CN115704049A - 核酸检测方法及检测反应器 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种核酸检测方法及检测反应器，所述方法包括以下步骤：S1、制备反应体系和样本保存液并加入反应器中；S2、取待测样本加入样本保存液中成样本液；S3、样本液通过外力压入反应体系；S4、将反应体系进行扩增反应读取反应结果，检测结果通过比色或荧光判定。反应器包括加样部、样本部和反应部，加样部和样本部之间、样本部和反应部之间活动连接实现密封状态，加样部为活塞结构，反应部与样本部连接处设有微孔且微孔孔径不大于样本液或样本保存液的毛细长度；加样部通过外力向反应部运动实现密封状态下样本液穿过微孔压入反应部内。本发明反应过程无需开盖，无需多次加液，可实现整个核酸检测无需PCR实验室，无气溶胶污染。

Description

核酸检测方法及检测反应器

技术领域

本发明涉及核酸检测(DNA或RNA)技术领域，具体涉及一种核酸检测方法及检测反应器。

背景技术

核酸检测作为一种具有高灵敏度及特异性的方法，目前已经广泛应用于许多领域，例如疾病诊断，食品安全，传染病防治等。用简单方式对特定核酸序列进行检测，可以赋予现场护理(point-of-care)诊断和现场病原体检测更大的价值。

PCR(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。然而，PCR作为经典的核酸检测方法，其固有的变性-复性-延伸循环，要求其必须需要热循环仪设备作为支撑，同时因为气溶胶污染问题，专业实验室也成为了必须要条件之一。目前，PCR延展技术平台，特别是定量PCR(qPCR)方法，是最广泛使用的病原体检测方法，并且被认为是新的金标准测试。qPCR提供短得多的样品到结果(sample-to-result)的时间(3到5小时)。然而，尽管qPCR被广泛接受，但它因依赖标准参考物质(标准曲线)进行定量而受到限制。不可靠和不一致的商业标准参考物质也可能影响qPCR定量的准确度。此外，qPCR易于受到由环境样品中自然存在的物质(例如，重金属和有机质)引起的抑制，从而导致靶定量不准确或假阴性结果。因而极大地限制了PCR在床旁快速诊断(POCT)和现场快速检测等领域的应用。与qPCR相比，最近的数字PCR技术已被证明是用于环境样品中的微生物病原体检测的更稳健的解决方案。数字PCR基于分区(partitioning)和泊松统计，因此，不需要比较外部定量标准来对未知浓度的样品定量。然而，将数字PCR方法实施于使用点应用(point-of-useapplication)可能是挑战性的。这是因为数字PCR需要昂贵的仪器(即Bio-rad液滴数字PCR)、设备齐全的实验室环境和训练有素的技术人员来进行测定。这些因素严重限制数字PCR在资源有限背景下的可及性和应用。

为了克服这些缺点，一大类等温核酸扩增的新方法大量出现，其中LAMP是最受关注也是最有应有前景的一种方法。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。LAMP作为一种分子生物学检测技术，具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及成本低的特点，已广泛用于临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片。

因此，LAMP被期望用于检测微生物的快速、简化、低成本的测定，以在集中式实验室之外，例如，在需要对资源有限的地方的环境水进行现场使用点测试的情况下提供分子测定。

LAMP检测在等温条件下进行，等温条件可以维持在不同的仪器中，例如热循环仪和水浴，或者本文采用的LAMP检测装置。该设备使得能够通过加热装置内部的检测室来扩增样品的DNA/cDNA，以检测病原体。

在本申请提及的设备上开发的检测中，概而言之，将分析中的生物样品的等分试样添加到试剂中，并将该集合(set)在LAMP检测室中加热。然后在检测过程中监测这些样品，以识别可能的颜色变化(例如，在使用羟萘酚蓝试剂时从紫色变为天蓝色)，该颜色变化表示样品相对于所用试剂的阳性反应。根据现有技术已知LAMP检测室的各种构造，并且会在以下段落中描述所述构造。

Wang,TT发表在“Journal of microbiological methods”上的文章“A novelCMOS image sensor system for quantitative loop-mediated isothermalamplification assays to detect food-borne pathogens(用于定量环介导等温扩增测定以检测食源性病原体的新型CMOS图像传感器***)”提出了用于LAM检测的低成本CMOS图像传感器***，来检测食源性病原体。所描述的***实时监测扩增过程中的颜色变化引起的光子变化。该文章最后指出，简单、紧凑、低成本且低能耗的设计，代表了用于现场诊断的便携式、灵敏、易于使用、实时定量分析工具发展中的重大进步。

Ahmed,ME发表在“BMC Veterinary Research”上的文章“Development andevaluation of real-time loop-mediated isothermal amplification assay forrapid detection of cystic echinococcosis(开发和评估快速检测囊性包虫病的实时环介导等温扩增测定)”描述了用于快速检测囊性包虫病的实时LMAP检测的开发和评估。所述检测在恒定温度(63℃)下进行，使用扩增和检测仪器以及荧光染料进行实时监测。在水浴中进行扩增循环后，用肉眼观察LAMP产物以检测颜色变化，并在UV光源下使该产物可视化。

Sayad,AA发布在“Sensors And Actuators B-Chemical”上的文章”Amicrofluidic lab-on-a-disc integrated loop mediated isothermal amplificationfor foodborne pathogen detection(用于食源性病原体检测的微流体盘上集成环介导等温扩增)”报道了用于检测食物病原体的LAMP扩增离心微流体装置，其中，使用强制对流加热源来驱动蜡阀和温度加热，以进行LAMP扩增。

文献WO2013043203涉及用于等温和非等温核酸的LAMP测定的容器，该容器包括主体，其除了具有主体开口端和通过通道延伸的柔性材料的***式盖(plug-in lid)之外，还具有内/外表面和开口端。根据该文献，与已知的微流控芯片相比，已开发的容器保证了更大的灵活性，这是由于其处理小体积和大体积流体的固有灵活性所致。另一个突出的优点是，所揭露的容器还可以提取样品并具有流体输送功能。

文献US20160231324描述了用于检测靶标的高性能多路复用***，该***包括用包含例如能够产生可检测信号的DNA酶的检测***或传感器封装生物样品，并检测该信号，其中所述检测***或传感器包括基于LAMP的检测。根据该文献，可以加热分析的样品，其中除了数据分析软件、用于传输信息的可视显示器、电子设备连接件以及其他特征之外该***还包括发光二极管和检测器。

文献WO2011150115涉及原位检测样品中核酸的LAMP方法和装置。描述了所使用的方法包括引入核酸扩增试剂和加热核酸扩增试剂。根据该文献，使用一次性加热器进行加热步骤，并且检测步骤包括检测与核酸扩增试剂流体连通的比色染料的颜色变化。提供的关于所述装置的构造细节很少。

文献US20140356874公开了用于便携式核酸扩增和检测的方法和装置，其中该仪器优选使用等温核酸扩增技术，例如LAMP。靶扩增的检测可以例如通过检测添加到扩增反应中的染料的色移或荧光来实现。根据该文献，所公开的装置包括对样品进行加热的加热室和检测样品颜色变化的传感器，其中，可以由中央控制***控制所述元件。

文献US9476836公开了通过LAMP方法检测样品(例如血液)中的核酸(DNA)的方法，该方法包括使核酸与封闭***内的检测试剂接触，并观察核酸和/或检测试剂的颜色变化。进一步描述了还可以通过测量样品溶液在可见光范围内的吸光度来进行可见光颜色变化的观察。但是，有关该装置整体构造细节的信息，例如传感器和光源的布置、显示设备等，提供的很少。

文献US20130331298公开了用于检测包括病原体在内的多种分析物的检测盒，其包括注射端口、中央通道、处理室、试剂容器和废物室。描述了所述检测可以是LAMP类型的检测。所述装置还包括一系列元件，例如加热器、加热器控制器、用于测量盒中流动流量的光学传感器。没有记载使用传感器识别受分析样品的颜色变化。

文献CN109355429 A基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法公开了一种基于LAMP的微流控芯片，该发明以循环核酸为分析对象，以微流控动态微阵列技术为依托，以环介导等温扩增技术、滚环扩增技术、基于微流控的物质传递增强效应以及石墨烯量子点的高荧光量子产率特性为信号放大手段，发展以微观条件下功能化微球为传感元件的高灵敏循环核酸分析新技术。该试剂盒的建立能够较好的解决微量医学分析技术领域或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题。该技术只需要2μL病毒DNA样本，可实现10amol/L的EB病毒DNA的检测，即单次实验可以检测10个EB病毒DNA。但该试剂盒在芯片外的EB病毒DNA检测中，仍需要将样本进行预处理，并需要人工操作加入进样孔，且非封闭反应环境，仍存在气溶胶污染的可能，始终需要在专业实验室操作。

文献CN 111902212 A公开了LAMP检测装置，其包括适于容纳至少一个样品的支撑轨道的加热室，其中支撑轨道通过样品***开口***加热室中，另外，加热室包括：至少一个内部加热元件；位于前壁或后壁上的发光元件电路；位于与发光元件电路相对的壁上的光传感器电路。该装置实现了主要成本降低和差异，是通过仅使用热惯性进行温度控制，这不同于使用去除和/或冷却技术控制温度，从而增加设备成本以及能耗的商业***。但该装置并未实现实验过程免加样的传统操作，且仍旧采用八连管的方式进行操作。

因为基于扩增的核酸检测试剂及检测设备的局限性，导致目前检测中扩增操作也无法解决核酸或者其他待测样品的提取问题，扩增过程也需要多次开盖，尤其是通过八连管作为反应器时，且同样需要在专业的PCR实验室操作以避免污染，所以现有技术的核酸检测仍无法实现现场取样、现场检测，尤其是没有可实现直接加入样本后进行直接一次性完成反应的反应器，仍旧采用传统的八连管或者EP管(离心管)，这是核酸检测无法很好的应用在POCT以及病原微生物拓展应用的重要掣肘。

发明内容

本发明要解决的技术问题就在于：提供一种更为便捷、低成本且精准的核酸检测方法，同时提供一种核酸检测方法及检测反应器，可实现该检测方法可实现直接POCT或现场快检，无需依赖专业PCR实验室及实验人员操作等诸多限制。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

核酸检测方法，所述方法包括以下步骤：

S1、制备检测试剂：根据待测物选择扩增方法且适应性地设计检测试剂，换言之，等温扩增采用等温扩增反应体系，变温扩增采用变温扩增反应体系(即PCR)；配置检测试剂(不含待测样本)后并将检测试剂预加入反应器中；检测试剂包括反应体系和样本保存液，且反应体系和样本保存液分别独立地内置于同一反应器内；

S2、取待测样本并加入样本保存液中成样本液，其中，所述样本为可获取核酸的样本来源；

S3、加入样本液，样本液通过外力压入反应体系中，样本液加入量小于100微升；

S4、将反应体系进行扩增反应并读取反应结果完成检测，检测结果通过比色或荧光判定；

其中：

反应体系为10-200微升，反应体系至少包括：反应酶、引物、dNTP、Buffer和染料，此时S1的反应体系处在未反应状态；

根据待测核酸适应性地设计特异性引物序列，

所述样本选自：鼻咽分泌物、肠道分泌物、呼吸道分泌物、生殖道分泌物或血液样本。

作为一种较佳的实施方式，当待测核酸为RNA时，反应酶包括RNA-逆转录酶；且当等温扩增反应体系时，反应酶还包括BST聚合酶；或当变温扩增反应体系时，反应酶还包括Taq聚合酶。

作为一种较佳的实施方式，当待测核酸为DNA时，等温扩增反应体系反应酶包括BST聚合酶，变温扩增反应体系反应酶包括Taq聚合酶。

作为一种较佳的实施方式，染料为显色染料或荧光染料，其中显色染料优选为：HNB、中性红染料、钙黄素、酸性铬蓝K(ACBK)、钼酸铵或可见光染料；荧光染料优选为：SYBRGreen、SYBR Gold、SYBR-safe、EvaGreen、RTGreen、SYTO-9、Gel Green、Gel Red、EB染料或Gold View I染料。

作为一种较佳的实施方式，取样方式优选为拭子取样；取样后将带有核酸的拭子放入已加有样本保存液的反应管中成样本液。

作为一种较佳的实施方式，降低该检测方法中反应体系的运输和保存要求，可实现常温运输，可S1中所述反应体系为冻干状态；为了进一步降低反应体系的环境敏感性，S1中反应器内反应酶、引物和dNTP中至少一个组分与另外二个组分通过预热可融的封隔层独立地分别加入所述反应器的同一腔内，换言之S4加热后所述封隔层融解后反应体系成反应液状态并进行扩增反应。

作为一种较佳的实施方式，所述封隔层的熔点为50～70℃，凝固点为0～40℃，优选为石蜡、硅油、十八烷等，且优选密度小于水。

作为一种较佳的实施方式，反应体系还包括冻干保护剂，优选地，冻干保护剂以下的一种或几种的混合物：海藻糖、蔗糖、聚蔗糖、葡聚糖、山梨醇、聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、甘露醇、右旋糖酐、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甘油或人血清白蛋。

作为本发明的另一个目的，本发明还提供了一种可实现上述核酸检测方法的反应器，所述反应器包括顺序连接的加样部、样本部和反应部，其中加样部和样本部之间、样本部和反应部之间活动连接实现密封状态，加样部为活塞结构，样本部内预装有样本保存液，反应部中装有反应体系；反应部与样本部连接处设有微孔且所述微孔的孔径不大于样本液或样本保存液的毛细长度(此时样本部的样本液或样本保存液无法在自然状态下即重力作用或无外力作用下流入反应部内)；换言之，微孔处的液体表面张力大于其重力，所述微孔的孔径为0.3～0.6mm；在反应器密封状态下，加样部通过外力向反应部方向运动实现密封状态下样本液穿过微孔压入反应部内。

作为一种较佳的实施方式，所述反应部内设有多个反应腔，每个所述反应腔内预设有独立的反应体系，可实现针对同一样本多个检测项的同时检测，微孔设置于反应腔的腔口处，且每个反应腔设置一个微孔，无外力情况下，液体不能从样本部流入反应腔。反应部可以设置一个反应腔，也可以设置多个反应腔，每个反应腔对应一个微孔，微孔与反应腔匹配设置。

作为一种较佳的实施方式，所述反应部设有分流塞，所述分流塞采用柔性材料制成，所述分流塞位于反应部与样本部的连接处，所述反应腔通过分流塞独立密封，所述微孔设于分流塞。

作为一种较佳的实施方式，所述分流塞的一面向反应腔内凸起封闭腔口，所述微孔贯穿凸起，所述分流塞面向样本部的一面为光滑面。

作为一种较佳的实施方式，所述反应部设有套接的内反应管和外套管，所述内反应管卡紧于外套管内，所述外套管设有与样本部配位螺接的螺纹。

作为一种较佳的实施方式，所述内反应管设有多个反应腔，外套管内设有螺纹。

作为一种较佳的实施方式，所述加样部包括套接的凹形塞和加样帽，所述加样帽内设一***凹形塞呈套接的硬性凸起件，所述加样帽还设有与样本部配位螺接的螺纹连接段，即可实现加样部与样本部之间的密封连接，又可通过单向旋转加样部向样本部加压实现样本液进入反应部中。

作为进一步的优选方式，所述加样部还设有一限位件，所述限位件用于限制加样部旋转；换言之，加样部加压前去除限位件后，加样部方能旋转。优选地，所述限位件为一撕拉环，所述撕拉环分别与加样帽和样本部端口连接，此时撕拉环可实现加样部与样本部之间的限位。

样本部近反应部端口封闭，未加入样本时呈独立密封状态，所述端口通过密封塞或密封膜实现封闭。

为了进一步保证样本部与加样部间的密封效果且同时降低生产成本，所述样本部为一同轴套管，其中内管为一中空管，且内径与所述凹形塞密封贴合连接，外管的一端设有与加样部配位螺接的螺纹；反应器密封时，内管的一段位于凹形塞与加样部的间隙；反应前样本保存液预设于内管的腔中。

此外，为了进一步保证样本部与反应部间的密封效果且同时降低生产成本，所述样本部的外管靠近反应部的一端设有与反应部配位螺接的螺纹，所述反应部与外管不连通，且螺纹处的外管与内管无缝贴合。

且为了避免生产过程及检测过程中误装配或误操作，所述样本部内管的近反应部的一端端口向外延展一限位环。

作为一种较佳的实施方式，采用上述反应器检测核酸的方法，S3还包括如下步骤：

S3-1、将取样后的拭子加入样本部内，密封反应部与样本部，施加外力混匀样本液；具体操作为：旋开反应器的样本部和反应部，将取样后的拭子加入样本部内，再将反应部与样本部拧紧，摇晃混匀反应器；

S3-2、不破坏反应器密封的条件下，通过加样帽对样本部进行加压加样；具体操作为：撕开撕拉环(易撕)，向样本部旋转加样帽进行加压加样；

S3-3、对反应器施加与反应器重力方向相同的力，使得挂在反应部顶部的样本液进入反应腔内，具体操作为：再将反应器向地向下方向摇晃(轻甩)，使得挂在反应部顶部的样本液进入反应腔底部。

作为另一种较佳的实施方式，S4还包括如下步骤：

S4-1、将反应器放入一快检设备或加热设备，加热后封隔层融化反应体系与样本液混合成反应液，

S4-2、反应器内温度维持至扩增温度，并振荡或旋转反应器，使反应液充分混匀进行扩增反应；为保证反应充分，可多次反复振荡或旋转反应器。

本发明提供的核酸检测方法及反应器，与现有技术相比有以下优点：

(1)本发明核酸检测方法及反应器，可以解决现有技术里扩增方法中污染、操作复杂等诸多问题，采用本发明提供的方法可以实现扩增操作中反应体系的预加入，预加入的反应体系不仅避免了现场配置反应体系对环境的限制，简化了检测前的体系配置步骤，还能够保证检测的快速进行和简便使用；后续扩增仅需加入待测样本，达到扩增反应条件如温度后可直接反应，无需再次加液，故检测过程中反应器只需要一次开盖加入待测样本，且样本与反应体系中其它组分无接触，在反应过程中充分接触直接进行反应，无需再次开盖，就可实现整个核酸检测过程对检测条件基本无限制，无气溶胶污染，检测反应完成后通过处理反应器获得结果即可。

(2)本发明的核酸检测方法可针对待测核酸设计特异性引物，一管多反应腔时可以通过预埋不同反应体系的方式同时对一个待测样本中的多个待测核酸进行检测，不仅提高了检测效率，而且相关核酸的检测结果可联合考虑，为临床判断提供更加准确的基因层面的建议。

(3)本发明核酸检测方法及反应器，加样部的特殊设计可以控制样本保存液的加入量，保证反应腔中反应充分进行的同时不会造成相互污染。

(4)本发明核酸检测方法及反应器，反应器微孔的孔径设置，即保证了在储存运输、待测样本加入等过程中样本液或样本保存液不进入反应腔内，也保证了在施加外力的情况下，样本液可以顺利进入反应腔中充分反应。

(5)本发明核酸检测方法及反应器，检测反应器整体结构简单、生产成本低，材料环境友好，圆柱形管体适配性强，可用于各类型的加热设备，也便于施加外力保证反应充分。

(6)本发明核酸检测方法及反应器，封隔层材料融化温度匹配加热反应温度，且不会对扩增反应体系产生影响，加热后封隔层融化，保证了在不开盖的情况下反应体系充分混合，融化后的封隔层材料由于密度小浮于反应体系之上，进一步行成了反应体系上的封隔层，对反应的充分进行提供了双重保证。

(7)本发明核酸检测方法及反应器，针对公共卫生事件，可通过简易加热设备(乃至保温杯)配合本发明的核酸检测方法及反应器实现，无需专业人士操作，结果清晰易判，适合目前国内外各类医疗检测场景需求，尤其是相对落后地区，可使其分子诊断能力大幅提升。

附图说明

图1是本发明一个实施例的反应器结构示意图。

图2是本发明一个实施例的反应器的***结构示意图。

图3是本发明一个实施例的分流塞结构示意图。

图4是本发明一个实施例的快检设备结构示意图。

图5是本发明一个实施例的快检设备的***结构示意图。

图6是本发明一个实施例的检测方法流程示意图。

图7是本发明一个实施例的检测方法所得结果图。

图中标号说明：

1、样本承载部；11、承载腔；2、加热部；21、加热板；22、陶瓷加热片；3、振动部；31、振动变形板；4、驱动部；41、振动电机；42、进出电机；5、拍照部；51、相机；52、拍照盒；53、滑块；54、滑轨；55、连接板；6、外壳；7、安装架体；71、上安装座；72、支座；73、底座；74、连接座。8、反应器；81、样本部；811、样本部外管；812、样本部内管；813、限位环；814、密封件；82、加样部；821、凹形塞；822、加样帽；823、限位件；83、反应部；831、反应部外管；832、反应腔体；833、反应腔；834、分流塞；8341、分流帽；8342、连接凸起；8343、微孔。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的利用等温扩增显色法进行核酸检测方法、反应器及快检设备作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

一种检测反应器，包括顺序连接的加样部82、样本部81和反应部83，其中，加样部82和样本部81之间、样本部81和反应部83之间活动连接实现密封状态。

样本部81为一同轴套管，外管和内管均为中空管，分别为样本部外管811和样本部内管812，较佳的，样本部外管811和样本部内管812均为圆筒。样本部内管812的外径小于样本部外管811的内径。样本部外管811一端设有外螺纹、另一端设有内螺纹。样本部内管812为光滑的圆筒，样本部内管812一端的端口向外延展一限位环813。换句话说，限位环813为一环形，限位环813的内圈连接样本部内管812一端端口的外表面，形成一凸出样本部内管812外表面的结构。较佳的，限位环813和样本部内管812垂直。限位环813的外径大于样本部外管811的内径、不大于样本部外管811的设有外螺纹一端端口的外径，以实现对样本部内管812和样本部外管811之间的限位，同时不影响外螺纹和其它部件的连接。具体的，样本部内管812位于样本部外管811内，限位环813的靠近样本部内管812的一端端面接触样本部外管811的设有外螺纹一端的端面，如此，实现了样本部内管812一端和样本部外管811一端的无缝贴合。

加样部82为活塞结构，加样部82包括限位件823、套接的凹形塞821和加样帽822。凹形塞821的材质为具有弹性的橡胶。凹形塞821位于样本部内管812内，凹形塞821为圆柱体，且圆柱体的凹形塞821的外径不小于样本部内管812的内径，满足凹形塞821位于样本部内管812时凹形塞821的外表面贴合样本部内管812的内表面，即样本部内管812与凹形塞821密封贴合连接，实现对样本部内管812一端的密封，使样本部内管812内的凹形塞821两侧的空间不能互通，同时凹形塞821能沿着样本部内管812轴线方向移动，使凹形塞821具有活塞功能。凹形塞821的一端设有盲孔，盲孔的开口设在凹形塞821的一端面上，盲孔的长度方向和凹形塞821的中心线平行或重合。

加样帽822包括插杆和帽头，插杆为杆状，插杆一端连接帽头一端的中部、另一端悬伸，插杆形成帽头上的一硬性凸起件。插杆能***凹形塞821的盲孔，较佳的，插杆的外径不小于凹形塞821的盲孔的孔径，以实现插杆和盲孔的稳固连接。帽头上设有外螺纹，帽头上外螺纹和样本部外管811一端的内螺纹可配位螺接。组装后，凹形塞821位于样本部内管812中，且设有盲孔的一端较另一端更远离样本部内管812的限位环813。加样帽822的插杆***凹形塞821的盲孔中、帽头和样本部外管811一端的内螺纹螺接。单向旋转帽头时，凹形塞821会被加样帽822推动在样本部内管812中移动。如此，样本部内管812的一端通过帽头和样本部外管811连接、另一端通过限位环813和样本部外管811限位，实现样本部内管812和样本部外管811的稳固连接。

限位件823用于限制加样帽822帽头的旋转限位。所述限位件823为一可撕开的撕拉环，所述撕拉环的两端分别连接帽头和样本部外管811的设有内螺纹的一端端口，此时撕拉环用于加样部82与样本部81之间的限位，帽头不能继续旋转，当撕下撕拉环后，限位作用解除，帽头可以继续旋转。

样本部内管812用于盛放样本保存液和接收加入的样本，接收加入的样本后形成样本液。当未加入样本时，样本部内管812呈独立密封状态，一端通过凹形塞821密封、另一端的端口通过密封件814实现封闭，密封件814为密封塞或密封膜。显然的，样本部内管812另一端的端面即为限位环813的端面，限位环813的一端端面接触样本部外管811一端的端面，限位环813的另一端端面接触密封件814实现封闭。如此，样本保存液能有效完整地保存在样本部内管812中。当需要加入样本时，取下密封塞或撕开密封膜即可。

反应部83为一套管，包括内反应管和外套管831，内反应管可拆卸地内设在外套管内且与外套管831过盈配合，使所述内反应管卡紧于外套管831内。其中，外套管831为中空管，较佳的，为圆筒状，外套管831的一端设有内螺纹，其和样本部外管811一端的外螺纹配位螺接。

内反应管包括反应腔体832和分流塞834。反应腔体832包括多个反应腔833，多个反应腔833通过在反应腔体832上开设多个平行间隔的盲孔形成，反应腔833的开口设在反应腔体832的一端端面上，反应腔体832的另一端端面是封闭的。反应腔833用于盛放反应体系，多个反应腔833可以盛放相同或不同的反应体系。内反应管安装在外套管831内时，各反应腔的中心线和外套管831的中心线平行，且反应腔体832的封闭的端面和外套管831的未设有内螺纹一端的端面平齐，实现对外套管831一端端面的密封。较佳的，反应腔体832的外表面设有定位凸起，外套管831的内表面设有定位凹槽，所述定位凸起和定位凹槽均与外套管831的轴线平行，所述定位凸起和定位凹槽配位连接。安装时，将反应腔体832的定位凸起对准并***外套管831的定位凹槽，即可将反应腔体832准确***外套管831中。

分流塞834用于封闭反应腔833和分流流体。分流塞834采用柔性材料制成，较佳的，分流塞834材质为橡胶，分流塞834外径不大于外套管831，以能套入外套管831中。分流塞834包括分流帽8341和多个连接凸起8342。连接凸起8342连接在分流帽8341上，连接凸起8342的外径不小于反应腔833的孔径，连接凸起8342的个数和所述反应腔833的个数相同，多个连接凸起8342可分别***多个反应腔833中并保持不掉落以封闭各反应腔833的腔口。同时分流塞834上有多个微孔8343，多个微孔8343分别连通多个反应腔833，使反应腔833能与外界相通。显然，所述微孔8343穿过连接凸起8342和分流帽8341。所述微孔8343的孔径不大于样本液或样本保存液的毛细长度，换言之，微孔处的液体表面张力大于其重力。所述微孔8343的孔径为0.3～0.6mm。如此，当样本液或样本保存液不受除重力之外的作用力时，样本液或样本保存液不能穿过所述微孔8343；当样本液或样本保存液受到超过一定大小的除重力之外的作用力时，样本液或样本保存液能穿过所述微孔8343，此时分流塞834能对样本液或样本保存液进行分流。

基于上述结构，当样本部外管811和外套管831配位螺接，样本部81和加样部82通过撕拉环限位，且所述反应腔833内装有反应体系，样本部内管812中装有样本保存液时，样本保存液一端通过凹形塞821密封、另一端通过密封件814封闭，反应体系通过分流塞834和外界分开。使用时，旋开样本部外管811和外套管831，取下密封件814，将待测样本放入样本保存液中，形成样本液，再旋紧样本部外管811和外套管831，使样本部外管811和外套管831形成封闭外壳，此时所述分流塞834实现了将反应腔833与样本部81的样本液隔开的作用。再撕下所述撕拉环，单向旋转加样帽822的帽头，使凹形塞821被推动朝着靠近反应部83的方向移动，所述样本液受压，样本液可通过所述微孔8343进入反应腔833中。

综上，加样部82既可实现样本部81一端与外界之间的密封连接，又可通过单向旋转加样部82向样本部81加压实现样本液加入反应部83中。同时，反应腔833内设有独立的反应体系，可实现同一样本的多个检测项的同时检测。

本实施例还提供一种和所述反应器配套使用的多人份核酸快检设备。所述核酸快检设备包括反应器8和反应仪，反应仪设有多个承载腔位11，待测样本放置于反应器8中，反应仪的检测过程中不破坏反应器8的密封，反应仪可对不同样本同时进行混检。

本实施例中，设备包括承载部1、加热部2、振动部3、驱动部4、拍照部5、安装架体7和外壳6，承载部1、加热部2、振动部3、驱动部4、拍照部5通过安装架体7设置在外壳6内。安装架体7为异形板结构，承载部1、加热部2和振动部3安装于异形板上端，驱动部4安装在异形板的腔内，位于振动部3的下方；拍照部5安装于异形板一侧。

本实施例中，安装架体7包括上安装座71、底座73和两个支座72，上安装座71的四个角端分别设有一个凸出的安装块75，上安装座71设有安装孔。两个支座72分别设在上安装座71的两边，支座72的底部固定在底座73。

本实施例中，承载腔位11设于承载部1，承载部1设有承载板和多个定位筒，定位筒固定于承载板上，承载板和定位筒采用导热且非柔性材料制作，承载腔位11由承载板和定位筒围设而成，承载腔位11依顺序阵列排布，每个承载腔位11可放置一个反应器8。外壳6设有盖子61，盖子61位于承载部1的上方，盖子61可以打开，用于放入或者取出反应器8。

本实施例中，加热部2包括加热板21和多个加热片，本实施例中加热片采用陶瓷加热片，陶瓷加热片位于加热板21下方，加热板21固定于承载板的底部，陶瓷加热片通过承载板和定位筒对反应器8整体加热，可以均匀加热，同时能够更精确的控制反应温度。

本实施例中，振动部3设有振动变形板31，陶瓷加热片安装于振动变形板31上，振动变形板31安装于上安装座71，振动变形板31设有四个安装板，每个安装板固定连接一个安装块75。振动变形板31的侧面与安装板之间存在间隙，这样可以减小振动变形板31的振动对上安装座71的冲击力。

本实施例中，驱动部4包括振动电机41和进出电机42，振动电机41的驱动轴上设有偏心振子，振动电机41安装于上安装座71的下方，固定在底座73上，振动电机41的驱动轴穿过上安装座71的安装孔，通过偏心振子驱动振动变形板31带动承载部1振动。进出电机42固定于底座73，用于驱动拍照部5。

本实施例中，拍照部5包括相机51、拍照盒52、滑块53、滑轨54和连接板55，上安装板设有连接座74，滑块53和连接座74固定连接，滑块53与滑轨54相配合，能够相对滑动。连接板55固定于滑轨54的底端，连接板55设有滑槽，进出电机42的驱动轴固定连接一偏心连杆，偏心连杆可以在连接板55的滑槽中滑动。相机51通过一相机座固定在底座73上，拍照盒52固定安装于滑轨54的一端。进出电机42通过偏心连杆，使滑轨54相对滑块53移动，以带动拍照盒52伸出外壳6。外壳6设有相对应的可开闭的口。拍照盒52设有用于放置反应管的槽位。拍照盒52移出外壳6的距离以槽位露出外壳6能够放置反应管即可。

本实施例中，拍照时拍照盒52伸出外壳6，放入已反应完毕的反应管，然后拍照盒52移入外壳6内，相机51进行拍照，拍照后拍照盒52伸出外壳6，取出已拍照的反应管，放入下一个反应管继续拍照。实际上，拍照和反应能够同时进行，即在第一次做完反应后，进行拍照时，承载部1可以放入第二批反应管，加快了检测速度。

本实施例的快检设备还设有对电机进行冷却的冷却单元，以及用于控制各零部件运行的主机。冷却单元设有风扇，对电机进行冷却。快检设备设有控制***，控制***包括检测模块、转换模块、处理模块、显示模块。检测模块设有温度传感器，用于检测承载部1的温度，并将检测数据传输至处理模块；转换模块包括DC-DC转换器；处理模块用于将检测到的温度数据在显示模块显示。相机51与处理模块电连接，照片在显示模块显示。冷却单元和控制***根据设备的机械结构部分进行设置，采用常规的可以达到相应控制效果的部件即可。

为了验证本发明提供的检测方法，本实施例采用CN112442555A公开内容设计反应体系，试剂的具体制备工艺参照现有技术，在此不赘述。

基于上述检测反应器和多人份核酸快检设备的检测核酸检测方法，包括以下步骤：

S1、制备检测试剂：根据上述文献获得新冠病毒对应的反应体系，包括引物、逆转录酶、Bst DNA聚合酶、dNTP、Buffer和中性红，并将反应体系制备为冻干粉制剂预加入反应器8中；样本保存液采用市售产品(达安基因生产)，且反应体系和样本保存液分别独立地内置于同一反应器8内，将样本保存液装在反应器8的样本部内管812中，样本部内管812的一端通过凹形塞821密封、另一端通过密封件814密封，使样本保存液密封保存在样本部内管812中。反应体系装在反应器8的反应腔833内，再***分流塞834。将样本部外管811和外套管831螺接后，分流塞834实现将反应体系和外界隔开。

为了保证反应体系的稳定，可将反应腔内的冻干试剂上加封一层石蜡，此外，还可将反应体系通过石蜡分为多层，如染料和dNTP为一层、逆转录酶、Bst DNA聚合酶和引物为一层、Buffer为一层。

S2、取待测样本并加入样本保存液中成样本液，其中，所述样本为鼻腔拭子取样，取样后的拭子放入已加有样本保存液的反应管中成样本液。

S3、加入样本液，样本液通过外力压入反应体系中，样本液加入量小于100微升。

具体的，步骤S3又包括如下三步：

S3-1、将取样后的拭子加入样本部81内，密封反应部83与样本部81，施加外力混匀样本液。

具体操作为：旋开反应器8的样本部外管811和外套管831，取下样本部81的密封塞或撕下密封膜，将取样后的拭子加入样本部内管812中，再将外套管831与样本部外管811螺接拧紧，螺接时，将样本部内管812的开口端朝上以防止样本液掉出。最后摇晃混匀反应器8。

S3-2、不破坏反应器8密封的条件下，通过加样帽822对样本部81进行加压加样。

具体操作为：撕开撕拉环(易撕)，向样本部81旋转加样帽822进行加压加样。具体的，旋转加样帽822的帽头，使帽头推动凹形塞821，凹形塞821在样本部内管812中朝着靠近反应部83的方向移动，样本部内管812中的样本液受到压力，能通过微孔8343进入反应部83的反应腔833中。

S3-3、对反应器8施加与反应器8重力方向相同的力，使得挂在反应部83顶部的样本液进入反应腔833内，具体操作为：再将反应器8向地向下方向摇晃(轻甩)，使得挂在反应部83顶部的样本液进入反应腔833底部。

S4、将反应体系进行扩增反应并读取反应结果完成检测，检测结果通过比色或荧光判定。

具体的，步骤S4又包括如下三步：

S4-1、将反应器8放入上述快检设备或加热设备(水浴锅、金属浴或普通PCR仪)，加热后封隔层融化反应体系与样本液混合成反应液，

S4-2、反应器8内温度维持至扩增温度，此时石蜡融化，样本液加入反应体系中，且石蜡上浮至含有样本液的反应体系上，也可形成一个封层作用，进一步密封从而保证反应结果，并振荡反应器8，使反应液充分混匀进行扩增反应；为保证反应充分，可多次反复振荡或旋转反应器8。

S4-3、对显色后的反应器8进行拍照，反应结果如图7所示，其中，阳性扩增结果呈***，阴性扩增结果为淡黄色，该结果与CN112442555A公开内容一致。

上述实施案例只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。

Claims (22)

1.核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、制备检测试剂：根据待测物选择扩增方法且适应性地设计检测试剂；配置检测试剂后并将检测试剂预加入反应器中；检测试剂包括反应体系和样本保存液，且反应体系和样本保存液分别独立地内置于同一反应器内；

S2、取待测样本并加入样本保存液中成样本液，其中，所述样本为可获取核酸的样本来源；

S3、加入样本液，样本液通过外力压入反应体系中，样本液加入量小于100微升；

S4、将反应体系进行扩增反应并读取反应结果完成检测，检测结果通过比色或荧光判定；

其中：

所述扩增反应为变温扩增反应或等温扩增反应；

所述反应体系为10-200微升，反应体系至少包括：反应酶、引物、dNTP、Buffer和染料；

根据待测核酸适应性地设计特异性引物序列；

所述样本选自：鼻咽分泌物、肠道分泌物、呼吸道分泌物、生殖道分泌物或血液样本。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当待测核酸为RNA时，反应酶包括RNA-逆转录酶；且当等温扩增反应时，反应酶还包括BST聚合酶；或当变温扩增反应时，反应酶还包括Taq聚合酶；或当待测核酸为DNA时，等温扩增反应体系反应酶包括BST聚合酶，变温扩增体系反应酶包括Taq聚合酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：染料为显色染料或荧光染料。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述显色染料选自以下的一种或几种的组合：HNB、中性红染料、钙黄素、酸性铬蓝K、钼酸铵或可见光染料；或所述荧光染料选自以下的一种或几种的组合：SYBR Green、SYBR Gold、SYBR-safe、EvaGreen、RTGreen、SYTO-9、GelGreen、Gel Red、EB染料或Gold View I染料。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：取样方式为拭子取样；取样后将带有核酸的拭子放入已加有样本保存液的反应管中成样本液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S1中所述反应体系为冻干状态。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S1中反应器内反应酶、引物和dNTP中至少一个组分与另外二个组分通过遇热可融的封隔层独立地分别加入所述反应器的同一腔内。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述封隔层的熔点为50～70℃，且凝固点为0～40℃。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：S4加热后所述封隔层融解后反应体系成反应液状态并进行扩增反应。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述封隔层选自以下的一种或几种的混合物：石蜡、硅油、或十八烷，且所述封隔层的密度小于水。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系还包括冻干保护剂。

12.一种用于权利要求1～11任一所述的核酸检测方法的反应器，其特征在于：所述反应器包括顺序连接的加样部、样本部和反应部，其中加样部和样本部之间、样本部和反应部之间活动连接实现密封状态，加样部为活塞结构，样本部内预装有样本保存液，反应部中装有反应体系；反应部与样本部连接处设有微孔且所述微孔的孔径不大于样本液或样本保存液的毛细长度；在反应器密封状态下，加样部通过外力向反应部方向运动实现密封状态下样本液穿过微孔压入反应部内。

13.根据权利要求12所述的反应器，其特征在于：所述反应部内设有多个反应腔，每个所述反应腔内预设有独立的反应体系，可实现针对同一样本多个检测项的同时检测，微孔设置于反应腔的腔口处，且每个反应腔设置一个微孔。

14.根据权利要求12或13所述的反应器，其特征在于：所述反应部设有分流塞，所述分流塞位于反应部与样本部的连接处，所述反应腔通过分流塞独立密封，所述微孔设于分流塞。

15.根据权利要求14所述的反应器，其特征在于：所述分流塞的一面向反应腔内凸起封闭腔口，所述微孔贯穿凸起。

16.根据权利要求12所述的反应器，其特征在于：所述反应部设有套接的内反应管和外套管，所述内反应管卡紧于外套管内，所述外套管设有与样本部配位螺接的螺纹。

17.根据权利要求16所述的反应器，其特征在于：所述内反应管设有多个反应腔。

18.根据权利要求13所述的反应器，其特征在于：所述加样部包括套接的凹形塞和加样帽，所述加样帽内设一***凹形塞呈套接的硬性凸起件，所述加样帽还设有与样本部配位螺接的螺纹连接段。

19.根据权利要求18所述的反应器，其特征在于：所述加样部还设有一限位件，所述限位件用于限制加样部旋转。

20.根据权利要求19所述的反应器，其特征在于：所述限位件为一撕拉环，所述撕拉环分别与加样帽和样本部端口连接，此时撕拉环用于加样部与样本部之间的限位。

21.根据权利要求12所述的反应器，其特征在于：样本部近反应部端口封闭，未加入样本时呈独立密封状态，所述端口通过密封塞或密封膜实现封闭。

22.根据权利要求12所述的反应器，其特征在于：所述样本部为一同轴套管，其中内管为一中空管，且内径与所述凹形塞密封贴合连接，外管的一端设有与加样部配位螺接的螺纹；反应器密封时，内管的一段位于凹形塞与加样部的间隙；反应前样本保存液预设于内管的腔中。

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