CN115747170B

CN115747170B - 一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用

Info

Publication number: CN115747170B
Application number: CN202211040444.9A
Authority: CN
Inventors: 袁泉; 曹叔琴; 李昱煜; 邹淑娟
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-08-29
Filing date: 2022-08-29
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2042-08-29
Also published as: CN115747170A

Abstract

本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒‑多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用，属于生物药物技术领域。本发明复合物是在豇豆褪绿斑驳病毒表面接枝多肽而得的复合物；所述多肽为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本发明复合物能够有效抑制破骨细胞的形成和分化，可有效改善骨质疏松的骨量和骨质，用于预防和/或治疗骨质疏松。此外，本发明复合物安全性强，无细胞毒性，且可以减少RANKL‑RANK信号通路被完全阻断所产生的副作用，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器无明显副作用。本发明复合物具有安全、无毒性、稳定、效果好等优势，在治疗骨质疏松方面具有良好的应用前景。

Description

一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用。

背景技术

骨质疏松症（osteoporosis）是一种以骨密度和骨质量减少、骨组织微观结构破坏为特点的全身代谢性疾病，最常见于绝经后妇女。2020年全国骨质疏松患者近3亿人，估计2050年将上升至5.333亿。随着人口老龄化进程的加速，骨质疏松症及骨折等并发症已成为我国面临的严重公共卫生问题。目前治疗骨质疏松的主要途径包括减少骨吸收、增加骨形成等。抗骨吸收类药物包括双磷酸盐类药物、破骨细胞分化因子抑制剂等。双磷酸盐类药物通过结合于骨组织中的羟基磷灰石，在破骨细胞行使骨吸收功能时进入成熟破骨细胞，阻碍破骨细胞进一步发挥功能并诱导破骨细胞凋亡，从而有效抑制骨吸收。然而，双磷酸盐亦存在一定的局限性，包括：沉积于骨组织中以致在体内的代谢速率较慢、仅影响成熟破骨细胞的功能而不影响破骨细胞的分化和形成、导致功能丧失的破骨细胞大量积聚等。

破骨细胞分化因子抑制剂地诺单抗是核因子ĸB受体活化因子配体RANKL的特异性单克隆抗体，通过与RANKL结合，阻断RANKL与其受体RANK结合，抑制RANKL-RANK信号通路的激活，从而有效减少破骨细胞的分化形成并削弱其骨吸收功能。但由于RANKL-RANK信号通路同样在免疫、炎症、感染等过程中发挥重要作用，因此阻断RANKL-RANK信号通路在减少破骨细胞形成及功能的同时，可能会增加感染风险等副作用。

可见现有治疗骨质疏松的药物均存在一定问题。研究一种可以抑制破骨细胞分化和形成，但不会增加感染风险的药物对于治疗骨质疏松症具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用。

本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，它是在豇豆褪绿斑驳病毒表面接枝多肽而得的复合物；所述多肽为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。所述接枝的含义为多肽通过酰胺键连接在豇豆褪绿斑驳病毒表面。

进一步地，制备豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物时，所述豇豆褪绿斑驳病毒和多肽的质量比为1：（0.1~50）。

进一步地，所述豇豆褪绿斑驳病毒和多肽的质量比为1：50。

本发明还提供了前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备方法，它包括如下步骤：

将多肽上的羧基活化后，与豇豆褪绿斑驳病毒混合，在溶剂中，活化的羧基与豇豆褪绿斑驳病毒上的氨基发生缩合反应，将反应混合物洗脱、透析，即得。

进一步地，

所述活化为使用EDC和NHS活化多肽上的羧基；

和/或，所述溶剂为PBS缓冲液或Tris缓冲液；

和/或，所述缩合反应为在4~25℃孵育1~12小时；

和/或，所述洗脱为通过脱盐柱洗脱；

和/或，所述透析为在PBS缓冲液中透析。

进一步地，

所述多肽、EDC和NHS的摩尔比为1:0.9:1；

和/或，所述洗脱的洗脱液为PBS缓冲液；和/或，所述洗脱时淋洗速度为0.5 mL/min；和/或，所述洗脱时淋洗体积为24 mL；

和/或，所述透析时分子截留量为14 kDa；和/或，所述透析时间为12小时；和/或，所述透析时每隔3小时换一次透析液。

本发明还提供了前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的用途。

进一步地，所述药物为抑制破骨细胞形成的药物。

进一步地，所述药物为抑制c-Fos、CTSK和/或Acp5基因表达的药物。

本发明还提供了一种药物，它是以前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，本发明复合物能够有效抑制破骨细胞的形成和分化，可有效改善骨质疏松的骨量和骨质，用于预防和/或治疗骨质疏松。此外，本发明复合物安全性强，无细胞毒性，且可以减少RANKL-RANK信号通路被完全阻断所产生的副作用，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器无明显副作用。本发明复合物具有安全、无毒性、稳定、效果好等优势，在治疗骨质疏松方面具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例2制备的RM-CCMV的表征结果：A为体积排除色谱（FPLC）洗脱结果；B为紫外分光光度计表征RM-CCMV的紫外吸收光谱；C为CCMV和RM-CCMV的动态力学粒径测试结果；D为CCMV和RM-CCMV的Zeta电位测试结果；E为CCMV的TEM检测结果；F为RM-CCMV的TEM检测结果；E和F中bar=50nm。

图2为实施例2制备的RM-CCMV对骨髓巨噬细胞（BMDM）生长影响的CCK-8检测结果：A为不同浓度RM-CCMV处理1天的检测结果；B为不同浓度RM-CCMV处理2天的检测结果；C为不同浓度RM-CCMV处理3天的检测结果。

图3为流式细胞术检测实施例2制备的RM和RM-CCMV的入胞率及稳定性结果：A为处理细胞1天、3天和5天的流式细胞检测结果图；B为入胞率统计图。

图4为qPCR检测实施例2制备的RW-CCMV对破骨相关基因的抑制效果；A为对c-Fos基因的表达抑制效果检测；B为对CTSK基因的表达抑制效果检测；C为对Acp5基因的表达抑制效果检测。

图5为TRAP染色检测实施例2制备的RW-CCMV对破骨细胞形成的抑制效果：A为TRAP染色图；B为破骨细胞形成数量统计图。

图6为Micro-CT、TRAP染色检测实施例2制备的RW-CCMV对骨质疏松小鼠骨量的改善情况：A为Micro-CT图像；B为TRAP染色图片；C为BV/TV、Tb. Th、Tb. Sp、Tb. N等参数的统计图；D为各组破骨细胞数量统计图。

图7为HE染色观察实施例2制备的RW-CCMV对脏器组织结构的影响。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本实验由（1）四川省自然科学基金 2022NSFSC1511；（2）四川大学华西口腔医院探索与研发项目基础与应用基础研究项目 RD-02-202207支持。

实施例1、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备主要包括如下步骤：

1、RANK结构域相关多肽的制备

首先，本发明根据RANK关键结构域Motif 2/3的氨基酸序列，制备得到长度为10个氨基酸的多肽，命名为RM。长度为10个氨基酸的多肽序列为：SRPVQEQGGA（SEQ ID NO.1）。多肽采用常规的多肽固相合成法制备而得。

2、豇豆褪绿斑驳病毒纳米颗粒的扩增

本实验使用的豇豆褪绿斑驳病毒来自ATCC，它的平台编号为Bio-46614。

CCMV储存液是pH为5，NaOAc浓度为1M，DTT浓度为5mM的水溶液。

豇豆褪绿斑驳病毒（CCMV）是一种病毒纳米颗粒（virus nanoparticles, VNPs），通过将CCMV人工感染豇豆叶子，并通过一系列分离提纯，可对其进行扩增，具体方法如下：

将豇豆种子播种在植物培育房中，7-10天后长出幼叶，将CCMV病毒溶液（溶剂是CCMV储存液，CCMV病毒浓度是1mg/mL）通过人工摩擦感染在嫩叶上，具体来说：摘取6-7片豇豆幼叶，研钵将其研碎，加入100 µL CCMV病毒溶液，以及100 mL蒸馏水，充分混匀，利用指腹蘸取少许上述浑浊液，在幼叶表面反复摩擦，直至表面出现轻微伤痕，再培育8-10天后，摘取所有的豇豆叶子，通过破壁机破壁，纱布过滤，离心取得上清液，获得含有大量蛋白质的粗产物，然后将离心上清液与PEG6000以10：1（体积质量比，mL/g）比例混合，将蛋白沉淀，离心获得蛋白沉淀，然后用CCMV储存液悬浮上述沉淀获得CCMV粗产物，然后通过超速离心机进行梯度离心（40000 RPM，17 h，4 ℃），获得CCMV纳米颗粒，并将其透析到CCMV储存液中（分子截留量为14 kDa，透析时间7天，每天换一次液)。

3、豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

本发明复合物是步骤2制备得到的CCMV和步骤1制备得到的多肽（RM）按照质量比5:1，通过缩合反应将RM修饰于CCMV表面制备而得。具体制备方法为：

首先将RM与EDC/NHS以摩尔比1:0.9:1混合，以PBS缓冲液作为溶剂，室温反应10-15min，然后将得到的混合液加入CCMV溶液（溶剂为PBS缓冲液）中，使RM活化的羧基与CCMV表面的氨基反应形成酰胺键，其中CCMV和RM的质量比为5:1，所述反应为4℃孵育2小时。然后将反应混合物通过脱盐柱洗脱，洗脱液为PBS缓冲液（pH=7.2），淋洗速度为0.5 mL/min，淋洗体积为24 mL。洗脱后将洗脱液放入分子截留量为14 kDa的透析袋，在PBS透析液中透析12小时，每隔3小时换一次透析液，透析后得到豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物（RM-CCMV），将所得溶液保存在-20℃。

实施例2、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将CCMV和RM的质量比改为1:50，制备得到RM-CCMV。

实施例3、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将CCMV和RM的质量比改为1:1，制备得到RM-CCMV。

实施例4、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将CCMV和RM的质量比改为1:5，制备得到RM-CCMV。

实施例5、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将CCMV和RM的质量比改为1:10，制备得到RM-CCMV。

实施例6、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将CCMV和RM的质量比改为1:20，制备得到RM-CCMV。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物（RM-CCMV）的表征

1、实验方法

利用体积色谱排除柱（FPLC）、紫外分光光度计、Zeta电位、透射电镜等对实施例2制备的RM-CCMV和CCMV进行表征。

其中，体积色谱排除柱（FPLC）的流动相为PBS缓冲液（pH=7.2），缓冲液的淋洗速度为0.5 mL/min，淋洗体积为24 mL，检测样品均分散在PBS缓冲液中，上样前需对样品进行过滤（过滤器孔径为200 μm），以除掉大的杂质避免堵塞柱子。

紫外分光光度计检测波长为220-700 nm，扫描速度100 nm/min，检测样品为FPLC分离提纯后的RM-CCMV溶液。

Zeta电位检测所用样品池为石墨电极，所需样品体积为1 mL，检测样品为FPLC分离提纯后的RM-CCMV溶液。

透射电镜检测电压为400 V，并将为FPLC分离提纯后的RM-CCMV溶液取5 μL滴在铜网上，用滤纸轻轻吸掉多余液体，然后滴加5 μL乙酸双氧铀染色液，室温染色45-60 s，再次用滤纸吸去多于液体，室温干燥等待检测。

2、实验结果

RM-CCMV的表征结果如图1所示。图1A为通过FPLC对所制备的RM-CCMV进行分离提纯，实验结果显示RM-CCMV在约11.5 ml左右的淋洗体积洗出，收集该组分并进行下一步的表征。图1B为紫外分光光度计表征RM-CCMV的紫外吸收光谱，说明RM改性后的CCMV在紫外吸收光谱上并未发生明显变化。图1C为动态力学粒径测试（DLS）结果，结果显示改性后RM-CCMV粒径与改性前的CCMV相比并无显著变化，大小均在30 nm左右。图1D的Zeta电位测试结果显示，改性后的RM-CCMV与CCMV均略带负电，且并无明显差异。图1E为CCMV的TEM检测结果，显示其大小与DLS测试结果一致；图1F为RM-CCMV的TEM检测结果，表明其大小以及形貌与CCMV类似，这与DLS测试结果一致。

上述实验结果说明RM-CCMV与CCMV在理化性质上并未发生明显的变化。

试验例2、RM-CCMV的细胞实验

一、CCK-8检测RM-CCMV是否存在细胞毒性

1、实验方法

取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞（BMDM），将其配置成细胞悬液（细胞密度为1.5万），然后在200 μL细胞悬液中分别加入5 μM、1 μM、0.2 μM、0.04 μM浓度的实施例2制备的RM-CCMV（培养基配制），37℃孵育骨髓巨噬细胞（BMDM）1天、2天和3天，孵育后分别使用CCK8检测细胞活性。使用不加RM-CCMV处理的骨髓巨噬细胞作为对照组（Ctrl）。

2、实验结果

不同浓度RM-CCMV处理骨髓巨噬细胞（BMDM）1天、2天和3天后，CCK8检测结果如图2所示。与对照组（Ctrl）相比，所有浓度的RM-CCMV处理1天、2天和3天后的BMDM的CCK8检测结果均没有显著的统计学差异，说明本发明制备的RM-CCMV不影响骨髓巨噬细胞生长，没有细胞毒性。

二、流式细胞术检测RM-CCMV的入胞率及稳定性

1、实验方法

使用Rodamine B标记的RM按照实施例2所述方法制备RM-CCMV，进行下述试验：

取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞（BMDM），将其配置成细胞悬液（细胞密度为10万），然后在1.5 mL细胞悬液中加入1 μM浓度的Rodamine B标记的RM或RM-CCMV（均使用培养基配制），37℃孵育骨髓巨噬细胞（BMDM）1天、3天和5天，孵育后通过流式细胞术检测RM或RM-CCMV进入细胞的效率以及在细胞中存在的时间。使用不处理的骨髓巨噬细胞作为对照组（Ctrl）。

2、实验结果

实验结果如图3所示：RM的摄取率明显低于RM-CCMV，RM-CCMV能够被细胞高效摄取且能够在细胞中稳定存在，相较于单纯的多肽来讲，提高了其入胞效率和稳定性。同时，流式细胞术检测基于荧光信号，只有在CCMV上成功接枝RM后，才能检测到荧光信号，因此进一步证明了RM-CCMV制备成功。

三、qPCR检测RM-CCMV对破骨相关基因的抑制效果

1、实验方法

qPCR检测RW-CCMV对破骨相关基因的抑制效果。取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞（BMDM），将其配置成细胞悬液（细胞密度为100万），然后在3 ml细胞悬液中分别加入5 μM、1 μM、0.2 μM、0.04 μM浓度的实施例2制备的RM-CCMV（培养基配制），37℃孵育骨髓巨噬细胞（BMDM）1天，然后加入RANKL进行体外破骨细胞诱导，RANKL加入的浓度为100 ng/ml，诱导4天。诱导后对细胞c-Fos、CTSK和Acp5基因的表达水平进行检测。以不加RM-CCMV，只加RANKL诱导的细胞作为对照组（RANKL）。

2、实验结果

RM-CCMV对c-Fos、CTSK和Acp5基因的表达抑制效果如图4所示。由图4可知：5 μM及1 μM的RM-CCMV对c-Fos、CTSK、Acp5等破骨相关基因表达具有显著的抑制作用。

四、TRAP染色检测RM-CCMV对破骨细胞形成的抑制效果

1、实验方法

本实验方法中使用的RM-CCMV为实施例2制备的RM-CCMV。

分别使用对照溶剂PBS、RANKL、RANKL+RM、RANKL+CCMV、RANKL+RM-CCMV处理BMDM细胞4天后，对细胞进行TRAP染色。具体方法如下：

取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞（BMDM），将其配置成细胞悬液（细胞密度为10万），然后在1 mL细胞悬液中分别加入1 μM浓度的RM-CCMV、1 μM浓度的RM或CCMV（CCMV的浓度是根据搭载率等量换算而得），37℃孵育骨髓巨噬细胞（BMDM）1天，然后各组加入100 ng/ml浓度的RANKL，对照溶剂组加入等量PBS，继续在37℃孵育4天。细胞培养结束后，使用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，再行TRAP染色。

2、实验结果

实验结果如图5所示：单独使用RM和CCMV均不能抑制破骨细胞的形成，而1 μM的RM-CCMV能够有效抑制破骨细胞的形成。

试验例3、RM-CCMV的动物实验

一、Micro-CT、TRAP染色检测RM-CCMV对骨质疏松小鼠骨量的改善情况

1、实验方法

通过切除C57/BL6小鼠双侧卵巢建立小鼠骨质疏松模型（OVX）。模型建立后第二天开始，分别使用RM、CCMV、RM-CCMV（实施例2制备）经尾静脉注射入骨质疏松小鼠体内，注射药物浓度均为1 μM（100 μL，PBS为溶媒），注射次数为8次（每周注射2次）。注射完毕后，Micro-CT扫描，对小鼠股骨骨小梁进行三维重建，并分析BV/TV（骨组织体积/总体积）、Tb.Th（骨小梁厚度）、Tb. Sp（骨小梁间隙）、Tb. N（骨小梁数目）等参数的组间差异。观察RM-CCMV对骨质疏松小鼠骨量的改善情况。

2、实验结果

实验结果如图6所示：RM-CCMV明显改善了骨质疏松小鼠股骨BV/TV、Tb. Th、Tb.Sp等参数值。而RM组或CCMV组与骨质疏松小鼠间未有明显的统计学差异。说明RM-CCMV可以显著改善骨质疏松小鼠股骨骨小梁的骨量和骨微结构；同时，RM-CCMV能够显著降低骨质疏松小鼠股骨中的破骨细胞数量。

二、HE染色观察RM-CCMV对脏器组织结构的影响

1、实验方法

通过切除C57/BL6小鼠双侧卵巢建立小鼠骨质疏松模型（OVX）。模型建立后第二天开始，分别使用RM、CCMV、RM-CCMV（实施例2制备）经尾静脉注射入骨质疏松小鼠体内，注射药物浓度均为1 μM（100 μL，PBS为溶媒），注射次数为8次（每周注射2次）。注射完毕后，解剖分离小鼠的各种脏器，进行HE染色，观察RM-CCMV对脏器组织结构的影响。

2、实验结果

实验结果如图7所示：各个脏器的微观结构未有组间明显差异。实验结果说明：RM-CCMV具有很好的生物相容性，在改善骨质疏松小鼠骨量和骨微结构的同时，并未对心、肝、脾、肺、肾等其他器官造成明显的损伤。

综上，本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，本发明复合物能够有效抑制破骨细胞的形成和分化，可有效改善骨质疏松的骨量和骨质，用于预防和/或治疗骨质疏松。此外，本发明复合物安全性强，无细胞毒性，且可以减少RANKL-RANK信号通路被完全阻断所产生的副作用，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器无明显副作用。本发明复合物具有安全、无毒性、稳定、效果好等优势，在治疗骨质疏松方面具有良好的应用前景。

Claims

1.一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，其特征在于：在豇豆褪绿斑驳病毒表面接枝多肽而得的复合物；所述多肽为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述接枝为多肽的羧基与豇豆褪绿斑驳病毒表面的氨基反应形成酰胺键；

制备豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物时，所述豇豆褪绿斑驳病毒和多肽的质量比为1：50。

2.权利要求1所述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

将多肽与EDC和NHS混合后反应，然后与豇豆褪绿斑驳病毒混合，在溶剂中，多肽活化的羧基与豇豆褪绿斑驳病毒表面的氨基发生缩合反应形成酰胺键，然后将反应物洗脱，透析，即得；

所述缩合反应为在4℃孵育2小时；

所述洗脱为通过脱盐柱洗脱；

所述洗脱的洗脱液为PBS缓冲液；

所述多肽、EDC和NHS的摩尔比为1:0.9:1；

所述透析时分子截留量为14 kDa。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

所述溶剂为PBS缓冲液或Tris缓冲液；

和/或，所述透析为在PBS缓冲液中透析。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

所述洗脱时淋洗速度为0.5 mL/min；和/或，所述洗脱时淋洗体积为24 mL；

和/或，所述透析时间为12小时；和/或，所述透析时每隔3小时换一次透析液。

5.权利要求1所述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物在制备治疗骨质疏松的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述药物为抑制破骨细胞形成的药物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述药物为抑制c-Fos、CTSK和/或Acp5基因表达的药物。

8.一种治疗骨质疏松的药物，其特征在于：以权利要求1所述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物为唯一活性成分，加上药学上可接受的辅料。