CN115698318A

CN115698318A - 用于邻近检测测定的对照

Info

Publication number: CN115698318A
Application number: CN202180036813.4A
Authority: CN
Inventors: J·布罗贝里
Original assignee: Olink Proteomics AB
Current assignee: Olink Proteomics AB
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2023-02-03
Also published as: WO2021191450A1; JP7365513B2; GB202004469D0; JP2023519366A; US20230323424A1; DE202021004362U1; EP4269608A1; JP2023171748A; EP4127217A1; US20230107654A1; CA3201060A1

Abstract

本发明提供了一种用于检测样品中的多种分析物的方法，所述方法包括进行多重基于邻近的检测测定。所述测定利用成对的具有共用杂交位点(即在不同的邻近探针对之间共用的杂交位点)的邻近探针。还提供了包含多个具有共用杂交位点的邻近探针对的产品，所述产品可用于本文公开的方法中。

Description

用于邻近检测测定的对照

技术领域

背景技术

现代蛋白质组学方法需要在小的样品量中检测到大量不同的蛋白质(或蛋白质复合物)的能力。为了实现这个目的，必须进行多重分析。可以实现对样品中的蛋白质进行多重检测的常用方法包括邻近延伸测定(proximity extension assay，PEA)和邻近连接测定(proximity ligation assay，PLA)。PEA和PLA在WO 01/61037中有所描述；PEA进一步描述于WO 03/044231、WO 2004/094456、WO 2005/123963、WO 2006/137932和WO 2013/113699中。

PEA和PLA是邻近测定，它们依赖于“邻近探测”的原理。在这些方法中，通过结合多个(即两个或更多个，通常两个或三个)探针来检测分析物，所述探针当通过与分析物(因此“邻近探针”)结合使其邻近时允许产生信号。通常，至少一个邻近探针包含与探针的分析物结合结构域(或部分)连接的核酸结构域(或部分)，并且信号的产生涉及在核酸部分和/或由其他探针携带的另外的功能部分之间的相互作用。因此信号产生依赖于探针之间(更特别是在核酸或由它们携带的其他功能部分/结构域之间)的相互作用，因此仅在必要的探针与分析物结合时才发生，从而导致检测***的特异性提高。

在PEA中，与探针对的分析物结合结构域连接的核酸部分在探针非常邻近时(即当与目标结合时)彼此杂交，然后使用核酸聚合酶进行延伸。探针对中的探针的核酸部分包含互补的“杂交位点”，它们彼此杂交。延伸产物形成报告核酸，对其的检测表明感兴趣的样品中存在特定的分析物(由相关探针对结合的分析物)。

在PLA中，当探针对的探针结合其目标时，与探针对的分析物结合结构域连接的核酸部分变得邻近，并且可以连接在一起，或者可替代地，它们可以一起为单独添加的寡核苷酸的连接提供模板，所述单独添加的寡核苷酸当它们处于邻近时能够与所述核酸结构域杂交。在PLA方法中，提供了至少一种桥接邻近探针核酸部分的“夹板”寡核苷酸。夹板寡核苷酸包含与探针核酸结构域上的“杂交位点”互补的序列。探针核酸部分与夹板寡核苷酸的结合使得两个探针核酸部分能够连接在一起。可替代地，如上面提到的，可以添加第二个夹板分子并将其连接到第一夹板。然后连接产物被扩增，充当报告核酸。

使用PEA或PLA的多重分析物检测可以通过在每个探针的核酸部分中包含独特的标识(ID)序列，诸如条形码序列或引物或探针结合位点来实现。与特定分析物对应的报告核酸分子可以通过其所含的ID序列来鉴定。

在邻近测定中，一些“背景”(即假阳性)信号是不可避免的。可能由于与反应溶液中未结合的邻近探针的或之间的随机相互作用而出现背景信号。目前，邻近反应中的背景信号水平是通过使用单独的阴性对照来确定的。对于阴性对照，仅使用缓冲液(即没有样品)进行邻近测定，使得所有信号都是背景。将实验测定与阴性对照进行比较允许确定真阳性信号。

本发明提供了一种使用改进的背景对照进行多重邻近测定的方法。在这种方法中，不同的邻近探针对共用杂交位点。这促使在共用相同杂交位点的所有未结合探针之间形成“背景”信号。来自产生的报告核酸的所有信号被一起读取(真阳性和假阳性)。真阳性信号与假阳性信号可以基于所得报告核酸是包含配对的条形码序列(即，条形码序列各自对应于相同的分析物，指示真阳性信号)还是未配对的条形码序列(即，条形码序列对应于不同的分析物，指示假阳性信号)进行区别。反应中产生的假阳性信号水平指示背景水平，这意味着不再需要进行单独的阴性对照反应来确定背景水平，从而简化了整体测定。

使用共用杂交位点确定背景也减轻了不同杂交位点之间的性能差异。不同对的杂交位点可能比其他对的相互作用或多或少更强，从而导致每对杂交位点产生不同水平的背景。共用杂交位点允许单独确定每个杂交位点对所产生的背景水平，从而更准确地确定要计算的背景水平。因此，本发明提供了一种更直接和准确对邻近测定中的假阳性结果控制的手段。

发明内容

为此，在本发明的第一方面，提供了一种用于检测样品中的多种分析物的方法，所述方法包括进行多重基于邻近的检测测定，所述测定包括：

(i)使所述样品与多对邻近探针接触，其中每个邻近探针对包含第一邻近探针和第二邻近探针，并且每个邻近探针包含：

(a)对分析物具有特异性的分析物结合结构域；和

(b)核酸结构域，

其中每对中的两个探针都包含对同一分析物具有特异性的分析物结合结构域，并且能够同时与所述分析物结合；并且每个探针对都对不同的分析物具有特异性；

其中每个邻近探针的所述核酸结构域包含ID序列和至少第一杂交序列，其中每个邻近探针的所述ID序列是不同的；并且其中：

在每个邻近探针对中，所述第一邻近探针和所述第二邻近探针包含配对杂交序列，使得在所述第一邻近探针和所述第二邻近探针与其分析物结合时，所述第一邻近探针和所述第二邻近探针的相应配对杂交序列彼此杂交或与包含杂交序列的共同夹板寡核苷酸杂交，所述杂交序列与所述第一邻近探针和所述第二邻近探针的所述配对杂交序列中的每个杂交序列互补；

并且其中至少一对杂交序列被至少两对邻近探针共用；

(ii)使所述邻近探针的所述核酸结构域彼此杂交或与所述夹板寡核苷酸杂交，以形成包含第一邻近探针的所述杂交序列和第二邻近探针的杂交序列的连续或非连续双链体，其中所述双链体包含至少一个游离的3'末端；

(iii)对所述双链体进行延伸和/或连接反应以生成包含所述第一邻近探针的所述ID序列和所述第二邻近探针的所述ID序列的延伸和/或连接产物

(iv)扩增所述延伸产物或连接产物；

(v)检测所述延伸产物或连接产物，其中所述延伸产物或连接产物的检测包括鉴定其中的所述ID序列，并确定每种延伸产物或连接产物的相对量；以及

(vi)确定所述样品中存在哪些分析物，其中：

(a)包含来自属于第一邻近探针对的第一邻近探针的第一ID序列和来自属于第二邻近探针对的第二邻近探针的第二ID序列的延伸产物和/或连接产物被视为背景；并且

(b)包含来自邻近探针对的第一ID序列和第二ID序列并且以高于背景的量存在的延伸产物或连接产物表明所述样品中存在被所述邻近探针对特异性结合的所述分析物。

在第二方面，本发明提供了一种产物，所述产物包含：

(i)多个邻近探针对，其中每个邻近探针对包含第一邻近探针和第二邻近探针，并且每个邻近探针包含：

(a)对蛋白质具有特异性的蛋白质结合结构域；和

(b)核酸结构域，

其中每对中的两个探针都包含对相同蛋白质具有特异性的蛋白质结合结构域，并且能够同时与所述蛋白质结合；并且每个探针对都对不同的蛋白质具有特异性；

其中每个邻近探针的所述核酸结构域包含ID序列和至少第一杂交序列，其中每个邻近探针的所述ID序列是不同的；并且其中在每个邻近探针对中，所述第一邻近探针和所述第二邻近探针包含配对杂交序列；以及，任选地

(ii)多个夹板寡核苷酸，每个夹板寡核苷酸包含与邻近探针对的所述配对杂交序列中的每一个互补的杂交序列；

其中每个邻近探针对的所述杂交序列构造成使得在所述第一邻近探针和所述第二邻近探针与其蛋白质结合时，所述第一邻近探针和所述第二邻近探针的所述相应配对杂交序列彼此杂交或与夹板寡核苷酸杂交；

并且其中至少一对杂交序列被至少两对邻近探针共用。

具体实施方式

如上所详述，本发明的第一方面提供了一种用于检测样品中的多种分析物的方法。如本文所用的术语“分析物”意指希望通过本发明的方法检测的任何物质(例如分子)或实体。因此，分析物是本发明的测定方法的“目标”，即使用本发明的方法检测或筛选的物质。

分析物因此可以是任何希望检测的生物分子或化学化合物，例如肽或蛋白质或核酸分子或小分子，包括有机和无机分子。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或其片段或产物。因此可以看出，分析物可以是任何物质或实体，可以为其开发特异性结合配偶体(例如亲和结合配偶体)。所需要的只是分析物能够同时结合至少两个结合配偶体(更具体地说，至少两个邻近探针的分析物结合结构域)。

已发现基于邻近探针的测定在检测蛋白质或多肽方面特别有用。因此，特别感兴趣的分析物包括蛋白质分子，诸如肽、多肽、蛋白质或朊病毒或任何包括蛋白质或多肽组分等的分子或它们的片段。在本发明的特别优选的实施方案中，分析物是全部或部分蛋白质分子，最特别是蛋白质。也就是说，优选的是分析物是或包含蛋白质。

分析物可以是单个分子或含有两个或更多个分子亚基的复合物，所述分子亚基彼此可以共价结合，也可以不共价结合，并且所述分子亚基可以是相同或不同的。因此，除了细胞或微生物之外，这样的复合分析物还可以是蛋白质复合物或包含蛋白质和一种或多种其他类型的生物分子的生物分子复合物。这种复合物因此可以是同多聚体或异多聚体。分子(例如蛋白质)的聚集体也可以是目标分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物也可以是诸蛋白质或肽与核酸分子诸如DNA或RNA之间的复合物。特别感兴趣的可能是在蛋白质与核酸(例如调节因子(诸如转录因子)和DNA或RNA)之间的相互作用。因此，在特定实施方案中，分析物是蛋白质-核酸复合物(例如蛋白质-DNA复合物或蛋白质-RNA复合物)。在另一个实施方案中，分析物是非核酸分析物，其意指不包含核酸分子的分析物。非核酸分析物包括如上所述的蛋白质和蛋白质复合物、小分子和脂质。

本发明的方法涉及检测样品中的多种分析物。多种分析物可以是相同类型(例如所有分析物都可以是蛋白质或蛋白质复合物)或不同类型(例如一些分析物可以是蛋白质、其他蛋白质复合物、其他脂质、其他蛋白质-DNA或蛋白质-RNA复合物等、或此类分析物类型的任何组合)。

如本公开中所用的术语“多个/种”意指多于一个/种(即两个/种或更多个/种)，符合其标准定义。术语“多种”和“多个”是可互换的。因此，本发明的方法用于检测样品中的至少两种分析物。然而，优选的是根据本发明方法检测比两种多得多的分析物。优选地，根据本发明方法检测至少10种、20种、50种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、1100种、1200种、1300种、1400种或1500种或更多种分析物。

本文中广泛使用的术语“检测”(“detecting”或“detected”)包括确定分析物的存在或不存在(即确定目标分析物是否存在于感兴趣的样品中)的任何手段。因此，如果执行本发明的方法并尝试检测样品中的特定感兴趣的分析物，但由于样品中不存在分析物而未检测到该分析物，则“检测分析物”的步骤具有仍然被执行，因为其在样品中的存在或不存在已经被评估。“检测”分析物的步骤不依赖于该检测的成功，即不依赖于实际检测到的分析物。

检测分析物还可以包括对样品中分析物的浓度或丰度的任何形式的测量。可以确定目标分析物的绝对浓度或分析物的相对浓度，为此目的，可以将目标分析物的浓度与样品或其他样品中的另一种目标分析物(或其他目标分析物)的浓度进行比较。

因此，“检测”可以包括以任何方式确定、测量、评估或测定分析物的存在或不存在或量。包括定量和定性确定、测量或评估，包括半定量确定。此类确定、测量或评估可以是相对的(例如当正在检测样品中的两种或更多种不同分析物时)，或者是绝对的。因此，术语“定量”当用于定量样品中的目标分析物时可以指绝对或相对定量。绝对定量可以通过包含一种或多种对照分析物的已知浓度和/或用已知对照分析物参考检测到的目标分析物水平来完成(例如，通过生成标准曲线)。可替代地，可以通过比较在两种或更多种不同目标分析物之间的检测水平或量来实现相对定量，以提供两种或更多种不同分析物中的每种分析物的相对定量，即相对于彼此。类似地，可以量化两个不同样品中特定分析物的相对水平。下面进一步讨论在本发明的方法中可以实现定量的方法。

本发明的方法是用于检测样品中的多种分析物。根据本发明可以测定任何感兴趣的样品。也就是说，含有或可能含有感兴趣的分析物的任何样品、以及人们希望对其进行分析以确定其是否含有感兴趣的分析物和/或确定其中的感兴趣的分析物的浓度的任何样品。

因此可以根据本发明分析任何生物或临床样品，例如生物体的或来自生物体的任何细胞或组织样品、或任何体液或衍生自其的制剂、以及诸如细胞培养物、细胞制剂、细胞裂解物等样品。环境样品(例如土壤和水样品)或食物样品也可以根据本发明进行分析。样品可以是新鲜制备的，或者其可以以任何方便的方式进行预先处理，例如以供储存。

因此，代表性样品包括可能含有生物分子或任何其他所需或目标分析物的任何材料，包括例如食品和相关产品、临床和环境样品。样品可以是生物样品，其可以包含任何病毒或细胞材料，包括原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。此类生物材料因此可以包括任何类型的哺乳动物和/或非哺乳动物的动物细胞、植物细胞、包括蓝绿藻等藻类、真菌、细菌、原生动物等。

优选的是，样品是临床样品，例如全血和血液衍生产品(诸如血浆、血清、血沉棕黄层和血细胞)、尿液、粪便、脑脊液或任何其他体液(例如呼吸道分泌物、唾液、奶等)、组织和活组织检查。特别优选的是，样品是血浆或血清样品。因此，本发明的方法可以用于例如生物标志物的检测，或用于测定样品中的病原体衍生的分析物。样品尤其可以来源于人，尽管本发明的方法同样可以应用于来源于非人动物的样品(即兽医样品)。可以以任何方便或期望的方式对样品进行预处理以制备其用于本发明方法，例如通过细胞裂解或去除等。

本发明的方法包括进行多重基于邻近的检测测定。如本文所用，术语“多重”用于指在同一反应混合物中同时测定多种(即至少两种)不同分析物的测定。然而，优选地，在根据本发明的多重反应中测定远远超过两种的分析物。例如，多重反应可以测定至少5种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种或更多种分析物。某些多重反应可能会测定超过此数量的分析物，例如至少70种、80种、90种、100种、110种、120种、130种、140种或150种或更多种分析物。

“基于邻近的检测测定”是利用邻近探针来检测样品中的分析物的任何测定。一般而言，邻近探针是与至少一个其他的同源邻近探针相互作用以产生可以被检测以便检测分析物的信号的探针。邻近探针是本领域众所周知的。如根据本公开和发明使用并且如本文权利要求中所定义的邻近探针是包含对分析物具有特异性的分析物结合结构域和核酸结构域的实体。“对分析物具有特异性的”意指分析物结合结构域特异性地识别并结合特定的目标分析物，即其以比结合其他分析物或部分更高的亲和力结合其目标分析物。分析物结合结构域优选地是抗体，特别是单克隆抗体。包含抗原结合结构域的抗体片段或抗体衍生物也适合用作分析物结合结构域。此类抗体片段或衍生物的实例包括Fab、Fab'、F(ab’)₂和scFv分子。

Fab片段由抗体的抗原结合结构域组成。可以看到单个抗体含有两个Fab片段，每个Fab片段由一条轻链及其连接的重链N末端部分组成。因此，Fab片段含有一条完整的轻链和与其结合的重链的V_H和C_H1结构域。可以通过用木瓜蛋白酶消化抗体来获得Fab片段。

F(ab’)₂片段由抗体的两个Fab片段加上重链结构域的铰链区(包括将两个重链结构域连接在一起的二硫键)组成。换句话说，F(ab’)₂片段可以看作两个共价连接的Fab片段。F(ab’)₂片段可以通过用胃蛋白酶消化抗体来获得。F(ab’)₂片段的还原产生两个Fab'片段，可以将其看作含有额外的巯基基团的Fab片段，所述额外的巯基基团可用于将片段与其他分子缀合。ScFv分子是通过将抗体轻链和重链的可变结构域融合在一起而产生的合成构建体。通常，这种融合是通过将抗体基因工程化以产生包含重链和轻链可变结构域两者的融合蛋白而重组实现的。

邻近探针的核酸结构域可以是DNA结构域或RNA结构域。优选地其是DNA结构域。每对中的邻近探针的核酸结构域通常被设计为与彼此杂交，或与一个或多个共同的寡核苷酸分子(一对的两个邻近探针的核酸结构域都可以与之杂交)杂交。因此，核酸结构域必须至少部分是单链的。在某些实施方案中，邻近探针的核酸结构域是完全单链的。在其他实施方案中，邻近探针的核酸结构域是部分单链的，包含单链部分和双链部分两者。

邻近探针通常成对提供，每一对都对目标分析物具有特异性。如上所述，目标分析物可以是单个实体，特别是单个蛋白质。在该实施方案中，邻近对中的两个探针结合目标分析物(例如蛋白质)，但在不同的表位结合。表位不重叠，使得所述对中的一个探针与其表位的结合不会干扰或阻止所述对中的另一个探针与其表位的结合。可替代地，如上所述，目标分析物可以是复合物，例如蛋白质复合物，在这种情况下，所述对中的一个探针结合复合物的一个成员，而所述对中的另一个探针结合复合物的另一个成员。探针在与蛋白质相互作用位点(即，蛋白质中的它们彼此相互作用的位点)不同的位点结合复合物中的蛋白质。

如上所述，邻近探针是成对提供的，每个探针都对目标分析物具有特异性。这意味着在每个邻近探针对内，两个探针都包含对同一分析物具有特异性的分析物结合结构域。由于所使用的检测测定是多重测定，因此在每个检测测定中使用多个不同的探针对，每个探针对都对不同的分析物具有特异性。也就是说，每个不同探针对的分析物结合结构域对不同的目标分析物具有特异性。根据本发明，可以使用任何利用邻近探针的检测方法。如上所述，特别合适的基于邻近的检测测定是邻近延伸测定(PEA)和邻近连接测定(PLA)。

本发明的方法包括使样品与多个成对(即多对)的邻近探针接触的第一步骤。每个邻近探针对包含第一邻近探针和第二邻近探针，并且每个邻近探针包含：(a)对分析物具有特异性的分析物结合结构域；和(b)核酸结构域。在每个邻近探针对中，两个探针都包含对相同的分析物具有特异性的分析物结合结构域，并且每个探针对对不同的分析物具有特异性(即每个探针对包含对不同的分析物具有特异性的分析物结合结构域)。

每个邻近探针的核酸结构域包含标识(ID)序列。每个邻近探针包含独特的ID序列(即，每个邻近探针中存在不同的ID序列)。值得注意的是，这并不意味着每个单独的探针分子都包含独特的ID序列。相反，每个探针种类包含一个独特的ID序列。“探针种类”意指包含特定分析物结合结构域的探针，因此换句话说，包含相同的分析物结合结构域的所有探针分子都包含相同的独特ID序列。每个不同的探针种类包含不同的ID序列。如下文进一步讨论的，ID序列允许鉴定在本发明的方法中产生的报告核酸。

每个邻近探针的核酸结构域还包含至少一个(或至少第一)杂交序列。第一杂交序列(可能是邻近探针中唯一的杂交序列，取决于所用探针的结构)在每个邻近探针对中配对。“配对杂交序列”意指该对中的两个杂交序列能够直接或间接地彼此相互作用，使得当执行本发明的方法并且一对邻近探针与其目标分析物结合时，两个探针的核酸结构域直接或间接地彼此连接。

在一个特定和优选的实施方案中，配对杂交序列彼此互补，使得它们彼此杂交。在该实施方案中，一对中的第一邻近探针的杂交序列是该对中的第二邻近探针的杂交序列的反向互补序列。

在一个替代实施方案中，配对杂交序列彼此不直接杂交，而是两者都与单独的桥接寡核苷酸(本文称为夹板寡核苷酸)杂交。单独的寡核苷酸可以视为该测定方法中的第三寡核苷酸。然而，可以使用一种或多种夹板寡核苷酸，因此可能存在配对杂交序列可以与之杂交的第三寡核苷酸或另外的寡核苷酸。换句话说，配对杂交序列能够与共同的寡核苷酸杂交。这可以是能够为核酸结构域的连接和/或延伸提供模板的寡核苷酸，或者可以是第三寡核苷酸和任选另外的寡核苷酸的延伸和/或连接由核酸结构域提供模板。

在一个此类实施方案中，夹板寡核苷酸与该对邻近探针一起可以形成每个邻近测定组的第三成员。夹板寡核苷酸包含两个杂交序列：一个与探针对中第一探针的杂交序列互补，另一个与探针对中第二探针的杂交序列互补。因此夹板寡核苷酸能够与其邻近测定组中邻近探针的两个配对杂交序列杂交。值得注意的是，夹板寡核苷酸能够同时与其邻近测定组中邻近探针的两个配对杂交序列杂交。因此，当一对邻近探针结合其分析物并变得邻近时，探针的核酸结构域都与夹板寡核苷酸杂交，从而形成包含两个探针核酸结构域和夹板寡核苷酸的复合物。

在本发明方法中，至少一对杂交序列被至少两对邻近探针共用。换句话说，至少两对邻近探针(与不同的分析物结合)具有相同的杂交序列。来自共用一对杂交序列的探针对能够彼此杂交，或一起形成复合物。当一对邻近探针的核酸结构域都与它们相应的分析物结合时，核酸结构域之间最有可能发生杂交，因为探针与分析物的结合使核酸结构域紧密邻近。然而，在溶液中未结合的邻近探针的核酸结构域的配对杂交序列(即未与其分析物结合的邻近探针的核酸结构域)之间将不可避免地形成一些相互作用，或当只有一个邻近探针与其分析物结合时，它可能与溶液中的另一个探针相互作用。值得注意的是，在溶液中未结合的邻近探针的核酸结构域同样可能与具有配对杂交序列的任何邻近探针的核酸结构域杂交(或形成复合物)，而不管邻近探针是结合相同的分析物还是不同的分析物。由于这种非特异性杂交(即由于溶液中未结合的邻近探针之间的杂交)而产生的报告核酸形成背景，如下文进一步所述。

优选的是很大一部分探针对与至少一个其他邻近探针对共用它们的杂交序列。在特定实施方案中，至少25％、50％或75％的邻近探针对与另一邻近探针对(即与至少一个其他邻近探针对)共用它们的杂交序列。在一个特定实施方案中，所有邻近探针对与至少一个其他邻近探针对共用它们的杂交序列。然而，正如从上文显而易见的，在另一个实施方案中，至少一对杂交序列对于单对邻近探针是独特的。也就是说，至少一对邻近探针不与任何其他邻近探针对共用其杂交序列。在特定实施方案中，至多75％、50％或25％的成对邻近探针不与任何其他邻近探针对共用它们的杂交序列。

在本发明的一个实施方案中，单对杂交序列在具有共用杂交序列的所有探针对之间共用。也就是说，所有与另一探针对共用其杂交序列的探针对都具有同一对杂交序列。在这个实施方案中，潜在地，在多重测定中使用的所有探针对可以具有同一对杂交序列。

然而，如果太多的探针对共用同一对杂交序列，这可能使过多的背景相互作用发生，从而隐藏真阳性信号。因此，可能优选的是每对杂交序列由更有限数目的探针对共用。在特定实施方案中，不超过20个、15个、10个或5个邻近探针对共用同一对杂交序列。因此，优选的是本发明的多重测定使用多组邻近探针对，每组共用一对特定的杂交序列。因此特定邻近探针对组中的所有邻近探针对共用同一对杂交序列，但每个不同的邻近探针对组使用不同对的杂交序列。这使得每个探针对组内所有探针对之间的非特异性杂交成为可能，但防止不同探针对组中的探针对之间的非特异性杂交。一般而言，每个探针对组包括2个至5个范围内的探针对，但如果优选可以使用更大的组。

在任何给定的多重测定中使用的探针对组的数目取决于该测定中使用的探针对的总数，即在该测定中检测的不同分析物的数目。不可避免地，该测定中使用的探针对数目越多，探针对组的数目就越大。

本发明方法的第一步骤包括使样品与以上讨论的多对邻近探针接触。一对的邻近探针可以成对或作为单独的邻近探针添加到预混样品中。也就是说，可以通过同时接触探针或在同一反应混合物中使样品与一对的邻近探针分开或同时接触。如果邻近探针构造成使得探针对中的两个探针与共同夹板寡核苷酸杂交(而不是彼此杂交)，则各种夹板寡核苷酸可以与邻近探针对，或者与一对的邻近探针中的一个邻近探针一起被包括在内，或者可以分开同时添加，或者在邻近探针之后添加。“接触样品”意指将样品和邻近探针对混合。可以将邻近探针对添加到样品中，或者相反，可以将样品添加到邻近探针对中。样品可以在与邻近探针对接触之前稀释。如果需要稀释样品，这可以使用适当的稀释剂，例如缓冲液来进行。用作稀释剂的合适的缓冲液包括PBS(磷酸盐缓冲盐水)、TBS(Tris缓冲盐水)、HBS(HEPES缓冲盐水)等。所使用的缓冲液(或其他稀释剂)必须在纯化的溶剂(例如水)中配制，使得其不含有污染物分析物。因此，稀释剂应该是无菌的，并且如果使用水作为稀释剂或稀释剂的基质，则所使用的水优选地是超纯水(例如Milli-Q水)。

在样品与邻近探针对接触后，使邻近探针的核酸结构域彼此杂交，或视情况与夹板寡核苷酸杂交。核酸结构域彼此杂交或与夹板寡核苷酸杂交导致形成连续双链体或非连续双链体。如本文所指的“双链体”是一段双链核酸。双链体包含第一邻近探针的杂交序列和第二邻近探针的杂交序列。如果杂交序列与共同夹板寡核苷酸杂交，而不是彼此杂交，则双链体还包含共同的夹板寡核苷酸。

在该步骤中，核酸结构域彼此杂交导致形成连续双链体，也就是包含两个核酸结构域的全部杂交序列的单个双链体。探针核酸结构域与共同夹板寡核苷酸的杂交导致形成不连续的双链体，包含在第一探针的夹板寡核苷酸与杂交序列之间形成的第一部分、在第二探针的夹板寡核苷酸与杂交序列之间形成的第二部分，以及位于双链体的第一部分与第二部分之间(即在两个探针的杂交序列之间)的空位。可以将不连续的双链体可替代地视为两个单独的双链体(即可以将不连续的双链体的第一部分和第二部分可替代地视为单独的第一双链体和第二双链体)。以这种方式可见，探针核酸结构域与共同的夹板寡核苷酸杂交导致形成两个连接的双链体。双链体是连接的，因为它们通过共同的夹板寡核苷酸接合在一起。

通过核酸结构域彼此杂交或与共同的夹板寡核苷酸杂交产生的双链体包含游离3'末端(或至少一个游离3'末端-该双链体可以含有多个游离3'末端。在某些实施方案中，该双链体包含两个游离3'末端)。游离3'末端是双链体中能够用聚合酶延伸核酸链的3'末端。

在该步骤中，杂交通常且最常发生在邻近探针对中的邻近探针的与目标分析物结合的核酸结构域之间。然而，如上所述，也与溶液中未结合、未配对的探针的核酸结构域发生背景杂交或在这些核酸结构域之间发生背景杂交。这种背景杂交发生在来自共用共同杂交序列的探针对的探针的核酸结构域之间。

在核酸结构域杂交形成双链体之后，对双链体进行延伸和/或连接反应以产生包含第一邻近探针的ID序列和第二邻近探针的ID序列的延伸和/或连接产物。所进行的反应的性质取决于所进行的邻近测定是PLA还是PEA。在PEA的情况下，仅进行延伸反应，从而产生延伸产物。下面讨论了许多PEA变型。在PLA的情况下，进行连接反应，但也可以进行延伸反应。下面也讨论了PLA的变型。优选地，延伸和/或连接产物是线性延伸和/或连接产物(即它不是环状产物)。

一旦产生了延伸产物或连接产物，就对其进行扩增。可以使用任何已知的核酸扩增技术进行扩增。优选地，通过PCR进行扩增，但可以使用任何其他的核酸扩增方法，例如环介导的等温扩增(LAMP)。

在一个优选的实施方案中，在多重测定中产生的所有报告核酸(即延伸和/或连接产物)包含共同的引物结合位点。也就是说，产生的所有报告核酸都包含同一对引物结合位点。这是有利的，因为它允许使用单个引物对在单个扩增反应(例如PCR)中扩增产生的所有报告核酸。

一旦扩增，就检测报告核酸。报告核酸的检测是通过检测其中的ID序列来实现的。通过检测延伸或连接产物中的ID序列，可以确定哪些探针彼此杂交产生产物。每种延伸或连接产物的相对量也在该步骤中确定。可以使用本领域已知的任何合适的检测方法。

ID序列可以是可以区别或标识邻近探针的任何序列。因此它是标签序列，通过它可以检测特定的邻近探针。ID序列可以直接引导，或者它可以为另一个实体提供结合位点(通过结合位点可以检测该实体)，例如特定的引物，或检测探针。

在本发明的一个优选实施方案中，ID序列是条形码序列。条形码序列是定义为对应于特定分析物的特定核苷酸序列。如果每个探针均带有条形码序列，则每个报告核酸都将含有两个条形码序列：来自组合得到产物的两个探针中的每个探针各一个。当检测到两个条形码序列时，因此可以鉴定组合得到报告核酸的两个探针。如果两个条形码序列来自一个邻近探针对(即来自一对结合相同目标分析物的探针)，则报告核酸可以指示样品中目标分析物的存在，或者可以是背景。如果两个条形码序列来自未配对的邻近探针(即两个条形码序列指示不同的分析物)，则将报告核酸认为是背景。

条形码序列位于探针的核酸结构域内。条形码序列不是位于第一杂交序列内：如上所详述，每个邻近探针包含不同的条形码序列，而杂交序列在多个不同探针之间共用。条形码序列也不是位于共同的引物结合位点中-如上所述，每个探针包含独特的条形码序列，而优选的是所有探针都包含共同的引物结合位点。

可以通过多种方式检测条形码序列。首先，可以通过对在多重检测测定期间产生的所有报告核酸分子进行测序来检测具体的条形码序列。通过对产生的所有报告核酸分子进行测序，产生的所有不同的报告核酸分子可以通过它们的条形码序列来鉴定。核酸测序是报告核酸检测/分析的优选方法。

用于检测报告核酸分子中的条形码的其他合适方法包括基于PCR的方法。例如，可以利用“TaqMan”探针进行定量PCR。在这种情形中，扩增报告核酸分子(或包含条形码序列的每个报告核酸分子的至少一部分)，并提供与每个条形码序列互补的探针，其中每个不同的探针与不同的可区分的荧光团缀合。然后可以基于特定条形码是否被扩增来确定每个条形码的存在或不存在。然而，很明显，诸如上文所述的基于PCR的方法仅适合用于同时分析相对少量的不同序列，但是使用用于解码条形码序列的探针的组合方法是已知的并且可以用于在一定程度上扩展多重能力。核酸测序对在任何一次尝试中可以鉴定的序列数量没有任何实际限制，使得能够实现比使用PCR的检测更高水平的多重反应，因此测序是报告核酸分子检测的优选方法。

优选地，将一种形式的高通量DNA测序用于检测报告核酸分子中的条形码。通过合成测序是优选的DNA测序方法。通过合成测序技术的实例包括焦磷酸测序、可逆染料终止子测序和离子激流测序，其中任何一种都可以用于本发明的方法中。优选地，使用大规模平行DNA测序对报告核酸进行测序。大规模平行DNA测序尤其可以应用于通过合成测序(例如，如上所述的可逆染料终止子测序、焦磷酸测序或离子激流测序)。使用可逆染料终止子方法的大规模平行DNA测序是优选的测序方法。可以例如使用

NovaSeq^TM***来执行使用可逆染料终止子方法的大规模平行DNA测序。

如本领域已知的，大规模平行DNA测序是其中多条(例如数千条或数百万条或更多条)DNA链被平行(即同时)测序的一种技术。大规模平行DNA测序需要将目标DNA分子固定到固体表面上，例如固定到流动池的表面上或固定到珠上。然后对每个固定的DNA分子进行单独测序。通常，采用可逆染料终止子测序的大规模平行DNA测序利用流动池作为固定表面，而采用焦磷酸测序或离子激流测序的大规模平行DNA测序利用珠作为固定表面。

如本领域技术人员所已知的，在大规模平行测序的背景下将DNA分子固定到表面上通常通过将一个或多个测序适配体连接到分子末端来实现，测序适配体能够将DNA分子附接到目标表面。因此，本发明的方法可以包括将一个或多个用于测序的适配体(测序适配体)添加到报告核酸分子中，如下面更详细所述。

在替代实施方案中，ID序列不是条形码序列。相反，ID序列可以允许通过其他手段鉴定探针。根据ID序列的性质，可以使用任何合适的方法来鉴定ID序列。例如，ID序列可以是限制性位点(即限制酶所识别的核苷酸序列)。在这个实施方案中，每个邻近探针的核酸结构域包含不同的限制性位点(使得它被不同的限制酶识别和裂解)。因此可以将限制酶的不同组合应用于由多重测定产生的报告核酸，以确定哪些探针组合已经相互作用。如果报告核酸被所应用的一对限制性酶两者裂解，这表明包含酶的相应限制性位点的两个探针已经相互作用得到报告核酸。

在另一个实施方案中，ID序列是引物结合位点。在这个实施方案中，每个邻近探针的核酸结构域包含独特的引物结合位点。然后用不同的引物组合进行报告核酸分子的扩增以确定哪些探针组合已经相互作用。如果用特定引物对的扩增反应得到扩增产物，这证明包含相应引物结合位点的两个探针已经相互作用产生报告核酸。以某种方式用于鉴定特定探针的任何其他序列可替代地用作ID序列。

特别优选使用条形码序列作为ID序列，因为这允许在单个测序反应中检测所有报告核酸分子。使用替代形式的ID序列(诸如独特的限制位点或引物结合位点)效率较低，因为它们需要在单独的反应中测试限制酶或引物的每种组合以确定哪些探针已经相互作用产生报告核酸。然而，尽管如此，在某些情况下，这种替代类型的ID序列是优选的。

因此，检测报告核酸分子(即延伸或连接产物)，并且所述检测包括鉴定每种报告核酸内的ID序列(优选条形码序列)，如上文所详述。检测步骤不仅包括检测产生的各种报告核酸分子，而且包括确定每种报告核酸分子的相对量。这可以通过任何合适的手段来实现。如以上详述的高通量DNA测序是报告核酸检测的优选手段，适于报告核酸分子的相对定量，因为每个特定报告核酸的数目通过测序反应进行量化。如上所述，定量PCR是可以检测报告核酸的另一种合适手段。通过定量PCR检测报告核酸分子能够量化每种报告核酸的相对量。可以使用用于量化每种报告核酸的相对量的任何其他合适的方法。

一旦检测到报告核酸，就执行确定步骤，以确定样品中存在哪些分析物。在该步骤中，首先确定背景水平。由于非特异性探针相互作用而产生的所有报告核酸可以视为背景相互作用。确定这些背景相互作用中的每种背景相互作用的相对量，从而确定背景相互作用的水平。“非特异性探针相互作用”意指未配对的探针之间的相互作用，即结合不同分析物的探针之间的相互作用。这种报告核酸是包含来自属于第一邻近探针对的第一邻近探针的第一ID序列(例如条形码序列)和来自属于第二邻近探针对的第二邻近探针的第二ID序列(例如条形码序列)的延伸产物和/或连接产物。可以将这种报告核酸可替代地描述为包含来自对第一分析物具有特异性的邻近探针的第一ID序列(例如条形码序列)和对第二(或不同)分析物具有特异性的邻近探针的第二ID序列(例如条形码序列)的延伸产物和/或连接产物。如上所述，未配对的邻近探针之间的非特异性相互作用可能在溶液中游离的探针之间发生，或者当只有一个探针与其分析物结合时，由于它们共用的杂交位点而发生。

然后分析通过特异性探针相互作用产生的报告核酸。“特异性探针相互作用”意指探针对内的探针之间的相互作用，即与同一分析物结合的两个探针之间的相互作用。这种报告核酸是包含来自邻近探针对的第一ID序列和第二ID序列(例如第一条形码序列和第二条形码序列)的延伸产物和/或连接产物。可以将这种报告核酸可替代地描述为包含来自对同一分析物具有特异性的邻近探针的第一ID序列和第二ID序列(例如第一条形码序列和第二条形码序列)的延伸产物和/或连接产物。

探针对内的探针也可以在溶液中相互作用，因此通过特异性探针相互作用产生的报告核酸也可以构成背景(即，是由于背景相互作用而产生的)。因此，将通过特异性探针相互作用产生的每种报告核酸的量与背景相互作用的水平进行比较，正如通过非特异性探针相互作用产生的报告核酸的量确定的。如果通过特异性探针相互作用产生的报告核酸存在的水平高于背景相互作用的水平(即非特异性背景报告核酸的水平)，这表明样品中存在由相关探针对结合的分析物。另一方面，如果通过特异性探针相互作用产生的报告核酸存在的水平不高于非特异性背景报告核酸(例如，如果通过特异性探针相互作用产生的报告核酸存在的水平等于或低于非特异性背景报告核酸)，则仅认为相关探针对之间的相互作用是背景。在这种情况下，探针对的探针之间的相互作用仅仅是背景的事实表明样品中不存在探针对结合的分析物。

可替代地，对于任何单个目标分子，背景相互作用可以仅定义为非特异性相互作用，包括结合该目标分子的探针。也就是说，对于每个目标分子，背景相互作用可以定义为识别目标分子的探针和与识别目标分子的探针共用其杂交位点的未配对探针(即不识别目标分子的探针)之间的非特异性相互作用。因此在这种情况下，两者均不识别目标分子的探针之间的非特异性相互作用不被视为该特定目标分子的背景相互作用。

在特定实施方案中，与特异性探针相互作用的水平进行比较的背景水平是所考虑的背景相互作用的平均水平，尤其是所考虑的背景相互作用的均值水平。

在一个特定实施方案中，该方法的第一步骤(即，使样品与多对邻近探针接触的步骤)还包括使样品与一种或多种不结合分析物的背景探针接触，所述背景探针包含：包含ID序列和与至少一个邻近探针共用的杂交序列的核酸结构域。“背景探针”在本文中也可以称为“惰性探针”。如上所述，惰性探针不结合分析物。尽管如此，如果惰性探针对已知不存在于样品中的分析物，尤其是抗体具有特异性，则它可以包含分析物结合结构域。惰性探针实际上可以包含“结合结构域”，其等同于功能性邻近探针的分析物结合结构域，但不执行分析物结合功能，即该结合结构域等效物是惰性的。在一个实施方案中，惰性结构域可以由本体IgG提供。可替代地，惰性探针可包含无活性的分析物结合结构域，即非功能性分析物结合结构域。例如，惰性探针可以包含假的分析物结合结构域，诸如抗体的恒定区，或抗体的一条链(仅重链或轻链)。可替代地，惰性探针可包含惰性结构域，核酸结构域附接至该惰性结构域，但没有功能并且与活性探针的分析物结合结构域无关。惰性结构域可以是例如可以添加到测定中而不干扰测定反应的蛋白质，诸如血清白蛋白(例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白)。在另一个替代方案中，惰性探针只是核酸分子，不含非核酸结构域。

每个惰性探针在其核酸结构域内均包含ID序列。在惰性探针中使用与在活性(即邻近)探针中相同类型的ID序列。例如，如果活性探针使用条形码序列作为ID序列，则惰性探针也使用条形码序列作为ID序列。惰性探针各自包含与至少一个邻近探针共用的杂交序列。优选地，惰性探针各自包含与多个邻近探针共用的杂交序列。当使用惰性探针时，可能仅使用单一种类的惰性探针，即所有惰性探针具有相同的杂交序列。然而优选地，使用多个种类的惰性探针，每种惰性探针包含不同的杂交序列(与不同的邻近探针或一组不同的邻近探针共用)。可能每个不同种类的惰性探针具有不同的、独特ID序列。可替代地，所有不同种类的所有惰性探针都可以使用共同的惰性探针ID序列。不管怎样，很明显惰性探针中使用的一个或多个ID序列不与任何邻近探针共用。

由于惰性探针与某些邻近探针之间共用的杂交位点，惰性探针与邻近探针在溶液中的背景相互作用是可能的。当惰性探针与邻近探针相互作用时，这导致在两个探针的核酸结构域之间形成双链体。延伸和/或连接反应的进行导致由两个探针形成的双链体形成延伸和/或连接产物。该延伸/连接产物与该测定的所有其他产物一起进行扩增、处理和检测。由惰性探针与邻近探针之间的相互作用产生的延伸/连接产物(即报告核酸)在确定步骤中被视为背景。

用于检测样品中的分析物的多重测定优选为PEA。在该实施方案中，如上所述，每个邻近探针对的核酸结构域包含彼此杂交以形成双链体的互补杂交序列。对形成的双链体进行延伸反应以得到延伸产物。具体而言，PEA的延伸产物是线性延伸产物。

PEA有几种不同的变型，每种变型都使用设计略有不同的邻近探针。每个邻近探针的核酸结构域的设计取决于使用探针的方法。图1中示意性地示出了邻近延伸测定形式的代表性样品，并且这些实施方案在下文中详细描述。通常，在邻近延伸测定中，在一对邻近探针与其目标分析物结合后，两个探针的核酸结构域彼此邻近并相互作用(即直接或间接地与彼此杂交)。诸两个核酸结构域之间的相互作用产生包含至少一个游离的3'末端的核酸双链体(即双链体内的至少一个核酸结构域具有可以延伸的3'末端)。在测定混合物中添加或激活核酸聚合酶会导致至少一个游离3'末端的延伸。因此，使用其配对的核酸结构域作为模板，双链体中的至少一个核酸结构域被延伸。获得的延伸产物包含ID序列，ID序列指示延伸产物是从哪两个探针产生的。

邻近探针的核酸结构域可以是单链的或部分双链的。核酸结构域可以彼此杂交，一个结构域可以为另一个结构域的延伸提供模板。可以延伸一个或两个结构域。在核酸结构域是部分双链的情况下，结构域的单链部分可以彼此杂交。单链部分因此可以处于链的3'末端。在核酸结构域是部分双链的情况下，一条链可以与分析物结合结构域缀合，而另一条链可以与缀合的链杂交。在特定实施方案中，部分双链结构域的单链部分可以是该链与缀合链杂交的一部分。如将在下文更详细描述的，部分双链核酸结构域的杂交链(与缀合链相对)可被视为“夹板链”或夹板寡核苷酸。

图1的版本1描绘了“传统的”邻近延伸测定，其中每个邻近探针的核酸结构域(显示为箭头)通过其5'末端连接到分析物结合结构域(显示为倒“Y”)，从而留下两个游离3'末端。当所述邻近探针与它们相应的分析物(图中未显示分析物)结合时，探针的核酸结构(其在它们的3'末端互补)能够通过杂交发生相互作用，即形成双链体。在测定混合物中添加或激活核酸聚合酶允许使用另一个邻近探针的核酸结构域作为模板来延伸每个核酸结构域，得到延伸产物。

图1的版本2描绘了替代性邻近延伸测定，其中第一邻近探针的核酸结构域通过其5'末端连接到分析物结合结构域，并且第二邻近探针的核酸结构域通过其3'末端连接到分析物结合结构域。第二邻近探针的核酸结构域因此具有游离5'末端(显示为钝箭头)，其无法使用典型的核酸聚合酶(其仅延伸3'末端)进行延伸。第二邻近探针的3'末端被有效地“阻断”，即它不是“游离的”，并且它不能被延伸，因为它与分析物结合结构域缀合并因此被分析物结合结构域阻断。在该实施方案中，当邻近探针与分析物上它们相应的分析物结合目标结合时，在它们的3'末端共用互补区域的探针核酸结构域能够通过杂交发生相互作用，即形成双链体。然而，与版本1对比，使用第二邻近探针的核酸结构域作为模板，只有第一邻近探针的核酸结构域(其具有游离3'末端)可以被延伸，产生延伸产物。

在图1的版本3中，与版本2一样，第一邻近探针的核酸结构域通过其5'末端连接到分析物结合结构域，并且第二邻近探针的核酸结构域通过其3'末端连接到分析物结合结构域。第二邻近探针的核酸结构域因此具有游离5'末端(显示为钝箭头)，其无法被延伸。然而，在该实施方案中，与相应邻近探针的分析物结合结构域连接的核酸结构域不具有互补性区域，因此不能直接形成双链体。相反，提供了第三核酸分子，其具有与每个邻近探针的核酸结构域同源的区域。该第三核酸分子充当核酸结构域之间的“分子桥”或“夹板(splint)”。夹板寡核苷酸桥接在核酸结构域之间的空位，允许它们间接与彼此相互作用，即每个核酸结构域与夹板寡核苷酸形成双链体。

因此，当邻近探针与分析物上它们相应的分析物结合目标结合时，探针的核酸结构域各自通过与夹板寡核苷酸杂交相互作用，即形成双链体。因此可以看出，第三核酸分子或夹板可以被视为提供在邻近探针之一上的部分双链核酸结构域的第二链。例如，可以向邻近探针之一提供部分双链核酸结构域，其通过一条链的3'末端连接到分析物结合结构域，并且其中另一条(未连接的)链具有游离3'末端。因此，这样的核酸结构域具有一个带有游离3'末端的末端单链区。在该实施方案中，第一邻近探针的核酸结构域(其具有游离3'末端)可以使用“夹板寡核苷酸”(或其他核酸结构域的单链3'末端区域)作为模板进行延伸。可替代地或另外，可以使用第一邻近探针的核酸结构域作为模板来延伸夹板寡核苷酸(即未连接的链，或3'单链区)的游离3'末端。

从以上描述中显而易见，在一个实施方案中，夹板寡核苷酸可以作为测定的单独组分提供。换句话说，其可以单独添加到反应混合物中(即单独添加到邻近探针中，以添加到含有分析物的样品中)。尽管如此，由于其与作为邻近探针一部分的核酸分子杂交，并且在与这种核酸分子接触时将会杂交，所以其可以仍被视为部分双链核酸结构域的链，尽管它是单独添加的。可替代地，夹板可以与邻近探针的核酸结构域之一预杂交，即在邻近探针与样品接触之前杂交。在该实施方案中，夹板寡核苷酸可以直接被视为邻近探针的核酸结构域的一部分，即其中所述核酸结构域是部分双链核酸分子，例如邻近探针可以通过以下方式来制备：将双链核酸分子与分析物结合结构域连接(优选地核酸结构域通过单链与分析物结合结构域缀合)并且修饰所述核酸分子以产生部分双链核酸结构域(具有能够与另一个邻近探针的核酸结构域杂交的单链突出端)。

因此，如本文所定义的邻近探针的核酸结构域的延伸也涵盖“夹板”寡核苷酸的延伸。有利地，当延伸产物起于夹板寡核苷酸的延伸时，所得的延伸核酸链仅通过核酸分子的两条链之间的相互作用(通过两条核酸链之间的杂交)与邻近探针对偶联。因此，在这些实施方案中，延伸产物可以使用变性条件(例如，增加温度、降低盐浓度等)从邻近探针对解离。

虽然图1的版本3中描绘的夹板寡核苷酸显示为与第二邻近探针的全长核酸结构域互补，但这仅是一个实例，并且这足够使夹板能够与邻近探针的核酸结构域的末端(或在末端附近)形成双链体，即在两个探针的核酸结构域之间形成桥。

在另一个实施方案中，夹板寡核苷酸可以作为第三邻近探针的核酸结构域提供，如WO2007/107743中所述，其通过引用并入本文，这表明这可以进一步改善邻近探针测定的灵敏度和特异性。

图1的版本4是版本1的修改，其中第一邻近探针的核酸结构域在其3'末端包含与第二邻近探针的核酸结构域不完全互补的序列。因此，当所述邻近探针与它们相应的分析物结合时，探针的核酸结构域能够通过杂交相互作用，即形成双链体，但第一邻近探针的核酸结构域的最3'末端(包含游离3'羟基基团的核酸分子部分)不能与第二邻近探针的核酸结构域杂交，因此以单链的未杂交的“副翼(flap)”存在。在添加或激活核酸聚合酶时，可以使用第一邻近探针的核酸结构域作为模板仅延伸第二邻近探针的核酸结构域。因此，在这个实施方案中，只有第二邻近探针的核酸结构域的3'末端是“游离的”-第一邻近探针的核酸结构域的3'末端不是“游离的”，因为它不与第二邻近探针的核酸结构域互补，因此不与其杂交并且不能延伸。

图1的版本5可以看作是版本3的修改。然而，与版本3对比，两个邻近探针的核酸结构域通过它们的5'末端连接至它们相应的分析物结合结构域。在该实施方案中，核酸结构域的3'末端不互补，因此邻近探针的核酸结构域不能直接相互作用或形成双链体。相反，提供了第三核酸分子，其具有与每个邻近探针的核酸结构域同源的区域。该第三核酸分子充当核酸结构域之间的“分子桥”或“夹板(splint)”。这个“夹板”寡核苷酸桥接在核酸结构域之间的空位，允许它们间接与彼此相互作用，即每个核酸结构域与夹板寡核苷酸形成双链体。因此，当邻近探针与它们相应的分析物结合时，探针的核酸结构域各自通过与夹板寡核苷酸杂交相互作用，即形成双链体。

根据版本3，因此可以看出，第三核酸分子或夹板可以被视为提供在邻近探针之一上的部分双链核酸结构域的第二链。在优选的实例中，可以向邻近探针之一提供部分双链核酸结构域，其通过一条链的5'末端连接到分析物结合结构域，并且其中另一条(未连接的)链具有游离3'末端。因此，这样的核酸结构域具有一个带有至少一个游离3'末端的末端单链区。在该实施方案中，第二邻近探针的核酸结构域(其具有游离3'末端)可以使用“夹板寡核苷酸”作为模板进行延伸。可替代地或另外，可以使用第二邻近探针的核酸结构域作为模板来延伸夹板寡核苷酸(即未连接的链，或第一邻近探针的3'单链区)的游离3'末端。

如上文结合版本3所讨论的，夹板寡核苷酸可以作为测定的单独组分提供。另一方面，由于其与作为邻近探针一部分的核酸分子杂交，并且在与这种核酸分子接触时将会杂交，因此其可以被视为部分双链核酸结构域的链，尽管它是单独添加的。可替代地，夹板可以与邻近探针的核酸结构域之一预杂交，即在邻近探针与样品接触之前杂交。在该实施方案中，夹板寡核苷酸可以直接被视为邻近探针的核酸结构域的一部分，即其中所述核酸结构域是部分双链核酸分子，例如邻近探针可以通过以下方式来制备：将双链核酸分子与分析物结合结构域连接(优选地核酸结构域通过单链与分析物结合结构域缀合)并且修饰所述核酸分子以产生部分双链核酸结构域(具有能够与另一个邻近探针的核酸结构域杂交的单链突出端)。

虽然图1的版本5中描绘的夹板寡核苷酸显示为与第一邻近探针的全长核酸结构域互补，但这仅是一个实例，并且这足够使夹板能够与邻近探针的核酸结构域的末端(或在末端附近)形成双链体，即在邻近探针的核酸结构域之间形成桥。

图1的版本6是本发明的最优选实施方案。如图所描绘，一对中的两个探针都与部分单链核酸分子缀合。在每个探针中，一条短核酸链通过其5'末端与分析物结合结构域缀合。与分析物结合结构域缀合的短核酸链不与彼此杂交。相反，每条短核酸链都与较长的核酸链杂交，所述较长的核酸链在其3'末端具有单链突出端(也就是说，所述较长核酸链的3'末端延伸超过与分析物结合结构域缀合的较短链的5'末端。两条较长核酸链的突出端与彼此杂交，形成双链体。彼此杂交的较长核酸链在本文中称为“杂交寡核苷酸”。如果两个较长核酸分子的3'末端与彼此完全杂交，如图所示，则双链体包含两个游离3'末端，尽管较长核酸分子的3'末端可以如版本4那样设计，使得较长核酸分子之一的最3'末端与另一个不互补，形成一个副翼，这意味着双链体仅含有一个游离3'末端。

因此可以看出，当使用PEA进行本发明的方法时，在一些实施方案中，在每个邻近探针对中，至少一个核酸结构域是部分双链的。可能在每个邻近探针对中，一个核酸结构域是部分双链的(如在版本3和版本5中)。优选的是在每个邻近探针对中，两个核酸结构域都是部分双链的，如在版本6中。

如关于版本6所详述，优选的是部分双链的核酸结构域包含：

(i)与所述分析物结合结构域缀合的第一寡核苷酸；和

(ii)包含所述第一杂交序列、所述ID序列和所述第二杂交序列的杂交寡核苷酸，所述第一杂交序列位于所述杂交寡核苷酸的3’末端；

其中所述核酸结构域的所述双链部分包含所述杂交寡核苷酸的所述第二杂交序列与所述第一寡核苷酸之间的双链体，并且所述核酸结构域的所述单链部分包含所述杂交寡核苷酸的所述第一杂交序列。

在一个特定实施方案中，所述杂交寡核苷酸从5'到3'包含所述第二杂交序列、所述ID序列和所述第一杂交序列，并且所述ID序列(优选条形码序列)位于所述核酸结构域的所述单链部分中。

情况可能是这样的，所有邻近探针都包含相同的第一寡核苷酸和相同的第二杂交序列(在杂交寡核苷酸内)。换言之，所有邻近探针可以共用通用的第一寡核苷酸和第二杂交序列。这可能导致探针的制造过程更直接。

如上文所详述，第一寡核苷酸和第二杂交序列彼此互补，使得这两个序列能够彼此杂交。在一个特定实施方案中，第二杂交位点与整个第一寡核苷酸互补，使得它们之间形成的双链体包含整个第一寡核苷酸。但这不是必需的，并且可能是第二杂交位点仅与第一寡核苷酸的一部分互补，使得它们之间形成的双链体仅包含第一寡核苷酸的一部分。还如上所述，第一杂交序列位于杂交寡核苷酸的3'末端，使得当具有互补的第一杂交序列的两个探针变得邻近时，它们的杂交寡核苷酸的3'末端彼此杂交。“位于3'末端”可以意指第一杂交序列延伸到每个杂交寡核苷酸的3'末端，即第一杂交序列可以包括每个杂交寡核苷酸的3'核苷酸。然而，这不是必需的，并且第一杂交序列可以可替代地仅延伸至每个探针对中一个杂交寡核苷酸的3'末端。因此，上述PEA版本6中使用的核酸结构域可以以与版本4相同的方式设计，使得每个探针对中的杂交寡核苷酸之一在其3'末端包含与另一邻近探针的杂交寡核苷酸不完全互补的序列，因此形成单链的、未杂交的“皮瓣”。

因此，在两个核酸结构域彼此杂交之后，至少一个杂交寡核苷酸被延伸以产生延伸产物(换句话说，一个或两个杂交寡核苷酸被延伸以产生延伸产物)。如果第一杂交序列延伸到每个探针对中两个杂交寡核苷酸的3'末端，则可能两个杂交寡核苷酸都被延伸以产生延伸产物。另一方面，如果其中一个杂交寡核苷酸在其3'末端包含未杂交的皮瓣(如上文所详述)，则只有一个杂交寡核苷酸被延伸以产生延伸产物(即没有皮瓣的杂交寡核苷酸)。

当进行的多重测定是PEA时，优选的是在PCR扩增的情况下进行延伸反应，或者换句话说，进行包括PCR扩增在内的单个反应以实现邻近探针核酸结构域的延伸，从而产生报告核酸分子，并实现所产生的报告核酸分子的扩增。在该实施方案中，反应不是从变性步骤开始(如PCR中通常的情况)，而是从延伸步骤开始，在此期间产生报告核酸分子。此后，从报告分子的变性开始，进行标准PCR以扩增报告核酸分子。如上文所详述，使用与报告核酸分子末端的共同序列结合的共同引物进行PCR。如下文所详述，引物中的一者或两者还可以包含测序适配体。换句话说，本发明方法的延伸和扩增步骤可以在单个反应中进行。

在另一个实施方案中，用于检测样品中的分析物的多重测定是PLA。使用的PLA可以是“标准”PLA。这意味着PLA使用单个夹板寡核苷酸来接合两个邻近探针的核酸结构域。在标准PLA中，每个邻近探针对的核酸结构域包含配对杂交序列，配对杂交序列与夹板寡核苷酸杂交以形成双链体。邻近探针对的核酸结构域与其相应的探针缀合，使得在每一对中，一个邻近探针具有带游离3'末端的核酸结构域，而另一个邻近探针具有带游离5'末端的核酸结构域，使得两个探针的核酸结构域的游离末端可以连接在一起。夹板寡核苷酸可以在其3'末端包含延伸阻断子，使得它不能被延伸。在双链体形成之后，两个邻近探针的核酸结构域直接或间接地彼此连接以产生包含第一邻近探针的ID序列和第二邻近探针的ID序列的连接产物。

当多重测定是PLA时，优选的是邻近探针对的核酸结构域与夹板寡核苷酸杂交，使得在两个核酸结构域之间的双链体中存在断裂，但没有空位。换句话说，一个核酸结构域的3'端可以与夹板的核苷酸杂交，该夹板的核苷酸和与另一核酸结构域的5'端杂交的夹板的核苷酸直接相邻。这使得两个核酸结构域能够彼此直接连接。

可替代地，邻近探针对的核酸结构域可与夹板寡核苷酸杂交，使得一个核酸结构域的3'端与另一核酸结构域的5'端之间存在空位。在该实施方案中，在夹板寡核苷酸和两个探针核酸结构域之间形成的双链体包含一定长度的来自夹板寡核苷酸的单链核酸，将双链体的两个部分分开。单链空位的长度可以是任意数目的核苷酸。在该实施方案中，进行空位填充延伸反应以填充两个探针核酸结构域末端之间的空位(即延伸包含游离3'末端的探针核酸结构域，以便填充空位)。在空位填充之后，使用连接酶将两个夹板寡核苷酸的核酸结构域彼此连接。在空位填充之后核酸结构域的彼此连接在本文中称为核酸结构域彼此的“间接连接”。

使用缺乏链置换活性的聚合酶进行空位填充延伸反应，使得在空位被填充时延伸结束，而不是置换游离3'末端下游的杂交核酸结构域。非置换聚合酶包括T4 DNA聚合酶。其他这种聚合酶是本领域已知的。

连接后，连接产物如上所述进行扩增(例如通过PCR)并检测。这些PLA实施方案得到线性连接(或延伸和连接)产物。优选的是在本发明的方法中产生的连接产物，或延伸和连接产物是线性的。

可替代地，使用的PLA可以是滚环扩增PLA(PLA-RCA)。这种PLA格式使用两个夹板寡核苷酸，它们相互连接以产生连接产物。PLA-RCA在例如

等人,Nature Methods3(12):995-1000(2006)有描述。在该实施方案中，邻近探针包含各自包含两个杂交序列的核酸结构域。第一杂交序列与第一夹板寡核苷酸上的杂交序列互补，并且第二杂交序列与第二夹板寡核苷酸上的杂交序列互补。第一杂交序列是配对的，如上所述，使得同一对第一杂交序列被多个邻近探针对共用。如上文所详述，这些与特定的第一夹板寡核苷酸杂交。第二杂交序列也可以是配对的，但更优选地，这些是通用位点，被多重测定中的所有邻近探针核酸结构域共用，使得所有邻近探针对只需要单个第二夹板寡核苷酸。

在PLA-RCA中，探针核酸结构域的ID序列(优选条形码序列)位于第一杂交位点与第二杂交位点之间。在两个夹板寡核苷酸与探针核酸结构域结合后，进行空位填充延伸反应，如上所述。然后将两个夹板寡核苷酸彼此连接形成环状分子，通过滚环扩增对环状分子进行扩增，并进行检测。

如上所述，优选的是通过大规模平行DNA测序检测报告核酸，并且这通常需要将测序适配体添加到待测序的DNA分子中。如上所述，测序适配体起到将DNA分子固定在表面上的作用。

因此，本发明的方法可以包括将一个或多个用于测序的适配体(测序适配体)添加到报告核酸中。

通常，测序适配体是核酸分子(特别是DNA分子)。在这种情形中，与适配体序列互补的短寡核苷酸与固定表面(例如珠或流动池的表面)缀合，使得靶DNA分子能够通过适配体序列与表面退火。可替代地，任何其他的结合配偶体对都可以用于将靶DNA分子缀合到固定表面上，例如生物素和抗生物素蛋白/链霉亲和素。在这种情况下，生物素可以用作测序适配体，并且抗生物素蛋白或链霉亲和素与固定表面缀合以结合生物素测序适配体，反之亦然。

因此，测序适配体可以是短的寡核苷酸(优选DNA)，一般为10-30个核苷酸长(例如15-25或20-25个核苷酸长)。如上文所详述，测序适配体的目的是使得靶DNA分子能够与固定表面退火，因此核酸适配体的核苷酸序列由其与固定表面缀合的结合配偶体的序列确定。除此之外，对核酸测序适配体的核苷酸序列没有特别的限制。

可以在PCR扩增期间将测序适配体添加到本发明的报告核酸中。在核酸测序适配体的情况下，这可以通过在一个或两个引物中包含测序适配体核苷酸来实现。可替代地，如果测序适配体是非核酸测序适配体(例如蛋白质/肽或小分子)，则适配体可以与一个或两个PCR引物缀合。可替代地，可以通过将测序适配体直接与报告核酸分子连接或缀合将测序适配体连接至报告核酸分子。优选地，本发明的方法中使用的一个或多个测序适配体是核酸测序适配体。

因此可以在一个或多个连接和/或扩增步骤中将一个或多个核酸测序适配体添加至报告核酸。因此，例如，如果将两个测序适配体添加至报告核酸分子(在每个末端一个)，则可以在单个步骤中(例如，通过使用一对都包含测序适配体的引物进行PCR扩增)或在两个步骤中添加这些适配体。所述两个步骤可以使用相同或不同的方法来执行，例如第一测序适配体可以通过连接添加至报告核酸分子，第二测序适配体通过PCR扩增添加至报告核酸分子，反之亦然；或者可以进行第一扩增反应以将第一测序适配体添加至报告核酸分子，随后进行第二扩增反应以将第二测序适配体添加至报告核酸分子。

如上所述，可以将一个或多个测序适配体添加至报告核酸分子。这意指一个或两个测序适配体—因为测序适配体被添加到DNA分子的末端，所以可以添加至单个DNA分子(例如报告核酸)的最大测序适配体数量是两个。因此，可以将单个测序适配体添加至报告核酸分子的一个末端，或者可以将两个测序适配体添加至报告核酸分子，每个末端添加一个。在特定实施方案中，使用Illumina P5和P7适配体，即P5适配体被添加到报告核酸分子的一个末端并且P7适配体被添加到另一个末端。P5适配体的序列如SEQ ID NO:1(AAT GATACG GCG ACC ACC GA)所示，并且P7适配体的序列如SEQ ID NO:2(CAA GCA GAA GAC GGCATA CGA GAT)所示。

PCR扩增因此可以与将一个或多个测序适配体添加至报告核酸分子相结合。这可以通过使用包含至少一个测序适配体的引物对扩增报告核酸分子来实现。在这种情形中，引物对中的至少一个引物包含在结合报告核酸分子的序列上游的测序适配体。因此，测序适配体通常位于包含它的任何引物的5'末端。

在特定实施方案中，使用包含含有测序适配体的一个引物的引物对进行扩增步骤，使得单个测序适配体被添加到报告核酸分子的一个末端。

在另一个实施方案中，使用其中两个引物都包含测序适配体的引物对进行扩增步骤，使得在单个扩增步骤中将测序适配体添加至报告核酸分子的每个末端。

在另一个实施方案中，进行两个单独的扩增反应以将测序适配体添加到报告核酸分子的每个末端，其中每个扩增步骤将不同的测序适配体添加到所述分子的不同末端。

在另一个实施方案中，使用不包含测序适配体的引物进行初始扩增步骤。然后使扩增的报告核酸分子经历一个或多个另外的扩增反应以将测序适配体添加到所述分子的每个末端，如上所述。

优选的是在两个PCR步骤中扩增报告核酸(即延伸和/或连接产物)。在第一PCR反应中，将第一测序适配体添加到延伸产物或连接产物的一个末端。然后在第二PCR反应中扩增第一PCR反应的产物，其中将第二测序适配体添加到报告核酸的另一末端。在一个特定实施方案中，第一PCR反应用也具有3'至5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶进行，并且第二PCR反应用缺乏3'至5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶进行，如WO 2012/104261中所述。具有3'至5'核酸外切酶活性的合适的核酸聚合酶包括T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Phi29(Φ29)DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)DNA聚合酶和乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei，Pwo)DNA聚合酶。缺乏3'至5'核酸外切酶活性的合适的核酸聚合酶包括DNA聚合酶III的α亚基、DNA聚合酶I的Klenow exo(-)片段、Taq聚合酶、Pfu(exo^-)DNA聚合酶和Pwo(exo^-)DNA聚合酶。

在另一个实施方案中，相同的聚合酶可用于两个PCR步骤，例如Pwo或Pfu聚合酶。

本发明的方法可用于同时测定多个样品。在这种情况下，如上所述对每个样品进行单独的多重测定。一旦产生了延伸和/或连接产物，就添加样品索引序列。样品索引是标识从中得到延伸和/或连接产物的源样品的核苷酸序列。因此，使用不同的核苷酸序列作为来源于每个不同样品的延伸/连接产物的样品索引序列。相反地，来自特定样品的所有延伸和/或连接产物都用相同的样品索引序列标记。

一旦所有产品都用样品索引进行了标记，就可以将多个样品的产物合并在一起并进行分析。当对报告核酸测序时，样品索引将指示每个单独的报告核酸分子来自哪个样品。任何核苷酸序列都可以用作样品索引。样品索引序列可以是任何长度，但优选是相对较短的，例如3-12个、4-10个或4-8个核苷酸。

可以通过任何合适的方法将样品索引序列添加至延伸/连接产物，例如可以在扩增反应(例如通过PCR)或连接反应中添加样品索引。值得注意的是，如果报告核酸分子要通过大规模平行DNA测序进行分析，并且在两个末端都需要测序适配体，则样品索引序列不能被添加成使得其最终位于报告核酸分子的末端。

在一个优选的实施方案中，样品索引序列在PCR扩增期间添加到延伸/连接产物中。如上所述，测序适配体也可以在PCR扩增过程中添加到延伸/连接产物中。在一个特定实施方案中，可以专门地进行专门的扩增步骤以将样品索引添加至报告核酸分子。在另一个实施方案中，样品索引可以在PCR扩增期间与一个或多个测序适配体同时添加。例如，如果进行单次PCR扩增以将测序适配体添加到报告核酸分子的两个末端，则可以同时添加样品索引。可替代地，如果在两次连续PCR扩增中将测序适配体添加到报告核酸分子的每个末端，则可以在任一PCR扩增期间添加样品索引。样品索引可以在第一PCR扩增期间添加，在这种情况下，它可以添加到报告核酸中与添加测序适配体相同的末端(在测序适配体内部)或相反的末端。可替代地，样品索引可以在第二PCR扩增期间添加，在这种情况下，它必须添加到报告核酸中与添加测序适配体相同的末端(在测序适配体内部)。可替代地，可以进行连接步骤以在扩增之前将样品索引添加到每个报告核酸分子的末端。

本发明的第二方面是可用于执行本发明第一方面的方法的产品。具体而言，如上所述，该产品包含：

(a)对蛋白质具有特异性的蛋白质结合结构域；和

(b)核酸结构域，

并且其中至少一对杂交序列被至少两对邻近探针共用。

该方面的各种特征与第一方面的等效特征相同(例如邻近探针、ID序列、夹板寡核苷酸、杂交序列等)。值得注意的是，在本发明的这个方面，每个探针对内的两个探针都包含对相同蛋白质具有特异性的蛋白质结合结构域。换句话说，在产品的每个探针对中，两个探针结合相同的蛋白质。如上文所详述，每个探针对中的两个探针在不同的表位上结合它们的目标蛋白，使得它们不会干扰彼此与目标的结合。本发明的探针可设计用于如上所述的PEA或PLA的任何式样或变型。

在一个实施方案中，本发明的产品还包含一种或多种不结合分析物的背景探针(或惰性探针)，如上所述。如在本发明的方法中，优选的是很大一部分探针对与至少一个其他邻近探针对共用它们的杂交序列。在特定实施方案中，至少25％、50％或75％的邻近探针对与另一邻近探针对(即与至少一个其他邻近探针对)共用它们的杂交序列，如同在该方法中一样。在一个特定实施方案中，所有邻近探针对与至少一个其他邻近探针对共用它们的杂交序列。然而，正如从上文显而易见的，在另一个实施方案中，至少一对杂交序列对于单对邻近探针是独特的。也就是说，至少一对邻近探针不与任何其他邻近探针对共用其杂交序列。在特定实施方案中，至多75％、50％或25％的成对邻近探针不与任何其他邻近探针对共用它们的杂交序列。如同在该方法中一样，在某些实施方案中，产品中不超过20个、15个、10个或5个邻近探针对共用同一对杂交序列。

本发明的产品可以作为包含所有邻近探针(和如果存在，夹板寡核苷酸和/或惰性探针)的单一组合物提供。可替代地，可以在单独的容器中提供产品的所有组分。例如，邻近探针对、夹板寡核苷酸和惰性探针都可以在单独的容器中提供。如果需要，每个探针对或甚至每个单独的邻近探针可以在单独的容器中提供，每个不同的夹板寡核苷酸和每个不同的惰性探针也可以。

该产品还可包含用于本发明方法的附加组分。例如，该产品可以包含一种或多种用于延伸和/或扩增步骤的核酸聚合酶，和/或如果需要连接步骤，则包含连接酶。该产品可以包含用于扩增的引物。如上文所详述，用于扩增步骤的引物可包含用于核酸测序的序列适配体和/或样品索引序列。该产品还可以包含用于延伸/扩增反应的核苷酸(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。该产品可以包含固体碱基，报告核酸可以固定在该固体碱基上用于测序，例如流动池或珠粒。

参考以下非限制性实施例和附图可以进一步理解本发明。

附图说明

图1示出了六种不同版本的邻近延伸测定的示意性图示，如上文所详述。倒“Y”形状代表抗体，作为示例性邻近探针分析物结合结构域。

图2示出了使用传统阴性对照或共用杂交位点阴性对照通过多重PEA确定的，六个不同样品中对于四种分析物表达水平获得的结果的比较。

图3示出了使用传统阴性对照或共用杂交位点阴性对照通过多重PEA确定的，六个不同样品(和用于图2的相同样品)中对于五种分析物表达水平获得的结果的比较。

实施例

血浆样品获自6名供体：3名健康受试者、一名被诊断患有乳腺癌的受试者、一名被诊断患有类风湿性关节炎(RA)的受试者和一名被诊断患有炎症性肠病(IBD)的受试者。

进行多重PEA(使用包含与具有以上版本6中描述的结构的核酸结构域缀合的抗体的探针)以检测样品中的9种蛋白质：NPDC1(UniProt Q9NQX5)；AHCY(UniProt P23526)；TM(UniProt P07204)；ANGPTL1(UniProt O95841)；LOX-1(UniProt P78380)；SEMA3F(UniProtQ13275)；CDH2(UniProt P19022)；CANT1(UniProt Q8WVQ1)；和CA13(UniProt Q8N1Q1)。靶向NPDC1、AHCY、TM和ANGPTL1的探针全部共用一对杂交位点；并且靶向LOX-1、SEMA3F、CDH2、CANT1和CA13的探针全部共用一对不同的杂交位点。每个探针包含一个独特的条形码序列。还使用了阴性对照，该阴性对照包含具有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水，没有样品。

如上所述进行PEA。在延伸产物的扩增期间，连同来自每个不同样品的报告核酸的独特样品索引，P5和P7测序适配体被添加到产物的每个末端，并且采用使用IlluminaNovaSeq平台的可逆染料终止子测序技术，将所有延伸产物通过大规模平行DNA测序进行测序。

来自目标的标准阴性对照的背景由目标探针的配对条形码相互作用确定。对于每个样品，来自目标的共用杂交位点的背景由目标探针对的每个相应探针与该组内其他探针(即与目标探针共用杂交位点的探针)之间的错配相互作用的平均值(由错配条形码确定)确定。换句话说，对于来自共用杂交位点的每个目标背景，定义为目标的每个探针与具有共用杂交位点的其他探针之间的非特异性相互作用。在背景的计算中不包括两者都不结合目标的探针之间的非特异性相互作用。

从两组目标分析物获得以下结果：

第1组-线性分析

来自阴性对照的高于背景的信号：

来自共用杂交位点的高于背景的信号：

第1组-对数分析(以2为底)

来自阴性对照的高于背景的信号：

来自共用杂交位点的高于背景的信号：

对数结果在图2中示出。

第2组-线性分析

来自阴性对照的高于背景的信号：

来自共用杂交位点的高于背景的信号：

第2组-对数分析(以2为底)

来自阴性对照的高于背景的信号：

来自共用杂交位点的高于背景的信号：

对数结果在图3中示出。

虽然对于两组分析物而言，高于背景的信号的实际值在两种类型的对照(阴性对照和共用杂交位点对照)之间可能不同，但对于每个样品的每种分析物而言，值的改变大致相同(即存在平行改变)。对于每种分析物获得的结果而言由高的R²值证明了这一点，表明由两种方法中的每一种方法确定的高于背景的信号程度之间存在非常高的相关性。这些结果证明，使用共用杂交位点是标准阴性对照的有效替代方案，因为分析物的相对信号水平在样品之间得以保持来自共用杂交位点的背景确定结果显示样品之间的区别与使用标准阴性对照时相似。

SEQUENCE LISTING

<110> 欧凌科蛋白质公司

<120> 用于邻近检测测定的对照

<130> P22116653WP

<150> GB2004469.9

<151> 2020-03-27

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P5适配体

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P7适配体

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agat 24

Claims

1.一种用于检测样品中的多种分析物的方法，所述方法包括进行多重基于邻近的检测测定，所述测定包括：

(a)对分析物具有特异性的分析物结合结构域；和

(b)核酸结构域，

并且其中至少一对杂交序列被至少两对邻近探针共用；

(iii)对所述双链体进行延伸和/或连接反应以生成包含所述第一邻近探针的所述ID序列和所述第二邻近探针的所述ID序列的延伸和/或连接产物；

(iv)扩增所述延伸产物或连接产物；

(vi)确定所述样品中存在哪些分析物，其中：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物是蛋白质或包含蛋白质。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分析物结合结构域是抗体或其片段。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤(i)还包括使所述样品与一种或多种不结合分析物的背景探针接触，所述背景探针包含：包含ID序列和与至少一个邻近探针共用的杂交序列的核酸结构域；

其中在步骤(v)中检测到由于背景探针与邻近探针之间的相互作用而产生的延伸和/或连接产物，并在步骤(vi)中被视为背景。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述ID序列是条形码序列。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中至少一对杂交序列对于单对邻近探针是独特的。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中不超过10个邻近探针对共用同一对杂交序列。

8.如权利要求7所述的方法，其中不超过5个邻近探针对共用同一对杂交序列。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中至少25％的邻近探针对与另一邻近探针对共用它们的一对杂交序列。

10.如权利要求9所述的方法，其中至少50％的邻近探针对与另一邻近探针对共用它们的一对杂交序列。

11.如权利要求10所述的方法，其中至少75％的邻近探针对与另一邻近探针对共用它们的一对杂交序列。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述基于邻近的检测测定是邻近延伸分析，其中每个邻近探针对的所述核酸结构域包含互补杂交序列，所述互补杂交序列彼此杂交以形成所述双链体；

并且其中对所述双链体进行延伸反应，所述延伸反应包括延伸所述至少一个游离3'末端以产生包含所述第一邻近探针的所述ID序列和所述第二邻近探针的所述ID序列的延伸产物。

13.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述基于邻近的检测测定是邻近连接测定，其中每个邻近探针对的所述核酸结构域包含配对杂交序列，所述配对杂交序列与所述夹板寡核苷酸杂交以形成所述双链体，并且其中步骤(iii)包括将所述第一邻近探针的所述核酸结构域直接或间接连接到所述第二邻近探针的所述核酸结构域以产生包含所述第一邻近探针的所述ID序列和所述第二邻近探针的所述ID序列的连接产物。

14.如权利要求12所述的方法，其中在每个邻近探针对中，至少一个核酸结构域是部分双链的。

15.如权利要求14所述的方法，其中在每个邻近探针对中，两个核酸结构域都是部分双链的。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述部分双链的核酸结构域包含：

(i)与所述分析物结合结构域缀合的第一寡核苷酸；和

17.如权利要求16所述的方法，其中所述杂交寡核苷酸从5'到3'包含所述第二杂交序列、所述ID序列和所述第一杂交序列，并且所述ID序列位于所述核酸结构域的所述单链部分中。

18.如权利要求16或17所述的方法，其中至少一个杂交寡核苷酸在步骤(iii)中延伸以产生延伸产物。

19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，其中在每个邻近探针对中，两个核酸结构域都是部分双链的，并且一个或两个杂交寡核苷酸在步骤(iii)中延伸以产生所述延伸产物。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述核酸结构域是DNA结构域。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，通过PCR扩增所述延伸产物或连接产物。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中通过核酸测序来检测所述延伸产物或连接产物。

23.如权利要求22所述的方法，其中在测序之前，在一个或多个扩增和/或连接步骤中将一个或多个测序适配体附接到延伸产物或连接产物。

24.如权利要求23所述的方法，其中在步骤(iv)中，将所述延伸产物或连接产物在第一PCR反应中扩增，其中将第一测序适配体添加到所述延伸产物或连接产物的一个末端；

并且将所述第一PCR反应的所述产物在第二PCR反应中扩增，其中将第二测序适配体添加到所述延伸产物或连接产物的另一末端。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述第一PCR反应用也具有3'至5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶进行，并且所述第二PCR反应用缺乏3'至5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶进行。

26.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中在测序之前，在扩增或连接步骤中将样品索引序列附接到所述延伸产物或连接产物，优选地其中在步骤(iv)中的PCR扩增期间将所述样品索引序列添加到所述延伸产物或连接产物。

27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述核酸测序是大规模平行DNA测序。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述样品是血浆或血清样品。

29.一种产品，所述产品包含：

(a)对蛋白质具有特异性的蛋白质结合结构域；和

(b)核酸结构域，

并且其中至少一对杂交序列被至少两对邻近探针共用。

30.如权利要求29所述的产品，其中所述蛋白质结合结构域是抗体或其片段。

31.如权利要求29或30所述的产品，所述产品还包含一种或多种不结合分析物的背景探针，所述背景探针包含：包含ID序列和与至少一个邻近探针共用的杂交序列的核酸结构域。

32.如权利要求29至31中任一项所述的产品，其中所述ID序列是条形码序列。

33.如权利要求29至32中任一项所述的产品，其中至少一对杂交序列对于单对邻近探针是独特的。

34.如权利要求29至33中任一项的所述产品，其中不超过10个邻近探针对共用同一对杂交序列。

35.如权利要求29至34中任一项所述的产品，其中至少75％的邻近探针对与另一邻近探针对共用它们的一对杂交序列。

36.如权利要求29至35中任一项所述的产品，其中每个邻近探针对的所述核酸结构域包含互补杂交序列，所述互补杂交序列彼此杂交以形成双链体。

37.如权利要求29至36中任一项所述的产品，其中所述邻近探针对如权利要求14至17或20中任一项所定义。