CN115720813A - 一种高效的松乳菇菌根人工合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效的松乳菇菌根人工合成方法，包括如下步骤：(1)取新鲜松乳菇子实体菌柄与菌盖连接处1‑3mm大小菌肉，置于PDA培养基中，于20‑25℃下组织培养20‑30天后，取菌丝块接种至PDA培养基上，于20‑25℃下继续培养25‑40天后，再取菌丝块接种至PDB培养基中培养30‑50天，得到松乳菇液体菌种；(2)将松属植株幼苗按照密度为6‑15株幼苗/筐移栽于装有菌根培养基质的培养筐中，将步骤(1)制备得到的松乳菇液体菌种加入到每棵幼苗根部附近3‑5cm深处的基质中，培养10‑14天后可形成菌根。本发明科学筛选松乳菇的培养基质和方法，使用优化后的培养基配方和培养方法，松乳菇菌丝生长更快，得到的松乳菇菌丝生物量更大；利用液体菌种接种植物根系，极大提高了接种效率；多棵接种的宿主植物在同一培养装置中培养，大大缩短了接种后菌根形成时长，有效地提高菌根合成率；减少菌根培养基质中泥炭土的用量，降低了杂菌与松属植株根系形成菌根的比例。

Description

一种高效的松乳菇菌根人工合成方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效的松乳菇菌根人工合成方法。

背景技术

松乳菇(Lactarius deliciosus)，又名美味乳菇、松菌，隶属于红菇科、乳菇属，该菌广泛分布于世界各地，在我国东北、云南、贵州、四川等地区均有分布，具有重要的经济和生态价值。松乳菇为常见的外生菌根食用菌之一，肉质细嫩，味道鲜美独特，营养丰富且富含高营养价值的矿质元素和氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸等)，被视为山中珍品，在国内外被广泛采食和销售，是许多产地老百姓重要的收入来源，同时松乳菇还具有抗肿瘤、抗菌、提高免疫力等药用价值。

松乳菇为菌根食用菌，比非菌根型担子菌(灵芝、香菇、杏鲍菇等)的栽培技术更为复杂，松乳菇的栽培仅能依靠人工合成菌根后移栽室外进行人工管理后出菇。现有的松乳菇人工合成菌根存在接种效率低、菌根合成率低、菌根形成所需时间长、杂菌污染率高等缺陷，限制了其松乳菇人工栽培研究和松乳菇菌根在植树造林中的应用。因此急需研究高效的松乳菇菌根人工合成方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的松乳菇菌根人工合成方法，包括如下步骤：

(1)取新鲜松乳菇子实体菌柄与菌盖连接处1-3mm大小菌肉，置于PDA培养基中，于20-25℃下组织培养20-30天后，取菌丝块接种至PDA培养基上，于20-25℃下继续培养25-40天后，再取菌丝块接种至PDB培养基中，于20-25℃、120-180rpm条件培养30-50天，得到松乳菇液体菌种；

(2)将松属植株幼苗按照密度为6-15株幼苗/筐移栽于装有菌根培养基质的培养筐中，再将步骤(1)制备得到的松乳菇液体菌种按照浓度为5-10ml加入到每棵幼苗根部附近3-5cm深处的基质中，将培养筐置于18-20℃、10000-20000lx、相对湿度(RH)为90-95％的环境中培养，10-14天后即可形成菌根。

本发明优选的技术方案中，所述PDA培养基含有20-25％的土豆，0.5-1％的葡萄糖，1-5％的琼脂，其余为蒸馏水。

本发明优选的技术方案中，所述PDB培养基含有20-25％的土豆，2-5％的可溶性淀粉，0.1-1％的硝酸钾，0.002-0.01％的维生素B1，其余为蒸馏水。

本发明优选的技术方案中，所述接种至PDA培养基的菌丝块为无杂菌污染、生长旺盛、未老化的菌丝块。

本发明优选的技术方案中，所述接种至PDB培养基的菌丝块为长和宽均为1mm的菌丝块，数量为8-10块。

本发明优选的技术方案中，所述松属植株幼苗的培养方法为，将松属植株种子清水浸泡36-48h后，再将种子浸泡在浓度为30％的双氧水中处理30-60min，过滤，种子用无菌水冲洗后，将其均匀置于培养筐中，种子表面覆盖1-3cm厚的种子萌发基质，定期浇水，设定昼长14-16h和夜长8-10h、16-20℃条件下培养50-60天，即得松属植物幼苗，所述种子培养基质由珍珠岩︰蛭石按照体积比1-3︰1均匀混合而成。

本发明优选的技术方案中，所述步骤(2)中的菌根培养基质由泥炭土：蛭石按照体积比为0.5-2：1均匀混合而成。

本发明优选的技术方案中，所述松属植株幼苗之间的栽种间距≥8cm×8cm。

本发明优选的技术方案中，所述松属植株幼苗的移栽密度为8-12株/筐。

本发明优选的技术方案中，所述培养筐的上口宽25cm*长35cm；下口宽20cm*长30cm。

本发明优选的技术方案中，所述培养筐的底面打20-30个孔，优选打孔25-28个。

本发明优选的技术方案中，松乳菇菌根合成率大于95％，优选大于99％，更优选为100％。

本发明优选的技术方案中，杂菌与松属植株形成菌根的比例小于5％，优选小于1％，更优选为0。

本发明的另一目的在于提供本发明高效的人工合成松乳菇菌根的方法在松属植株幼苗造林中的应用。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

除非另行说明，本发明采用如下检测方法：

1.菌根鉴定：用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌根DNA，用ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增，PCR产物测序后进行Blast比对，确认合成菌根为松乳菇菌根。

2.松乳菇菌根合成率＝培养筐中合成松乳菇菌根的松属植株幼苗数量/培养筐中所有松属植株幼苗数量×100％。

3.杂菌菌根污染率＝培养筐中合成杂菌菌根的松属植株幼苗数量/培养筐中所有松属植株幼苗数量×100％。

与现有技术相比，本发明有益的技术效果包括：

1、本发明科学筛选松乳菇菌种的培养基质和方法，松乳菇菌丝生长更快，得到的松乳菇菌丝生物量更大，多棵接种的宿主植物在同一培养装置中培养，不同植株根系附近松乳菇菌丝萌发后可互相侵染，提高了接种效率，大大缩短了接种后松乳菇菌根形成时长，有效地提高菌根合成率，并降低了杂菌与松属植株根系形成菌根的比例。

2、本发明操作简单，松属植物与杂菌形成菌根的比例低，成本低廉，适合大规模生产。且本发明的松树菌根化方法还能提高松属植株幼苗造林后的成活率，有利于绿色生态保护。

附图说明

图1实施例1-3的松乳菇菌根的生长情况

图2实施例1-3的松属植株幼苗人工合成菌根后的培养情况

具体实施方式

以下参照实施例说明本发明。但本发明不局限于实施例。

供试菌株：美味松乳菇，来自四川省凉山州会东县。

松属植物种子：华山松或马尾松，分别购自四川省凉山州会东县和四川省达州市。

松属植株幼苗的制备：将松属植株种子用清水浸泡48h，再将种子浸泡在30％双氧水中30min后，过滤，种子用无菌水冲洗3遍。将处理好的种子埋于种子萌发培养基质，距表面1cm深处；按照植物光周期昼16h，18℃；夜8h，16℃设定光源和温度，每天浇水，育苗培养2个月，得到松属植株幼苗。

泥炭土、珍珠岩和蛭石：商购。

聚丙烯培养筐：上口宽25cm、长35cm；下口宽20cm、长30cm，高度19cm，底面打孔25个，孔直径为4mm。

PDA培养基：200g土豆，20g葡萄糖，15g琼脂，1L蒸馏水。

PDB培养基：200g土豆，20g可溶性淀粉，1g硝酸钾，20mg维生素B1，加蒸馏水至1L。

种子萌发培养基质：按照珍珠岩：蛭石按照体积比1：1均匀混合后，将其置于121℃灭菌2h后，冷却，备用。

菌根培养基质：按照泥炭土：蛭石的体积比2：1均匀混合，将其置于121℃灭菌2h后，冷却，备用。

实施例1

本发明松乳菇菌根的人工合成方法包括以下步骤：

(1)将采集的松乳菇子实体，经消毒后，取菌柄与菌盖连接处4mm菌肉大小，将其转入PDA培养基中，于25℃温度下培养20天后，再取无杂菌污染、生长旺盛、未老化的菌丝块接种至PDA培养基上，培养20天左右待菌落直径大于2cm时，用手术刀片划成长和宽约为1mm的接种块，再次接种到PDB培养基中，于23℃、120rpm条件培养40天，制得松乳菇液体菌种；

(2)将9株松属植株幼苗移入装有菌根培养基质的1个培养筐中，将5ml步骤(1)所得的松乳菇液体菌种，注射到每棵幼苗根系旁附近距表面5cm左右的基质中；于16-18℃温度、光照10000lx、湿度90-95％培养10天后，可见明显菌根形成。

实施例2

本发明松乳菇菌根的人工合成方法包括以下步骤：

(1)将采集的松乳菇子实体，经消毒后，取菌柄与菌盖连接处4mm菌肉大小，将其转入PDA培养基中，于25℃温度下培养20天后，再取无杂菌污染、生长旺盛、未老化的菌丝块接种至PDA培养基上，培养半个月左右待菌落直径大于2cm时，用手术刀片划成长和宽约为1mm的接种块，再次接种到PDB培养基中，于23℃、120rpm条件培养30天，制得松乳菇液体菌种；

(2)将10株松属植株幼苗移入装有菌根培养基质的1个培养筐中，将8ml步骤(1)所得的松乳菇液体菌种，注射到每棵幼苗根系旁附近距表面5cm左右的基质中；于16-18℃温度、光照10000lx、湿度90-95％培养12天后，可见明显菌根形成。

实施例3

本发明松乳菇菌根的人工合成方法包括以下步骤：

(1)将采集的松乳菇子实体，经消毒后，取菌柄与菌盖连接处4mm菌肉大小，将其转入PDA培养基中，于25℃温度下培养20天后，再取无杂菌污染、生长旺盛、未老化的菌丝块接种至PDA培养基上，培养半个月左右待菌落直径大于2cm时，用手术刀片划成长和宽约为1mm的接种块，再次接种到PDB培养基中，于23℃、120rpm条件培养30天，制得松乳菇液体菌种；

(2)将12株松属植株幼苗移入装有菌根培养基质的1个培养筐中，将10ml步骤(1)所得的松乳菇液体菌种，注射到每棵幼苗根系旁附近距表面5cm左右的基质中；于16-18℃温度、光照10000lx、湿度90-95％培养10天后，可见明显菌根形成。

试验例1

取实施例1-3制备得到的部分菌根，用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌根DNA，用ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增，PCR产物测序后进行Blast比对，确认菌根为松乳菇菌根。实施例1-3制备得到的松乳菇菌根合成率均大于99％，杂菌与松属植株形成菌根的比例小于1％。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种高效的松乳菇菌根人工合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取新鲜松乳菇子实体菌柄与菌盖连接处1-3mm大小菌肉，置于PDA培养基中，于20-25℃下组织培养20-30天后，取菌丝块接种至PDA培养基上，于20-25℃下继续培养25-40天后，再取菌丝块接种至PDB培养基中，于20-25℃、120-180rpm条件培养30-50天，得到松乳菇液体菌种；

(2)将松属植株幼苗按照密度为6-15株幼苗/筐移栽于装有菌根培养基质的培养筐中，再将步骤(1)制备得到的松乳菇液体菌种按照浓度为5-10ml加入到每棵幼苗根部附近3-5cm深处的基质中，将培养筐置于16-22℃、10000-20000lx、相对湿度(RH)为90-95％的环境中培养，10-14天后即可形成菌根。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PDA培养基含有20-25％的土豆，0.2-1％的葡萄糖，1.5-2.5％的琼脂，其余为蒸馏水。

3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述PDB培养基含有20-25％的土豆，2-5％的可溶性淀粉，0.1-1％的硝酸钾，0.002-0.01％的维生素B1，其余为蒸馏水。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述接种至PDA培养基的菌丝块为无杂菌污染、生长旺盛、未老化的菌丝块。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述接种至PDB培养基的菌丝块为长和宽均为约1mm的菌丝块，数量为8-10块。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述松属植株幼苗的培养方法为，将松属植株种子清水浸泡36-48h后，再将种子浸泡在浓度为30％的双氧水中处理30-60min，过滤，种子用无菌水冲洗后，将其均匀置于培养筐中，种子表面覆盖1-3cm厚的种子萌发基质，定期浇水，设定昼长14-16h和夜长8-10h、18-20℃条件下育苗2-3个月，即得，所述种子培养基质由珍珠岩︰蛭石按照体积比1-3︰1均匀混合而成。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的菌根培养基质由泥炭土：蛭石按照体积比为0.5-2：1均匀混合而成。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述松属植株幼苗的移栽密度为8-12株/筐。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，松乳菇菌根合成率大于95％，优选大于99％，更优选为100％。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，杂菌与松属植物形成菌根的比例小于5％，优选小于1％，更优选为0。

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