任一项所述的抗体或抗体片段。
35.一种在受试者中治疗感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求23所述的药物组合物。
36.权利要求35所述的方法，其中所述感染是选自冠状病毒、流感病毒、人类偏肺病毒(HMPV)、人类巨细胞病毒(HCMV)、仙台病毒、新城疫病毒和痘病毒的病毒的病毒感染。
37.权利要求36所述的方法，其中所述冠状病毒选自SARS和MERS。
38.权利要求37所述的方法，其中所述冠状病毒是COVID-19。
39.嵌合抗原受体(CAR)，其包含至少一种根据权利要求1至7中的任一项所述的抗体或抗体片段。
40.根据权利要求39所述的CAR，其包含选自CD8茎结构域、CD28 TM结构域、41BB结构域和CD3ζ结构域的至少一个受体结构域。
41.一种淋巴细胞群体，其被工程化改造以表达根据权利要求40所述的CAR。
42.一种T-细胞或NK-细胞群体，其被工程化改造以表达根据权利要求39至40中的任一项所述的CAR。
43.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用至少一种表达根据权利要求39或40中的任一项所述的CAR的细胞或根据权利要求41或42中的任一项所述的细胞群体。
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