CN115671298A - 一种ros响应的抗菌药物纳米载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ROS响应的抗菌药物纳米载体及其制备方法，包括两嵌段聚合物P(PEGMA10‑co‑PBA2)‑b‑PMTEMA25，还提供基于上述纳米载体的抗菌药物载药囊泡，来提供一种同时具有ROS响应并且具有抗氧化抗炎能力的药物载体，在其作为抗菌药物载体时，能够抗菌抗炎相互协同，降低抗菌药物的给药量，同时具备与细菌有良好的粘附性，从而提高药物的生物利用度，在减少药物给药次数的基础上达到更好的抗菌治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌药物材料领域，尤其是涉及一种ROS响应的抗菌药物纳米载体及其制备方法。
背景技术
细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染。抗生素是目前细菌感染治疗的常规方法。尽管抗生素在对抗细菌性疾病方面取得了一些成功，但耐抗生素细菌数量的持续增长尤其是多重耐药菌，削弱了抗生素的疗效，导致感染性疾病的高死亡率。
炎症免疫微环境中的氧自由基的破坏机制，引起了越来越多的关注。在急性炎症反应期间，活化的吞噬细胞，如粒细胞和巨噬细胞会产生一定量的氧自由基，来杀死病原体或消化外来颗粒，起到保护作用。但当炎症不可控，持续的氧化应激、会导致持续的氧自由基释放，造成不可逆的组织和器官损伤，炎症的迁移。过高的活性氧水平会引起伤口中强烈的炎症反应，进一步恶化伤口，而单纯使用抗生素治疗细菌感染炎症，局部部位多余的活性氧可能会阻碍细菌性炎症的愈合过程，治疗效果有限。通过加大抗生素的用量也带来了抗生素耐药问题。因此，从尝试清除氧自由基，解除氧化应激破坏入手，寻找一种理想的抗菌、抗炎、抗氧化剂进行治疗。
嵌段共聚物囊泡是双亲性嵌段共聚物在溶剂中发生取向组装排列形成的中空结构，具有良好的结构稳定性及丰富的功能性，在药物释放、纳米反应器、水凝胶等领域都有广泛的应用。
现有技术中，如专利号CN114796502A公开的一种响应型水凝胶载药***，其由水凝胶基体、抗菌剂、抗炎剂构成，能够针对高ROS环境响应，可以程序性裂解并且释放包载在其中的抗菌剂、抗炎剂体系，从而实现抗菌和抗炎的作用。但是其是通过在载药体系中加入抗炎剂来实现抗炎效果。
因此本发明的目的在于，寻找一种新的具有ROS响应并且具有抗氧化抗炎效果的药物载体。
另外本发明要解决的另外一个技术问题是，在具体的应用中，细菌性角膜炎(BK)是因细菌感染而引起的化脓性角膜炎，又称细菌性角膜溃疡。病情多较危重，如果得不到有效治疗，可发生角膜溃疡穿孔，甚至眼内感染，最终眼球萎缩。角膜细菌感染的局部反应通常涉及炎症过程，其特点是炎性细胞(如巨噬细胞)的浸润、活性氧(ROS)的产生、促炎细胞因子TNF-α和IL-1β以及促炎脂质介质的积聚。氟喹诺酮类药物的单一治疗是治疗BK的首选药物。但是，由于眼部的特殊结构，眼药水的利用度不高，需要增加药物的给药次数以及药物用量，对于抗生素而言，过量的使用又会增加细菌的耐药性，不利于疾病的治疗。以及氟喹诺酮类药物在泪液pH值下的溶解度低，在施用市售眼用溶液时会发生沉淀，导致低的眼部生物利用度以及眼部刺激。所以本发明构建一种同时具有抗炎及粘附性的药物载体来输送抗生素治疗细菌性角膜炎。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种新的具有ROS响应并且具有抗氧化抗炎效果的药物载体。
为实现上述目的，本发明提供一种ROS响应的抗菌药物纳米载体，包括两嵌段聚合物P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25，所述P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25具有下式所示结构：
本发明还提供一种基于上述一种ROS响应的抗菌药物纳米载体的抗菌药物载药囊泡，还包括抗菌剂，该抗菌剂负载包裹在载药囊泡内。
在本发明一个具体的实施方式中，所述抗菌剂为氟喹诺酮类药物。
在本发明一个具体的实施方式中，所述抗菌剂为环丙沙星。
本发明另外提供上述抗菌药物载药囊泡在制备治疗细菌性眼部炎症药物的应用。
在本发明一个具体的实施方式中，所述用途为抗菌药物载药囊泡在制备治疗细菌性角膜炎药物的应用。
本发明另外提供所述ROS响应的抗菌药物纳米载体的制备方法，步骤一、制备大分子链转移剂P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA
将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、3-丙烯酰胺基苯硼酸和偶氮二异丁腈混合溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，之后将溶液在冰浴中用氮气鼓泡20-60分钟，在70℃的热浴条件下并以低速搅拌，在氮气下聚合5-10小时后，将所得溶液暴露于空气中以终止聚合，使用2000Da的透析袋在水中透析，真空冷冻干燥，得到产物大分子链转移剂P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA；
步骤二、制备嵌段聚合物P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25将步骤一制备的P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA、2-(甲硫基)甲丙烯酰酸乙酯和偶氮二异丁腈混合溶解在甲醇中，之后将溶液在冰浴中用氮气鼓泡20-60分钟，在60℃的热浴条件下并低速搅拌，在氮气下聚合10-15小时后，将所得溶液暴露于空气中以终止聚合，将产物离心后用甲醇洗涤，得到的产物真空浓缩干燥，得到两嵌段聚合物P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25。
在本发明一个具体的实施方式中，步骤一中的4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、3-丙烯酰胺基苯硼酸和偶氮二异丁腈的摩尔比为1：10：2：0.5。
在本发明一个具体的实施方式中，步骤二中的P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA、2-(甲硫基)甲丙烯酰酸乙酯和偶氮二异丁腈的摩尔比为1：25：0.5。
本发明还提供一种抗菌药物载药囊泡的制备方法，将P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25两嵌段共聚物溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，然后在连续搅拌下缓慢滴加CIP水溶液，制备得到CIP囊泡，然后将CIP囊泡分散体转移到7000Da透析袋中，并在去离子水中透析3h，除去残留的N，N-二甲基甲酰胺和游离的CIP，得到载药囊泡CIP@PPM。
本发明具有如下优点：
本发明通过提供一种ROS响应的抗菌药物纳米载体，来提供一种同时具有ROS响应并且具有抗氧化抗炎能力的药物载体，在其作为抗菌药物载体时，能够抗菌抗炎相互协同，降低抗菌药物的给药量。
本发明提供的ROS响应的抗菌药物纳米载体，还具备与细菌有良好的粘附性，从而提高药物的生物利用度，在减少药物给药次数的基础上达到更好的抗菌治疗效果。
在将本发明提供的ROS响应的抗菌药物纳米载体，应用在眼部抗炎药物的载体使用时，其增加了眼表药物的粘附性，增加了抗菌药在眼表滞留时间，同时通过改善看抗菌药物的溶解度，解决了眼部抗炎药物在眼部环境性，容易发生沉淀，刺激眼部的问题，降低抗菌药物的给药量和有效抗菌浓度。通过包覆抗生素治疗细菌性角膜炎，并且将局部部位多余的活性氧消除，促进细菌性角膜炎的愈合过程。
附图说明
图1A图为P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25的合成过程模式图，即PPM；
图1B为P(PEGMA10-co-BAA2)-b-PMTEMA25的合成过程模式图，即PAM；
图2A为P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25合成的1H核磁共振光谱图；
图2B为P(PEGMA10-co-BAA2)-b-PMTEMA25合成的1H核磁共振光谱图；
图3A为聚合物囊泡PPM和载药囊泡CIP@PPM的粒径图；
图3B为PPM和CIP@PPM的TEM和扫描电镜图；
图3C为CIP@PPM的紫外光谱图；
图3D为对照组聚合物囊泡PAM和载药囊泡CIP@PAM的粒径图；
图3E为PAM和CIP@PAM的TEM图；
图3F为CIP@PAM的紫外光谱图；
图4A为PPM和CIP@PPM的细胞毒性CCK8实验检测图；
图4B为PPM和CIP@PPM的细胞毒性活死染色；
图4C为PAM和CIP@PAM的细胞毒性CCK8实验检测图；
图5A为ABTS法评估PPM清除·OH的紫外光谱图；
图5B为通过ROS响应探针评估PPM清除细胞活性氧的荧光代表图；
图6A为H2O2刺激释放CIP抑菌圈实验的代表图；
图6B为H2O2刺激释放CIP抑菌圈实验量化分析图；
图7为负载FITC绿色荧光的PAM和PPM对细菌黏附能力比较的共聚焦3D图；
图8A为局部给药前和给药后7天的裂隙灯对比图；
图8B为给药7天后角膜组织TUNEL染色代表图；
图9为负载FITC绿色荧光的PAM和PPM对角膜渗透能力(绿色)比较和抗金黄色葡萄球菌抗体对感染角膜模型验证(红色)的共聚焦代表图；
图10A为治疗过程中的裂隙灯代表图；
图10B为角膜评分量化图；
图10C为H&E染色评估治疗七天后角膜的结构形态图；
图10D为治疗后角膜的匀浆涂板结果；
图11为IL-1β、TNF-α免疫荧光代表图；
图12为图1-11的彩色图储图的二维码。
具体实施方式
下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。
实施例1P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25的合成
将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、3-丙烯酰胺基苯硼酸和偶氮二异丁腈以摩尔比1：10：2：0.5加入玻璃瓶中，随后溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，之后将溶液在冰浴中用氮气鼓泡30分钟，将玻璃瓶放入70℃的油浴中并以200转/分的速度搅拌，在氮气下聚合6.5小时后，将玻璃瓶从油浴中取出，将所得溶液暴露于空气中以终止聚合，使用2000Da的透析袋在水中透析48小时后，真空冷冻干燥38小时，得到产物大分子链转移剂P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA。
然后，将P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA、2-(甲硫基)甲丙烯酰酸乙酯和偶氮二异丁腈以摩尔比1：25：0.5加入玻璃瓶中，随后溶解在1.85mL甲醇中，之后将溶液在冰浴中用氮气鼓泡30分钟，将玻璃瓶放入60℃的油浴中并以200转/分的速度搅拌，在氮气下聚合12小时后，将玻璃瓶从油浴中取出，将所得溶液暴露于空气中以终止聚合。将产物离心后用甲醇洗涤，得到的产物真空浓缩干燥9h，得到两嵌段聚合物P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25。其合成方法如图1A所示，其产物的1H核磁共振光谱如图2A所示，表示最终产物确为P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25。
对比例1P(PEGMA10-co-BAA2)-b-PMTEMA25的合成
将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、正丁醛苯胺缩合物和偶氮二异丁腈以摩尔比1：10：2：0.5加入玻璃瓶中，随后溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,之后将溶液在冰浴中用氮气鼓泡30分钟，将玻璃瓶放入70℃的油浴中并以200转/分的速度搅拌，在氮气下聚合6.5小时后，将玻璃瓶从油浴中取出，将所得溶液暴露于空气中以终止聚合，使用2000Da的透析袋在水中透析48小时后，真空冷冻干燥38小时，得到产物大分子链转移剂P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA。
然后，将P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA、2-(甲硫基)甲丙烯酰酸乙酯和偶氮二异丁腈以摩尔比1：25：0.5加入玻璃瓶中，随后溶解在1.85mL甲醇中，之后将溶液在冰浴中用氮气鼓泡30分钟，将玻璃瓶放入60℃的油浴中并以200转/分的速度搅拌，在氮气下聚合12小时后，将玻璃瓶从油浴中取出，将所得溶液暴露于空气中以终止聚合。将产物离心后用甲醇洗涤，得到的产物真空浓缩干燥9h，得到两嵌段聚合物P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25。其合成方法如图1B所示，其产物的1H核磁共振光谱如图2B所示，表示最终产物确为P(PEGMA10-co-BAA2)-b-PMTEMA25。
实施例2载药囊泡CIP@PPM的制备
将P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25两嵌段共聚物溶解在偶氮二异丁腈中，然后在连续搅拌下缓慢滴加环丙沙星(CIP)水溶液，得到CIP囊泡，然后将CIP囊泡分散体转移到7000Da透析袋中，并在去离子水中透析3h，每半小时更换一次透析液以除去残留的偶氮二异丁腈和游离的环丙沙星(CIP)，得到载药囊泡CIP@PPM。
对比例2载药囊泡CIP@PAM的制备
将P(PEGMA10-co-BAA2)-b-PMTEMA25两嵌段共聚物溶解在偶氮二异丁腈中，然后在连续搅拌下缓慢滴加环丙沙星(CIP)水溶液，得到CIP囊泡，然后将CIP囊泡分散体转移到7000Da透析袋中，并在去离子水中透析3h，每半小时更换一次透析液以除去残留的偶氮二异丁腈和游离的环丙沙星(CIP)，得到载药囊泡CIP@PAM。
实施例3实施例实施例1-2PPM,CIP@PPM和对比例1-2制备的PAM,CIP@PAM的的理化性质
采用动态光散射仪测定的PPM,PAM的流体动力学直径(Dh)和分散指数(PDI)，如图3所示，动态光散射测量(DLS)结果显示PPM和PAM的流体动力学直径(Dh)为203.6nm(图3A)和210.2nm(图3C)，PPM和PAM的形态通过透射电子显微镜(TEM)得到证实(图3B，图3D)。透射电镜观察到的PPM和PAM的大小与DLS的研究一致。PPM,CIP@PPM的分散指数(PDI)为0.042(图3A)和0.033nm(图C)，表明载药颗粒均匀性良好。如图3A所示，CIP@PPM的大小(大小分布)为247.1(0.002)。与相应的空白囊泡(PPM)相比，载有CIP的囊泡的尺寸更大是由于药物的包封。TEM结果显示，CIP-PPM仍为囊泡，但与PPM相比，中间有药物负载。SEM结果还显示，由于干燥状态下纳米粒子的囊泡形态，CIP@PPM会收缩。实验还证明了纳米粒子呈囊泡状，其粒径与DLS结果一致。利用紫外光谱法证明了药物的成功包载，以及mapping也有观察到囊泡内部的CIP所含的F元素信号，图3E、F所示。
实施例4实施例1和实施例2制备的PPM,CIP@PPM的细胞毒性
对数生长期的细胞HCECs作为靶细胞(T)；以E∶T为10∶1的比例分别接种于96细胞板中，加入梯度稀释的PPM或CIP@PPM，37℃孵育48h，使用EnhancedCellCountingKit-8试剂盒(CCK-8，Beyotime)和Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(Beyotime)对比分析PPM,CIP@PPM的细胞毒性。结果如图4A、C所示，4A图中细胞活率均在85％以上，图4B中95％以上都是活细胞(绿色)，说明PPM或CIP@PPM对细胞均无毒性。
采用相同的方法对对比例1和对比例2的PAM,CIP@PAM的生物相容性进行评估，结果如图4C所示，细胞活率均在85％以上，说明对细胞无毒性。
实施例5PPM的ROS清除效果
通过ABTS测定PPM对OH·的清除效果来衡量PPM的抗氧化能力。用紫外-可见光见分光光度计在730nm处测量吸光度。结果如图5A所示，PPM具有抗氧化能力。
HCECs接种于96孔中，细胞密度为5×103个/孔。细胞孵育24小时后，更换成含有300μM过氧化氢的无FBS的DMEM-F12培养基，以模拟一个高活性氧环境。以正常条件培养的HCECs作为对照组。然后，在孔中加入30μg/mLPPM和CIP@PPM孵育24小时，根据制造商的说明，使用CM-H2DCFDA(Invitrogen)测量细胞内ROS水平，图5B中可以看出PPM组活性氧荧光强度降低，说明PPM具有清除ROS效果。
实施例6CIP@PPM的ROS靶向性
将5mm的无菌滤纸片浸泡在含有不同材料的溶液中4小时后备用，分别是PBS、H2O2、CIP、PAM、PPM、CIP@PPM、CIP@PAM、CI P@PPM+H2O2、CIP@PAM+H2O2处理，其中CIP的含量几乎一致。金黄色葡萄球菌单菌落在TSB培养基中培养7小时，将细菌培养液加入灭菌后冷却至合适温度的TSA培养基中，然后将20mL含菌TSA培养基倒入细菌培养皿中。待含菌TSA培养基完全冷却凝固后，将其平均分为四份，然后将每个组的载药滤纸片放在含菌培养基上，37℃恒温培养24小时后拍照观察抑菌圈的大小。
结果如图6所示，高H2O2浓度可促进CIP@PPM、CIP@PAM颗粒释放CIP加速，说明CIP@PPM具有ROS靶向性。
实施例7PPM的细菌粘附性
将500μL金黄色葡萄球菌悬浮液(约108CFU/mL)与24孔板中的500μLFITC@PPM或者FITC@PAM溶液混合，并在37℃振荡器中孵育过夜。9000g离心10min，使用1mLPBS悬浮细胞，然后，使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液进行细菌染色，黑暗中静置15分钟后将染色后的菌液治愈载玻片上并封片。使用激光共聚焦显微镜进一步观察，结果如图7共聚焦3D图所示，PPM组中PPM(绿色)和细菌(蓝色)重合的比率明显高于PBM组，说明PPM对于细菌有很好的粘附性。
实施例8细菌性角膜炎动物模型的构建
本研究所使用的实验动物为6-8周龄、雌性C57BL/6j小鼠30只。实验动物均由温州医科大学实验动物中心提供，经过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准。小鼠饲养于智能环境控制***下(相对湿度30±5％，风速2.1±0.2m/s，温度21-23℃)，实验分组共有5组，每组6只。
模型构建：麻醉后的小鼠用无菌手术刀将标角膜刮至浅层基质层，角膜损伤1mm左右。使用浓度为3-5×108CFU/mL金黄色葡萄球菌用于感染。在加入细菌悬液后的24小时内，小鼠没有受到干扰而促进细菌性角膜炎的形成。
实验随机分为六组:阴性对照组(PBS组)、阳性对照组(CIP组)、对照实验组(PPM、PAM、CIP@PAM)、实验组(CIP@PPM组)。每只小鼠每天滴入10μL治疗药物于眼中，5μL/眼(每天两次)，持续一周。通过测定CIP@PAM、CIP@PPM组的CIP含量，给予CIP@PAM、CIP@PPM组和CIP组几乎相同剂量的CIP。
实施例9PPM、PAM、CIP@PAM、CIP@PPM的动物实验的生物相容性
为了验证纳米载药颗粒对角膜的影响，眼部局部分别给药PPM、PAM、CIP@PAM、CIP@PPM，每天给药3次(5μL/眼)，持续一周。在自然光下使用裂隙灯显微镜检查角膜健康。随后，用荧光素钠对角膜进行染色，并用裂隙灯显微镜在钴蓝光下检查角膜上皮缺损，以评估上皮缺损的程度。苏木精-伊红(H&E)染色用于观察各组小鼠角膜、虹膜和巩膜的组织切片进行染色的病理变化。按照一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)的说明检测角膜中的凋亡。裂隙灯检查提示角膜光滑透明，无充血、角膜混浊。荧光染色后，角膜上皮完整，未染色(图8A)。角膜内几乎未见凋亡细胞(8B图)，说明PPM、PA M、CIP@PAM、CIP@PPM具有良好的生物相容性。
实施例10PPM、PAM的在细菌性角膜炎模型中对细菌的粘附性能
为了评估局部给药后载有FITC的药物载体在角膜中的穿透和持久性，每10分钟将10μL试剂滴入动物眼中，5μL/眼。在局部给药后4小时，将角膜组织与抗金黄色葡萄球菌的特异性抗体(Abcam)和Cy3-缀合的山羊抗兔二抗(proteintech)在37℃下连续孵育1小时。使用共聚焦激光扫描显微镜观察了给药后4小时FITC@PAM或FITC@PPM在金黄色葡萄球菌感染角膜中的分布。图9可见红色荧光信号在角膜内清晰分布，反映了金黄色葡萄球菌细胞的存在，证明了细菌性角膜炎模型的成功。此外，局部给药4h后，基于PBA的FITC@PPM粘附功能优于CIP@PAM的粘附作用，甚至部分纳米粒子已经穿透上皮并进入基质，具有良好的体内角膜渗透能力。
实施例11载药囊泡对细菌性角膜炎的治疗效果
分别采用CIP、PAM、PPM、CIP@PPM、CIP@PAM治疗细菌性角膜炎模型，每只小鼠每天滴入10μL治疗药物于眼中，5μL/眼(每天两次)，持续一周。提取角膜组织并匀浆，通过在TSB平板上涂布来确定残留细菌的数量。如图10C所示，CIP@PPM组的CFU计数比PBS和PAM组低得多(p<0.01)，表明局部应用CIP@PPM具有显著的抗菌效果，并比单独使用CIP更显著。为了观察CIP@PPM对细菌感染角膜的促进愈合作用，在治疗7天后拍摄了角膜混浊的代表性图像。同时记录角膜混浊评分，从定量角度进一步判定促进愈合的疗效。如图10A、B所示，角膜混浊CIP@PPM组评分显著低于PBS组和PAM组(P<0.05)，且略小于CIP、PPM、CIP@PAM组，提示CIP@PPM能显著降低角膜混浊，是抗感染的最佳治疗效果。H&E染色的结果显示在图10C中。在PBS和PAM组中，观察到异常的角膜结构，如角膜水肿和增厚，以及大量浸润的炎性细胞。其次，PPM组角膜中央也有水肿性异常结构和少量炎性细胞浸润。但在CIP、CIP@PPM和CIP@PAM中，角膜水肿消退，角膜结构基本恢复正常，纤维基质层排列整齐，其中CIP@PPM中，纤维基质层更加整齐并且角膜水肿异常结构更加少。
实施例12载药囊泡对细菌性角膜炎的炎症因子的影响
通过免疫荧光染色实验评价炎性因子(TNF-α和IL-1β)在角膜中的表达和定位。脱蜡后的切片先使用抗原修复液修复，为了减少非特异性反应，用含3％牛血清白蛋白的PBS溶液处理。然后，用含有抗IL-6单克隆抗体和抗TNF-α多克隆抗体的溶液处理样品。将样品与FITC结合的TNF-α山羊抗兔IgGpAbs(绿色)和Cy3结合的IL-1β山羊抗小鼠IgGpAbs(红色)在37℃下孵育1小时。最后，将组织与稀释的DAPI在室温下孵育，并通过荧光显微镜(LSM880NLOwithAiryScan)观察。结果如图11所示，在PBS和PAM组中，TNF-α水平(绿色荧光)均匀分布在角膜上皮和基质中，而在PPM、CIP@PAM和CIP处理的角膜基质中几乎不表达。在PBS、PAM、PPM和CIP组中，IL-1β(红色荧光)在角膜中表达。使用PPM、CIP@PAM和CIP@PPM治疗后，这两种炎性因子的荧光强度显著降低。在CIP@PPM中观察到的荧光强度最低，只有一点带红色和绿色。因此，CIP@PPM可进一步降低炎性因子的强度并抑制炎性因子的分泌。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种ROS响应的抗菌药物纳米载体，其特征在于：包括两嵌段聚合物P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25，所述P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25具有下式所示结构：
2.一种抗菌药物载药囊泡，其特征在于，包括权利要求1所述的ROS响应的抗菌药物纳米载体和抗菌剂。
3.根据权利要求2所述的一种抗菌药物载药囊泡，其特征在于，所述抗菌剂为氟喹诺酮类药物。
4.根据权利要求3所述的一种抗菌药物载药囊泡，其特征在于，所述抗菌剂为环丙沙星。
5.一种权利要求2-4任意一项所述的抗菌药物载药囊泡的用途，其特征在于：所述用途为抗菌药物载药囊泡在制备治疗细菌性眼部炎症药物的应用。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述用途为抗菌药物载药囊泡在制备治疗细菌性角膜炎药物的应用。
7.权利要求1所述的ROS响应的抗菌药物纳米载体的制备方法，其特征在于：
步骤一、制备大分子链转移剂P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA
将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、3-丙烯酰胺基苯硼酸和偶氮二异丁腈混合溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，之后将溶液在冰浴中用氮气鼓泡20-60分钟，在70℃的热浴条件下并以低速搅拌，在氮气下聚合5-10小时后，将所得溶液暴露于空气中以终止聚合，使用2000Da的透析袋在水中透析，真空冷冻干燥，得到产物大分子链转移剂P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA；
步骤二、制备嵌段聚合物P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25将步骤一制备的P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA、2-(甲硫基)甲丙烯酰酸乙酯和偶氮二异丁腈混合溶解在甲醇中，之后将溶液在冰浴中用氮气鼓泡20-60分钟，在60℃的热浴条件下并低速搅拌，在氮气下聚合10-15小时后，将所得溶液暴露于空气中以终止聚合，将产物离心后用甲醇洗涤，得到的产物真空浓缩干燥，得到两嵌段聚合物P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25。
8.根据权利要求7的一种ROS响应的抗菌药物纳米载体的制备方法，其特征在于：步骤一中的4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、3-丙烯酰胺基苯硼酸和偶氮二异丁腈的摩尔比为1：10：2：0.5。
9.根据权利要求7的一种ROS响应的抗菌药物纳米载体的制备方法，其特征在于：步骤二中的P(PEGMA10-co-PBA2)-CTA、2-(甲硫基)甲丙烯酰酸乙酯和偶氮二异丁腈的摩尔比为1：25：0.5。
10.权利要求2-4任意一项所述的抗菌药物载药囊泡的制备方法，其特征在于：将P(PEGMA10-co-PBA2)-b-PMTEMA25两嵌段共聚物溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后在连续搅拌下缓慢滴加CIP水溶液，制备得到CIP囊泡，然后将CIP囊泡分散体转移到7000Da透析袋中，并在去离子水中透析3h，除去残留的N,N-二甲基甲酰胺和游离的CIP，得到载药囊泡CIP@PPM。
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