CN115724969A

CN115724969A - Lag-3结合分子及其应用

Info

Publication number: CN115724969A
Application number: CN202110992947.5A
Authority: CN
Inventors: 程联胜; 王为为; 刘雯婷; 张大艳; 曾小丽; 周维明
Original assignee: Hefei Hankemab Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hefei Hankemab Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了LAG‑3结合分子，所述LAG‑3结合分子包括LAG‑3抗体、或所述LAG‑3抗体的抗原结合片段、或含有所述LAG‑3抗体的融合蛋白、或含有所述抗原结合片段的融合蛋白、或含有所述LAG‑3抗体的抗体药物偶联物、或含有所述抗原结合片段的抗体药物偶联物、或含有所述LAG‑3抗体的双特异性抗体或含有所述抗原结合片段的双特异性抗体。本发明所提供的LAG‑3结合分子能结合人和猴LAG‑3，并对人LAG‑3表现高亲和力以及有效增强T细胞反应，可用于调节T细胞和抗体介导的免疫反应，作为免疫调节物具有广泛的治疗用途，诸如癌症、自身免疫疾病、炎症疾病、和感染疾病等。

Description

LAG-3结合分子及其应用

技术领域

本发明涉及抗体工程领域，特别涉及LAG-3结合分子及其应用。

背景技术

淋巴细胞激活基因3(LAG-3)也称为CD223，是一种跨膜蛋白，由胞外区，跨膜区和胞内区3个部分组成。胞外区由Domain1、Domain2、Domain3、Domain4共计4个部分组成。人的LAG-3有498个氨基酸，相对分子量70kDa，定位于人12号染色体(20p13.3)。LAG-3最初鉴定表达在T细胞(特别是活化T细胞)、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞表面。LAG-3是一种抑制性受体，通过D1结构域形成二聚体分子与抗原呈递细胞APC表面的MHCII类分子特异性结合，通过胞质区高度保守的KIEELE序列的信号传导，负调节T细胞扩增和控制记忆性T细胞池。LAG-3对CD4+、CD25+调节性T细胞(Treg细胞)的抑制功能也具有直接的调节作用，是Treg细胞行使功能所必需的分子。

除了MHCII类分子，LAG-3还被报道与另外三种配体结合，即纤维蛋白原蛋白1(FGL-1)、肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)和半乳糖结合凝集素-3(Galectin-3)。FGL-1由肝细胞分泌，研究表明，FGL-1与T细胞表面的LAG-3结合时，T细胞增殖受到抑制，免疫活性也受到影响。

此外，LAG-3对维持免疫稳态具有重要作用，无论在自身免疫还是癌症中，其表达量的高低都有明显的标志作用。LAG-3在自身免疫中有保护作用，LAG-3基因的阻断和缺失将加速自身免疫疾病的进展。在癌症和慢性病毒感染中，LAG-3的表达量上调，抑制了T细胞的免疫的功能，在癌症中，LAG-3通常标志着失能或耗竭的T细胞。此外，LAG-3在对PD-1抗具有耐药性的动物T细胞中高表达，有研究显示，在临床前实体瘤和血液瘤模型中，同时阻断LAG-3和PD1通路，比单独阻断PD1通路能更好的改善抗肿瘤效应功能和抑制肿瘤生长。因此LAG-3抗体与PD-1抗体联用可改善PD-1抗体使用时产生的耐药性问题。

目前并无LAG-3抑制剂药物上市，最前沿的LAG-3抑制剂作为抗癌治疗药物处于临床试验中或者正在招募参与者，例如Bristol-Myers Squibb公司开发的一种抗LAG-3的全人源IgG4单克隆抗体BMS-986016，Merck Sharp&Dohme公司开发的抗LAG-3的全人源IgG4单克隆抗体MK-4280，主要与抗PD-1/PD-L1抗体联合使用治疗多种实体瘤和血液***恶性肿瘤。LAG-3作为一种新型免疫治疗靶点，在肿瘤的免疫治疗中发挥着重要的临床意义，但目前尚有很多恶性肿瘤并未获得明确的免疫治疗获益证据，抗LAG-3抗体免疫治疗的应用范围和治疗有效性仍有很大研究空间。

发明内容

本发明的目的是提供LAG-3结合分子，使更多的癌症患者能够在治疗中获益。

第一个方面，本发明提供LAG-3结合分子，所述LAG-3结合分子包括LAG-3抗体、或所述LAG-3抗体的抗原结合片段、或含有所述LAG-3抗体的融合蛋白、或含有所述抗原结合片段的融合蛋白、或含有所述LAG-3抗体的抗体药物偶联物、或含有所述抗原结合片段的抗体药物偶联物、或含有所述LAG-3抗体的双特异性抗体或含有所述抗原结合片段的双特异性抗体，所述LAG-3结合分子含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含下述13H4)或3F6)所述的CDR区序列，

13H4)重链可变区中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1第26-35位所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1第50-66位所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1第99-109位或SEQ ID No.6第99-109位所示；轻链可变区中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.3第24-34位所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.3第50-56位所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.3第89-96位或SEQ ID No.5第89-96位或SEQ ID No.7第89-96位所示；

3F6)重链可变区中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.8第26-35位所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.8第50-66位或SEQ ID No.12第50-66位所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.8第97-105位所示；轻链可变区中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.10第24-34位所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.10第50-56位所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.10第89-97位所示。

本发明所述CDR为“互补决定区”，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的“超变环”和/或含有抗原接触残基“抗原接触点”的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。

进一步地，上述的LAG-3结合分子，13H4)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.1第1-120位或SEQ ID No.6所示，或与SEQ ID No.1第1-120位或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性(不一致处优选在FR区)；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID No.3第1-106位或SEQ ID No.5或SEQ ID No.7所示，或与SEQ ID No.3第1-106位或SEQID No.5或SEQ ID No.7所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性(不一致处优选在FR区)；

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8第1-116位或SEQ ID No.12所示，或与SEQ ID No.8第1-116位或SEQ ID No.12所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性(不一致处优选在FR区)；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.10第1-107位所示，或与SEQ IDNo.10第1-107位所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性(不一致处优选在FR区)。

进一步地，上述的LAG-3结合分子中，所述LAG-3抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区类别可为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD中的任一种；所述抗体的轻链类型可为κ链或λ链。

所述IgG可为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任一种或其突变体。

所述IgG1可为鼠IgG1、人IgG1或其突变体。

所述人IgG1的突变体可为突变类型为L234A和/或L235A(Kabat计数)突变的IgG1突变体。

具体地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.1第121-450位所示。

本发明所述抗体的轻链类型可为κ链。

具体地，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.3第107-213位所示。

进一步地，上述的LAG-3结合分子中，所述LAG-3抗体的重链的氨基酸序列如SEQID No.1所示或与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示或与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性；或，

重链的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示或与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示或与SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性。

上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、的同一性。

本发明所提供的抗体具有如下一或多种性质或特性：

1)特异性结合人LAG-3；

2)可结合食蟹猴LAG-3；

3)与鼠LAG-3结合微弱；

4)一定程度上，能阻断配体如MHCII类分子、FGL1与人LAG-3的结合；

5)是IgG，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或上述IgG的突变体；

6)是人源化抗体或嵌合抗体或鼠源抗体。

7)主要结合人LAG-3胞外区的Domain1。

上述的LAG-3结合分子中所述抗原结合片段包括：Fab、Fab'、F(ab')₂、Fab'-SH、Fv、ScFv中的一种或几种组合。

Fab片段为由木瓜蛋白酶消化抗体后得到的，Fab包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(CH1)。

Fab'片段是在Fab基础上在重链CH1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。

F(ab')2是由胃蛋白酶消化整个IgG抗体(去除大部分Fc区同时完整保留一些铰链区后得到的，F(ab')₂片段具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab)部分，因此F(ab')₂片段为双价。

Fab'-SH是对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为成对Fab'片段生成的，在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。

Fv是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，正是每个可变结构域的三个CDR作用来限定了VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。

scFv或单链Fv，是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。

“双特异性抗体”指具有结合两个不同抗原的结合位点的抗体，或者具有结合同一个抗原不同表位的结合位点的抗体。

抗体药物偶联物(ADC)是由具有靶向特异性的抗体和具有高毒性的小分子药物通过连接肽偶联而成的药物。

本发明的第二个方面是提供与上述LAG-3结合分子相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：

B1)编码上述LAG-3结合分子的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的动物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的植物物细胞系；

B7)产生上述LAG-3结合分子的宿主细胞。

进一步地，上述的生物材料中，B1)所述的核酸分子包括：

g1)编码链的编码序列如SEQ ID No.2的第76-105位所示的DNA分子；

g2)编码链的编码序列如SEQ ID No.2的第148-198位所示的DNA分子；

g3)编码链的编码序列如SEQ ID No.2的第295-327位所示的DNA分子；

g4)编码链的编码序列如SEQ ID No.4的第69-102位所示的DNA分子；

g5)编码链的编码序列如SEQ ID No.4的第148-168位所示的DNA分子；

g6)编码链的编码序列如SEQ ID No.4的第265-288位所示的DNA分子；

g7)编码链的编码序列如SEQ ID No.2第1-360位核苷酸所示的DNA分子；

g8)编码链的编码序列如SEQ ID No.4第1-318位核苷酸所示的DNA分子；

g9)编码链的编码序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；

g10)编码链的编码序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；

g11)编码链的编码序列如SEQ ID No.9的第76-105位所示的DNA分子；

g12)编码链的编码序列如SEQ ID No.9的第148-198位所示的DNA分子；

g13)编码链的编码序列如SEQ ID No.9的第277-315位所示的DNA分子；

g14)编码链的编码序列如SEQ ID No.11的第69-102位所示的DNA分子；

g15)编码链的编码序列如SEQ ID No.11的第148-168位所示的DNA分子；

g16)编码链的编码序列如SEQ ID No.11的第265-291位所示的DNA分子；

g17)编码链的编码序列如SEQ ID No.9第1-348位核苷酸所示的DNA分子；

g18)编码链的编码序列如SEQ ID No.11第1-321位核苷酸所示的DNA分子；

g19)编码链的编码序列如SEQ ID No.9所示的DNA分子；

g20)编码链的编码序列如SEQ ID No.11所示的DNA分子。

本发明的第三个方面是提供药物或药物组合物，所述药物或药物组合物含有上述的LAG-3结合分子。

进一步地，所述药物或药物组合物还包括PD-1抗体，所述PD-1抗体包括但不限于：Pembrolizumab、Nivolumab、Toripalimab、Sintilimab、Camrelizumab、Tislelizumab、Cemiplimab和/或Prolgolimab。

所述药物或药物组合物可为LAG-3抑制剂(抑制LAG-3的活性的物质)。

本发明的第四个方面是提供上述的LAG-3结合分子或与上述LAG-3结合分子相关的生物材料在制备LAG-3抑制剂中的应用。

上文中，所述LAG-3抑制剂可用于治疗包括癌症在内的疾病。

所述癌症包括但不限于：B淋巴细胞淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、软组织细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌、食管癌、MSS结直肠癌、脊索瘤、血液肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、***、子宫内膜癌、胰腺癌、乳腺癌、腹膜癌和/或肾细胞癌。

本发明所述LAG-3结合分子具有抑制性活性，能抑制LAG-3对免疫细胞的负调作用，从而刺激CD4⁺T和CD8⁺T细胞增殖，并显著增加IFN-γ的表达量，体内实验证明LAG-3抗体与PD-1抗体联合用药可显著抑制肿瘤生长。上述实验结果说明所述LAG-3结合分子可以通过调节免疫细胞活性进而对免疫***进行调控，能够运用于免疫增强物抗肿瘤或抗病毒免疫反应的免疫增强物，或T细胞介导的自身免疫疾病的免疫调节物。

附图说明

图1A为FACS检测第一部分鼠源抗体与人LAG-3亲和力。

图1B为FACS检测第二部分鼠源抗体与人LAG-3亲和力。

图2为嵌合抗体刺激T细胞释放IFN-γ实验。

图3为嵌合抗体体内药效实验肿瘤体积变化。

图4A为FACS检测第一部分13H4人源化抗体与人LAG-3亲和力。

图4B为FACS检测第二部分13H4人源化抗体与人LAG-3亲和力。

图4C为FACS检测第三部分13H4人源化抗体与人LAG-3亲和力。

图5A为FACS检测第一部分3F6人源化抗体与人LAG-3亲和力。

图5B为FACS检测第二部分3F6人源化抗体与人LAG-3亲和力。

图6为13H4亲和力成熟的单链抗体与人LAG-3亲和力测定。

图7为13H4亲和力成熟抗体与人LAG-3亲和力测定。

图8A为人源化抗体的IgG1亚型与人LAG-3结合的亲和力。

图8B为人源化抗体的IgG1亚型与猴LAG-3结合的亲和力。

图8C为人源化抗体的IgG1亚型与鼠LAG-3结合的亲和力。

图9为人源化抗体对MHC II的结合阻断活性。

图10为人源化抗体对FGL1的结合阻断活性。

图11A为人源化抗体与对照抗体Ab1的表位竞争。

图11B为人源化抗体与对照抗体Ab2的表位竞争。

图12为人源化抗体体内药效实验肿瘤体积变化。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，阳性对照抗体Ab1为Bristol Myers Squibb公司的BMS-986016(Relatlimab，专利号:US9505839 B2)，阳性对照抗体Ab2为Merck Sharp&Dohme公司的MK4280(专利号：US20170097333A1)。阴性对照抗体为人IgG(南京金斯瑞产品)。

下述实施例中的载体pcDNA3.4为Invitrogen的Cat:A14697的pcDNA^TM 3.4

载体。

下述实施例中ExpiCHO-S细胞(购自于赛默飞，货号29127)

下述实施例中HEK293F细胞(购自于赛默飞，货号A14527)常规器材和试剂如下：

1、96孔酶标板(Nunc公司)；

2、铺板缓冲液：浓度为0.05M的NaHCO3溶液；

3、洗涤液(PBST)：仅含0.05％体积百分含量Tween 20的pH为7.0的磷酸盐缓冲液；

4、封闭液：仅含10g/L BSA的洗涤液。

5、辣根过氧化物酶标记亲和素；

6、显色底物：四甲基联苯胺；

7、终止液：1M硫酸。

实施例1、小鼠免疫与杂交瘤筛选

1.1、小鼠免疫

选用4-6周龄的Balb/c小鼠和C57b1/6小鼠各3只，以人LAG-3胞外段和猴LAG-3胞外段为抗原同时免疫小鼠，每2周免疫1次，共免疫4次。第3次免疫后尾静脉采血，ELISA检测抗体效价，取效价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，获得的杂交瘤细胞用于进一步筛选。

1.2、ELISA筛选阳性克隆

用1μg/ml的重组人LAG-3(23L-450L)包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。用PBST洗板3次后依次加入1.1收取的杂交瘤细胞培养上清液，于37℃孵育1小时，再用PBST洗板3次，加入4000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP(Thermo Fisher公司)于37℃孵育45min，PBST洗板3次后加入显色液TMB显色15分钟，450nm波长下测定吸光值。初步筛选到的阳性克隆继续亚克隆，直到所有亚克隆细胞培养上清检测为100％阳性。取克隆阳性并且长势好的单克隆细胞株进行扩大培养，得到LAG-3单克隆抗体杂交瘤细胞株，冻存备用。

1.3、鼠源抗体纯化浓缩

将1.2筛选获得的杂交瘤细胞株逐级扩大培养，取细胞培养液10000rpm离心10分钟，取上清。将所得上清用Protein G亲和层析柱纯化，具体操作方法如下：先用PBS平衡Protein G柱(GE公司)，然后培养液上清过柱，先采用A液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM磷酸钠、500mM NaCl，pH5.0)预洗脱5个柱体积，再采用B液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM醋酸钠、150mM NaCl，pH3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰，然后用30KDa浓缩离心管浓缩获得含有抗体的浓缩液。

1.4、亚型鉴定

初步筛选获得共计8株杂交瘤细胞株，分别为HKL3F6、HKL15A10、HKL5E10、HKL11B6、HKL13H4、HKL9A1、HKL7E5、HKL1G8；抗体亚型鉴定均为IgG1，κ型。对得到的抗LAG-3抗体进行测序，结果表明所得抗LAG-3抗体分子量大小为150Kb，包含重链和轻链，为典型的完整抗体。

1.5、FACS测定鼠源抗LAG-3抗体与人LAG-3的亲和力

将pcDNA3.4-HuLAG3质粒转染ExpiCHO-S细胞，24h后收集细胞进行检测，获得的表达人LAG-3的细胞命名为CHO-S/pcDNA3.4-HuLAG3。胰酶消化CHO-S/pcDNA3.4-HuLAG3细胞，收集细胞并离心去上清、1xPBS重悬计数，添加200μL共计2x10⁵个细胞到EP管中，1000rpm离心2min，以1％BSA(溶于PBS)溶液洗一次，去上清。杂交瘤分泌的鼠源抗LAG-3抗体为待测抗体，将待测抗体用1％BSA稀释到20μg/ml作为起始浓度，4倍倍比稀释，共得到6个不同浓度的抗体，取每个浓度的抗体稀释液100μl，分别加到加有上述CHO-S/pcDNA3.4-HuLAG3细胞的EP管中，重悬细胞进行混匀，4℃避光孵育1小时。孵育完成后加入400ul含2％BSA的1xPBS2000rpm离心5分钟弃上清，重复此操作一次。每EP管加稀释200倍的羊抗鼠IgG-FITC(Jackson公司)100μl，室温孵育0.5小时，加入400ul含2％BSA的1xPBS 2000rpm离心5分钟弃上清，重复此操作一次，清洗之后，加入400ul1xPBS重悬细胞后，上流式细胞仪检测，用GraphPad Prism统计软件处理数据，数据处理结果如表1和图1A、图1B所示。

结果表明：杂交瘤分泌抗体均能与表达人LAG-3的CHO-S细胞特异性结合，其中HKL3F6和HKL13H4，HKL9A1具有更高的亲和力。

表1：FACS测定杂交瘤分泌抗体的亲和力

编号	HKL3F6	HKL15A10	HKL5E10	HKL11B6	HKL13H4	HKL9A1	HKL7E5	HKL1G8
									EC50(ug/ml)	0.982	0.861	4.417	0.937	0.505	0.395	1.939	3.545
R2	0.999	0.998	1	0.998	0.999	0.997	0.999	0.998

1.6、ELISA方法测定鼠源抗体与食蟹猴LAG-3的亲和力

采用ELISA方法测定杂交瘤分泌抗体识别猴的LAG-3的亲和力。具体步骤为：用NaHCO₃将猴LAG-3(Jackson公司)稀释至2μg/mL，每孔100μL加入酶标板中，4℃孵育过夜；PBST洗板3次；每孔350ul 1％BSA(Sangon Biotech公司)加入酶标板中，37℃孵育封闭2小时后；PBST洗板3次；PBST洗板3次；1％BSA稀释待检LAG-3抗体至1000ng/mL，4倍倍比稀释6次，获得7个待测样品浓度，取待测LAG-3抗体每孔100μL加入酶标板中，室温孵育1小时；PBST洗板3次；1％BSA稀释羊抗鼠IgG-HRP 4000倍，每孔100μl加入酶标板中，室温孵育0.5小时；PBST洗板3次；每孔加入TMB 50μL，室温避光显色15分钟；每孔50μL加2mol/LH₂SO₄终止显色反应；将酶标板放入SepctraMax Versa酶标仪中，测定OD_450nm值，用GraphPad Prism统计结果并计算EC50的值，结果如表2所示。结果表明：杂交瘤分泌的鼠源抗体均能识别猴的LAG-3。

表2：鼠源抗体识别猴的LAG-3

编号	HKL1G8	HKL3F6	HKL5E10	HKL7E5	HKL9A1	HKL11B6	HKL13H4	HKL15A10
									EC50(ng/ml)	4.746	5.798	0.035	2.50	0.109	43.450	5.518	0.532
R<sup>2</sup>	0.9520	0.9382	0.9904	0.9548	0.9800	0.9548	0.9586	0.9504

根据与人LAG-3亲和力和与猴LAG-3亲和力的测定结果，HKL13H4和HKL3F6和HKL9A1的亲和力最高，用于嵌合抗体的构建。

实施例2、嵌合抗体构建及筛选

2.1、嵌合抗体构建

收集HKL3F6、HKL13H4和HKL9A1杂交瘤细胞，送至南京金斯瑞生物科技股份有限生物公司进行测序。测序得到鼠源抗体的氨基酸序列如下：

表3：HKL13H4、HKL3F6和HKL9A1可变区氨基酸序列

将HKL3F6、HKL13H4、HKL9A1的轻链和重链可变区氨基酸序列嫁接到到人κappa和IgG1的恒定区，氨基酸序列进行反向翻译为DNA后进行基因合成。进一步以基因工程技术构建到pcDNA3.4载体上，进行瞬时转染HEK293F细胞表达***进行蛋白表达，获得嵌合抗体CHL3F6、CHL13H4、CHL9A1。收获的嵌合抗体采用1.3的方法进行纯化浓缩，保存备用。

2.2、嵌合抗体的PBMC细胞激活效应检测

(1)金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB，购自sigma-aldrich公司)用PBS稀释到0.05ng/ml，得到SEB溶液将嵌合抗体CHL3F6、CHL9A1、CHL13H4利用PBS进行稀释，分别得到浓度为10μg/ml、0.33μg/ml、0.01μg/ml的嵌合抗体溶液。将SEB溶液分别与上述抗体溶液按照1:1的体积比混合均匀后，加入96孔板包板，50μL/孔，设3个复孔，设置50μL/孔SEB溶液作为对照。将96孔板静置于37℃孵育1小时。使用前，用PBS清洗三次。

(2)人PBMC细胞分离：从健康人体中抽取全血，使用淋巴细胞分离液(Sigma公司)，分离获得PBMC细胞计数备用。

(3)按照5×10⁴个/孔的添加量将PBMC细胞加入步骤(1)的96孔细胞培养板中，再将96孔板放于37℃，5％CO₂培养箱中培养3天，收集细胞上清，检测细胞因子IFN-γ的分泌量，实验结果见图2。

结果表明：嵌合抗体CHL3F6、CHL9A1、CHL13H4均能刺激PBMC细胞活化并分泌细胞因子IFN-γ，其中CHL3F6和CHL9A1效果最好。

2.3、体内药效

实验选择B-hPD-1/hLAG3小鼠作为受试小鼠检测LAG-3抗体体内抗肿瘤药效，B-hPD-1/hLAG3小鼠模型是基因工程鼠，是在遗传背景C57BL/6小鼠的基因组嵌合有人源的HuLAG-3基因和HuPD-1基因，购自百奥赛图。

将MC38细胞(小鼠结肠癌细胞，购自于南京科佰)培养至80％满度，胰酶消化，1000rpm离心5min，收集细胞，清洗、离心并重悬细胞，得到细胞悬液，保证细胞活率>95％，计数备用。

在受试小鼠(周龄6-8周，体重为20±0.3g)后背(剃毛)一侧皮下接种MC38细胞(每只小鼠接种100μL共计2×10⁶个细胞)。当荷瘤鼠平均瘤体积达到100-150mm³时，将小鼠随机分6组，每组6只。设置5个实验组，分别为CHL3F6+anti PD-1、CHL9A1+anti PD-1、CHL13H4+anti PD-1、Ab2+anti PD-1、anti-PD-1，以生理盐水作为对照。anti LAG-3给药浓度为5mg/kg，anti PD-1给药浓度为0.1mg/kg。其中，anti PD-1抗体由安徽安科生物工程(集团)股份有限公司提供。

将上述实验用抗体根据注射浓度用生理盐水稀释至相应浓度，保存在4℃冰箱备用。

CHL3F6+anti PD-1组每次注射100ul CHL3F6和anti PD-1溶液(溶剂为生理盐水，溶质为CHL3F6和anti PD-1)使CHL3F6每次给药剂量为5mg/kg体重，anti PD-1每次给药剂量为0.1mg/kg体重，每周给药2次，共给药7次；

CHL9A1+anti PD-1组每次注射100ul CHL9A1和anti PD-1溶液(溶剂为生理盐水，溶质为CHL9A1和anti PD-1)使CHL9A1每次给药剂量为5mg/kg体重，anti PD-1每次给药剂量为0.1mg/kg体重，每周给药2次，共给药7次；

CHL13H4+anti PD-1组每次注射100ul CHL13H4和anti PD-1溶液(溶剂为生理盐水，溶质为CHL13H4和anti PD-1)使CHL13H4每次给药剂量为5mg/kg体重，anti PD-1每次给药剂量为0.1mg/kg体重，每周给药2次，共给药7次；

Ab2+anti PD-1组每次注射100ul Ab2和anti PD-1溶液(溶剂为生理盐水，溶质为Ab2和anti PD-1)使Ab2每次给药剂量为5mg/kg体重，anti PD-1每次给药剂量为0.1mg/kg体重，每周给药2次，共给药7次；

anti PD-1组每次注射100ul anti PD-1溶液(溶剂为生理盐水，溶质为anti PD-1)，使anti PD-1每次给药剂量为0.1mg/kg体重，每周给药2次，共给药7次；

生理盐水组为对照组，每只小鼠皮下注射100ul生理盐水，每周给药2次共给药7次；

在肿瘤接种后，每周两次检查动物生存和活动情况包括：肿瘤生长情况、体重、活动能力、饮食状况并记录。

肿瘤生长结果见图3，结果表明：相比于生理盐水，各实验组抗体均能抑制MC38肿瘤生长；其中ChL13H4和ChL3F6与PD-1联合给药对肿瘤抑制效果最好。

实施例3、人源化抗体构建及表达

3.1、人源化抗体构建

采用同源序列建模-抗体互补结构区(complementary determining region,CDRs)移植-框架区(framework region，FR)关键氨基酸回突变(back mutation)技术对嵌合抗体CHL13H4和CHL3F6分别进行人源化设计。

分析抗体CHL13H4基因序列，然后通过抗体Fab的同源建模与优化，表面扫描确定人源化突变位点，虚拟突变与分子动力学模拟，确定关键氨基酸等一系列分析设计合理的人源化抗体。最终得到4条重链候选序列和3条轻链候选序列，组合得到12个候选抗体，用于如本实施例所述进一步鉴定。12个候选抗体分别为HuL13H4-H1L1、HuL13H4-H1L2、HuL13H4-H1L3、HuL13H4-H2L1、HuL13H4-H2L2、HuL13H4-H2L3、HuL13H4-H3L1、HuL13H4-H3L2、HuL13H4-H3L3、HuL13H4-H4L1、HuL13H4-H4L2、HuL13H4-H4L3。

分析抗体CHL3F6基因序列，然后通过抗体Fab的同源建模与优化，表面扫描确定人源化突变位点，虚拟突变与分子动力学模拟，确定关键氨基酸等一系列分析设计合理的人源化抗体。最终得到3条重链可变区(VH)候选序列和3条轻链可变区(VL)候选序列。VH候选序列和VL候选序列组合得到9个候选抗体，用于进一步鉴定。9个候选抗体分别为：HuL3F6-H1L1、HuL3F6-H1L2、HuL3F6-H1L3、HuL3F6-H2L1、HuL3F6-H2L2、HuL3F6-H2L3、HuL3F6-H3L1、HuL3F6-H3L2、HuL3F6-H3L3。

可变区候选序列的氨基酸序列如表4所示

表4：可变区候选序列的氨基酸序列列表

3.2、FACS测定人源化抗LAG-3抗体与人LAG-3的亲和力

将pcDNA3.4-HuLAG3质粒转染CHO-S细胞，24h后收集细胞进行检测，获得的表达人LAG-3的细胞命名为CHO-S/pcDNA3.4-HuLAG3。胰酶消化CHO-S/pcDNA3.4-HuLAG3细胞，收集细胞离心去上清、1xPBS重悬计数，将细胞数调整到每EP管1.5x10⁵个细胞，1000rpm离心2min，以1％BSA(溶于PBS)溶液洗一次，去上清。人源化抗LAG-3抗体为待测抗体，将待测抗体用1％BSA稀释到30μg/ml作为起始浓度，3倍倍比稀释5次得到6个不同浓度的抗体，取每个浓度的抗体稀释液100μl，分别加到加有上述CHO-S/pcDNA3.4-HuLAG3细胞的EP管中，重悬细胞进行混匀，4℃避光孵育1小时，以1％BSA稀释液作为阴性对照。孵育完成后加入400ul含2％BSA的1xPBS 2000rpm离心5分钟弃上清，重复此操作一次。每EP管加稀释200倍的羊抗人IgG-FITC(Jackson公司)100μl，室温孵育0.5小时，加入400ul含2％BSA的1xPBS2000rpm离心5分钟弃上清，重复此操作一次，清洗之后，加入400ul 1xPBS重悬细胞后，上流式细胞仪检测，用GraphPad Prism统计软件处理数据。

HuL13H4的亲和力结果如表5.1和图4A、图4B、图4C所示。

HuL3F6的亲和力结果如表5.2和图5A、图5B所示。

表5.1：HuL13H4抗体识别人LAG-3

表5.2：HuL3F6抗体分子识别人LAG-3

名称	HuL3F6-H1L1	HuL3F6-H1L2	HuL3F6-H1L3	HuL3F6-H2L1	HuL3F6-H2L2
						EC50(μg/ml)	1.542	1.453	1.402	1.112	1.038
名称	HuL3F6-H2L3	HuL3F6-H3L1	HuL3F6-H3L2	HuL3F6-H3L3
						EC50(μg/ml)	2.450	2.857	3.950	4.906

实施例4、亲和力成熟和潜在脱酰胺位点突变

4.1、HuL13H4-H1L3亲和力成熟和潜在脱酰胺位点突变

4.1.1、HuL13H4-H1L3亲和力成熟候选分子的获得

将HuL13H4-H1L3人源化分子构建成单链抗体形式，即VH-(G4S)3-VL-Fc，HuL13H4-H1L3的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。亲和力成熟交给Abstudio公司对轻链和重链的CDR区进行改造，得出5个候选分子，scF-HuL13H4-2B8-Fc、scFv-HuL13H4-F4-Fc、scFv-HuL13H4-2E8、scFv-HuL13H4-2B4-Fc、scFv-HuL13H4-2A6-Fc。

4.1.2、FACS测定HuL13H4-H1L3亲和力成熟候选分子的亲和力

将pcDNA3.4-HuLAG3质粒转染ExpiCHO-S细胞，24h后收集细胞进行检测，获得的表达抗原人LAG-3的细胞命名为ExpiCHO-S/pcDNA3.4-HuLAG3。

胰酶消化ExpiCHO-S/pcDNA3.4-HuLAG-3细胞，收集细胞离心去上清、1xPBS重悬计数，将细胞数调整到每EP管1.5x10⁵个细胞，1000rpm离心2min，以1％BSA(溶于PBS)溶液洗一次，去上清。亲和力成熟获得的单链抗体为待测抗体，将待测抗体用1％BSA稀释到30μg/ml作为起始浓度，3倍倍比稀释5次得到6个不同浓度的抗体，取每个浓度的抗体稀释液100μl，分别加到加有上述CHO-S/pcDNA3.4-HuLAG3细胞的EP管中，重悬细胞进行混匀，4℃避光孵育1小时，以1％BSA稀释液作为阴性对照。孵育完成后加入400ul含2％BSA的1xPBS2000rpm离心5分钟弃上清，重复此操作一次。每EP管加稀释200倍的羊抗人IgG-FITC(Jackson公司)100μl，室温孵育0.5小时，加入400ul含2％BSA的1xPBS 2000rpm离心5分钟弃上清，重复此操作一次，清洗之后，加入400ul 1xPBS重悬细胞，上流式细胞仪检测，用GraphPad Prism统计软件处理数据，数据处理结果如表6和图6所示。结果表明：scFv-L13H4-F4-Fc和scFv-L13H4-2B4-Fc具有更高的亲和力。

表6：HKL13H4亲和力成熟候选亲和-ScFv

优选scFv-L13H4-F4-Fc和scFv-L13H4-2B4-Fc作为候选，其中scFv-L13H4-F4-Fc的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.3第1-106位所示，其重链可变区序列保持与HuL13-H1L3人源化分子一致，如SEQ ID No.6所示；scFv-L13H4-2B4-Fc的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，其重链可变区序列保持与HuL13-H1L3人源化分子一致，如SEQ IDNo.6所示。将scFv-L13H4-F4-Fc和scFv-L13H4-2B4-Fc还原成完整抗体，即将重链可变区嫁接到重链恒定区(IgG1亚型，具有L234A和L235A突变，其氨基酸序列如SEQ ID No.1第121-450位所示)上，将轻链可变区嫁接到轻链恒定区(即Kappa亚型，其氨基酸序列如SEQ IDNo.3第107-213位所示)上，得到抗体HuL13H4-2B4和HuL13H4-F4。进一步通过FACS检测其对人LAG-3的结合能力，具体实验过程同4.1.2，结果如图7所示。

4.1.3、HuL13H4-2B4和HuL13H4-F4潜在脱酰胺位点突变

抗体HankeL13，为亲和力成熟抗体HuL13H4-F4突变获得的，重链可变区第104位或105位天冬酰胺进行突变，以避免潜在的脱酰胺位点，该突变可以是将第104位的天冬酰胺突变为谷氨酸或丙氨酸，或者将第105位的天冬酰胺突变为谷氨酸或丙氨酸，或者将第104位和第105位的天冬酰胺同时进行突变，优选将第104位的天冬酰胺突变为谷氨酸，保持HuL13H4-F4其他序列不变。突变后的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID.1第1-120位所示；优选重链恒定区IgG1亚型并进行L234A和L235A突变。HankeL3的重链全长氨基酸序列如SEQID No.1所示，其编码链的编码序列如SEQ ID No.2所示；HankeL3轻链全长氨基酸序列如SEQ ID.3所示，其编码链的编码序列如SEQ ID.4所示。

4.2、HuL3F6-H2L2潜在脱酰胺位点突变

抗体HankeL3，为人源化抗体HuL3F6-H2L2突变获得的，重链可变区进行G56A突变，以避免潜在的脱酰胺位点；保持HuL3F6-H2L2其他序列不变。突变后的重链可变区序列如SEQ ID.8第1-116位所示；优选重链恒定区IgG1亚型并进行L234A和L235A突变，HankeL3的重链全长氨基酸序列如SEQ ID.8所示，其编码链的编码序列如SEQ ID.9所示；HankeL3轻链全长氨基酸序列如SEQ ID.10所示，其编码链的编码序列如SEQ ID.11所示。

实施例5、抗体HankeL13和HankeL3的表达与功能验证

5.1、抗体HankeL13和HankeL3表达与纯化

根据测序得到的基因序列，合成全长基因序列，HankeL13抗体的重链编码基因如SEQ ID No.2所示，HankeL13抗体的轻链编码基因如SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.2的第1-360位为HankeL13抗体重链可变区VH的编码基因，其中CDR1、CDR2和CDR3的编码序列分别如SEQ ID No.2的第76-105位、第148-198位、第295-327位所示。SEQ ID No.4的第1-318位为HankeL13抗体轻链可变区VL的编码基因，其中CDR1、CDR2和CDR3的编码序列分别如SEQ IDNo.4的第69-102位、第148-168位、第265-288位所示。

根据测序得到的基因序列，合成全长基因，HankeL3抗体重链的编码基因如SEQ IDNo.9所示，HankeL3抗体轻链的编码基因如SEQ ID No.11所示。SEQ ID No.9的第1-348位为HankeL3抗体重链可变区VH的编码基因，其中CDR1、CDR2和CDR3的编码序列分别如SEQ IDNo.9的第76-105位、第148-198位、第277-315位所示。SEQ ID No.11的第1-321位为HankeL3抗体轻链可变区VL的编码基因，其中CDR1、CDR2和CDR3的编码序列分别如SEQ ID No.11的第69-102位、第148-168位、第265-291位所示。

将SEQ ID No.2或SEQ ID No.9所示DNA片段(抗体重链的编码基因)克隆到载体pcDNA3.4的酶切位点Xba I和Hind III之间后得到表达所述抗体的重链的重组表达载体，分别命名为pcDNA3.4-HankeL13-H和pcDNA3.4-HankeL3-H；为了更加有利于蛋白表达，构建所述抗体的重链的重组表达载体时，在SEQ ID No.2或SEQ ID No.9所示DNA片段(抗体重链编码基因)的5'上游还依次引入了XbaI酶切位点、kozak共识别序列(5'-GCCACC-3')和singal peptide的编码序列(5'-ATGGAGTTTGGACTGTCTTGGGTGTTCCTGGTGGCTATCCTGAAAGGAGTCCAGTGC-3')，在SEQ ID No.2或SEQ ID No.9所示DNA片段(抗体重链编码基因)的3'下游引入终止密码子TGA及HindIII酶切位点。将上述基因序列送至南京金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成，随后用XbaI和HindIII酶切位点进行酶切，连接至XbaI和HindIII酶切的pcDNA3.4载体上。

将SEQ ID No.4或SEQ ID No.11所示DNA片段(抗体轻链的编码基因)克隆到pcDNA3.4载体的酶切位点Xba I和Hind III之间后得到表达所述抗体的轻链的重组表达载体(命名分别为pcDNA3.4-HankeL3-L和pcDNA3.4-HankeL13-L)。为了更加有利于蛋白表达，构建所述抗体的轻链的重组表达载体时，在SEQ ID No.4或SEQ ID No.11所示DNA片段(抗体轻链的编码基因)的5'上游还依次引入了XbaI酶切位点、kozak共识别序列(5'-GCCACC-3')和singal peptide的编码序列(5'-ATGGAAACAGATACACTCCTCCTCTGGGTGCTGCTCCTCTGGGTGCCAGGATCTACAGGA-3')，在SEQ ID No.4或SEQ ID No.11所示DNA片段(抗体重链编码基因)的3'下游引入终止密码子TGA及HindIII酶切位点。将上述基因序列送至南京金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成，随后用XbaI和HindIII酶切位点进行酶切，连接至XbaI和HindIII酶切酶切的pcDNA3.4载体上。

将pcDNA3.4-HankeL13-H和pcDNA3.4-HankeL13-L导入到人胚胎肾细胞系HEK293F，得到重组细胞HEK293F/pcDNA3.4-HankeL13。重组细胞HEK293F/pcDNA3.4-HankeL13可表达抗体HankeL13。

将pcDNA3.4-HankeL3-H和pcDNA3.4-HankeL3-L导入到人胚胎肾细胞系HEK293F，得到重组细胞HEK293F/pcDNA3.4-HankeL3。重组细胞HEK293F/pcDNA3.4-HankeL3可表达抗体HankeL3。

然后将重组细胞HEK293F/pcDNA3.4-HankeL13和HEK293F/pcDNA3.4-HankeL3分别在37℃、5％CO₂振荡培养箱中培养，转速120rpm。

利用Protein A亲和层析柱从培养上清中纯化抗体蛋白。具体操作是：先用PBS平衡Protein A柱(GE公司)，然后培养上清过柱，先采用A液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM磷酸钠、500mM NaCl，pH5.0)预洗脱5个柱体积，再采用B液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM醋酸钠、150mM NaCl，pH3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰，然后30KDa浓缩离心管浓缩获得所述抗体即获得抗人LAG-3抗体(HankeL3和HankeL13)。

对抗体HankeL13进行测序，结果显示，所得抗人LAG-3抗体HankeL13由重链和轻链组成，重链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其CDR1、CDR2和CDR3的序列分别如SEQ IDNo.1自N端起第第26-35位、第50-66位、第99-109位所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其CDR1、CDR2和CDR3的序列分别如SEQ ID No.3自N端起第24-34位、第50-56位、第89-96位所示。

所得抗人LAG-3抗体HankeL3为完整抗体，由重链和轻链组成，重链的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，其CDR1、CDR2和CDR3的序列分别如SEQ ID No.8自N端起第26-35位、第50-66位、第97-105位所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，其CDR1、CDR2和CDR3的序列分别如SEQ ID No.10自N端起第24-34位、第50-56位、第89-97位所示。

5.2、抗体HankeL13和HankeL3对人、猴、鼠LAG-3亲和力鉴定

5.2.1、抗原制备

分别在人、猴、鼠LAG3抗原胞外区的基因序列5'末端依次加上XbaI酶切位点、kozak共识别序列(5'-GCCACC-3')，3'末端依次加上鼠Fc的基因序列、终止密码子TGA和HindIII酶切位点，将上述基因序列送至南京金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成，随后用XbaI和HindIII酶切位点进行酶切，连接至同样酶切的pcDNA3.4载体上，分别得到pcDNA3.4/HuLAG3-Fc、pcDNA3.4/CyLAG3-Fc和pcDNA3.4/MuLAG3-Fc载体。将pcDNA3.4/HuLAG3-Fc、pcDNA3.4/CyLAG3-Fc和pcDNA3.4/MuLAG3-Fc载体分别导入到HEK293F细胞中，37℃、5％CO₂振荡培养箱中培养，转速120rpm。3天后收取细胞上清，利用Protein A亲和层析柱从培养上清中纯化抗体蛋白。具体操作同5.1。分别获得HuLAG-3-Fc、CyLAG-3-Fc和MuLAG-3-Fc抗原蛋白，蛋白氨基酸序列如表7所示。

表7：表达的人/鼠/猴蛋白氨基酸序列

5.2.2、抗体HankeL13和HankeL3对人LAG-3亲和力测定

待测抗体与Ab1的表位竞争测定方法为：用NaHCO3稀释羊抗鼠Fc(Jackson公司)至工作浓度，每孔100μl加入酶标板中，4℃孵育过夜；PBST洗板3次；每孔200ul 5％NON-FatMilk(Sangon Biotech公司)加入酶标板中，37℃孵育封闭2小时后；PBST洗板3次；再用1％NON-Fat Milk稀释HuLAG-3-Fc抗原(5.2.1中自制)至1ug/ml，每孔100μl加入酶标板中，4℃孵育过夜，PBST洗板3次；抗体HankeL13和HankeL3作为待测抗体，1％NON-Fat Milk稀释待检样品4倍倍比稀释6次获得7个梯度浓度，最高浓度50nM，每孔100μl加入酶标板中，以Ab1为阳性对照；室温孵育1小时；PBST洗板3次；1％NON-Fat Milk稀释羊抗人-HRP，每孔100μl加入酶标板中，室温孵育0.5小时；PBST洗板3次；每孔加入TMB，室温避光显色；加H₂SO₄终止显色反应；将酶标板放入SepctraMax Versa酶标仪中，在450nm下测定吸光值(OD值)，用GraphPad Prism统计结果并计算EC50的值。

抗体HankeL13和HankeL3对猴、鼠LAG-3亲和力测定方法同上，仅需要把人LAG-3换成猴LAG-3(5.2.1中自制)和鼠LAG-3(5.2.1中自制)，最高浓度分别为10nM和2ug/ml，其余步骤同上。

实验结果见表8和图8A、图8B、图8C。结果表明抗体HankeL13和HankeL3与人LAG-3和猴LAG-3均能识别，与鼠有较弱的结合。

表8：ELISA测定单克隆抗体与人/猴/鼠LAG-3抗原的结合(EC50(nM))

抗体	HankeL3	HankeL13	Ab1	Ab2	Anti-Mouse-LAG-3
						人LAG-3	0.2395	0.7137	1.236	NA	NA
猴LAG-3	0.196	1.466	NA	0.145	NA
						鼠LAG-3	25.42	19228	NA	NA	0.0467

5.3、配体竞争

5.3.1、HankeL13和HankeL3与配体MHCII竞争结合活性测定

使用A375细胞(表达MHCII，购自南京科佰生物科技有限公司)检测抗体HankeL3和HankeL13与配体MHCII分子竞争结合LAG-3抗原活性，以Ab1和Ab2为阳性对照，以IgG1为阴性对照。(1)胰酶消化培养24h的A375细胞，收集细胞并离心去上清、1xPBS重悬计数，添加200μL共计2x10⁵个细胞到1.5mL EP管中。(2)HankeL13和HankeL3为待测抗体，用PBS稀释待测抗体至25uM，5倍倍比稀释6次获得7个浓度的抗体待测溶液，用PBS稀释HuLAG-3-Fc抗原(5.2.1中自制)浓度至250nM，把抗原抗体稀释液等体积混合共计100ul加入到步骤(1)所述EP管中，室温孵育1小时，2000rpm离心3分钟，加入PBS重悬细胞后，2000rpm离心3分钟，弃上清。(3)加入200倍稀释的羊抗鼠-FITC二抗，室温孵育30分钟，2000rpm离心3分钟，加入PBS重悬细胞后，2000rpm离心3分钟，弃上清，加入400ul PBS重悬上机检测。用GraphPad Prism统计结果并计算IC50的值。

结果如表9和图10所示。结果表明：抗体HankeL13和HankeL3可阻断抗原与配体MHCII的结合。

表9：FACS检测LAG-3抗原与配体MHCII分子的阻断

	HankeL3	HankeL13	Ab1	Ab2	IgG
						IC50(uM)	0.047	0.045	0.031	0.034	NA

5.3.2、HankeL13和HankeL3与配体FGL1竞争结合活性测定

使用ELISA检测anti LAG-3抗体与人FGL1竞争结合LAG-3抗原的活性，以Ab1和Ab2为阳性对照，以IgG1为阴性对照。NaHCO3稀释FGL1-hFc(Acro公司，货号FG1-H5258)至1ug/ml，每孔100μl加入酶标板中，4℃孵育过夜；PBST洗板3次；每孔200ul 1％BSA(SangonBiotech公司)加入酶标板中，37℃孵育封闭2小时后；PBST洗板3次；用1％BSA稀释抗原HuLAG-3-Fc抗原(5.2.1中自制)，用1％BSA稀释LAG-3抗体至200nM，2倍倍比稀释6次获得7个浓度梯度，抗原抗体等体积混合后，每孔100μl加入酶标板中，室温孵育1小时；PBST洗板3次；1％BSA稀释羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl加入酶标板中，室温孵育0.5小时；PBST洗板3次；每孔加入TMB，室温避光显色；加H₂SO₄终止显色反应；将酶标板放入SepctraMax Versa酶标仪中，在450nm下测定吸光值(OD值)，用GraphPad Prism统计结果并计算IC50值。

实验结果如表10和图10所示。结果表明：抗体HankeL13和HankeL3可有效阻断LAG-3抗原与配体FGL1的结合。

表10：ELISA检测LAG-3抗原与配体FGL-1分子的阻断

	HankeL3	HankeL13	Ab1	Ab2	IgG
						IC50(nM)	0.579	1.625	0.998	1.525	NA

5.4、抗原表位结合分析

5.4.1、抗原结合Domain表位分析

分别将人LAG-3抗原胞外Domain 1(37G-167G)、Domain 2(168Q-252S)、Domain 3(265P-343N)和Domain 4(348L-419R)或其组合用鼠TIM-3相应胞外区替代，合成相应的目的基因，分别***pcDNA3.4载体得到不同人鼠嵌合LAG-3抗原的DNA质粒，通过将质粒导入HEK293F细胞中，24h后收集细胞进行FACS检测，具体见表11。将细胞数用PBS溶液调整到每EP管2x105个细胞，1000rpm离心2min，以1％BSA(溶于PBS)溶液洗一次，去上清。将待测抗体Ab1、HankeL13、HankeL3用1％BSA稀释到30μg/ml，分别加到上述表达不同人鼠嵌合抗原的HEK293F细胞中，混匀，4℃避光孵育1小时。孵育完成后加入400ul含2％BSA的1xPBS2000rpm离心5分钟弃上清，重复此操作一次。每EP管加稀释200倍的羊抗人IgG-FITC(Jackson公司)100μl，室温孵育0.5小时，加入400ul含2％BSA的1xPBS 2000rpm离心5分钟弃上清，重复此操作一次，清洗之后，加入400ul 1xPBS重悬细胞后，上流式细胞仪检测。

通过上述操作，可以得知Ab1的荧光强度趋势在细胞C、D、E和F组降低，说明Ab1主要结合人LAG-3胞外区的Doamin1和Domain2；HankeL13和HankeL3的荧光强度趋势在细胞C、E和F组降低，说明HankeL13和HankeL3主要结合人LAG-3胞外区的Domain1。具体结果见表11。

表11：抗体结合不同人鼠嵌合LAG-3抗原表位平均荧光强度分析

细胞序号	抗原具体组合结构	Ab1	HankeL13	HankeL3
					A	人LAG-3全长	14440.9	13141.1	6296.5
B	人LAG-3 Domain1-2+鼠LAG-3 Domain 3-4	13543.1	11802.4	6101.2
					C	鼠LAG-3 Domain1-2+人LAG-3 Domain 3-4	675.5	6464.6	734
D	人LAG-3 Domain1+鼠LAG-3 Domain 2-4	8787.1	12338.4	7721.4
					E	人LAG-3 Domain2+鼠LAG-3 Domain 1、3-4	709.9	8103.8	558.2
F	鼠LAG-3全长	590.6	8889.5	619.4

5.4.2、与阳性对照抗体表位竞争

使用ELISA检测法比较HankeL3和HankeL13抗体与对照抗体Ab1、Ab2表位竞争关系。

待测抗体与Ab1的表位竞争测定方法为：用NaHCO₃稀释羊抗鼠Fc(Jackson公司)至工作浓度，每孔100μl加入酶标板中，4℃孵育过夜；PBST洗板3次；每孔200ul 5％NON-FatMilk(Sangon Biotech公司)加入酶标板中，37℃孵育封闭2小时后；PBST洗板3次；再用1％NON-Fat Milk稀释HuLAG-3-Fc抗原(5.2.1中自制)至1ug/ml，每孔100μl加入酶标板中，室温孵育1小时；PBST洗板3次。用链霉亲和素-生物素(SA-Biotin生物素，SA)标记阳性对照抗体Ab1，用NON-Fat Milk稀释生物素标记的Ab1至浓度为2nM记为溶液A，同时用NON-FatMilk分别配制未被标记的Ab1、HankeL3、HankeL13和IgG至2μM，5倍稀释1个点，随后10倍梯度稀释4个点，标记为B溶液。将A溶液与各浓度的B溶液各取50μL混合后加入LAG-3抗原包被的96孔板中，室温孵育1小时，PBST洗板3次。每孔加入100μL8000倍稀释的SA-HRP(Biolegend公司)，室温孵育0.5小时，PBST洗板3次，每孔加入TMB，室温避光显色；加H₂SO₄终止显色反应；将酶标板放入SepctraMax Versa酶标仪中，在450nm下测定吸光值，用GraphPad Prism统计结果并计算EC50的值。

待测抗体与Ab2的表位竞争测定方法同上，将A液换为浓度为2nM的生物素标记的Ab2。

具体结果见表12以及图11A和图11B所示。实验表明HankeL13和HankeL3与阳性对照抗体Ab1和Ab2的抗原结合表位不同。

表12：ELISA检测表位竞争(OD_450nm)

5.5、体内药效

A20肿瘤模型

实验选择PBMC重建小鼠A20模型检测LAG-3抗体体内抗肿瘤药效。B-NDG B2M KOplus小鼠是在基因敲除鼠B2m基因的同时，表达了融合在FcRn基因中的B2m基因。这种小鼠结合了B-NDG小鼠背景同时存在MHC I类缺失。基因工程鼠B-NDG B2M KO plus小鼠，购自百奥赛图。

将A20细胞(小鼠B细胞性淋巴瘤，购买自南京科佰，货号：Cobioer/cbp60279)养至80％满度，胰酶消化，1000rpm离心5min，收集细胞，清洗、离心并用重悬液重悬细胞，得到细胞悬液，保证细胞活率>95％，计数备用。

在受试B-NDG B2M KO plus小鼠(周龄6-8周，体重为20±0.3g)后背(剃毛)一侧皮下接种A20细胞系(每只小鼠接种2×10⁶个细胞，100μl)。5天后接种人的PBMC(每只小鼠接种5×10⁶个细胞)。当荷瘤鼠平均瘤体积达到约50mm³时，将小鼠随机分入6组，每组6只。共设计5个实验组，分别为：Ab1+Keytruda组、Ab2+Keytruda组、HankelL3+Keytruda组、HankelL13+Keytruda组和Keytruda组，以生理盐水作为对照。

Ab1+Keytruda组每次注射100ul Ab1和Keytruda溶液(溶剂为生理盐水，溶质为Ab1和Keytruda)使Ab1每次给药剂量为10mg/kg体重，Keytruda每次给药剂量为10mg/kg体重，每周给药2次，共给药2周；

Ab2+Keytruda组每次注射100ul Ab2和Keytruda溶液(溶剂为生理盐水，溶质为Ab2和Keytruda)使Ab2每次给药剂量为10mg/kg体重，Keytruda每次给药剂量为10mg/kg体重，每周给药2次，共给药2周；

HankelL3+Keytruda组每次注射100ul HankelL3和Keytruda溶液(溶剂为生理盐水，溶质为HankelL3和Keytruda)使HankelL3每次给药剂量为10mg/kg体重，Keytruda每次给药剂量为10mg/kg体重，每周给药2次，共给药2周；

HankelL13+Keytruda组每次注射100ul HankelL13和Keytruda溶液(溶剂为生理盐水，溶质为HankelL13和Keytruda)使HankelL13每次给药剂量为10mg/kg体重，Keytruda每次给药剂量为10mg/kg体重，每周给药2次，共给药2周；

Keytruda组每次注射100ul Keytruda溶液(溶剂为生理盐水，溶质为Keytruda)使Keytruda每次给药剂量为10mg/kg体重，每周给药2次，共给药2周；

生理盐水组为对照组，每只小鼠皮下注射100ul生理盐水，每周给药2次共给药2周；

帕博利珠单抗注射液(Keytruda，购自MSD ireland，进口药品注册证号：S20180019)，将上述抗体根据浓度需要用生理盐水稀释，保存在4℃冰箱。

肿瘤体积见图12(0天为接种肿瘤当天)，结果表明相比于生理盐水，各实验组抗体均能抑制A20肿瘤生长，并且不影响小鼠活动能力及体重；其中HankelL13+Keytruda实验组在所有实验组中对肿瘤抑制效果最好。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 合肥瀚科迈博生物技术有限公司

<120> LAG-3结合分子及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Asp Arg Tyr Glu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 2

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagtgcagc tggtgcagtc tggagcagaa gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

tcttgtaagg cttccggcta tacctttacc gactacaaca tccattgggt gagacaggct 120

ccaggaaagg gcctcgagtg gatcggatac atctaccctt acacaggcgg cacaggctat 180

aatcagaagt tcaagaacag ggtgaccctg acagtggata catctatctc caccgcctac 240

atggaactgt ctagactgag atccgaggac acagcagtgt actattgcgc tagatccgga 300

gataggtacg aagacgctat ggactattgg ggacagggaa catcagtgac agtgtcttcc 360

gcttctacaa aggggccctc cgtgtttcct ctggctcctt cttctaagtc tacaagcgga 420

ggaacagcag ctctgggttg tctggtgaag gattacttcc cagagccagt gacagtgtct 480

tggaactccg gagctctgac ctcaggagtg catacatttc cagcagtgct gcagagttca 540

ggactgtatt ctctgtcttc cgtggtgaca gtgccttctt cttctctggg aacacagacc 600

tacatttgca acgtgaacca caagccctcc aacacaaagg tggacaagag agtggagcct 660

aagtcttgcg acaagaccca cacttgtcct ccttgtccag ctccagaagc agcaggagga 720

ccttccgtgt ttctgtttcc tcctaagcct aaggacaccc tgatgatctc cagaacacca 780

gaagtgactt gcgtggtggt ggacgtgtct cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaattgg 840

tacgtggacg gagtggaagt gcataacgct aaaaccaagc ctagagagga gcagtacaac 900

tctacctaca gagtggtgtc agtgctgaca gtgctgcatc aggattggct gaacggaaag 960

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct ctgccagctc ctattgaaaa gaccatctct 1020

aaggctaagg gacagcctag agaacctcag gtgtacaccc tgcctccttc ccgggaggag 1080

atgaccaaga accaggtgtc tctgacttgt ctggtgaagg gattctaccc ttccgacatc 1140

gccgtcgagt gggaatctaa cggacagcca gagaacaact ataagaccac ccctcctgtg 1200

ctggattcag acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggataa gtctaggtgg 1260

cagcagggaa acgtgttctc ttgtagcgtg atgcacgaag ctctgcataa ccactacaca 1320

cagaagtctc tgtctctgtc tccaggaaag 1350

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ser Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Gly His Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacatccaga tgacccagtc tccttcttct ctgtctgctt cagtgggaga tagagtgacc 60

atcacctgta gagcttctca ggacatctcc aactacctca actggtacca gcagaagcca 120

gacggatctc tgaagctgct gatctctttc acctccagac tgcattccgg agtgccttct 180

agattctctg gctccggctc tagaaccgac tttacactga caatctctag tctgcagcca 240

gaggacgtgg ctacatatta ttgccagcag ggaatcggcc attggacatt tggcggagga 300

acaaaggtgg agatcaagag aaccgtggct gctccttccg tgtttatttt ccctccttct 360

gacgaacagc tgaaatccgg aacagcttca gtcgtctgcc tgctgaacaa cttctaccct 420

agagaggcca aagtccagtg gaaagtggat aacgctctgc agtccggaaa ttctcaggaa 480

tccgtgaccg agcaggattc taaggattct acctactccc tgtcttctac cctgacactg 540

tctaaggccg attacgagaa gcacaaggtg tacgcttgcg aagtgacaca tcagggactg 600

tcttctccag tgaccaagtc cttcaacaga ggcgagtgt 639

<210> 5

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ser Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Arg Gln Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Asp Arg Tyr Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ser Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Ala Asp Thr Glu Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Arg Glu Pro Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 9

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggttcagc tggtgcagag cggagctgaa gtgaagaagc ccggagcttc cgtgaagctg 60

tcctgtacag cttccggctt caatatcaag gactacttca tccactgggt gcggcagaga 120

cctggacagg gactggagtg gatgggatgg atcgacccag agaacgctga caccgagtac 180

gatcccaagt tccagggcag ggctaccatg acagtggata ccagcatctc caccgcctac 240

ctggagttgt ccaggttgag aagcgaggac accgccgttt actattgcaa cgccagggag 300

cctggcctgg attattgggg acagggtacc ctggtgacag tgagctctgc ctctaccaag 360

gggcccagcg tgttcccact ggccccctct agcaagtcta ccagcggagg cacagccgcc 420

ctgggatgcc tggtgaagga ctacttccca gagccagtga ccgtgagctg gaactccggc 480

gccctgacca gcggagtgca cacatttcca gccgtgctgc agtcctctgg cctgtactcc 540

ctgagctccg tggtgaccgt gccctctagc tccctgggca cccagacata tatctgcaac 600

gtgaatcaca agccatctaa tacaaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgtgat 660

aagacccaca catgcccccc ttgtcctgca ccagaggccg ccggcggccc tagcgtgttc 720

ctgtttccac ccaagcctaa ggacaccctg atgatctccc ggaccccaga ggtgacatgc 780

gtggtggtgg acgtgtctca cgaggacccc gaggtgaagt ttaactggta cgtggatggc 840

gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcct cgggaggagc agtacaacag cacctataga 900

gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtataagtgc 960

aaggtgagca ataaggccct gcccgcccct atcgagaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020

cagcctaggg agccacaggt ctatacactg cctccaagcc gcgacgagct gaccaagaac 1080

caggtgtccc tgacatgtct ggtgaagggc ttctatcctt ccgatatcgc cgtggagtgg 1140

gagtctaatg gccagccaga gaacaattac aagaccacac cccctgtgct ggactctgat 1200

ggcagcttct ttctgtattc taagctgacc gtggataaga gcaggtggca gcagggcaac 1260

gtgttttcct gctctgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actatacaca gaagagcctg 1320

tccctgtctc ccggcaag 1338

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asp Ile Gly Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatgtgcaga tgacccagag cccatcctcc ttgagcgctt ctctgggaga cagagtgacc 60

atcacctgca gatcctccca ggacatcggc tcttatctga actggttcca acagaagcct 120

gacggcacca tcaagctgct gatctattac acctccaccc tgcactccgg cgtgccttcc 180

aggttctccg gatccggatc tggaaccgat ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240

gaagactttg ccacctactt ttgccagcag ggctacaccc tgccttatac ctttggccag 300

ggtaccaagc tggagatcaa gaggaccgtg gccgctccat ccgtgttcat ctttccccct 360

agcgacgagc agctgaagag cggcacagct tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 420

cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagagcgg caattctcag 480

gagtccgtga ccgagcagga cagcaaggat tctacatatt ccctgagctc taccctgaca 540

ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac ccatcagggc 600

ctgtccagcc ccgtgacaaa gtcttttaac aggggcgagt gt 642

<210> 12

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Arg Glu Pro Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

Claims

1.LAG-3结合分子，其特征在于，所述LAG-3结合分子包括LAG-3抗体、或所述LAG-3抗体的抗原结合片段、或含有所述LAG-3抗体的融合蛋白、或含有所述抗原结合片段的融合蛋白、或含有所述LAG-3抗体的抗体药物偶联物、或含有所述抗原结合片段的抗体药物偶联物、或含有所述LAG-3抗体的双特异性抗体或含有所述抗原结合片段的双特异性抗体，所述LAG-3结合分子含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含下述13H4)或3F6)所述的CDR序列，

3F6)重链可变区中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.8第26-35位所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.8第50-66位或SEQ ID No.12第50-66位所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQID No.8第97-105位所示；轻链可变区中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.10第24-34位所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.10第50-56位所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.10第89-97位所示。

2.如权利要求1所述的LAG-3结合分子，其特征在于：

13H4)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1第1-120位或SEQ ID No.6所示，或与SEQ ID No.1第1-120位或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3第1-106位或SEQ ID No.5或SEQ ID No.7所示，或与SEQ ID No.3第1-106位或SEQ ID No.5或SEQ ID No.7所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性；

3F6)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8第1-116位或SEQ ID No.12所示，或与SEQ ID No.8第1-116位或SEQ ID No.12所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.10第1-107位所示，或与SEQ ID No.10第1-107位所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性。

3.如权利要求1或2所述的LAG-3结合分子，其特征在于：所述LAG-3抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的类别为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD；所述轻链恒定区的类别为κ链或λ链。

4.如权利要求1-3任一项所述的LAG-3结合分子，其特征在于，所述LAG-3抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性；或重链的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，或与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，或与SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性。

5.如权利要求1或2所述的LAG-3结合分子，其特征在于：所述抗原结合片段包括：Fab、Fab'、F(ab')₂、Fab'-SH、Fv、ScFv中的一种或几种组合。

6.与权利要求1-5任一项所述LAG-3结合分子相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述任一种：

B1)编码权利要求1至5任一项所述LAG-3结合分子的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B7)产生权利要求1至5任一项所述LAG-3结合分子的宿主细胞。

7.如权利要求5所述的生物材料，其特征在于，B1)所述的核酸分子包括：

g1)编码链的编码序列如SEQ ID No.2的第76-105位所示的DNA分子；

g2)编码链的编码序列如SEQ ID No.2的第148-198位所示的DNA分子；

g3)编码链的编码序列如SEQ ID No.2的第295-327位所示的DNA分子；

g4)编码链的编码序列如SEQ ID No.4的第69-102位所示的DNA分子；

g5)编码链的编码序列如SEQ ID No.4的第148-168位所示的DNA分子；

g6)编码链的编码序列如SEQ ID No.4的第265-288位所示的DNA分子；

g9)编码链的编码序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；

g10)编码链的编码序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；

g11)编码链的编码序列如SEQ ID No.9的第76-105位所示的DNA分子；

g12)编码链的编码序列如SEQ ID No.9的第148-198位所示的DNA分子；

g13)编码链的编码序列如SEQ ID No.9的第277-315位所示的DNA分子；

g14)编码链的编码序列如SEQ ID No.11的第69-102位所示的DNA分子；

g19)编码链的编码序列如SEQ ID No.9所示的DNA分子；

g20)编码链的编码序列如SEQ ID No.11所示的DNA分子。

8.药物或药物组合物，其特征在于：所述药物或药物组合物含有权利要求1-5任一项所述的LAG-3结合分子。

9.如权利要求8所述的药物或药物组合物，其特征在于，所述药物或药物组合物还包括抗PD-1抗体。

10.权利要求1-5任一项所述的LAG-3结合分子或权利要求6或7所述的生物材料在制备LAG-3抑制剂中的应用。