CN115717148A - 一种人源iii型胶原蛋白低聚肽大规模工业制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人源III型胶原蛋白低聚肽大规模工业制备方法，属于微生物发酵技术领域。该重组胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明利用所述重组胶原蛋白制得了低聚肽粉，其分子量特征分布为：小于1000道尔顿的低聚肽占比大于75％；小于2000道尔顿的多肽占比大于85％；小于3000道尔顿的多肽占比大于90％。

Description

一种人源III型胶原蛋白低聚肽大规模工业制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种人源III型胶原蛋白低聚肽大规模工业制备方法。

背景技术

胶原蛋白(collagen)是一种细胞外蛋白质，由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白占全身总蛋白质的30％以上，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复具有重要作用，已广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。在分子结构上，胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、羟脯氨酸(HYP)等氨基酸。

目前，胶原蛋白的主要来源是从动物皮组织中提取，然后利用酶解技术生产高纯度且有活性的动物来源胶原蛋白，这种胶原蛋白可称为第一代胶原蛋白制备技术，而随着生物技术的发展，利用DNA重组技术，通过微生物发酵法获得重组胶原蛋白，解决了传统提取法存在的病毒隐患，同时与天然胶原蛋白相比，人工设计的重组胶原蛋白的亲水性和生物相容性显著提高。

专利CN 1371919A(一种类人胶原蛋白及其生产方法)利用原核表达***表达的胶原蛋白分子量较大(全长357个氨基酸)，原核表达***的翻译后加工修饰体系不完善，蛋白分子量过大会导致表达的蛋白以包涵体形式存在，给下游纯化带来较大困难且表达产物的生物活性较低等不足。

专利CN 103102407A(基因重组人胶原蛋白)提供了一种利用真核生物酵母基因工程菌表达人源化基因重组人胶原蛋白(全长474个氨基酸)，其带有特异性亲和纯化His标签和两段完全相同的人Ⅲ型胶原片段。该专利采用与天然胶原的部分肽段序列完全相同的两段序列(通过EFT连接)构建重组蛋白。虽然使用His标签可以利用Ni填料纯化，从而获得纯度较高的目的蛋白，但是His标签会影响蛋白的免疫原性且微量Ni离子残留会导致人体过敏反应，从而影响蛋白在二类和三类医疗器械中的应用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种重组胶原蛋白，所述重组胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之二在于提供上述重组胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将含有重组胶原蛋白SEQ ID NO.1序列的质粒转化毕赤酵母宿主菌；

(2)对步骤(1)中获得的毕赤酵母进行种子培养；

(3)再进行发酵培养；

(4)收集发酵液并浓缩获得浓缩液。

优选地，所述步骤(1)中的质粒为pPIC9K质粒。

更优选地，所述步骤(1)中毕赤酵母宿主菌为GS115。

本发明的目的之三在于提供一种利用上述重组胶原蛋白制备低聚肽粉的方法，所述方法包括以下步骤：首先酶解浓缩液，后对酶进行高温灭活，再进行超滤浓缩，最后喷雾干燥，即可获得低聚肽粉。

优选地，所述酶解使用的酶为枯草杆菌蛋白酶。

更优选地，所述枯草杆菌蛋白酶的添加量为0.05g/g胶原蛋白。

更优选地，所述低聚肽粉的分子量特征分布为：小于1000道尔顿的低聚肽占比大于75％；小于2000道尔顿的多肽占比大于85％；小于3000道尔顿的多肽占比大于90％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本申请设计了分子量较小、结构稳定的重组人胶原蛋白氨基酸序列。

(2)本发明采用毕赤酵母连续流发酵技术，高效表达了重组人胶原蛋白。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例中使用的培养基如下：

YPG：1％ Yeast Extract(酵母膏)，2％ Peptone(蛋白胨)，2％ Glucose)(葡萄糖)。

YNB：3.4g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)，10g硫酸铵共同充分溶解于800m去离子水中，并最终定容至1000ml，过滤除菌，4℃保存。

BMGY：2％胰蛋白胨，1.34％YNB，1％甘油(G)，1％酵母提取物，4×10^-6％生物素，0.1M pH为6.0的K₂HPO₄/KH2PO₄缓冲液。

PMT1：CuSO4·5H2O 6.0g/L，KI 0.088g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，CoCl₂·6H₂O 0.5g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，Biotin 0.2g/L，浓H₂SO₄ 5.0ml。

BSM基础盐培养基：85％ H₃PO₄ 26.7ml/L，CaSO₄·2H₂O 0.93g/L，K₂SO4 18.2g/LMgSO₄·2H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40g/L，PMT1 4.0ml/L。

实施例1

1、人源胶原蛋白氨基酸序列设计

本发明根据天然人源III型胶原蛋白氨基酸序列设计，选取其中109个Gly-X-Y构成的肽段组成，主要根据以下条件进行优化：该109组Gly-X-Y全部是人源III型胶原蛋白α1(GenBank:KAI2526100.1)链中的序列且蛋白分子量小于30000道尔顿；Gly-X-Y三肽构成的类人源胶原蛋白中，甘氨酸(Glycine，缩写为Gly或G)在氨基酸组成中大于37.0％，脯氨酸(Proline，缩写为Pro或P)在氨基酸组成中大于24.0％；连续的Gly-X-Y构成的肽段理论等电点在6.5-7.0之间。

DNA序列SEQ ID NO.1如下：

Ggtggtccaggtagcgacggtaagccaggtccaccaggtagccagggtgaaagcggtcgaccaggtccaccaggtccaagcggtccacgaggtcagccaggtgtcatrggtttcccaggtccaaagggtaacgacggtgcaccaggtaagaacggtgaacgaggtggtccaggtggtccaggtccacagggtccaccaggtaagaacggtgaaaccggtccacagggtccaccaggtccaaccggtccaggtggtgacaagggtgacaccggtccaccaggtccacagggtctccagggtctcccaggtaccggtggtccaccaggtgaaaacggtaagccaggtgaaccaggtccaaagggtgacgcaggtgcaccaggtgcaccaggtggtaagggtgacgcaggtgcaccaggtgaacgaggtccaccaggtctcgcaggtgcaccaggtctccgaggtggtaccggtccaccaggtccagaaggtggtaagggtgcagcaggtccaccaggtccaccaggtgcagcaggtaccccaggtctccagggtatrccaggtgaacgaggtggtctcggtagcccaggtccaaagggtgacaagggtgaaccaggtggtccaggtgcagacggtgtcccaggtaaggacggtccacgaggtccaaccggtccaatcggtccaccaggtccagcaggtcagccaggtgacaagggtgaaggtggtgcaccaggtctcccaggtatygcaggtccacgaggtagcccaggtgaacgaggtgaaaccggtccaccaggtccagcaggtttcccaggtgcaccaggtcagaacggtgaaccaggtggtaagggtgaacgaggtgcaccaggtgaaaagggtgaaggtggtccaccaggtgtcgcaggtccaccaggtggtagcggtccagcaggtccaccaggtccacagggtgtcaagggtgaacgaggtagcccaggtggtcca。

氨基酸序列SEQ ID NO.2如下：

GGPGSDGKPGPPGSQGESGRPGPPGPSGPRGQPGVMGFPGPKGNDGAPGKNGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGPGGDKGDTGPPGPQGLQGLPGTGGPPGENGKPGEPGPKGDAGAPGAPGGKGDAGAPGERGPPGLAGAPGLRGGTGPPGPEGGKGAAGPPGPPGAAGTPGLQGMPGERGGLGSPGPKGDKGEPGGPGADGVPGKDGPRGPTGPIGPPGPAGQPGDKGEGGAPGLPGIAGPRGSPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGERGSPGGP。

2、制备重组人源III型胶原蛋白

2.1重组人源III型胶原蛋白基因

根据上述氨基酸序列和毕赤酵母密码子偏好性，设计并人工合成目标基因序列hCOL(SEQ ID NO.1)，将上述目标基因序列连接至质粒载体pMD19-T simple中，经测序鉴定获得质粒载体。

2.2重组人源III型胶原蛋白基因工程菌构建

将基因hCOL(5’端添加有Xho I限制性内切酶酶切位点，在3’端添加有EcoR I限制性内切酶酶切位点)克隆到pPIC9K质粒中，然后将质粒转入大肠杆菌中大量扩增并提取pPIC9K-hCOL，利用限制性内切酶Sal I酶切线性化，然后通过电穿孔仪转化毕赤酵母宿主菌GS115(Invitrogen)，经G418筛选高拷贝转化子，并通过摇瓶发酵确定表达情况。摇瓶发酵上清液经SDS-PAGE电泳检测，在理论分子量30.6kDa位置有明显的电泳条带，确定获得重组人源III型胶原蛋白基因工程菌。

3、重组人源III型胶原蛋白的发酵生产

3.1种子培养

挑取YPG平板上的新鲜单菌落,接入含有50mL BMGY种子培养基的500mL三角瓶中,于30℃,220r/min培养至OD为6～8时,将50mL种子培养液全部接入5L发酵罐中(含1.8L的BSM基础盐培养基)。

3.2发酵培养，

甘油生长阶段温度控制30℃,pH 5.0,通过调节搅拌转速200～800r/min之间来维持溶解氧(DO)在30％以上。当基础培养基中的甘油耗尽后,流加50％甘油,同时控制DO在30％-40％,甘油相补料时间约为6h。随后停止补甘油。

进入甲醇诱导相,一次性加入10g甲醇,以在线甲醇电极监控发酵液中的甲醇残留浓度来控制甲醇流加速率,并维持DO大于30％。后期溶氧过低,则控制甲醇流加速度,优先维持溶氧。通过氨水和酵母生长自身产酸控甲醇诱导阶段的pH 4.5-5.0,诱导温度为20-25℃，诱导40～50小时，放罐，离心收取发酵上清液。

3.3超滤浓缩

将收集的发酵液分别过35KD超滤膜和纳滤膜脱盐浓缩。

4、胶原蛋白酶解

向酶解罐中加入上一步收集的胶原蛋白浓缩液，调节PH至7.0-7.5，搅拌均匀后水浴加热至55℃；用10mol/L的NaOH溶液调蛋白液PH至8.6±0.2，加入液态枯草杆菌蛋白酶(Alcalase)0.05g/g胶原蛋白，开始计时酶解3.0h，酶解过程用2mol/L的NaOH溶液滴定，维持PH为8.6±0.2。

5、高温灭活

酶解反应结束，用3mol/L的HCl溶液调PH至4.0-4.5，加热至90℃，维持30min，水浴冷却至室温，在4000g、25℃下离心20min，过1200目筛，取上清多肽溶液。

6、超滤浓缩

将上清多肽溶液通过1000Da的超滤膜，截留1000道尔顿以下的多肽的溶液，将收集的肽液通过纳滤膜浓缩，除去小分子盐类物质并浓缩肽液至30％-40％。

7、喷雾干燥

将脱盐后的肽液，通过喷雾干燥机快速干燥：高压匀质后，人源III型胶原蛋白多肽溶液固形物达到30％-40％，即可进行喷雾干燥。喷雾干燥条件：进口温度为125-135℃，塔内温度为75-80℃，排风口温度为75-80℃。

8、分子量检测

取0.1g喷雾干燥后的胶原蛋白低聚肽粉进行质谱检测，检测方法为：GB/T22492-2008附录A GPC/UV，具体数据如下：

分子量分布如下表所示：

表1

人源III型胶原蛋白低聚肽分子量特征分布：小于1000道尔顿的低聚肽占比大于75％；小于2000道尔顿的多肽占比大于85％；小于3000道尔顿的多肽占比大于90％。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求1或2所述重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将含有重组胶原蛋白SEQ ID NO.1序列的质粒转化毕赤酵母宿主菌；

(2)对步骤(1)中获得的毕赤酵母进行种子培养；

(3)再进行发酵培养；

(4)收集发酵液并浓缩获得浓缩液。

4.根据权利要求3中所述的重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的质粒为pPIC9K质粒。

5.根据权利要求4中所述的重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中毕赤酵母宿主菌为GS115。

6.一种利用权利要求3中制备得到的重组胶原蛋白制备低聚肽粉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先酶解浓缩液，后对酶进行高温灭活，再进行超滤浓缩，最后喷雾干燥，即可获得低聚肽粉。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶解使用的酶为枯草杆菌蛋白酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述枯草杆菌蛋白酶的添加量为0.05g/g胶原蛋白。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述低聚肽粉的分子量特征分布为：小于1000道尔顿的低聚肽占比大于75％；小于2000道尔顿的多肽占比大于85％；小于3000道尔顿的多肽占比大于90％。

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