CN115710589A

CN115710589A - 一种田菁的遗传转化方法

Info

Publication number: CN115710589A
Application number: CN202211452332.4A
Authority: CN
Inventors: 李涛; 刘钊君; 曹晓风; 赵丽媛; 卢娟; 贾志伟
Original assignee: Hainan Yazhouwan Seed Laboratory; Longping Biotechnology Hainan Co ltd; Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Hainan Yazhouwan Seed Laboratory; Longping Biotechnology Hainan Co ltd; Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2022-11-21
Filing date: 2022-11-21
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2042-11-21
Also published as: CN115710589B

Abstract

本发明涉及植物遗传转化技术领域，尤其是涉及一种田菁的遗传转化方法。本发明提供的转化方法包括以下步骤：(1)田菁无菌苗的制备、(2)外植体预培养、(3)侵染与共培养、(4)恢复培养、(5)筛选培养、(6)分化培养、(7)生根培养。该方法以田菁的子叶或下胚轴为起始外植体，建立起一种快速有效的再生体系。该方法首次建立了农杆菌介导的田菁的草甘膦筛选转化体系，填补了田菁遗传转化体系的空白。

Description

一种田菁的遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物遗传转化领域，具体涉及一种田菁的遗传转化方法。

背景技术

田菁，为一年生草本豆科植物，喜温暖气候，具有很强的耐盐、耐涝、耐瘠能力，是改良盐碱地的先锋绿肥作物，在盐碱地区具有较大的推广价值。此外，在工业和医学领域也发现了田菁的利用价值：田菁茎皮的耐腐蚀程度和纤维拉力均优于黄麻，是黄麻的理想代用品；从田菁种子胚乳中提取的田菁胶是一种天然多糖类高分子物质，其主要成分为D-半乳糖和D-甘露糖，可用做食品的乳化剂、增稠剂和稳定剂，以改善食品的质量。

田菁在生态学、生理生化特性、栽培种植技术等方面有一定的研究，而在转基因和遗传转化方面的研究极少。由于可利用资源少和遗传能力弱等限制因素，严重制约了田菁深入研究的开展。为解决上述问题，最有效的手段就是通过生物技术方法对田菁进行遗传改良。

田菁的遗传转化体系尚为空白，田菁的转化体系建立及转基因材料的获得对于田菁性状改良和应用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种田菁的遗传转化方法，填补田菁遗传转化体系的空白。

本发明提供的技术方案如下：

一种田菁的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)田菁无菌苗的制备：将灭菌的田菁种子接种至1/2MS固体培养基中培养，得到无菌苗；

(2)外植体预培养：从所述无菌苗上切取外植体部位，将外植体接种至预培养基上进行预培养；

(3)侵染与共培养：将所述外植体与农杆菌侵染液浸染5-10min，所述农杆菌侵染液含有乙酰丁香酮，侵染结束后吸干外植体水分，放入共培养培养基中暗培养2-4d，得到共培养外植体；

(4)恢复培养：将所述共培养外植体于25℃光照下进行恢复培养；

(5)筛选培养：将恢复后的组织转移到筛选培养基，于25℃下光培养，筛选得到抗性愈伤组织；

(6)将所述抗性愈伤组织转移到分化培养基上，于25℃下培养分化，得到田菁幼苗；

(7)生根培养：将所述田菁幼苗转移到生根培养基，25℃下培养至株高约10cm，得到田菁转基因植株。

进一步的，步骤(1)中，所述1/2MS固体培养基的成分为：MS盐2g/L、B5维他命3g/L、蔗糖15g/L、琼脂10g/L，培养时间为7-10天。

进一步的，步骤(1)中，所述灭菌的具体方法为将田菁种子依次用纱布包裹、80℃水浴锅中煮15min、75％酒精消毒2次、40％ NaCl消毒2次、无菌水冲洗4～5次每次15min，然后去除表面水分。

进一步的，步骤(2)中，所述预培养培养基的成分为：MS盐4.3g/L、B5维他命3g/L、蔗糖20g/L、琼脂10g/L、MES 4g/L、生长素(IAA)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L，pH5.6，培养时间为2-4天，优选为3天。

进一步的，步骤(3)中，所述农杆菌侵染液的OD660为0.4-0.6；所述共培养培养基的组成为：MS盐3g/L、B5维他命2g/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、MES 2g/L、萘乙酸(NAA)2mg/L、AS 20mg/L、半胱氨酸50mg/L、琼脂8g/L，pH5.6，共培养时间为2-4天，共培养温度为22℃。

在一个具体的实施方式中，所述外植体为田菁的下胚轴；此时步骤(3)中所述外植体与农杆菌侵染液共培养时用超声波处理，侵染时间为5min，所述农杆菌侵染液含有40mg/L浓度的乙酰丁香酮。

在一个具体的实施方式中，所述外植体为田菁的子叶；此时步骤(3)中所述外植体与农杆菌侵染液共培养进行侵染的时间为2-4min，所述农杆菌侵染液含有20mg/L浓度的乙酰丁香酮。

进一步的，步骤(4)中，所述恢复培养基的组成为：MS盐3g/L、B5维他命4g/L、MES1g/L、蔗糖30g/L、激动素(KT)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L，pH5.6，培养时间为7-10天。

进一步的，步骤(5)中，所述筛选培养基的组成为：MS盐2g/L、B5维他命4g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.2g/L、草甘膦30-50mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.6，培养时间为4周。

进一步的，步骤(6)中，所述分化培养基的组成为：MS盐2g/L、B5维他命4g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.2g/L、草甘膦10-30mg/L、玉米素(ZT)0.5-3mg/L、琼脂8g/L，PH5.6。

进一步的，所述生根培养基的组成为：B5盐3g/L、B5维他命4g/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、萘乙酸(NAA)0.2-1.0mg/L。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明建立的田菁遗传转化方法填补了田菁遗传转化体的空白。

(2)本发明通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，使用除草剂草甘膦作为筛选剂，得到转基因阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的田菁遗传转化体系。

(3)本发明的遗传转化方法转化效率高，转化周期短，全部过程只需3-4个月。

附图说明

图1A为本发明实施例1中得到的愈伤组织；图1B为实施例1中经筛选培养基筛选后得到的抗性愈伤组织；图1C为实施例1中经生根培养基培养后得到的植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1田菁遗传转化过程

1、遗传转化表达载体的构建：

使用限制性内切酶NcoI和EcoRI，通过双酶切技术将花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的土壤杆菌属CP4菌株的草甘膦耐受性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(cEPSPS,)构建至pCAMBIA3301载体骨架(淼灵生物科技，Cat：MLCC9683)上，构成重组过表达载体I p35S-EPSPS，所述p35S序列SEQ ID NO:1所示，EPSPS序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1

CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAATTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCATTGAGATTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTATTGTGAAGATAGTGAAAGGAAGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTGCCGACAGTGTCCAAAGAGACCCCACCCAOGAGGAGCATCGTGGAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCAACCACTATCTTCGCAAGACCTTCTCTATATAAGGATTTTATTGAGAGAACACGGGGGACT

SEQ ID NO:2

ATGCTTCACGGTGCAAGCAGCCGTCCAGCAACTGCTCGTAAGTCCTCTGGTCTTTCTGGAACCGTCCGTATTCCAGGTGACAAGTCTATCTCCCACAGGTCCTTCATGTTTGGAGGTCTCGCTAGCGGTGAAACTCGTATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATCAACACTGGTAAGGCTATGCAAGCTATGGGTGCCAGAATCCGTAAGGAAGGTGATACTTGGATCATTGATGGTGTTGGTAACGGTGGACTCCTTGCTCCTGAGGCTCCTCTCGATTTCGGTAACGCTGCAACTGGTTGCCGTTTGACTATGGGTCTTGTTGGTGTTTACGATTTCGATAGCACTTTCATTGGTGACGCTTCTCTCACTAAGCGTCCAATGGGTCGTGTGTTGAACCCACTTCGCGAAATGGGTGTGCAGGTGAAGTCTGAAGACGGTGATCGTCTTCCAGTTACCTTGCGTGGACCAAAGACTCCAACGCCAATCACCTACAGGGTACCTATGGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCAACACCCCAGGTATCACCACTGTTATCGAGCCAATCATGACTCGTGACCACACTGAAAAGATGCTTCAAGGTTTTGGTGCTAACCTTACCGTTGAGACTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATCCGTCTTGAAGGTCGTGGTAAGCTCACCGGTCAAGTGATTGATGTTCCAGGTGATCCATCCTCTACTGCTTTCCCATTGGTTGCTGCCTTGCTTGTTCCAGGTTCCGACGTCACCATCCTTAACGTTTTGATGAACCCAACCCGTACTGGTCTCATCTTGACTCTGCAGGAAATGGGTGCCGACATCGAAGTGATCAACCCACGTCTTGCTGGTGGAGAAGACGTGGCTGACTTGCGTGTTCGTTCTTCTACTTTGAAGGGTGTTACTGTTCCAGAAGACCGTGCTCCTTCTATGATCGACGAGTATCCAATTCTCGCTGTTGCAGCTGCATTCGCTGAAGGTGCTACCGTTATGAACGGTTTGGAAGAACTCCGTGTTAAGGAAAGCGACCGTCTTTCTGCTGTCGCAAACGGTCTCAAGCTCAACGGTGTTGATTGCGATGAAGGTGAGACTTCTCTCGTCGTGCGTGGTCGTCCTGACGGTAAGGGTCTCGGTAACGCTTCT

GGAGCAGCTG

TCGCTACCCACCTCGATCACCGTATCGCTATGAGCTTCCTCGTTATGGGTCTCGTTTC

TGAAAACCCTGTTACTGTTGATGATGCTACTATGATCGCTACTAGCTTCCCAGAGTTC

ATGGATTTGATGGCTGGTCTTGGAGCTAAGATCGAACTCTCCGACACTAAGGCTGCT

TGA

2.农杆菌转化：

通过35S-EPSPS过表达载体I转化农杆菌感受态细胞EHA105，所述农杆菌感受态细胞购买自上海唯地生物(China,Shanghai,Cat:AC1010)，获得转化成功的p35S-EPSPS农杆菌I；以EPSPS基因作为指示标记，验证下胚轴稳定转化体系；

3、遗传转化具体操作步骤

(1)将从田菁植株中采集成熟的豆荚，去掉外壳，挑选饱满无斑点的种子，用纱布包裹，放入80℃水浴锅煮15min，75％酒精消毒2次，40％ NaCl消毒2次，每次15min无菌水冲洗4～5次。将消毒后的种子转移至无菌纸上在超净台内吹干水分，将灭菌后的种子放入无菌离心管中保存备用。

(2)将灭菌后的田菁种子在超净工作台中接种在盛有1/2MS固体培养基中，尽量让种子散开，以获得最大的生长空间。将接种好的田菁种子放置于25度光照培养室中进行培养，大约7-10d幼苗子叶展开即可。

1/2MS固体培养基组成：MS盐2g/L、B5维他命3g/L、蔗糖15g/L、琼脂10g/L。

(3)接种7-10d后，在无菌环境下将田菁子叶放置于预培养基上进行预培养用。预培养培养基预处理2-4天，优选为处理3天。

预培养培养基组成：MS盐4.3g/L、B5维他命3g/L、蔗糖20g/L、琼脂10g/L、MES 4g/L、生长素(IAA)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L(pH5.6)。(4)将预培养后生长良好的子叶加入已转化并鉴定带有p35S-EPSPS过表达载体的农杆菌侵染液(OD660＝0.4-0.6)进行侵染，所述农杆菌侵染液是将含有目的基因表达载体的农杆菌在含有20mg/L浓度的乙酰丁香酮的侵染液中震荡混匀得到的；将无菌培养的子叶与所述的农杆菌侵染液共培养5-10分钟，优选为处理7分钟，侵染结束后放于灭菌后的滤纸上吹干。然后将子叶接于共培养培养基上22℃暗培养2-4d。

共培养培养基组成：MS盐3g/L、B5维他命2g/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、MES 2g/L、萘乙酸(NAA)2mg/L、AS 20mg/L、半胱氨酸50mg/L、琼脂8g/L(pH5.6)。

(5)在共培养结束后，进行恢复培养7-10d，25℃下光培养。

恢复培养基组成：MS盐3g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、激动素(KT)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L(pH5.6)。

(6)将恢复后的组织转移到筛选培养基，25℃下光培养4周，筛选得到抗性愈伤组织。

筛选培养基组成：MS盐2g/L、B5维他命4g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.2g/L、草甘膦30-50mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L(pH5.6)。

(7)将筛选得到的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，25℃下培养分化。

分化培养基组成：MS盐2g/L、B5维他命4g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.2g/L、草甘膦10-30mg/L、玉米素(ZT)1mg/L、琼脂8g/L(PH5.6)。

(8)将分化出来的幼苗转移到生根培养基，25℃下培养至株高约10cm移至温室培养。

生根培养基组成：B5盐3g/L、B5维他命4g/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、萘乙酸(NAA)0.2-1.0mg/L。

4、转基因阳性植株的鉴定

用全式金公司2×EasyTaq PCR SuperMix(China，Beijing，Cat:AS111-11)普通PCR扩增验证转入EPSPS基因的田菁植株，PCR扩增得到大小为1368bp的转基因植株为基因组中包含EPSPS基因的阳性转基因田菁。

PCR引物序列为：

EPSPS-F(SEQ ID NO:3)：ATGCTTCACGGTGCAAGEPSPS-R(SEQ ID NO:4)：TCAAGCAGCCTTAGTGTCG

PCR反应的条件是：30个循环，每个循环是95℃30’，58℃30’，72℃40’。

结果显示，最终鉴定得到8株阳性转基因田菁植株，由于起始子叶数量为150，故计算转化效率为5％。

实施例2田菁遗传转化方法的优化

本实施例是在实施例1中遗传转化步骤的基础上进行的如下改变：

(1)田菁外植体部位替换

在其他条件不变的前提下，将实施例1中“3、遗传转化具体操作步骤”步骤(3)和步骤(4)中的田菁子叶替换为下胚轴，将下胚轴用剪刀或手术刀切成长为1cm左右的小段，均匀地将切好的下胚轴放置于预培养基上进行预培养及后续步骤。

(2)农杆菌侵染步骤优化

在其他条件不变的前提下将实施例1中“3、遗传转化具体操作步骤”步骤(4)中用超声波辅助侵染，侵染液中乙酰丁香酮的浓度调整为40mg/L，将无菌培养的田菁下胚轴与农杆菌侵染液共培养的时长延长至5min。

鉴定结果显示，在起始下胚轴数量为150的情况下，筛选得到18株阳性转基因田菁植株，转化率达到12％。

综上所述，在农杆菌侵染过程中，通过对外植体部位、侵染液中乙酰丁香酮浓度、共培养时长以及超声波辅助处理等各个环节进行优化，显著增加外源基因***植物基因组的效率，最终提高田菁的转化效率(由5％提升至12％)。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种田菁的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(5)筛选培养：将恢复后的组织转移到筛选培养基，于25℃下光培养，筛选培养后得到抗性愈伤组织；

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述1/2MS固体培养基的成分为：MS盐2g/L、B5维他命3g/L、蔗糖15g/L、琼脂10g/L，培养时间为7-10天。

3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述灭菌的具体方法为将田菁种子依次用纱布包裹、80℃水浴锅中煮15min、75％酒精消毒2次、40％NaCl消毒2次、无菌水冲洗4～5次每次15min，然后去除表面水分。

4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预培养培养基的成分为：MS盐4.3g/L、B5维他命3g/L、蔗糖20g/L、琼脂10g/L、MES4g/L、生长素(IAA)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L，pH5.6，培养时间为2-4天，优选为3天。

5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述农杆菌侵染液的OD660为0.4-0.6；所述共培养培养基的组成为：MS盐3g/L、B5维他命2g/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、MES 2g/L、萘乙酸(NAA)2mg/L、AS 20mg/L、半胱氨酸50mg/L、琼脂8g/L，pH5.6，共培养时间为2-4天，共培养温度为22℃。

6.根据权利要求1-5任一项所述的遗传转化方法，其特征在于，所述外植体为田菁的下胚轴；此时步骤(3)中所述外植体与农杆菌侵染液共培养时用超声波处理，侵染时间为5min，所述农杆菌侵染液含有40mg/L浓度的乙酰丁香酮。

7.根据权利要求1-5任一项所述的遗传转化方法，其特征在于，所述外植体为田菁的子叶；此时步骤(3)中所述外植体与农杆菌侵染液共培养进行侵染的时间为2-4min，所述农杆菌侵染液含有20mg/L浓度的乙酰丁香酮。

8.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述恢复培养基的组成为：MS盐3g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、激动素(KT)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L，pH5.6，培养时间为7-10天。

9.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述筛选培养基的组成为：MS盐2g/L、B5维他命4g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.2g/L、草甘膦30-50mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.6，培养时间为4周。

10.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(6)中，所述分化培养基的组成为：MS盐2g/L、B5维他命4g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.2g/L、草甘膦10-30mg/L、玉米素(ZT)0.5-3mg/L、琼脂8g/L，PH5.6。

11.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(7)中，所述生根培养基的组成为：B5盐3g/L、B5维他命4g/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、萘乙酸(NAA)0.2-1.0mg/L。