CN115721781A - 一种兼具细胞密度和机械强度的人工肌腱的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种兼具细胞密度和机械强度的人工肌腱的制备工艺,用于制备一种新型的人工肌腱,并应用到肌腱组织修复领域,所示工艺包括:(1)利用电流体喷射打印技术制备PCL网格;(2)将PCL卷成管状;(3)利用海藻酸钠与钙离子交联的特性在管状的PCL支架***形成薄膜;(4)向支架胶囊中注入细胞;(5)培养到一定时间后,利用海藻酸钠与柠檬酸钠的去交联特性将支架胶囊外的薄膜溶掉;(6)培养到一定时间后,开始进行一定时间的循环拉伸。本技术制备的人工肌腱的细胞浓度可达3×108个细胞/ml。
Description
技术领域
本发明提供了一种兼具细胞密度和机械强度的人工肌腱的制备工艺,用于制备一种新型的人工肌腱,并应用到肌腱组织修复领域。
背景技术
目前为止有很多的研究报道了用生物材料制作人工肌腱进行组织修复治疗的研究,有各种各样的人工肌腱被制备。已有技术问题主要在于:
1.肌腱组织工程纤维支架制备都需要生物材料,目前为止比较流行的材料有PLA、PCL、PLGA等合成高分子材料和蚕丝、海藻酸钠等天然材料,虽然这些材料具有生物相容性,但是这些生物材料的微结构与活性和天然肌腱基质差别较大。
2.制备的支架无论是何种结构,其支架的大部分的空间都被生物材料占据,使得支架上细胞的密度较低(如1×106个细胞/mL)细胞间相互作用弱,不利于细胞的伸展、增殖、3D培养以及ECM的形成。
3.基于细胞团簇技术制作的结构体只包含有细胞,虽然细胞密度高,但是由于缺少生物材料的支撑,需要经过较长时间的培养才能具备较高的强度(压缩模量≈1.1MPa),但依旧难以满足肌腱组织的强度(肌腱位置不同,强度不同,整体范围大约为:杨氏模量65-820MPa,极限强度11-80MPa)要求,无法应用到肌腱组织的修复。
现有技术CN201610534817.6公开了一种人工肌腱的制作方法,其制作的人工肌腱接种的细胞浓度为1×106细胞/mL,但是接种细胞的数量还有待提高。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题,本发明提供了一种兼具细胞密度和机械强度的人工肌腱的制备工艺,包括:
(1)利用电流体喷射打印技术制备PCL网格,优选技术方案为:打印参数设定:打印针头21G,打印电压3kv,注射速度:1微升/min,制备出尺寸为30*20mm的PCL网格;
(2)将PCL卷成管状;
(3)利用海藻酸钠与钙离子交联的特性在管状的PCL支架***形成薄膜,优选技术方案为:放入质量浓度为0.8%海藻酸钠水溶液中浸透,保证海藻酸钠溶液在附着均匀之后迅速放入质量浓度为4%氯化钙水溶液中,在PCL支架***形成薄膜;
(4)向支架胶囊中注入细胞,优选技术方案为:利用2.5mg抗坏血酸+5μg TGF-β3生长因子+75ml牛血清蛋白(康宁)+5ml青霉素-链霉素+500ml的DMEM培养基(FBS)制成的肌腱分化培养基,将人类充间质干细胞肌腱分化7天,之后经胰蛋白酶消化、离心,获得细胞团块,用微量注射器抽吸细胞团块注射到支架胶囊中,并且两端用中号血管夹夹紧,放入60mm的培养皿(康宁)开始培养,其中,每两天一换液,每次6-8ml即可;
(6)培养到一定时间后,利用海藻酸钠与柠檬酸钠的去交联特性将支架胶囊外的薄膜溶掉,优选技术方案为:放入质量浓度4%柠檬酸水钠的水溶液中,使用摇床使用100的rpm的速度晃动5分钟,利用海藻酸钠与柠檬酸钠的去交联特性将支架胶囊外的薄膜溶掉;
(6)培养到一定时间后,开始进行一定时间的循环拉伸,优选技术方案为:拉伸频率为0.1Hz,径向拉伸幅度为3%。
通过大量的研究发现:选用质量浓度为0.8%海藻酸钠水溶液可以保证管状的PCL支架上的海藻酸钠水溶液能够均匀的分部在支架各处,并且厚度适当。如果溶液浓度过高,溶液粘度就会太高而在管状的PCL支架上面形成巨大的液滴和制作的薄膜壁厚过厚,如果溶液浓度浓度低,会无法因为完全分部管状的PCL支架上各处,容易使制作的薄膜有缺陷。
并且,通过大量的研究发现:选用质量浓度为4%氯化钙水溶液是为了能够让更快的交联,保证薄膜快速形成,不会产生额外的变形;选用质量浓度为4%柠檬酸钠水溶液,是为了能够更快的去交联,能更快更好的将薄膜溶解掉,减少人工肌腱在柠檬酸钠水溶液的时间,避免对细胞造成损伤,此外该浓度对细胞的损害较小。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤(5)的培养时间为培养到第7天。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤(6)的培养时间为培养到第14天,为期七天的循环拉伸。
本发明相对于现有技术的有益效果包括:
1.相比于传统的肌腱支架制备技术,本工艺的细胞浓度更高,接近与天然人体组织。例如专利中CN201610534817.6,其制作的人工肌腱接种的细胞浓度为1×106细胞/mL,而本技术的细胞浓度可达3×108个细胞/ml。此外,本工艺制备人工肌腱的机械强度也能够满足天然肌腱组织的要求。
2.本工艺进一步采用拉伸培养,循环拉伸培养的使用,会给细胞带来新的刺激,会进一步促进制作的人工肌腱内细胞的肌腱相关基因(Tnmd,Scx)和肌腱相关蛋白Col I andtenomodulin和肌腱相关基质基因(Col I,Fmod,Fn,TnC,and Thbs4)的表达。
附图说明
图1,人工肌腱的制备工艺流程图;
图2,利用电流体喷射打印技术制备PCL网格流程图;
图3,PCL网格示意图;
图4,将PCL卷成管状示意图;
图5,利用海藻酸钠与钙离子交联的特性在管状的PCL支架***形成薄膜示意图;
图6,支架胶囊结构明细示意图。
图7,向支架胶囊中注入细胞示意图;
图8,注射完成,两端用血管夹夹紧示意图;
图9,培养一段时间细胞聚集示意图;
图10,培养到第七天,利用海藻酸钠与柠檬酸钠的去交联特性将支架胶囊外的薄膜溶掉示意图;
图11,培养到第14天,开始进行为期七天循环拉伸培养示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明,但本发明不局限于此。
实施例1,参照图1-11所示,一种兼具细胞密度和机械强度的人工肌腱的制备工艺,工艺步骤包括:
1)利用电流体喷射打印技术(打印参数设定:打印针头21G,打印电压3kv,注射速度:1微升/min),制备出尺寸为30*20mm的PCL网格(横向网格间隙0.5mm,纵向网格间隙1mm,由1层直径100微米左右粗纤维网格及3层直径为20微米左右的细纤维网格堆叠而成)。
2)使用0.8mm直径的304不锈钢棒将其卷成管状。
3)将钢棒和棒上管状的PCL支架一同放入质量浓度为0.8%海藻酸钠的水溶液中浸透,保证海藻酸钠溶液在附着均匀之后迅速放入质量浓度为4%氯化钙的水溶液中,利用海藻酸钠与钙离子交联的特性在管状的PCL支架***形成薄膜(称支架胶囊)。
4)利用2.5mg抗坏血酸+5μgTGF-β3生长因子+75ml牛血清蛋白(康宁)+5ml青霉素-链霉素+500ml的DMEM培养基(FBS)制成的肌腱分化培养基,将人类充间质干细胞肌腱分化7天,之后经胰蛋白酶消化、离心(2000rpm,5min),获得细胞团块,用微量注射器抽吸细胞团块注射到支架胶囊中,并且两端用血管夹夹紧,细胞浓度可达3×108个细胞/ml,放入60mm的培养皿(康宁)开始培养,其中,每两天一换液,每次6-8ml即可。
5)培养七天后,将整个结构放入质量浓度为4%柠檬酸钠的水溶液中,使用摇床使用100的rpm的速度晃动5分钟,利用海藻酸钠与柠檬酸钠的去交联特性将支架胶囊外的薄膜溶掉,再继续培养。
6)培养7天后,利用拉伸培养生物反应器,对人工肌腱在进行为期7天的拉伸培养,进一步促进人工肌腱内细胞的肌腱相关基因和蛋白的表达与蛋白的排列,最终完成人工肌腱的制备,其中拉伸频率为0.1Hz,径向拉伸幅度为3%。
通过前述步骤所得支架胶囊结构明细示意图如图6所示,细胞浓度可达3×108个细胞/ml。
注:支架制备工艺全过程中均需要保证无菌。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种兼具细胞密度和机械强度的人工肌腱的制备工艺,其特征在于,包括:
(1)利用电流体喷射打印技术制备PCL网格;
(2)将PCL卷成管状;
(3)利用海藻酸钠与钙离子交联的特性在管状的PCL支架***形成薄膜;
(4)向支架胶囊中注入细胞;
(5)培养到一定时间后,利用海藻酸钠与柠檬酸钠的去交联特性将支架胶囊外的薄膜溶掉;
(6)培养到一定时间后,开始进行一定时间的循环拉伸。
2.根据权利要求1的制备工艺,其特征在于,打印参数设定:打印针头型号为21G,打印电压3kv,注射速度:1微升/min,制备出尺寸为30*20mm的PCL网格。
3.根据权利要求1的制备工艺,其特征在于,放入质量浓度为0.8%海藻酸钠的水溶液中浸透,保证海藻酸钠溶液在附着均匀之后迅速放入质量浓度为4%氯化钙的水溶液中,在PCL支架***形成薄膜。
4.根据权利要求1的制备工艺,其特征在于,利用2.5mg抗坏血酸+5μgTGF-β3生长因子+75ml牛血清蛋白(康宁)+5ml青霉素-链霉素(康宁)+500ml的DMEM培养基(康宁)制成的肌腱分化培养基,将人类充间质干细胞肌腱分化7天,之后经胰蛋白酶消化、离心,获得细胞团块,用微量注射器抽吸细胞团块注射到支架胶囊中,并且两端用中号血管夹夹紧,放入60mm的培养皿(康宁)开始培养,其中,每两天一换液,每次6-8ml即可。
5.根据权利要求1的制备工艺,其特征在于,放入质量浓度为4%柠檬酸钠的水溶液中,使用摇床使用100rpm的速度晃动5分钟,利用海藻酸钠与柠檬酸钠的去交联特性将支架胶囊外的薄膜溶掉。
6.根据权利要求1的制备工艺,其特征在于,拉伸频率为0.1Hz,径向拉伸幅度为3%。
7.根据权利要求1的制备工艺,其特征在于,所述步骤(5)的培养时间为培养到第7天。
8.根据权利要求1的制备工艺,其特征在于,所述步骤(6)的培养时间为培养到第14天,进行为期七天的循环拉伸。
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- 2022-09-09 CN CN202211114799.8A patent/CN115721781B/zh active Active
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