CN115702948A - 一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用。具体的,本发明将末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇和对称交联及非对称交联剂作为成胶组分,通过聚乙二醇末端亲电基团和交联剂上的多个亲核基团自发进行亲核取代反应,形成自固化粘附型凝胶。通过对称及非对称交联调控可对凝胶化时间、降解周期、力学性能进行优化从而更加适合于眼科手术使用并代替传统缝合对眼部切口的密封提供技术性变革。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,具体地,本发明涉及一种新型眼科凝胶绷带的制备和应用。
背景技术
在临床中眼科手术切口需要被缝合,缝合虽然是当今切口封闭的“金标准”,但是缝线缝合通常费时费力,且不可避免会改变伤口的结构,有一定的异物感,且通常需要被二次拆除。
水凝胶是将亲水性聚合物链进行三维连接,所形成的聚合网络能保留大量的水而不被溶解的一类材料。因其柔软程度、含水率、微观结构等性质与生物组织有很大的相似性,因此常被作为新一代的生物医用材料进行使用。寻找一种可原位成型且具有粘附性的水凝胶来代替使用缝线密封伤口,从而提供更光滑的伤口表面,提高对伤口的适应性和贴合性,减少术后的疼痛和炎症,改善切口愈合,提高手术效率是未来的发展趋势。
聚乙二醇(PEG)因其具有良好生物相容性和可代谢性,近年在生物材料领域得到广泛地应用。PEG基水凝胶密封剂通常是基于末端修饰活性酯基团四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-NHS)与带两个及以上功能基团交联剂自发进行化学应形成的原位固化水凝胶,该凝胶的粘合作用一方面来自水凝胶内部分子的化学键连接,另一方面是改性PEG与施用部位组织蛋白上功能基团发生同样反应产生的键合力。基于PEG的密封剂通常具有机械强度高、组织粘结力强、成本低等特点。目前市面可见的该类水凝胶产品主要有美国的(Baxter Corportion,USA)、(Integra Lifesciences Corporation,USA)、ProGELTM(Neomend,USA)等,但目前这些水凝胶在某些性能上存在局限很难运用在眼部区域,例如降解周期长,远远慢于眼部伤口正常自愈合所需时间,从而易造成组织愈合畸形;再者成胶速率过快,通常两相溶液相遇后即立刻成胶(≤5s)而无法均匀精准交付,目前唯一款被美国食品药品管理局(FDA)批准用于角膜的密封剂(Ocular Therapeutix,USA),由于交联剂为单一性能难以调节从而应用效果不佳。例如凝胶化时间过快,从而易导致凝胶提前凝固而无法涂抹于伤口,且一般一次只能涂抹单个切口,又如其降解过快(≤3d)而易造成液漏再次发生等问题。因此开发出一款性能可根据实际使用需求的眼科组织密封剂,从而代替传统缝线对眼科组织切口进行密封/粘合是非常值得研究的。
我们将末端修饰琥珀酰亚胺活性酯四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-NHS,Succinimideactivated ester)与对称交联剂和非对称交联剂作为主要成分,通过合成的4-arm-PEG-NHS上的亲电基团与对称交联剂及非对称交联剂上的自由氨基、巯基等亲核基团发生取代反应形成-(C=O)-NH-或-(C=O)-S-交联结构,即可形成原位自固化的水凝胶。同时可以发现凭借多聚对称交联剂上重复的亲核基团进行快速交联,所形成的凝胶网络较为完整及紧密,凝胶具有较硬的力学性能、较快的凝胶化时间、较慢的降解特性等特性;而由于非对称交联剂上两亲核基团的不对称及反应活性不一,所形成的网络较为松散、力学较软、凝胶化时间慢、降解快等特性。因此基于多聚对称交联剂及非对称交联剂所形成的凝胶性质特殊性,通过比例调节可对凝胶的力学性能、凝胶化时间、降解周期等进行精细化调节以匹配不同眼部组织使用需求。该设计所有主要成分均生物安全性较高、无刺激性,且降解后产物无毒均可通过泪液等方式排出体外,无毒副残留,因此为项目的产品转化提供了良好的基础保障。
发明内容
本发明的目的是提供一种医生使用便捷、成胶及降解时间可控、机械性能良好、组织粘合能力强、生物相容性优异的医用眼科凝胶密封剂/粘合剂材料。
本发明第一方面提供了一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带材料,所述水凝胶包括:
(1)末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇;
(2)多聚对称交联剂/非对称交联剂混合物;
(3)成胶缓冲溶液;
其中,所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇具有以下一个或多个特征:
(a)聚乙二醇的臂数≥2,每条臂的臂长及结构一致;
(b)重均分子量为5000~40000;
在另一优选例中,所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的臂数为2~8,其中最佳为4。
在另一优选例中,所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的分子量为5000~20000,其中最佳为10000。
在另一优选例中,所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团根据连接臂不同可为碳酸酯、乙酸酯、琥珀酸酯、戊酸脂等,其中较佳的为琥珀酸酯及戊酸酯。
其所述聚多聚对称交联剂,具有以下一个或多个特征:
(a)为水溶性大分子聚合物,重均分子量≥1000;
(b)每个重复单元至少含有一个亲核基团;
(d)每个亲核基团相邻结构及反应活性一致;
在另一优选例中,多聚对称交联剂可以选择为聚乙烯亚胺、聚烯丙基氨、聚精氨酸、聚赖氨酸、壳聚糖,其中最佳为聚乙烯亚胺和聚赖氨酸。
其所述聚非对称交联剂,具有以下一个或多个特征:
(a)为水溶性分子,重均分子量<1000;
(b)分子上至少含有两个亲核基团;
(d)每个亲核基团相邻结构及反应活性不一;
在另一优选例中,多聚对称交联剂可以选择为半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、寡肽-1等,其中最佳为赖氨酸和半胱氨酸。
在另一优选例中,其所述多聚对称/非对称交联剂所提供的亲核基团摩尔比为9:1~1:9之间,其中最佳6:4~7:3:。水凝胶成胶液中亲电官能团和亲核官能团的摩尔比在10:6~10:18之间,最佳为10:8~10:12之间。
其中,所述成胶缓冲液包含pH为4~6弱酸性缓冲液A及pH为7~10弱碱性缓冲液B两种溶液。
在另一优选例中,pH为4~6弱酸性缓冲液A可为水、盐酸稀释液、醋酸稀释液、硫酸稀释液等,或者为硫酸氢钠等酸性盐溶液。
在另一优选例中,pH为7~10弱碱性缓冲液B为磷酸盐、碳酸盐、四硼酸盐等碱性盐溶液,其中pH为9~10的盐溶液为最佳。
在另一优选例中,根据活性酯种类及对称/非对称交联剂配比不同,随其所述水凝胶在3~60天内可控降解,其中较佳为7~15天。
在另一优选例中,随聚对称/非对称交联剂配比不同,随其所述水凝胶的凝胶化时间在8~300s内可调,其中较佳为20~150秒。
在另一优选例中,随聚对称/非对称交联剂配比不同,其储能模量(G’)在2000~20000Pa内可调,其中较佳为3000~10000Pa。
在另一优选例中,随聚对称/非对称交联剂配比不同,其所述水凝胶的组织粘合强度在15~40KPa内可调。
在另一优选例中,随聚对称/非对称交联剂配比不同,随其所述水凝胶的组织***强度在30~150mmHg内可调。
本发明第二方面提供过了三种本发明第一方面所述的基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带制备使用方法,第一种方法包括步骤:
(a)成胶缓冲液A溶解末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇作为成胶前驱液A;
(b)成胶缓冲液B溶解多聚对称/非对称交联剂混合物,作为成胶前驱液B;
(c)将成胶前驱液A和成胶前驱液B混合。
(d)将成胶液混合均匀后,涂抹或微量注射至所需组织部位,原位形成水凝胶。其中,步骤(a)和(b)的顺序可以互换。
本发明所提供的第二种制备方法包括步骤:
(a)末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇、多聚对称/非对称交联剂粉末混合均匀;
(b)加入成胶缓冲液A使得混合粉末充分溶解;
(c)加入成胶缓冲液B混合;
(d)将成胶液混合均匀后,涂抹或微量注射至所需组织部位,原位形成水凝胶。本发明所提供的第三种制备方法包括步骤:
(a)将成胶缓冲液A和B混合均匀
(b)用混合均匀的缓冲液溶解对称/非对称交联剂混合粉末;
(c)将溶解后的溶液溶解末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇粉末;
(d)将成胶液混合均匀后,涂抹或微量注射至所需组织部位,原位形成水凝胶。
在另一优选例中,所有主要成份都可进行辐照灭菌(有效灭菌剂量≥20KGy)。
在另一优选例中,成胶所需的温度为25℃±10℃,较佳地,为25℃。
在另一优选例中,成胶前驱液A和成胶前驱液B的体积可以相同也可以不同,其中较佳为1:1。
在另一优选例中,凝胶中多臂聚乙二醇衍生物质量浓度为80~150mg/mL,其中较佳为100±10mg/mL。
本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述的基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的应用,用于制备眼科医用材料。
在另一优选例中,所述医用材料用于眼部组织封堵、组织粘合、组织修复、药物原位缓释载体等。
在另一优选例中,所述医用材料为如下的一个或多个:
(1)作为组织密封(可应用于眼科角膜、巩膜、结膜等伤口密封或者移植角膜进行粘合)
(2)作为栓塞剂(可应用于干眼症患者的泪道栓塞)
(3)作为药物缓释载体凝胶(可负载相应药物对眼部进行原位涂抹交付并原位缓释药物)。
应理解,在本发明范围内,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了该眼科凝胶绷带医疗器械包设计,及相应的交付方式。
图2显示了基于不同交联剂成分凝胶绷带的制备。
图3显示了不同对称/非对称交联比例下凝胶的力学性能、微观结构调控。
图4显示了在不同对称/非对称交联剂配比下的凝胶化时间调节。
图5显示了在不同活性酯种类及不同对称/非对称交联剂配比下的降解周期调节。
图6显示了在不同对称/非对称交联剂配比下凝胶绷带对猪皮组织粘附强度。
图7显示了在不同对称/非对称交联剂配比下凝胶绷带对猪眼角膜切口密封的抗***强度。
图8显示了该眼科凝胶绷带的细胞相容性。
图9显示了该凝胶绷带对角膜切口密封的有效性评价。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,首次设计开发出一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用。具体的,本发明将末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇和多聚对称/非对称交联剂作为成胶组分,通过聚乙二醇末端活性酯(亲电基团)和多聚对称/非对称交联剂上的多个氨基或巯基(亲核基团)自发进行亲核取代反应,形成自固化凝胶,并在成胶过程中可与组织蛋白上氨基/巯基键合以提供粘合力。该凝胶绷带可实现1)通过对称及非对称两种交联方式的选择对原位凝胶化时间进行调控,从而满足眼科凝胶精细化涂抹或混合后微量注射所需的操作时间。2)通过调整聚合物网络中的对称交联及非对称交联比例可让凝胶具有合理化的降解周期,避免过快降解或长期占位;3)通过对称及非对称交联设计可对凝胶的力学性能进行调控从而更好的贴合柔软的眼部组织。在此基础上,完成了本发明。
术语说明
末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的多臂化聚乙二醇(m-arm-PEG-NHS)
本发明的所采用的末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的多臂聚乙二醇为多臂聚乙二醇衍生物,其制备过程为在EDCI(1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)作用下将多臂聚乙二醇酸(4-arm-PEG-COOH)末端羧基进行改性得到m-arm-PEG-NHS,其特征为末端含有琥珀酰亚胺和相邻酯基。基于m-arm-PEG-COOH末端结构不同,m-arm-PEG-NHS末端可分为碳酸酯琥珀酰亚胺、乙酸酯琥珀酰亚胺、琥珀酸酯琥珀酰亚胺、戊酸酯琥珀酰亚胺等。其结构如下:多臂聚乙二醇碳酸酯琥珀酰亚胺(m-arm-PEG-SC)多臂聚乙二醇乙酸酯琥珀酰亚胺(m-arm-PEG-SCM)多臂聚乙二醇琥珀酸酯琥珀酰亚胺(m-arm-PEG-SS)
本发明的主要优点在于:
1)可以涂抹或微量注射成胶液并发生原位凝胶化将伤口密封,从而代替传统缝线对眼科伤口的闭合提供技术性变革。
2)通过调整聚合物网络中的对称交联及非对称交联比例,可较为简单地对凝胶化时间、降解周期、力学性能等进行调控,从而更加满足眼部组织使用所需性能要求。
3)所有主要成分均生物安全性较高、无刺激性,且降解后产物无毒副残留,因此为项目的产品转化提供了良好的基础保障。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例一 包设计。
本发明从使用有效性及简便性的角度出发,设计两种可涂抹自密封型凝胶绷带医疗器械包。如图1-(a)所示,其中含有一瓶4-arm-PEG-NHS粉末,一只盐酸稀释液(约稀释107倍),一只含有对称/非对称交联剂的混合溶液,一只涂抹棒。该医疗器械包使用时,先加入盐酸稀释液将4-arm-PEG-NHS溶解,溶解后加入对称/非对称交联剂的混合溶液,利用涂抹棒搅拌均匀后对组织进行涂抹。
如图1-(b)所示,该设计医疗器械包中含有一管4-arm-PEG-NHS粉末,一管含有对称/非对称交联剂的混合溶液,一只三通阀,一个注射头。该医疗器械包使用时,先将两只注射器装于三通阀上,通过往返推注的方式将4-arm-PEG-NHS粉末溶解均匀,再转动三通阀进行微量注射。
实施例二 不同成分凝胶绷带的制备
该凝胶绷带使用制备过程分为,首先向装有4-arm-PEG-NHS粉末中加盐酸稀释液将其溶解,溶解后4-arm-PEG-NHS浓度为20%,再加入或滴入同等体积的含有对称交联剂(聚赖氨酸(PLL)\聚乙烯亚胺(PEI)\水溶性壳聚糖(CS))/非对称交联剂(赖氨酸(Lys)/半胱氨酸(Cys)/精氨酸(Arg))混合溶液,搅拌搅匀后将成胶液涂抹,或用移液枪转移至目标区域,原位形成凝胶,其中亲核与亲电基团摩尔比为1:1,对称交联剂与非对称交联剂所提供的亲核基团比为1:1。
如图2所示:将混合均匀的成胶液吸取到不同的模具中。可看出:(1)成胶液可具有合适的凝胶化时间,可以在混合均匀后转移至不同的模具中进行成胶反应。(2)水凝胶固化后呈现与模具相同的形状,且成胶具有良好的成型性。
实施例三 力学性能、微观结构、吸水率表现调控。
根据上述方法制备了不同对称/非对称交联比例的PEG-PLL-Lys水凝胶,所形成的凝胶记为PEG-PLL-Lys(a:b:c),其中a:b:c=PEG上活性酯基团:PLL上伯氨基团:Lys上伯氨基团摩尔比。按照上诉方法制备PEG-PLL(10:10:0)、PEG-Lys(10:0:10)、PEG-PLL-Lys(10:6:4)、PEG-PLL-Lys(10:4:6)水凝胶。将制备好的凝胶进行按压测试。并将不同成分比例的成胶液注射于流变样品台上,选取凝胶线性黏弹区中间振幅值在0~600s内进行时间扫描测试,分析不同水凝胶在成胶液在成胶过程中网络结构及动态力学反应变化过程。然后将成胶后的凝胶冻干后用液氮脆断,对表面进行喷金处理,在场发射扫描电镜(S-3400)下进行观察并拍摄。
如图3-(a)所示,可以发现PEG-PLL(10:10)水凝胶较硬和脆,相同形变下,受到挤压的PEG-PLL(10:10)易于发生破裂,而PEG-Lys(10:10)水凝胶可以被压至较大形变也保持其外观的完整性。这一结果是这两种水凝胶完全具备不同的交联网络所造成的,由于PLL上的伯氨基团具有高度的对称性及相连性,且每个重复单元上氨基反应活性相同,因此形成的网络更为紧密和对称;而Lys由于其氨基的不对称性(反应活性不一),所形成的凝胶更为松散,我们认为这是由于相邻两个末端的活性酯如果同时与两个Lys上活性较高的-NH2发生反应,相邻的两端的PEG则失去了交联的机会。通过流变分析(图3-(b)),可以看出随着对称交联剂(PLL)比例不断提升,水凝胶的储能模量不断提升,证明凝胶网络趋于完整。同时,通过SEM观察可以发现(图3-(c)),PEG-PLL(10:10)水凝胶网孔结构较为对称和密实、而PEG-Lys(10:0:10)凝胶网孔结构较为疏松和无规,这也证明了PLL作为交联剂可形成更为对称和密实的网络结构,而Lys上的氨基由于其不对称性,形成的网络结构较为无规和松散。而PEG-PLL-Lys(10:6:4)水凝胶可以介于两者之间。
实施例四 凝胶化时间测定。
通过观察“倒置离心管,成胶液流动”的方法,测定了不同对称/非对称交联比例下水凝胶的凝胶化时间。按照上诉凝胶制备方法,将含有PLL、Lys混合溶液加入到4-arm-PEG-SS溶液中开始计时并加以搅拌(5~10s),搅拌后观察成胶液流动情况,当直到停止流动所记时间视为该凝胶的凝胶化时间。
如图4-(a)所示,可以发现随着PLL加入量越大,凝胶化时间越短,这与PLL上的氨基本身就是多聚结构,以及PLL上氨基具有相同的反应活性有关。交联时间对粘合剂在眼科的使用起到十分重要的作用,这是因为,眼科的伤口一般所需凝胶量较小(一般需为10~30μL),因此,一般只能通过涂抹或微量注射的方式进行上样,这就需要凝胶在发生凝胶化转变前具有合适的操作窗口时间(即凝胶化时间),如果凝胶化时间过短,则来不及将成胶液混均或者转移涂抹\注射,如果凝胶化时间过长,涂抹或注射过后流动性较强则会存在随意流动造成眼部二次伤害风险。通过对PLL/Lys比例进行调节可以发现水凝胶当活性酯与PLL上氨基为10:6时,凝胶化时间约为23~40s比较满足我们所需的混合、转移、涂抹所需时间。同时可以发现,Lys的加入量不对凝胶化时间影响不大(图4-(b)),这可能是因为在成胶液在最初反应过程中,PLL快速诱导的对称交联对凝胶的相转变过程起到主要作用。
实施例五 体内外降解性能。
根据上述方法,使用4-arm-PEG-SS制备不同比例的PEG-PLL-Lys水凝胶并进行冷冻干燥后进行精确称重(W0),再将水凝胶置于PBS中,并置于37℃恒温摇床中进行降解实验,并在预定时间后将水凝胶取出干燥后进行称重(Wt)。并根据一下公式不同水凝胶在不同时间点的残留量:
物质残留量(%)=Wt/W0*100%
从图5可以看出,当对称交联剂加入量一定,随着非对称交联剂加入量的提升,降解周期先变长后变小,我们推测这是因为随着Lys不断加入,Lys的交联作用使得凝胶网络趋于完整,但是Lys加入过量后,Lys上的活泼氨基优先反应,多数的Lys未起到交联作用,并使松散交联比例增加。因此,通过对凝胶交联剂比例的改变对凝胶的降解性能在3~15天内进行精细化调控以满足使用需求。
同时如果用4-arm-PEG-SC或者4-arm-PEG-SG制备PEG-PLL-Lys水凝胶,相同比例下,降解时间会明显变长。
实施例六 猪皮组织粘附强度测定
按照上诉方法制备PEG-PLL-Lys(10:6:4)凝胶并注射到清洗干净的猪皮表面,成胶后进行折、拧、拗等实验操作以观察其力学性能以及与组织的粘合强度。用于眼科的可涂抹组织密封,需要其首先能够牢固地粘附在潮湿的眼部环境,并能抵抗因眨眼、眼球转动等动态环境产生的机械应力。如图6-(a)所示,在成胶液形成水凝胶过程中,成胶液中的活性酯基团可以于组织上氨基发生相似的酰胺化反应产生连接力,同时水凝胶中PLL分子还能与界面的组织产生氢键、静电等非共价作用从而使得水凝胶能牢固的黏附于组织表面。从图6-(b)直观地观察到,PEG-PLL-Lys水凝胶可以紧密地粘合在一块猪皮表面,并承受纽、拧等应力作用而不会断裂或脱落。接下来我们将黏附有水凝胶的猪皮放在PBS溶液中并加以震荡,可以清晰地看出,PEG-PLL-Lys水凝胶在观察的5天中,没有发生明显的破裂、脱落等不良现象(图6-(c))。
将成胶液混合均匀后涂抹于两块猪皮间。反应完全后(30min),通过氰基丙烯酸酯胶将粘合在一起的猪皮分别固定到表面经过粗糙化处理过的玻璃片的一端。并使用万能力学拉伸机夹住玻璃片对粘合在一起的猪皮进行拉伸,拉伸速率为5mm/min。拉伸过程中所测得的最大值即对应水凝胶的粘合强度,装置示意图如6-(d)所示。
如图6-(e)所示,随着水凝胶中Lys的加入量不断增加,粘合强度先增加后降低,这证明了Lys的适量加入可以提升凝胶网络的完整性,从而增加凝胶的在粘合过程中的内聚力,当水凝胶加入量比例为10:6:4时,该凝胶的粘附强度最大为23kPa左右,且明显大于医用猪纤维蛋白胶(15kPa)。
实施例七 不同PLL/Lys配比凝胶对于猪眼角膜切口密封的抗***强度测定
将离体猪眼清洗干净后,在角膜边缘建立切口,并按上诉方法涂敷成胶液,利用橡皮管及三通接头一端连接注射器,一端接有电子压力计,另外一端连接针头后***眼内。开动注射泵恒定流速往眼内均匀注入PBS液体,并监测血管内压力。当内部开始下降,即认为是水凝胶的最大的***压力,装置示意图为7-(a)所示。从图7-(b)观察,在角膜边缘建立切口后,涂抹混合均匀的成胶液,大约10min,在眼球的另外一端***30G针并向眼内注射PBS,并实时监测眼内压力,直到切口处发生破裂所记录的最大压力记为凝胶绷带的抗***压力。可以发现,PEG-PLL-Lys在加入不同量Lys调整后水凝胶具有较好韧性,当水压较大时,水凝胶只会发生向外凸起的形变而不破裂,且所有组都大于人的正常眼压15mmHg,因此其作为眼科密封剂防止眼内液体流出有效性可以得到初步保证。
实施例八 细胞相容性评价。
参照GB/T 16886体外细胞毒性试验评价标准,在37℃无菌环境下将灭菌凝胶浸泡于细胞培养基中48h制备水凝胶浸提液(0.1g/mL),选用小鼠成纤维细胞(L929)作为细胞模型,并采用CCK-8试剂盒测定细胞在浸提液中细胞增殖活力,并采用细胞活死荧光染色法对用浸提液培养不同时间后的细胞进行评价。
从图8-(a)可以看出,不同成分比例下,水凝胶浸提液所表现出的细胞毒性不一,但是所有组别的细胞活力都几乎大于≥80%,且增殖正常,通过活死染色发现,几乎所有的细胞都呈现存活状态、细胞铺展。由此可以证明该凝胶绷带具有良好的生物相容性。
实施例九 角膜切口密封有效性评价
选用新西兰大白兔的角膜为动物伤口密封模型。按照单次使用量及施加操作手册在眼表进行涂抹,观察材料对角膜切口的密封及修复情况。
(1)首先术前一天对兔子的眼球滴加诺氟沙星滴眼液进行抗菌处理。并术前半小时对兔子的眼球进行局部麻醉,使用眼压计对术前眼压进行测定记录。
(2)夹具固定以防手术过程中眼皮的眨动,使用角膜刀对角膜进行长度为3.2mm的穿刺。
(3)检查伤口处的房水流出情况,擦干流出的房水,按照上诉凝胶制备过程,将PEG-PLL-Lys(10:6:4)涂抹于角膜切口(加入了50μL/mL亮蓝作为染色液),成胶液涂抹量约为10~20μL。
(4)大约30s后检查凝胶成形情况,大约3min后按压眼球,检查凝胶绷带对角膜伤口的密封情况。
(5)并使用眼压对术后3min\1d\2d\3d\5d的眼压进行检测。
从图9-(a)可以看出,在建立伤口后可以看见大量的房水流出,如果不进行干预治疗,可能会造成眼压过低、细菌感染、视力模糊等多种病发症。涂抹成胶液,成胶液可以迅速将伤口覆盖并原位成型将伤口密封,按压眼球,也无房水流出,说明相对于传统缝合线,该凝胶绷带对伤口的密封具有更高的效率及更好的效果。同时对密封后的眼压进行监测,眼压可以立刻恢复至6mmHg,正常约为10mmHg,而对照组(建立伤口后不做任何处理),眼压一直为0mmHg且伴有房水不断流出情况发生(图9-(c))。术后24h对伤口进行观察,对照组的眼压也明显低于凝胶密封组,且对照组眼眶周围出现大量分泌物,这是因为眼球出现了炎症所致,后续对其持续进行诺氟沙星滴眼液治疗,情况有所好转(图9-(b));而实验组眼眶较为干净,无明显分泌物,眼压进一步恢复,在第三眼压可恢复至正常水平,而对照组眼压恢复仍较慢。
通过术后7天H&E切片分析,原来的伤口处已经大部分愈合,组织结构层次清晰正常,无明显炎症和其它不良情况(图9-(e))。综上,该基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带具有良好的应用效果。
Claims (7)
1.一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用,其主要特征在于所制备过程需要的主要原料包括:
(1)末端修饰琥琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇;
(2)对称交联剂及非对称交联剂混合物;
(3)成胶缓冲溶液A及B;
其中对称交联剂为聚合物,每个重复单元中含有相同的亲核基团(氨基或巯基),且每个反应活性及相邻基团相同,可选聚烯丙基氨、聚乙烯亚胺、聚精氨酸、聚赖氨酸、壳聚糖中的一种或多种。
其中非对称交联剂一般为小分子化合物,且含有两个及以上亲核基团(氨基或巯基),但亲核基团具有明显的不对称性,每个位点相邻基团及亲核性不同,可选赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、寡肽-1中的一种或多种。
通过末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇于多聚对称交联剂及非对称交联剂发生交联后,水凝胶的主要结构为多臂聚乙二醇-(C=O)-NH-对称交联剂,多臂化聚乙二醇-(C=O)-NH-非对称交联剂及多臂化聚乙二醇-(C=O)-S-非对称交联剂。
2.如权利要求1所述的一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用,其特征在于对称交联剂及非对称交联剂的基团摩尔比为9:1~1:9之间,水凝胶中亲电官能团和亲核官能团的总摩尔比在10:6~10:18之间。
3.权利要求1所述的一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用,其特征在于凝胶化时间在5~300秒内可调,降解周期为3-60天,储能模量为2000~20000Pa。
4.如权利要求1所述的一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用,其特征在于成胶缓冲液A通常为乙酸、盐酸等酸稀释液,成胶缓冲液B通常为磷酸盐、碳酸盐等碱性缓冲溶液。
5.如权利要求1所述的一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用,其特征在于制备使用方法可分为三种,方法一:
(a)用成胶缓冲液A溶解末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇作为成胶前驱液A;
(b)用成胶缓冲液B溶解对称/非对称交联剂混合物,作为成胶前驱液B;
(c)将成胶前驱液A和成胶前驱液B混合。
(d)将成胶液混合均匀后,涂抹或注射至所需组织部位,原位形成凝胶。
其中,步骤(a)和(b)的顺序可以互换。
方法二为:
(a)末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇、交联剂粉末混合均匀;
(b)加入成胶缓冲液A使得混合粉末充分溶解;
(c)加入成胶缓冲液B混合;
(d)将成胶液混合均匀后,涂抹或注射至所需组织部位,原位形成水凝胶。
方法三为:
(a)将成胶缓冲液A和B混合均匀
(b)用混合均匀的缓冲液溶解对称/非对称交联剂混合粉末;
(c)将溶解后的溶液溶解末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇粉末;
(d)溶解均匀后,涂抹或注射至所需组织部位,原位形成水凝胶。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述方法包含以下一个或者多个特征:
(1)成胶后,凝胶中多臂聚乙二醇衍生物浓度为90mg/mL~120mg/mL;
(2)对称/非对称交联剂可按照基团比例进行配置和调整从而达到不同的凝胶性质。
(3)根据不同的操作方式,所述凝胶化时间需保证具有充分的混合和上胶操作时间。
7.如权利要求1所述的一种基于对称/非对称组合交联的性能定制化眼科凝胶绷带的制备和应用,其特征在于应用在眼科领域。
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