CN115702912A - 利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法及其应用，属于植物次生代谢产物提取技术领域。所述的利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法，包括紫锥菊茎样品的微波预处理和利用响应面法对紫锥菊茎粉末进行乙醇提取步骤。本发明比较了微波、阴干、冷冻干燥三种预处理干燥方法对紫锥菊茎多酚含量的保留效果，总体上微波干燥预处理法对于紫锥菊茎中多酚的提取有较好的效果。而且，本发明的超声醇提取法对紫锥菊茎中多酚的溶出有较好效果，可缩短提取时间，提高有效成分的提取率。
Description
技术领域
本发明属于植物次生代谢产物提取技术领域，涉及利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法及其应用。
背景技术
植物多酚是一种广泛存在于植物体内的次级代谢产物，具有抗炎抗菌、增强免疫、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等生物活性。紫锥菊(Echinacea purpurea L.)是菊科(Asteraceae)松果菊属(Echinacea)多年生草本植物，松果菊属(Echinacea)有8个种及数个变种，在我国引种成功的有具紫色舌状花并且已开发利用的紫锥菊(E.purpurea L.)、狭叶紫锥菊(E.angustifolia DC.)、淡白紫锥菊(E.pallia Nutt.)。其中紫锥菊最为广泛利用，其含有的主要药用成分有多糖、糖蛋白、烷基酰胺和多酚这几类，紫锥菊多酚具有很强的抗氧化与自由基清除能力。但因加工方法、提取工艺及紫锥菊研究品种、部位的不同，其多酚的组成成分及含量是不同的，这会使得其药理活性存在显著的差异。在紫锥菊多酚中，菊苣酸是主要活性物质。而在材料的前处理中，干燥方法对菊苣酸的提取有很大的影响。目前国内外对紫锥菊中多酚提取方法的研究虽然有一些报道，但存在成本高，提取率低等问题且对于不同部位的紫锥菊多酚提取条件的优化研究还不足。因此，寻找一种低成本、高提取率的紫锥菊茎中的多酚的提取方法具有一定的技术及研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法。
本发明的另一个目的在于提供上述利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法，包括如下步骤：
(1)样品的微波预处理：将紫锥菊茎剪成长为4～6cm茎段后用薄膜密封，置于微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，然后于800W烘干1～2min，打开薄膜蒸发掉水分，得到第一次微波处理的样品；将第一次微波处理的样品用薄膜密封，置于微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，然后于640W烘干1～2min，打开薄膜蒸发掉水分，得到第二次微波处理的样品；将第二次微波处理的样品用薄膜密封，置于微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，然后于480W烘干1～2min，打开薄膜蒸发掉水分，得到第三次微波处理的样品；将第三次微波处理的样品用薄膜密封，置于微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，然后于320W烘干1～2min，打开薄膜蒸发掉水分，得到第四次微波处理的样品；取第四次微波处理的样品用薄膜密封，放入微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，于320W下烘干20～30min至干燥，粉碎过筛，即可得到紫锥菊茎粉末样品；
(2)向紫锥菊茎粉末样品中加入乙醇，超声提取，采用响应面法设定提取的变量参数，超声提取结束后，过滤，即得含有多酚的提取液。
所述的响应面法通过以下二次多项回归方程设定超声提取的变量参数：Y＝29.047-14.037A+1.547B+3.719C-2.993AB-2.329AC+0.977BC-10.586A2-2.479B2-0.451C2；其中，Y为微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎多酚提取量响应值；设定提取的变量参数：A为乙醇体积分数、B为料液比、C为提取次数。
步骤(1)中，所述的紫锥菊茎优选为新鲜一年生紫锥菊茎。
步骤(1)中，所述的紫锥菊茎的长度优选为5cm。
步骤(1)中，所述的薄膜优选为保鲜袋。
步骤(1)中，所述的粉碎过筛优选为：用粉碎机粉碎过200目筛。
步骤(2)中，所述的乙醇体积分数A为20％～100％；料液比B为1:20～500；提取次数C为1～5次；优选乙醇体积分数A为40％～100％；料液比B为1:100～500；提取次数C为1～3次。
所述的利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法在紫锥菊有效成分提取中的应用。
与现有技术相比，本申请具有以下优点及有益效果：
(1)本发明比较了微波、阴干、冷冻干燥三种预处理干燥方法对紫锥菊茎多酚含量的保留效果，总体上微波干燥预处理法对于紫锥菊茎中多酚的提取有较好的效果。而且，本发明的超声醇提取法对紫锥菊茎中多酚的溶出有较好效果，可缩短提取时间，提高有效成分的提取率。
(2)本发明通过单因素试验探究了超声时间、超声温度、超声功率、提取次数、乙醇体积分数和料液比因素对紫锥菊茎多酚提取的影响效果，在单因素试验的基础上，利用响应面试验模拟出的最佳提取条件具有更高的可靠性。此外，本发明提供了一种利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法，可用于紫锥菊茎中有效成分的工业化生产，本发明所述方法具有精确度好、提取率高和可操作性强等特点。
附图说明
图1是乙醇体积分数对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响结果图；其中：微波茎是指微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；阴干茎是指阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；冻干茎是指冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量。
图2是料液比对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响结果图；其中：微波茎是指微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；阴干茎是指阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；冻干茎是指冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量。
图3是超声时间对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响结果图；其中：微波茎是指微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；阴干茎是指阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；冻干茎是指冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量。
图4是超声温度对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响结果图；其中：微波茎是指微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；阴干茎是指阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；冻干茎是指冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量。
图5是超声功率对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响结果图；其中：微波茎是指微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；阴干茎是指阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；冻干茎是指冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量。
图6是提取次数对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响结果图；其中：微波茎是指微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；阴干茎是指阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量；冻干茎是指冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
紫锥菊采自华南农业大学农场。
1、含有多酚的提取液的制备
1.1微波干燥预处理法提取紫锥菊茎中的多酚：
利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法，包括如下步骤：
(1)样品的微波预处理：采取新鲜的一年生紫锥菊，将紫锥菊茎洗净，待表面水渍干后，将紫锥菊茎剪成长为4～6cm的茎段，将剪后的茎放进保鲜袋密封，置于微波炉中将茎段在保鲜袋中均匀平铺一层，于800W下烘干1min后，打开保鲜袋快速蒸发掉地表水，得到第一次微波处理的样品；将第一次微波处理的样品放进保鲜袋密封，置于微波炉中将茎段在保鲜袋中均匀平铺一层，于640W下烘干1min后，打开保鲜袋快速蒸发掉地表水，得到第二次微波处理的样品；将第二次微波处理的样品放进保鲜袋密封，置于微波炉中，将茎段在保鲜袋中均匀平铺一层，于480W下烘干1min后，打开保鲜袋快速蒸发掉地表水，得到第三次微波处理的样品；将第三次微波处理的样品放进保鲜袋密封，置于微波炉中将茎段在保鲜袋中均匀平铺一层，于320W下烘干1min后，打开保鲜袋快速蒸发掉地表水，得到第四次微波处理的样品；取第四次微波处理的样品放进保鲜袋密封，置于微波炉中将茎段在保鲜袋中均匀平铺一层，于320W下烘干20min至干燥，然后用粉碎机粉碎过200目筛，即可得到紫锥菊茎粉末样品；
(2)精确称取紫锥菊茎粉末样品0.1g于50mL三角瓶中，以一定的料液比加入一定浓度的乙醇，在超声破碎仪设置超声功率，温度和时间进行提取，采用响应面法设定提取的变量参数，超声提取结束后，过滤，即得含有多酚的提取液。
1.2冷冻干燥预处理法提取紫锥菊茎中的多酚：
利用冷冻干燥预处理法提取紫锥菊茎中的多酚的方法，包括如下步骤：
(1)采取新鲜的一年生紫锥菊，将紫锥菊茎洗净，待表面水渍干后，放到-80℃冰箱保存预冻4h以上，然后用冷冻干燥机进行干燥，干燥完后用粉碎机粉碎，过200目筛，即可得到紫锥菊茎粉末样品；
(2)精确称取紫锥菊茎粉末样品0.1g于50mL三角瓶中，以一定的料液比加入一定浓度的乙醇，在超声破碎仪设置超声功率，温度和时间进行提取，采用响应面法设定提取的变量参数，超声提取结束后，过滤，即得含有多酚的提取液。
1.3阴干预处理法提取紫锥菊茎中的多酚：
利用阴干预处理法提取紫锥菊茎中的多酚的方法，包括如下步骤：
(1)采取新鲜的一年生紫锥菊，将紫锥菊茎洗净，待表面水渍干后自然阴干，然后用粉碎机粉碎，过200目筛，即可得到紫锥菊茎粉末样品；
(2)精确称取紫锥菊茎粉末样品0.1g于50mL三角瓶中，以一定的料液比加入一定浓度的乙醇，在超声破碎仪设置超声功率，温度和时间进行提取，采用响应面法设定提取的变量参数，超声提取结束后，过滤，即得含有多酚的提取液。
2、多酚含量测定
(1)标准曲线绘制
利用70％酒精溶液将1mg/mL的没食子酸溶液分别稀释成0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL 5个浓度梯度的标准溶液，精确取各梯度标准溶液20μL放入2mL离心管中，再在各管中加入1mol/L福林酚试剂10μL，混匀，暗处放置5min，加入20％Na2CO3溶液40μL，蒸馏水430μL，混匀，室温避光放置1h，制得标准曲线待测液。精确取200μL各梯度标准曲线待测液于96孔板标准曲线检测孔，于760nm处检测吸光度，每个梯度平行测三次，绘制标准曲线。
标准曲线为：y＝2.6105x+0.1884 R2＝0.9995。
(2)福林酚试剂法(Folin-Ciocalteu)检测多酚含量
精确吸取上述制备的含有多酚的提取液20μL放入2mL离心管中，再在各管中加入1mol/L福林酚试剂10μL，混匀，暗处放置5min，加入20％Na2CO3溶液40μL，蒸馏水430μL，混匀，室温避光放置1h制得样品待测液。分别取200μL样品待测液于96孔板样品检测孔中，每种样品平行测定3次，以70％乙醇溶液代替提取液，做空白对照，于760nm处检测吸光度，通过回归方程计算出各含有多酚的提取液中的多酚含量。
多酚含量计算公式：Y＝CV/M；
式中：
Y—样品中多酚含量mg/g；
C—校准曲线多酚浓度mg/mL；
V—样品体积mL；
M—样品质量g。
实施例1：乙醇体积分数对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响
分别取3份1.1-1.3不同预处理法得到的紫锥菊茎粉末样品，每份紫锥菊茎粉末样品的质量为0.1g，按料液比1:40(g:mL)的比例向紫锥菊茎粉末样品中加入乙醇，设定乙醇体积分数分别为20％、40％、60％、70％、80％、90％、100％，设置超声破碎仪温度50℃，超声功率为280W，超声时间40min，提取次数为1次，平行试验三次。以紫锥菊茎中的多酚提取量为考量标准，分析乙醇体积分数对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响。微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量如图1所示。
通过图1可以看出，乙醇体积分数对微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量的影响趋势一致，表现为在乙醇体积分数低于80％时上述三种预处理方法对提取的多酚含量影响不大，而当乙醇体积分数大于80％小于100％时，三种预处理方法得到的多酚含量都一致大幅度降低。
实施例2：料液比对紫锥菊茎中多酚含量的影响
分别取3份1.1-1.3不同预处理法得到的紫锥菊茎粉末样品，每份紫锥菊茎粉末样品的质量为0.1g，按料液比(g:mL)1:20、1:40、1:60、1:80、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500的比例向紫锥菊茎粉末样品中加入80％(v/v)乙醇，设置超声破碎仪温度50℃，超声功率为280W，超声时间40min，提取次数为1次，平行试验三次。以紫锥菊茎中的多酚提取量为考量标准，分析料液比对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响。微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量如图2所示。
通过图2可以看出，料液比对微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量影响都很大，三种预处理方法得到的多酚在料液比为1:20-1:100变化显著；在料液比为1:100-1:500时，冷冻干燥预处理法和阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量随液料比的增大变化不明显，而微波干燥预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量随着料液比的增大呈缓慢增大后降低的趋势。
实施例3：超声时间对紫锥菊茎中多酚含量的影响
分别取3份1.1-1.3不同预处理法得到的紫锥菊茎粉末样品，每份紫锥菊茎粉末样品的质量为0.1g，按料液比1:40(g:mL)的比例向紫锥菊茎粉末样品中加入80％(v/v)乙醇，设置超声破碎仪温度50℃，超声功率为280W，设定超声时间分别为20min、30min、40min、50min、60min，提取次数为1，平行试验三次。以紫锥菊茎中的多酚提取量为考量标准，分析超声时间对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响。微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量如图3所示。
通过图3可以看出，超声时间对微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量的影响没有一致规律，且无显著差异，因此可采取较短的时间(20min)来提取紫锥菊茎中多酚即可。
实施例4：超声温度对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响
分别取3份1.1-1.3不同预处理法得到的紫锥菊茎粉末样品，每份紫锥菊茎粉末样品的质量为0.1g，按料液比1:40(g:mL)的比例向紫锥菊茎粉末样品中加入80％乙醇，设置超声破碎仪温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，超声功率为280W，超声时间40min，提取次数为1，平行试验三次。以紫锥菊茎中的多酚提取量为考量标准，分析超声温度对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响。微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量如图4所示。
通过图4可以看出，在本研究的温度范围内，温度对微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量的影响呈现随温度的升高而缓慢增大的趋势，在70℃时微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量达到最大值。
实施例5：超声功率对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响
分别取3份1.1-1.3不同预处理法得到的紫锥菊茎粉末样品，每份紫锥菊茎粉末样品的质量为0.1g，按料液比1:40(g:mL)的比例向紫锥菊茎粉末样品中加入80％(v/v)乙醇，设置超声破碎仪温度为50℃，超声时间40min，设定超声功率分别为280W、350W、420W、490W、560W，提取次数为1，平行试验三次。以紫锥菊茎中的多酚提取量为考量标准，分析超声功率对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响。微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量如图5所示。
通过图5可以看出，超声功率对微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量的影响没有一致规律，且总体上三种预处理方法得到的紫锥菊中的多酚含量无显著差异。
实施例6：提取次数对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响
分别取3份1.1-1.3不同预处理法得到的紫锥菊茎粉末样品，每份紫锥菊茎粉末样品的质量为0.1g，按料液比1:40(g:mL)的比例向紫锥菊茎粉末样品中加入80％(v/v)乙醇，超声破碎仪温度为50℃，超声时间40min，超声功率为280W，设定提取次数分别为1、2、3、4、5次，平行试验三次。以紫锥菊茎中的多酚提取量为考量标准，分析提取次数对紫锥菊茎中的多酚提取量的影响。微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量如图6所示。
通过图6可以看出，提取次数对微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚提取量的影响都很大，微波干燥预处理法、冷冻干燥预处理法、阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量都有随提取次数的增加而增加的趋势。
实施例7：微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量
在单因素试验基础上，进行响应面分析。选取对微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量影响较大的三个因素：乙醇体积分数、料液比和提取次数用Box-Behnken法进行试验分析。以微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量响应值为Y，乙醇体积分数A、料液比B和提取次数C为自变量，进行三因素三水平响应面试验，试验设计因素水平及结果见表1和表2。
表1：响应面试验因素水平
表2：响应面试验方案与结果
回归方程分析结果如下表3。
表3：回归方程分析表
| 来源 | 平方和 | 自由度(Df) | 均方 | F值 | P值 | |
| 模型 | 2284.04 | 9 | 253.78 | 78.03 | <0.0001 | 显著 |
| A-乙醇体积分数 | 1576.24 | 1 | 1576.24 | 484.66 | <0.0001 | |
| B-料液比 | 19.14 | 1 | 19.14 | 5.89 | 0.0457 | |
| C-次数 | 110.65 | 1 | 110.65 | 34.02 | 0.0006 | |
| AB | 35.84 | 1 | 35.84 | 11.02 | 0.0128 | |
| AC | 21.70 | 1 | 21.70 | 6.67 | 0.0363 | |
| BC | 3.81 | 1 | 3.81 | 1.17 | 0.3147 | |
| A<sup>2</sup> | 471.85 | 1 | 471.85 | 145.08 | <0.0001 | |
| B<sup>2</sup> | 25.88 | 1 | 25.88 | 7.96 | 0.0257 | |
| C<sup>2</sup> | 0.8576 | 1 | 0.8576 | 0.2637 | 0.6234 | |
| 残差 | 22.77 | 7 | 3.25 | |||
| 失拟项 | 17.13 | 3 | 5.71 | 4.05 | 0.1049 | 不显著 |
| 误差项 | 5.64 | 4 | 1.41 | |||
| 总和 | 2306.81 | 16 |
微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量Y对乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取次数(C)的二次回归方程为：Y＝29.047-14.037A+1.547B+3.719C-2.993AB-2.329AC+0.977BC-10.586A2-2.479B2-0.451C2。模型的P值<0.0001，表明该模型达到了高度显著的水平，而失拟项P＝0.1049>0.05，相对于纯误差，失拟项是不显著的，说明该模型是可行的。模型决定系数R2＝0.9901，Adj R2＝0.9774，说明该模型可以解释97.74％响应值的变化，模型与试验的拟合程度较好。一次项A、二次项A2对结果有高度显著的影响。一次项C对结果的影响为极显著，一次项B和交互项AB、AC、二次项B2对结果的影响为显著，而交互项BC和二次项C2对结果的影响为不显著。由主要因素A、B、C的F值可以得知，各因素对紫锥菊茎中的多酚提取率的影响程度依次为：乙醇体积分数(A)>提取次数(C)>料液比(B)。
经过软件分析得到微波干燥预处理法提取紫锥菊茎中的多酚的最佳提取工艺条件为：提取时间20min、超声温度70℃、超声功率420W、乙醇体积分数42.556％、料液比1:500、提取次数3次，微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量预测值Y＝41.210mg/g。考虑到操作方便性，将工艺条件修正为提取时间20min、超声温度70℃、超声功率420W、乙醇体积分数46％、料液比1:500、提取次数3次，微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量验证值为40.165mg/g，与预测值的相对误差为2.536％。说明该模型的拟合度较好，可以通过微波干燥预处理法提取紫锥菊茎中的多酚。
实施例8：冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中多酚含量
在单因素试验基础上，进行响应面分析。选取对冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量影响较大的三个因素：乙醇体积分数、料液比和提取次数用Box-Behnken法进行试验分析。以冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量为响应值Y，乙醇体积分数A、料液比B和提取次数C为自变量，进行三因素三水平响应面试验，试验设计因素水平及结果见表4和表5。
表4：响应面实验因素水平
表5：响应面试验方案与结果
回归方程分析结果如下表6。
表6：回归方程分析表
| 来源 | 平方和 | 自由度(Df) | 均方 | F值 | P值 | |
| 模型 | 811.82 | 9 | 90.20 | 54.43 | <0.0001 | 显著 |
| A-乙醇体积分数 | 413.18 | 1 | 413.18 | 249.32 | <0.0001 | |
| B-料液比 | 0.1427 | 1 | 0.1427 | 0.0861 | 0.7777 | |
| C-次数 | 10.79 | 1 | 10.79 | 6.51 | 0.0380 | |
| AB | 0.3835 | 1 | 0.3835 | 0.2314 | 0.6452 | |
| AC | 0.4215 | 1 | 0.4215 | 0.2543 | 0.6295 | |
| BC | 1.05 | 1 | 1.05 | 0.6359 | 0.4514 | |
| A<sup>2</sup> | 232.16 | 1 | 232.16 | 140.08 | <0.0001 | |
| B<sup>2</sup> | 62.26 | 1 | 62.26 | 37.57 | 0.0005 | |
| C<sup>2</sup> | 56.50 | 1 | 56.50 | 34.09 | 0.0006 | |
| 残差 | 11.60 | 7 | 1.66 | |||
| 失拟项 | 3.99 | 3 | 1.33 | 0.6999 | 0.5994 | 不显著 |
| 误差项 | 7.61 | 4 | 1.90 | |||
| 总和 | 823.42 | 16 |
冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量Y对乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取次数(C)的二次回归方程为：Y＝21.017-7.187A-0.134B+1.1615C-0.310AB+0.325AC-0.513BC-7.425A2-3.84B2-3.663C2。模型的P值<0.0001，表明该模型达到了高度显著的水平，而失拟项P＝0.5994>0.05，相对于纯误差，失拟项是不显著的，说明该模型是可行的。模型决定系数R2＝0.9859，Adj R2＝0.9678，说明该模型可以解释96.78％响应值的变化，模型与试验的拟合程度较好。一次项A和二次项A2对结果有高度显著的影响。二次项A2和B2对结果的影响为极显著，一次项C对结果的影响为显著，而一次项B和交互项AB、BC、AC对结果的影响为不显著。由主要因素A、B、C的F值可以得知，各因素对紫锥菊多酚提取率的影响程度依次为：乙醇体积分数(A)>提取次数(C)>料液比(B)。
经过软件分析得到冷冻干燥预处理法提取紫锥菊茎中的多酚的最佳提取工艺条件为：提取时间20min、超声温度70℃、超声功率420W、乙醇体积分数55.562％、料液比1:298.608、提取次数2.138次，冷冻干燥预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量预测值Y＝22.825mg/g。考虑到操作方便性，将工艺条件修正为提取时间20min、超声温度70℃、超声功率420W、乙醇体积分数56％、料液比1:300、提取次数2次，验证值为22.305mg/g，与预测值的相对误差为2.275％。说明该模型的拟合度较好，可以通过冷冻干燥预处理法提取紫锥菊茎中的多酚，但与微波干燥预处理法相比，通过冷冻干燥预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量更低。
实施例9：阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量
在单因素试验基础上，进行响应面分析。选取对阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚提取量影响较大的三个因素：乙醇体积分数、料液比和提取次数用Box-Behnken法进行试验分析。以阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量为响应值Y，乙醇体积分数A、料液比B和提取次数C为自变量，进行三因素三水平响应面试验，试验设计因素水平及结果见表7和表8。
表7：响应面实验因素水平
表8：响应面试验方案与结果
回归方程分析结果如下表9。
表9：回归方程分析表
| 来源 | 平方和 | 自由度(Df) | 均方 | F值 | P值 | |
| 模型 | 272.47 | 9 | 30.27 | 48.96 | <0.0001 | 显著 |
| A-乙醇体积分数 | 36.56 | 1 | 36.56 | 59.13 | 0.0001 | |
| B-料液比 | 101.94 | 1 | 101.94 | 164.85 | <0.0001 | |
| C-次数 | 42.84 | 1 | 42.84 | 69.28 | <0.0001 | |
| AB | 17.34 | 1 | 17.34 | 28.04 | 0.0011 | |
| AC | 0.4392 | 1 | 0.4392 | 0.7102 | 0.4272 | |
| BC | 0.6047 | 1 | 0.6047 | 0.9779 | 0.3557 | |
| A<sup>2</sup> | 57.28 | 1 | 57.28 | 92.64 | <0.0001 | |
| B<sup>2</sup> | 8.90 | 1 | 8.90 | 14.39 | 0.0068 | |
| C<sup>2</sup> | 1.99 | 1 | 1.99 | 3.21 | 0.1161 | |
| 残差 | 4.33 | 7 | 0.6183 | |||
| 失拟项 | 0.2170 | 3 | 0.0723 | 0.0704 | 0.9728 | 不显著 |
| 误差项 | 4.11 | 4 | 1.03 | |||
| 总和 | 276.80 | 16 |
阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量Y对乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取次数(C)的二次回归方程为：Y＝14.21-2.14A+3.57B+2.31C+2.08AB+0.3313AC+0.3888BC-3.69A2-1.45B2-0.687C2。模型的P值<0.0001，表明该模型达到了极显著的水平，而失拟项P＝0.9728>0.05，相对于纯误差，失拟项是不显著的，说明该模型是可行的。模型决定系数R2＝0.9844，Adj R2＝0.9643，说明该模型可以解释96.43％响应值的变化，模型与试验的拟合程度较好。一次项B、C和二次项A2对结果的影响为高度显著，一次项A二次项B2和交互AB项对结果的影响为极显著，而交互项AC、BC和二次项C2对结果的影响为不显著。由主要因素A、B、C的F值可以得知，各因素对紫锥菊多酚提取率的影响程度依次为：料液比(B)>提取次数(C)>乙醇体积分数(A)。
经过软件分析得到阴干预处理法提取紫锥菊茎中的多酚的最佳提取工艺条件为：提取时间20min、超声温度70℃、超声功率420W、乙醇体积分数71.045％、料液比1:500、提取次数3次，阴干预处理法得到的紫锥菊茎中的多酚含量预测值Y＝18.346mg/g。考虑到操作方便性，将工艺条件修正为提取时间20min、超声温度70℃、超声功率420W、乙醇体积分数71％、料液比1:500、提取次数3次，验证值为17.715mg/g，与预测值的相对误差为3.442％。说明该模型的拟合度较好，可以通过阴干预处理法提取紫锥菊茎中的多酚，但与微波干燥预处理法相比，通过阴干预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量更低。
通过实施例7-9可以看出，相较于阴干预处理法和冷冻干燥预处理法提取紫锥菊茎中的多酚，本发明的微波干燥预处理法提取的紫锥菊茎中的多酚含量更高。本发明所述方法具有精确度好、提取率高和可操作性强等特点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品的微波预处理：将紫锥菊茎剪成长为4～6cm的茎段后用薄膜密封，置于微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，然后于800W烘干1～2min，打开薄膜蒸发掉水分，得到第一次微波处理的样品；将第一次微波处理的样品用薄膜密封，置于微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，然后于640W烘干1～2min，打开薄膜蒸发掉水分，得到第二次微波处理的样品；将第二次微波处理的样品用薄膜密封，置于微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，然后于480W烘干1～2min，打开薄膜蒸发掉水分，得到第三次微波处理的样品；将第三次微波处理的样品用薄膜密封，置于微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，然后于320W烘干1～2min，打开薄膜蒸发掉水分，得到第四次微波处理的样品；取第四次微波处理的样品用薄膜密封，放入微波炉中将茎段在薄膜中平铺一层，于320W下烘干20～30min至干燥，粉碎过筛，即可得到紫锥菊茎粉末样品；
(2)向紫锥菊茎粉末样品中加入乙醇，超声提取，采用响应面法设定提取的变量参数，超声提取结束后，过滤，即得含有多酚的提取液；
所述的响应面法通过以下二次多项回归方程设定超声提取的变量参数：
Y＝29.047-14.037A+1.547B+3.719C-2.993AB-2.329AC+0.977BC-10.586A2-2.479B2-0.451C2；其中，Y为微波干燥预处理法得到的紫锥菊茎多酚提取量响应值；设定提取的变量参数：A为乙醇体积分数、B为料液比、C为提取次数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中，所述的乙醇体积分数A为20％～100％；料液比B为1:20～500；提取次数C为1～5次。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的乙醇体积分数A为40％～100％；料液比B为1:100～500；提取次数C为1～3次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述的紫锥菊茎为新鲜一年生紫锥菊茎。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述的紫锥菊茎的长度为5cm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述的薄膜为保鲜袋。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述的粉碎过筛为用粉碎机粉碎过200目筛。
8.权利要求1～7任一所述的利用响应面法提取紫锥菊茎中的多酚的方法在紫锥菊有效成分提取中的应用。
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