CN115667314A - T细胞双特异性结合蛋白 - Google Patents

T细胞双特异性结合蛋白 Download PDF

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Abstract

本文提供了可用于T细胞介导的表达HSC抗原的造血干细胞(HSC)，例如CD117+细胞耗竭以及用于治疗各种造血疾病、代谢病症、癌症(例如，急性髓性白血病(AML))和自身免疫疾病等的组合物和方法。本文描述了双特异性结合多肽及其双特异性抗原结合部分，所述多肽及其部分包含针对T细胞抗原(诸如CD3)的第一结合部分和针对HSC抗原(诸如CD117)的第二结合部分。

Description

T细胞双特异性结合蛋白
相关申请
本申请要求2020年3月16日提交的美国临时申请号62/990,281的优先权。前述优先权申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式通过电子方式提交并且特此以全文引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2021年3月16日，命名为M103034_2210WO_Sequence_Listing.txt并且大小为56,311字节。
发明领域
本发明涉及T细胞双特异性结合蛋白，诸如抗CD3双特异性抗体，介导免疫驱动的靶细胞(包括在HSC细胞上表达的抗原)耗竭的用途。本发明进一步涉及抗CD117双特异性结合蛋白或其片段、其组合物及用途，所述蛋白或其片段包含结合至造血细胞(诸如造血干细胞)表面上表达的抗原的第一结合结构域和结合至T细胞的第二结合结构域。
发明背景
选择性细胞耗竭具有用于许多疗法的治疗潜力，包括干细胞移植的调理、自身免疫疾病的治疗和某些癌症的治疗。举例来说，B细胞耗竭疗法可以用于治疗某些自身免疫疾患(Lee等(2020)Nature Reviews Drug Discovery,第20卷,第179-199页)。
调理是使患者做好准备(即，“调理”)以接受含有造血干细胞的移植物的过程。调理程序由此促进造血干细胞移植物的植入。在植入之前进行调理以便为患者接受移植创建适当的条件(例如，创建干细胞生态位)。此外，在一些情况下，移植细胞的20％植入可以缓解或治愈特定疾病状态。
当前在造血干细胞疗法(HSCT)适应症和血红蛋白病中使用了许多非特异性(即，非靶向)调理方法，包括但不限于使用照射(例如，全身照射(TBI))和DNA烷化剂/修饰剂，这两者不仅对患者的许多器官***具有高毒性，而且还影响造血和非造血细胞以及造血微环境。这些苛刻的调理方案通常会破坏接受体患者的免疫***和生态位细胞，这在许多情况下可能导致危及生命的并发症。
因此，需要开发选择性地使靶组织中的内源性造血干细胞群体耗竭，同时避免前述非特异性调理方法的不良毒性的温和调理方案。通过靶向在HSC上表达的某些分子(包括例如CD117)可以促进干细胞(诸如HSC)的耗竭。
CD117(也称作c-kit或干细胞因子受体(SCRF))是结合配体干细胞因子(SCF)的单一跨膜受体酪氨酸激酶。SCF诱导cKIT的同源二聚化，激活其酪氨酸激酶活性并通过PI3-AKT和MAPK途径发信号(Kindblom等,Am J.Path.1998 152(5):1259)。CD117最初作为癌基因被发现并且已经在肿瘤学领域中进行了研究(参见例如Stankov等(2014)Curr PharmDes.20(17):2849-80)。CD117在造血干细胞(HSC)上高度表达。这种表达模式使CD117成为调理多种疾病的潜在靶标。然而，仍然需要基于抗CD117的疗法，所述疗法有效调理患者以进行移植，诸如骨髓移植。
当前需要靶向干细胞，例如CD117+干细胞的替代方法和组合物，所述组合物可以用作调理剂以促进外源性干细胞的植入。此类疗法和药剂也可用于治疗选择性细胞耗竭将具有治疗性的其它疾病。
发明内容
本文描述了与介导免疫驱动的靶细胞耗竭的T细胞双特异性结合蛋白有关的方法和组合物。在某些实施方案中，本文所公开的方法和组合物涉及CD3双特异性结合蛋白，诸如双特异性抗体，所述双特异性结合蛋白还结合至干细胞，诸如造血干细胞(HSC)上表达的靶抗原。本文所公开的组合物和方法的优点是双特异性剂使用T细胞使靶细胞耗竭并减少或消除对细胞耗竭的非特异性方法，诸如化学疗法或照射的需要。
在一个方面，本文描述了包含以下的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段：结合至造血细胞，诸如造血干细胞的表面上表达的抗原(即，人类CD117；也称为c-kit)的第一结合结构域，和结合至免疫细胞，诸如T细胞的表面上表达的抗原(例如，CD3)的第二结合结构域，以及使用所述双特异性结合蛋白的组合物和方法。
在一个方面，本公开提供了一种双特异性结合多肽，所述双特异性结合多肽具有结合至造血干细胞(HSC)或造血祖细胞上表达的CD117的第一抗原结合部分；和结合至T细胞上表达的抗原的第二抗原结合部分。在一个实施方案中，第一抗原结合部分来源于抗CD117抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，第一抗原结合部分包含单链可变片段(scFv)。在又一个实施方案中，第一抗原结合部分选自由Fab、Fab'、二-scFv、串联二-scFv、三-scFv、串联三-scFv、Fv、二硫键连接的Fv、DART、单结构域抗体(sdAb)、双链抗体、串联双链抗体、三链抗体和串联三链抗体组成的组。在另一个实施方案中，第一抗原结合部分包含抗CD117 scFv。
在其它实施方案中，抗CD117 scFv包含(i)包含具有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，并且包含有包含具有分别如SEQ IDNO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或(ii)包含如SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(iii)包含具有分别如SEQ ID NO:21、22和23所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，并且包含有包含具有分别如SEQ ID NO:24、25和26所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或(iv)包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，双特异性抗CD3/CD117抗体包含如表4中所描述的抗CD117抗体和抗CD3抗体氨基酸序列中所描述的结合区(例如，VH和VL；或VH和VL CDR)。
在某些其它实施方案中，第二抗原结合部分来源于抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，第二抗原结合部分包含单链可变片段(scFv)。在另一个实施方案中，第二抗原结合部分选自由Fab、Fab'、二-scFv、串联二-scFv、三-scFv、串联三-scFv、Fv、DART、二硫键连接的Fv、单结构域抗体(sdAb)、双链抗体、串联双链抗体、三链抗体和串联三链抗体组成的组。在又一个实施方案中，免疫细胞上表达的抗原是CD3。在一些实施方案中，CD3由选自由CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)和CD3Z(CD3ζ)组成的组的基因编码。在其它实施方案中，第二抗原结合部分包含抗CD3 scFv。
在其它实施方案中，抗CD3 scFv包含如SEQ ID NO:37所示的抗CD117 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:38所示的抗CD117 VL氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第一抗原结合部分包含第一单链可变片段(scFv)并且其中第二抗原结合部分包含第二scFv。在又一个实施方案中，双特异性结合多肽是包含第一scFv和第二scFv的串联单链可变片段(ta-scFv)。在某些其它实施方案中，第一scFv和第二scFv通过连接子连接。在一些实施方案中，第一scFv是抗CD117 scFv并且其中第二scFv是抗CD3 scFv。
在某些实施方案中，抗CD117 scFv包含(i)包含具有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，并且包含有包含具有分别如SEQ IDNO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或(ii)包含如SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(iii)包含具有分别如SEQ ID NO:21、22和23所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，并且包含有包含具有分别如SEQ ID NO:24、25和26所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或(iv)包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另外的实施方案中，抗CD3 scFv包含如SEQ ID NO:37所示的抗CD117 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:38所示的抗CD117 VL氨基酸序列。
在某些其它实施方案中，双特异性结合多肽具有包含能够稳定缔合的第一Fc结构域和第二Fc结构域的Fc区。在一些实施方案中，Fc区是选自由IgG、IgA、IgM、IgD和IgE组成的组的同种型。在其它实施方案中，IgG是IgG1或IgG4。在其它实施方案中，Fc区相对于野生型Fc区在位置L234、L235(EU索引)和D265(EU索引)处包含氨基酸取代。在一个实施方案中，在位置L234处的氨基酸取代是L234A。在另一个实施方案中，在位置L235处的氨基酸取代是L235A。在又一个实施方案中，双特异性结合多肽是双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物具有治疗有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗人类患者的干细胞病症的方法，所述方法是通过向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗人类患者的免疫缺陷病症的方法，所述方法是通过向所述患者施用治疗有效量的如本文所描述的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在一些实施方案中，免疫缺陷病症是先天性免疫缺陷或获得性免疫缺陷。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗人类患者的代谢病症的方法，所述方法是通过向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在一个实施方案中，代谢病症选自由糖原贮积病、粘多糖贮积症、高歇氏病(Gaucher's Disease)、赫尔勒氏病(Hurlers Disease)、鞘脂贮积症和异染性脑白质营养不良组成的组。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗人类患者的自身免疫病症的方法，所述方法是通过向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在一个实施方案中，自身免疫病症选自由以下组成的组：多发性硬化症、人类全身性狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病、治疗牛皮癣、1型糖尿病、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病(Addison's disease)、普秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫内耳病、自身免疫淋巴增生综合征、自身免疫***、巴娄病(Balo disease)、***(Behcet's disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、恰加斯氏病(Chagas'disease)、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、疤痕性类天疱疮、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、冷凝集素病、CREST综合征、德戈斯病(Degos disease)、盘状狼疮、自主神经异常、子宫内膜异位、原发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、格雷夫氏病(Grave's disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、化脓性汗腺炎、特发性和/或急性血小板减少性紫癜、特发性肺纤维化、IgA神经病、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、川崎氏病(Kawasaki's disease)、扁平苔癣、莱姆病(Lyme disease)、梅尼埃病(Meniere disease)、混合性***病、重症肌无力、神经性肌强直、眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、沃德氏甲状腺炎(Ord's thyroiditis)、寻常天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多肌炎和皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、结节性多动脉炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、原发性无丙种球蛋白血症、雷诺现象(Raynaud phenomenon)、莱特尔氏综合征(Reiter'ssyndrome)、风湿热、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征(
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syndrome)、僵人综合征、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、外阴痛和韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗人类患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在一个实施方案中，癌症选自由白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和成神经细胞瘤组成的组。
在另一个方面，本公开提供了一种使人类患者中的干细胞群体耗竭的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在一个实施方案中，所述方法涉及向患者施用包含造血干细胞的移植物。
本文包括一种双特异性结合多肽，所述双特异性结合多肽包含结合至造血干细胞(HSC)或造血祖细胞上表达的CD117的第一抗原结合部分；和结合至T细胞上表达的抗原的第二抗原结合部分。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分结合至CD3。
在一个实施方案中，第一抗原结合部分包含抗CD117单链可变片段(scFv)并且第二抗原结合部分包含抗CD3 scFv。
在一个实施方案中，双特异性结合多肽是双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗CD117结合部分包含有包含具有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区和包含具有分别如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗CD117结合部分包含有包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗CD117结合部分包含有包含具有分别如SEQ ID NO:21、22和23所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区和包含具有分别如SEQ ID NO:24、25和26所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗CD117结合部分包含有包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗CD3结合部分包含有包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗CD3结合部分包含有包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区。
本文还公开了包含CD117结合区和CD3结合区的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中所述CD117结合区包含有包含具有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，和包含具有分别如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区；包含具有分别如SEQ IDNO:21、22和23所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，和包含具有分别如SEQID NO:24、25和26所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或包含如SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分的CD3结合区包含(i)如SEQ ID NO:37所示的抗CD117 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:38所示的抗CD117 VL氨基酸序列；或(ii)包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ IDNO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分包含有包含第一重链的第一CH3区和第二重链的第二CH3区的Fc区，其中所述第一CH3区和所述第二CH3区能够通过杵臼相互作用稳定缔合。
在一个实施方案中，双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分是选自由IgG(例如，IgG1或IgG4)、IgA、IgM、IgD和IgE组成的组的同种型。
在一个实施方案中，双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分的Fc区相对于野生型Fc区在位置L234、L235、H435或它们的组合(EU索引)处包含一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，在位置L234处的氨基酸取代是L234A。在一个实施方案中，在位置L235处的氨基酸取代是L235A。在一个实施方案中，在位置H435处的氨基酸取代是H435A。
在某些实施方案中，双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分包含在位置T366、L368和Y407(EU索引)处包含氨基酸取代的第一CH3区，和在位置T366(EU索引)处包含氨基酸取代的第二CH3区。在一个实施方案中，在位置T366处的氨基酸取代是T366S。在一个实施方案中，在位置L368处的氨基酸取代是L368A。在一个实施方案中，在位置Y407处的氨基酸取代是Y407V或Y407T。在一个实施方案中，在位置T366处的氨基酸取代是T366W或T366Y。
还公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
其它实施方案包括一种治疗人类患者的干细胞病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
其它实施方案包括一种治疗人类患者的免疫缺陷病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在一个实施方案中，免疫缺陷病症是先天性免疫缺陷或获得性免疫缺陷。
另一个实施方案包括一种治疗人类患者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在一个实施方案中，代谢病症选自由糖原贮积病、粘多糖贮积症、高歇氏病、赫尔勒氏病、鞘脂贮积症和异染性脑白质营养不良组成的组。
又一个实施方案包括一种治疗人类患者的自身免疫病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。自身免疫病症的实例包括多发性硬化症、人类全身性狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病、治疗牛皮癣、1型糖尿病、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病、普秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫内耳病、自身免疫淋巴增生综合征、自身免疫***、巴娄病、***、大疱性类天疱疮、心肌病、恰加斯氏病、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、克罗恩氏病、疤痕性类天疱疮、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、冷凝集素病、CREST综合征、德戈斯病、盘状狼疮、自主神经异常、子宫内膜异位、原发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、特发性和/或急性血小板减少性紫癜、特发性肺纤维化、IgA神经病、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、川崎氏病、扁平苔癣、莱姆病、梅尼埃病、混合性***病、重症肌无力、神经性肌强直、眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、沃德氏甲状腺炎、寻常天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多肌炎和皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、结节性多动脉炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、原发性无丙种球蛋白血症、雷诺现象、莱特尔氏综合征、风湿热、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、僵人综合征、高安氏动脉炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、外阴痛或韦格纳氏肉芽肿病。
又一个实施方案包括一种治疗人类患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在一个实施方案中，癌症选自由白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和成神经细胞瘤组成的组。
又一个实施方案包括一种使人类患者中的干细胞群体耗竭的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如本文所公开的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。在某些实施方案中，所述方法还包括向患者施用包含造血干细胞的移植物。
本文还包括一种选择性地使有需要的人类患者中的造血干细胞(HSC)耗竭的方法，所述方法包括向有需要的人类受试者施用双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，以使HSC耗竭，其中所述双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分包含特异性结合至人类HSC细胞表面抗原的第一结合部分并且包含特异性结合至人类T细胞表面抗原的第二结合部分。在一个实施方案中，第一抗原结合部分结合至选自由以下组成的组的人类HSC细胞表面抗原：CD7、CDwl2、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD117、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349和CD350。在某些实施方案中，第一抗原结合部分结合至CD117。在某些实施方案中，第二抗原结合部分结合至人类CD3。
在一个实施方案中，第一抗原结合部分结合至CD117，并且其中所述第一抗原结合部分包含(i)包含具有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，并且包含有包含具有分别如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或(ii)包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(iii)包含具有分别如SEQ IDNO:21、22和23所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，并且包含有包含具有分别如SEQ ID NO:24、25和26所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或(iv)包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，第二抗原结合部分结合至CD3，并且其中所述第二抗原结合部分包含(i)包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段是IgG，例如，IgG1或IgG4。
在某些实施方案中，双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段包含有包含第一重链的第一CH3区的Fc区，并且包含第二重链的第二CH3区，其中所述第一CH3区和所述第二CH3区能够通过杵臼相互作用稳定缔合。在一个实施方案中，第一CH3区在位置T366、L368和Y407(EU索引)处包含氨基酸取代，并且第二CH3区在位置T366(EU索引)处包含氨基酸取代。在一个实施方案中，在位置T366处的氨基酸取代是T366S。在一个实施方案中，在位置L368处的氨基酸取代是L368A。在一个实施方案中，在位置Y407处的氨基酸取代是Y407V或Y407T。在一个实施方案中，在位置T366处的氨基酸取代是T366W或T366Y。
在一个实施方案中，患者患有干细胞病症并且需要移植。在一个实施方案中，所述方法还包括在耗竭后向患者施用HSC移植物。
在一个实施方案中，患者患有免疫缺陷病症、代谢病症、自身免疫病症或癌症。
附图说明
图1以图形方式描绘了使用表达CD117的靶细胞(Kasumi-1细胞)，对于抗CD117/CD3双特异性抗体(即，“bs-Ab-1”)与具有一个非靶向臂和一个靶向臂(即，CD3或CD117靶向臂)的抗体对照相比的体外细胞杀伤测定的结果。对照抗体在图1中称作“抗CD117同种型抗体”和“抗CD3同种型抗体”。
图2以图形方式描述了使用原代人类造血干细胞，对于bs-Ab-1双特异性抗体与具有一个非靶向臂和一个靶向臂(即，CD3或CD117靶向臂)的抗体对照相比的体外细胞杀伤测定的结果。对照在图2中称作“抗CD117同种型抗体”和“抗CD3同种型抗体”。
图3A至3D以图形方式描绘了显示bs-Ab-1双特异性抗体选择性地使人源化NSG小鼠中的人类HSC耗竭的体内细胞耗竭测定的结果。图3A示出了在用各种浓度的单剂量的以下各物处理的小鼠中21天后维持的CD34+细胞的频率(％)：(i)bs-Ab-1双特异性抗体，(ii)抗CD117同种型抗体，(iii)抗CD3同种型抗体，(iv)抗CD117同种型抗体和抗CD3同种型抗体的组合，以及(v)对照(即，“PBS”)。图3B示出了在用各种浓度的单剂量的以下各物处理的小鼠中21天后维持的CD34+细胞的绝对数目：(i)bs-Ab-1双特异性抗体，(ii)抗CD117同种型抗体，(iii)抗CD3同种型抗体，(iv)抗CD117同种型抗体和抗CD3同种型抗体的组合，以及(v)对照(即，“PBS”)。图3C示出了在用各种浓度的单剂量的以下各物处理的小鼠中21天后维持的CD34+CD117+细胞的频率(％)：(i)bs-Ab-1双特异性抗体，(ii)抗CD117同种型抗体，(iii)抗CD3同种型抗体，(iv)抗CD117同种型抗体和抗CD3同种型抗体的组合，以及(v)对照(即，“PBS”)。图3D示出了在用各种浓度的单剂量的以下各物处理的小鼠中21天后维持的CD34+CD117+细胞的绝对数目：(i)bs-Ab-1双特异性抗体，(ii)抗CD117同种型抗体，(iii)抗CD3同种型抗体，(iv)抗CD117同种型抗体和抗CD3同种型抗体的组合，以及(v)对照(即，“PBS”)。如上文所描述，抗CD3同种型抗体和抗CD117同种型抗体是指具有CD3或CD117靶向臂和非靶向臂的对照抗体。
图4以图形方式描绘了使用原代人类干细胞，对于bs-Ab-2双特异性抗体和bs-Ab-3双特异性抗体与以下各物比较的体外细胞杀伤测定的结果：(i)Ab85同种型抗体(即，具有Ab85的CD117靶向臂(具有T366Y和H435A氨基酸取代)和非靶向臂(具有Y407T和H435A氨基酸取代)的抗体，在图4中称作“Ab85同种型”)和抗CD3同种型抗体(即，具有Ab2的CD3靶向臂(具有Y407T和H435A氨基酸取代)和非靶向臂(具有T366Y和H435A氨基酸取代)的抗体；在图4中称作“抗CD3同种型”)的组合；以及(ii)Ab67同种型(即，具有Ab67的CD117靶向臂(具有T366Y和H435A氨基酸取代)和非靶向臂(具有Y407T和H435A氨基酸取代)的抗体；在图4中称作“Ab65同种型”)和抗CD3同种型抗体(即，具有Ab2的CD3靶向臂(具有Y407T和H435A氨基酸取代)和非靶向臂(具有T366Y和H435A氨基酸取代)的抗体；在图4中称作“抗CD3同种型”)的组合。
图5提供了可以用于介导免疫驱动的靶细胞耗竭的T细胞双特异性抗体的示意图。图5中的双特异性抗体具有结合至CD3的T细胞结合臂(重链和轻链)和结合至CD117的靶细胞(例如，HSC)结合臂(重链和轻链)。
具体实施方式
本文描述了可以用于通过T细胞介导细胞耗竭的双特异性剂。本文所公开的方法和组合物使用由T细胞特异性双特异性蛋白结合的T细胞以使靶细胞耗竭，其中靶标由双特异性蛋白的第二臂界定。举例来说，双特异性剂可以靶向CD3(T细胞抗原)和CD117(HSC靶抗原)。因此，本文包括与结合至人类CD117和人类CD3的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段有关的方法和组合物。
一般来说，本文所公开的HSC和CD3靶向双特异性蛋白，例如本文所提供的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段具有许多特征，使得它们有利于疗法，包括调理人类患者以进行干细胞移植的方法。这些特征还使得本文所公开的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段有利于用于治疗罹患各种病态，诸如血液疾病、代谢病症、癌症和自身免疫疾病等的患者的方法。
本公开提供了结合至人类CD117的胞外域并结合至T细胞表面上的人类CD3的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段。下文描述了本文所鉴定的分离的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段的某些实施方案的结合区。
本文所公开的HSC和CD3靶向双特异性蛋白(例如，本文所描述的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段)可以用于治疗多种病症，诸如造血谱系中的细胞类型的疾病、癌症、自身免疫疾病、代谢病症和干细胞病症等的方法。本文所描述的组合物和方法可以(i)直接使引起病态的细胞群体，诸如癌细胞(例如，白血病细胞)和自身免疫细胞(例如，自身反应性T细胞)群体耗竭，和/或(ii)使内源性造血干细胞群体耗竭，从而通过提供移植的细胞可以归巢的生态位来促进移植的造血干细胞的植入。前述活性可以通过施用例如抗CD117双特异性结合蛋白或其片段来达成，所述蛋白或其片段能够结合由造血干细胞(或内源性致病细胞)表达的抗原(即，CD117)和由免疫细胞，诸如T细胞表达的抗原(例如，CD3)。在直接治疗疾病的情况下，这种施用可以促成引起所关注的病态的细胞的数量减少。在为患者准备造血干细胞移植疗法的情况下，这种施用可以促成内源性造血干细胞群体的选择性耗竭，从而在造血组织，诸如骨髓中创造空缺，随后被移植的外源性造血干细胞填补。本发明部分地基于以下发现：可以向患者施用能够结合CD117(诸如GNNK+CD117)和CD3的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段以影响上述两种活性。可以向罹患癌症或自身免疫疾病的患者施用结合CD117和CD3的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段以直接使癌细胞或自身免疫细胞群体耗竭，并且也可以向需要造血干细胞移植疗法的患者施用以促进移植的造血干细胞的存活和植入潜力。
归因于施用结合至CD3和抗HSC抗原的双特异性结合蛋白，例如，抗CD117双特异性结合蛋白或其片段，造血干细胞移植物的植入可以在多种经验测量中体现。举例来说，可以通过评估在施用例如能够结合CD117和CD3的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段并且随后施用造血干细胞移植物之后患者骨髓内存在的竞争性再植单位(CRU)的数量来评价移植的造血干细胞的植入。另外，可以通过将报告基因，诸如催化化学反应产生荧光、发色或发光产物的酶掺入已经转染供体造血干细胞的载体中并且随后监测造血干细胞已经归巢的组织(诸如骨髓)中的相应信号来观察造血干细胞移植物的植入。还可以通过评价造血干细胞和祖细胞的数量和存活率来观察造血干细胞植入，例如，通过本领域中已知的荧光激活细胞分选(FACS)分析方法所确定。还可以通过在移植后的时段期间测量外周血中的白血细胞计数和/或通过测量骨髓抽吸样品中供体细胞对骨髓细胞的恢复来确定植入。
以下部分提供了结合至T细胞抗原(例如，CD3)和干细胞靶标(例如，CD117)的双特异性结合蛋白的描述。实例包括抗CD117双特异性结合蛋白或其片段。本文所公开的组合物和方法可以用于治疗患者，诸如罹患癌症(诸如急性骨髓性白血病或骨髓增生异常综合征)或自身免疫疾病的患者，或需要造血干细胞移植疗法以促进造血干细胞移植物的植入的患者，以及向患者施用将此类治疗剂(例如，在造血干细胞移植之前)的方法。
定义
如本文所用，术语“约”是指高于或低于所描述值的5％以内的值。
如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合至特定抗原或与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子。抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、基因工程抗体和其它修饰形式的抗体，包括但不限于去免疫抗体、嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合物抗体(例如，双特异性、三特异性和四特异性抗体、双链抗体、三链抗体和四链抗体)和抗体片段(即，抗体的抗原结合片段)，包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段，只要它们展现所需抗原结合活性即可。
一般来说，抗体包含含有抗原结合区(本文中也称作抗原结合部分)的重链和轻链。每条重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，间插有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合至靶抗原的能力的抗体的一个或多个部分。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。抗体片段可以是例如Fab、F(ab')2、scFv、双链抗体、三链抗体、亲和抗体、纳米抗体、适体或结构域抗体。术语抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，含有在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)包括VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(参见例如Ward等,Nature 341:544-546,1989)；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；以及(ix)可以任选地通过合成连接子连接的两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过连接子连接，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等,Science 242:423-426,1988和Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以按与完整抗体相同的方式针对效用来筛选片段。抗原结合片段可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解，或者在某些情况下通过本领域中已知的化学肽合成程序来产生。在双特异性抗体的情形中，抗原结合片段将为双特异性片段，即，双特异性抗原结合片段(或部分)。
如本文所用，“完整”或“全长”抗体是指具有通过二硫键互连的两条重(H)链多肽和两条轻(L)链多肽的抗体。双特异性抗体可以是完整抗体，其中双特异性抗体的第一臂包含结合至第一抗原(或表位)的轻链和重链，并且双特异性抗体的第二臂包含结合至第二抗原(或表位)的重链和轻链。
如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体或双特异性结合蛋白识别并结合至特定蛋白质结构(表位)而不是一般蛋白质的能力。如果抗体或双特异性结合蛋白对表位“A”具有特异性，那么在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离、未标记的A)的分子的存在将减少结合至抗体的标记的A的量。举例来说，如果抗体在标记时可以与相应的未标记抗体竞争离开其靶标，那么抗体“特异性结合”至靶标。在一个实施方案中，如果抗体对靶标具有至少约10-4M、约10-5M、约10-6M、约10-7M、约10-8M、约10-9M、约10-10M、约10-11M、约10-12M或更小(更小意味着小于约10-12的数字，例如，10-13)的KD，那么抗体或双特异性结合蛋白特异性结合至靶标，例如，由造血干细胞表达的抗原，诸如CD117。在一个实施方案中，根据标准生物层干涉法(BLI)确定KD。然而，应了解，抗体可能能够特异性结合至序列相关的两个或更多个抗原。举例来说，在一个实施方案中，抗体可以特异性结合至抗原，例如CD117的人类和非人类(例如，小鼠或非人类灵长类动物)直系同源物。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指通过本领域中可用或已知的任何方式从单个克隆体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆体得到的抗体，并且不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。可以使用本领域中已知的多种技术制备可用于本公开的单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或它们的组合。
如本文所用，术语“免疫细胞”旨在包括但不限于具有造血来源并且在免疫反应中起作用的细胞。免疫细胞包括但不限于T细胞和自然杀伤(NK)细胞。自然杀伤细胞在本领域中是众所周知的。在一个实施方案中，自然杀伤细胞包括细胞系，诸如NK-92细胞。NK细胞系的其它实例包括NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS细胞和NKL细胞。免疫细胞可以是同种异体的或自体的。
如本文所用，术语“抗CD117抗体”或“结合至CD117的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD117的抗体，以使得这种抗体可用作靶向CD117的诊断和/或治疗剂。同样地，术语“抗CD117双特异性结合蛋白”或“结合至CD117的双特异性结合蛋白”是指能够以足够的亲和力结合CD117的双特异性结合蛋白，以使得这种双特异性结合蛋白可用作靶向CD117的诊断和/或治疗剂。
如本文所用，术语“双特异性结合蛋白”或“双特异性结合多肽”是指包含结合至两个抗原(或同一抗原上的两个表位)的抗原结合区的蛋白质。双特异性结合蛋白的实例是双特异性抗体或BiTE(参见例如Einsele等(2020)Cancer第126(14)卷:3192-3201)。
术语“双特异性抗体”或“双特异性抗体构建体”是指对两个不同抗原或两个不同表位展现出双重结合特异性的抗体，其中每个结合位点不同并识别不同的抗原或表位。举例来说，一种结合特异性可以针对造血干细胞(HSC)表面抗原，例如CD117(例如，GNNK+CD117)上的表位，而另一种结合特异性可以针对不同细胞，诸如免疫细胞(例如，T细胞)上的表位或不同造血干细胞表面抗原或另一种细胞表面蛋白上的表位，诸如参与增强细胞生长的信号转导途径的受体或受体亚单位等。在一个实施方案中，双特异性抗体由图5中所描述的完整抗体表示，其中所述双特异性抗体含有包含抗体重链和轻链的T细胞特异性结合臂，并且含有包含抗体重链和轻链的第二靶特异性结合臂(例如，结合至HSC上表达的抗原)。
在特定实施方案中，“双特异性结合蛋白”或“双特异性抗体”或“双特异性抗体构建体”具有结合至CD117的第一抗原结合结构域(或结合部分)并具有结合至CD3的第二抗原结合结构域(或结合部分)。
鉴于本文所公开的双特异性结合蛋白，例如抗CD117双特异性结合蛋白或其片段是(至少)双特异性的，它们不是天然存在的并且它们明显不同于天然存在的产物。“双特异性”结合蛋白或免疫球蛋白因此是具有至少两个具有不同特异性的不同结合位点的人工杂合抗体或免疫球蛋白。双特异性结合蛋白可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Imunol.79:315-321(1990)。
术语“杵臼”或“杵入臼”是指某种类型的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含含有结合至第一抗原(或表位)的轻链和重链的第一臂和含有结合至第二抗原(或表位)的第二轻链和重链的第二臂。杵臼双特异性抗体涉及对每个臂的CH3结构域进行工程化以在每条重链中创造“杵”或“臼”，以促进两条重链的异源二聚化。
根据特定实施方案，T细胞/HSC特异性双特异性剂(例如，抗CD3/CD117双特异性抗体)是“双特异性单链结合蛋白”，更优选双特异性“单链Fv”(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成连接子连接，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子；参见例如Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:5879-5883。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且按与完整或全长抗体相同的方式针对功能来评价片段。单链可变片段(scFv)因此是免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，所述重链(VH)和轻链(VL)可变区通常与约10至约25个氨基酸、优选约15至20个氨基酸的短连接子肽连接。连接子通常富含甘氨酸而具有柔性，以及丝氨酸或苏氨酸而具有溶解性，并且可以将VH的N端与VL的C端连接，反之亦然。尽管去除恒定区并引入连接子，这种蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)是指在抗体(或如本文所描述的双特异性结合蛋白)的轻链和重链可变结构域中均发现的高变区。可变结构域的更加高度保守的部分称作框架区(FR)。描绘抗体(或如本文所描述的双特异性结合蛋白)的高变区的氨基酸位置可以变化，这取决于上下文和本领域中已知的各种定义。可变结构域内的一些位置可以视为混合高变位置，因为这些位置在一组准则下可以视为在高变区内，而在一组不同准则下视为在高变区外。这些位置中的一个或多个也可以在扩展的高变区中发现。本文所描述的抗体(或如本文所描述的双特异性结合蛋白)可以在这些混合高变位置处含有修饰。天然重链和轻链的可变结构域各自含有四个框架区，它们主要采用由三个CDR连接的β-折叠构型，这三个CDR形成连接β-折叠结构并且在一些情况下构成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的CDR通过框架区按FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序紧密保持在一起，并且与来自其它抗体链的CDR一起有助于形成抗体的靶结合位点(参见Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,MD.,1987)。在某些实施方案中，除非另有指示，否则根据Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号***进行免疫球蛋白氨基酸残基的编号(不过可以利用任何抗体编号方案，包括但不限于IMGT和Chothia)。
如本文所用，术语“Fc”、“Fc区”、“Fc结构域”和“IgG Fc结构域”是指与通过IgG分子的木瓜蛋白酶消化获得的可结晶片段相关的免疫球蛋白，例如IgG分子的部分。Fc区包含通过二硫键连接的IgG分子的两条重链的C端一半。它没有抗原结合活性，但含有碳水化合物部分以及补体和Fc受体，包括FcRn受体(见下文)的结合位点。举例来说，Fc结构域含有第二恒定结构域CH2(例如，人类IgG1的EU位置231-340处的残基)和第三恒定结构域CH3(例如，人类IgG1的EU位置341-447处的残基)。如本文所用，Fc结构域包括“下铰链区”(例如，人类IgG1的EU位置233-239处的残基)。
Fc可以指孤立的这个区域，或在双特异性结合蛋白、抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的情形中的这个区域。已经在Fc结构域中的多个位置处观察到多态性，包括但不限于EU位置270、272、312、315、356和358，并且因此在本申请中呈现的序列与本领域中已知的序列之间可能存在细微差异。因此，“野生型IgG Fc结构域”或“WT Ig G Fc结构域”是指任何天然存在的IgG Fc区(即，任何等位基因)。人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链序列可以在许多序列数据库中找到，例如，在Uniprot数据库(www.uniprot.org)中登录号分别为P01857(IGHG1_HUMAN)、P01859(IGHG2_HUMAN)、P01860(IGH G3_HUMAN)和P01861(IGHG1_HUMAN)。
如本文所用，术语“修饰的Fc区”或“变体Fc区”是指包含在Fc结构域内的任何位置处引入的一个或多个氨基酸取代、缺失、***或修饰的IgG Fc结构域。在某些方面，与不包含一个或多个氨基酸取代的野生型Fc结构域相比，变体IgG Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，使得对FcγR和/或C1q的结合亲和力降低或消除。此外，Fc结合相互作用对于多种效应子功能和下游信号传导事件是必不可少的，包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，在某些方面，相对于其它方面具有相同氨基酸序列但不包含一个或多个氨基酸取代、缺失、***或修饰，诸如在Fc区中的相应位置处含有天然存在的氨基酸残基的未修饰的Fc区的相应抗体，包含变体Fc结构域的抗体(例如，抗体、融合蛋白或缀合物)可以展现出对至少一个或多个Fc配体(例如，FcγR)的结合亲和力改变。
变体Fc结构域是根据构成它们的氨基酸修饰来定义。对于本文所论述的关于Fc区的所有氨基酸取代，编号始终根据Kabat中的EU索引。因此，举例来说，D265C是Fc变体，其中EU位置265处的天冬氨酸(D)相对于亲本Fc结构域被半胱氨酸(C)取代。应注意，提供取代的顺序是任意的。同样地，例如，D265C/L234A/L235A定义了相对于亲本Fc结构域在EU位置265(D至C)、234(L至A)和235(L至A)处具有取代的变体Fc变体。还可以根据其在突变的EU氨基酸位置中的最终氨基酸组成来指定变体。举例来说，L234A/L235A突变体可以称作“LALA”。作为另一个实例，E233P.L234V.L235A.delG236(236缺失)突变体可以称作“EPLVLAdelG”。作为又一个实例，I253A.H310A.H435A突变体可以称作“IHH”。应注意，提供取代的顺序是任意的。
如本文所用，术语“Fcγ受体”或“FcγR”是指结合IgG抗体Fc区并且由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)，以及任何未发现的人类FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
如本文所用，术语“效应子功能”是指由Fc结构域与Fc受体相互作用引起的生物化学事件。效应子功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。如本文所用，“效应细胞”是指免疫***中表达一个或多个Fc受体并介导一种或多种效应子功能的细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans'cell)、自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞，并且可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。
如本文所用，术语“沉默的”、“沉默”或“沉默中”是指具有本文所描述的修饰的Fc区的抗体或双特异性结合蛋白，相对于包含未修饰的Fc区的相同抗体或双特异性结合蛋白与FcγR的结合，这种抗体与Fcγ受体(FcγR)的结合降低(例如，如通过例如BLI所测量，与FcγR的结合相对于包含未修饰的Fc区的相同抗体与FcγR的结合降低至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)。在一些实施方案中，Fc沉默的抗体或双特异性结合蛋白与FcγR的结合不可检测。具有修饰的Fc区的抗体与FcγR的结合可以使用本领域中已知的多种技术来确定，例如但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)；KinExA，Rathanaswami等Analytical Biochemistry,第373卷:52-60,2008；或放射免疫测定(RIA))，或通过表面等离子共振测定或其它基于动力学的测定机制(例如，BIACORETM分析或OctetTM分析(forteBIO))，以及其它方法，诸如间接结合测定、竞争性结合测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些和其它方法可以利用一种或多种所检查的组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可以在Paul,W.E.编,FundamentalImmunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中找到，其重点是抗体-免疫原相互作用。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，包括在增加量的未标记的抗原存在下将标记的抗原与所关注的抗体一起孵育，以及检测结合至标记的抗原的抗体。所关注的抗体对特定抗原的亲和力和结合解离率可以通过斯卡查德图分析(scatchard plotanalysis)从数据中确定。还可以使用放射免疫测定来确定与第二抗体的竞争。在这种情况下，在增加量的未标记的第二抗体存在下，将抗原与缀合至标记的化合物的所关注的抗体一起孵育。
如本文所用，术语“包含未修饰的Fc区的相同抗体”或“包含未修饰的Fc区的相同双特异性结合蛋白”是指缺乏所列氨基酸取代(例如，D265C、H435A、L234A和/或L235A)，但在其它方面与所比较的Fc修饰的抗体或Fc修饰的双特异性结合蛋白具有相同氨基酸序列的抗体或双特异性结合蛋白。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中包含Fc结构域的多肽，例如抗体或双特异性结合蛋白，结合至某些细胞毒性细胞(例如，主要是NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)，并且使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至带有抗原的“靶细胞”，随后用细胞毒素杀伤靶细胞。(Hogarth等,Nature review Drug Discovery 2012,11:313)预期除了抗体或双特异性结合蛋白及其片段之外，具有特异性结合至带有抗原的靶细胞的能力的包含Fc结构域的其它多肽，例如Fc融合蛋白和Fc缀合物蛋白，将能够实现细胞介导的细胞毒性。
为简单起见，由包含Fc结构域的多肽的活性产生的细胞介导的细胞毒性在本文中也称作ADCC活性。可以测定本公开的任何特定多肽介导ADCC对靶细胞的溶解的能力。为了评估ADCC活性，将所关注的多肽(例如，抗体)与免疫效应细胞组合添加至靶细胞中，引起靶细胞的细胞溶解。细胞溶解一般通过从溶解的细胞中释放标记(例如，放射性底物、荧光染料或天然细胞内蛋白质)来检测。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。体外ADCC测定的具体实例描述于Bruggemann等,J.Exp.Med.166:1351(1987)；Wilkinson等,J.Immunol.Methods 258:183(2001)；Patel等,J.Immunol.Methods 184:29(1995)中。替代地或另外，可以在体内，例如在动物模型中评估所关注的抗体或双特异性结合蛋白的ADCC活性，诸如Clynes等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:652(1998)中所公开的动物模型。
如本文所用，术语“调理”和“调理中”是指患者准备接受含有造血干细胞的移植物的过程。此类程序促进了造血干细胞移植物的植入(例如，根据在调理程序和后续造血干细胞移植后从患者分离的血液样品内活的造血干细胞数量的持续增加推断出)。根据本文所描述的方法，可以通过向患者施用能够结合由造血干细胞表达的抗原(诸如CD117(例如，GNNK+CD117))和由T表达的抗原(诸如CD3)的T细胞介导的HSC细胞耗竭双特异性抗体(例如，抗CD117双特异性结合蛋白)或其片段来调理患者用于造血干细胞移植疗法。在某些实施方案中，向需要造血干细胞移植疗法的患者施用能够结合HSC上的抗原(例如，CD117)和T细胞上的抗原(例如，CD3)的双特异性结合蛋白或其片段可以促进造血干细胞移植物的植入，例如，通过选择性地使内源性造血干细胞耗竭，从而创造由外源性造血干细胞移植物填补的空缺。
还提供了本文所描述的SEQ ID NO所示的序列的“保守序列修饰”，即，不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体或双特异性结合蛋白与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。此类保守序列修饰包括保守核苷酸和氨基酸取代，以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。举例来说，可以通过本领域中已知的标准技术将修饰引入本文所描述的SEQ IDNO中，诸如定点诱变和PCR介导的诱变。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括以下氨基酸：具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，双特异性抗体，例如抗CD117抗体或抗CD117双特异性结合蛋白中的预测非必需氨基酸残基优选地被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基置换。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域中是众所周知的(参见例如Brummell等,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等ProteinEng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:412-417(1997))。
如本文所用，术语“供体”是指在向接受体施用细胞或其子代之前分离出一种或多种细胞的人类或动物。一种或多种细胞可以是例如造血干细胞群体。
如本文所用，术语“双链抗体”是指含有两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括通过连接子连接的VH和VL结构域，这种连接子过短(例如，由五个氨基酸组成的连接子)而不允许同一肽链上的VH和VL结构域进行分子内缔合。这种构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对，从而形成同源二聚结构。因此，术语“三链抗体”是指含有三条肽链的三价抗体，其中每条肽链含有通过连接子连接的一个VH结构域和一个VL结构域，这种连接子极短(例如，由1-2个氨基酸组成的连接子)而不允许同一肽链内的VH和VL结构域进行分子内缔合。为了折叠成它们的天然结构，以这种方式配置的肽通常会三聚化，以便定位相邻肽链的VH和VL结构域在空间上彼此靠近(参见例如Holliger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-48,1993)。
如本文所用，术语“内源性”描述天然存在于特定生物体，诸如人类患者中的物质，诸如分子、细胞、组织或器官(例如，造血干细胞或造血谱系的细胞，诸如巨核细胞、血栓细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞)。
如本文所用，术语“植入潜力”用于指造血干细胞和祖细胞在组织中再植的能力，无论此类细胞是天然循环的还是通过移植提供的。这个术语涵盖围绕或促成植入的所有事件，诸如细胞的组织归巢和细胞在所关注的组织内的定植。可以使用本领域技术人员已知的任何临床上可接受的参数来评价或定量植入效率或植入率，并且可以包括例如竞争性再植单位(CRU)的评估；在干细胞已经归巢、定植或植入的一个或多个组织中掺入或表达标志物；或通过疾病进展、造血干细胞和祖细胞的存活或接受体的存活评价受试者的进展。还可以通过在移植后的时段期间测量外周血中的白血细胞计数来确定植入。还可以通过测量骨髓抽吸样品中供体细胞对骨髓细胞的恢复来评估植入。
如本文所用，术语“外源性”描述不天然存在于特定生物体，诸如人类患者中的物质，诸如分子、细胞、组织或器官(例如，造血干细胞或造血谱系的细胞，诸如巨核细胞、血栓细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞)。外源物质包括从外部来源提供给生物体或提供给从其中提取的培养物的那些物质。
如本文所用，术语“框架区”或“FW区”包括与抗体或其抗原结合片段的CDR相邻的氨基酸残基。FW区残基可以存在于例如人类抗体、人源化抗体、单克隆抗体、抗体片段、Fab片段、单链抗体片段、scFv片段、抗体结构域和双特异性结合蛋白或其片段等中。
如本文所用，术语“造血干细胞”(“HSC”)是指具有自我更新并分化成构成不同谱系的成熟血细胞的能力的未成熟血细胞，包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、血栓细胞(例如，巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，NK细胞、B细胞和T细胞)。此类细胞可以包括CD34+细胞。CD34+细胞是表达CD34细胞表面标志物的未成熟细胞。在人类中，据信CD34+细胞包括具有上文所定义的干细胞特性的细胞亚群，而在小鼠中，HSC是CD34-。另外，HSC还指长期再植HSC(LT-HSC)和短期再植HSC(ST-HSC)。LT-HSC和ST-HSC是基于功能潜力和细胞表面标志物表达来区分。举例来说，人类HSC是CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、CD49F+和lin-(对于成熟谱系标志物，包括CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11B、CD19、CD20、CD56、CD235A呈阴性)。在小鼠中，骨髓LT-HSC是CD34-、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+、CD48-和lin-(对于成熟谱系标志物，包括Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7ra呈阴性)，而ST-HSC是CD34+、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+和lin-(对于成熟谱系标志物，包括Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7ra呈阴性)。另外，在稳态条件下，ST-HSC比LT-HSC的静止性更弱并且增殖性更强。然而，LT-HSC具有更大的自我更新潜力(即，它们在整个成年期存活，并且可以通过继承的接受体连续移植)，而ST-HSC具有有限的自我更新(即，它们仅存活有限的时间段，并且不具备连续移植潜力)。这些HSC中的任一者可以用于本文所描述的方法中。ST-HSC特别有用，因为它们具有高度增殖性并且因此可以更快地产生分化的子代。
如本文所用，术语“造血干细胞功能潜力”是指造血干细胞的功能特性，包括1)多能性(指分化成多种不同血液谱系的能力，包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、血栓细胞(例如，巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，NK细胞、B细胞和T细胞)，2)自我更新(指造血干细胞产生与母细胞具有同等潜力的子细胞的能力，并且进一步说明这种能力可以在个体一生中反复出现而不会耗尽)，以及3)造血干细胞或其子代再引入移植接受体中的能力，随之，它们归巢于造血干细胞生态位并重建生产性和持续性造血作用。
如本文所用，术语“人类抗体”旨在包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人类抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或在基因重排期间或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人类抗体”不旨在包括其中来源于另一哺乳动物物种，诸如小鼠的种系的CDR序列已经移植至人类框架序列上的抗体。人类抗体可以在人类细胞中(例如，通过重组表达)或由能够表达功能重排的人类免疫球蛋白(诸如重链和/或轻链)基因的非人类动物或原核或真核细胞产生。当人类抗体是单链抗体时，它可以包含天然人类抗体中未发现的连接子肽。举例来说，Fv可以含有连接重链可变区和轻链可变区的连接子肽，诸如两个至约八个甘氨酸或其它氨基酸残基。此类连接子肽视为人类来源的。人类抗体可以通过本领域中已知的多种方法制得，包括使用来源于人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。人类抗体也可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白，但可以表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生(参见例如PCT公布号WO 1998/24893；WO 1992/01047；WO 1996/34096；WO 1996/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598)。
如本文所用，“需要”造血干细胞移植的患者包括在一种或多种血细胞类型中展现出缺陷或不足的患者，以及患有干细胞病症、自身免疫疾病、癌症或本文所描述的其它病态的患者。造血干细胞一般展现出1)多能性，并且因此可以分化成多种不同血液谱系，包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、血栓细胞(例如，巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，NK细胞、B细胞和T细胞)，2)自我更新，并且因此可以产生与母细胞具有同等潜力的子细胞，以及3)再引入移植接受体中的能力，随之，它们归巢于造血干细胞生态位并重建生产性和持续性造血作用。因此可以向造血谱系的一种或多种细胞类型有缺陷或不足的患者施用造血干细胞以在体内重构缺陷或不足的细胞群体。举例来说，患者可能罹患癌症，并且缺陷可能是由于施用选择性地或非特异性地使癌细胞群体耗竭的化疗剂或其它药物所致。另外或替代地，患者可能罹患血红蛋白病(例如，非恶性血红蛋白病)，诸如镰状细胞性贫血、地中海贫血、范可尼贫血(Fanconi anemia)、再生障碍性贫血和威-奥二氏综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)。受试者可以是罹患腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷病(ADA SCID)、HIV/AIDS、异染性脑白质营养不良、戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia)和施-戴二氏综合征(Schwachman-Diamond syndrome)的受试者。受试者可能患有遗传性血液病症(例如，镰状细胞性贫血)或自身免疫病症或受其影响。另外或替代地，受试者可能患有恶性病，诸如成神经细胞瘤或血液癌症或受其影响。举例来说，受试者可能患有白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，受试者患有急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)。在一些实施方案中，受试者患有骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫疾病，诸如硬皮病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、1型糖尿病或本文所描述的另一种自身免疫病态。在一些实施方案中，受试者需要嵌合抗原受体T细胞(CART)疗法。在一些实施方案中，受试者患有代谢贮积症或以其它方式受代谢贮积症影响。受试者可能罹患代谢病症或以其它方式受代谢病症影响，所述代谢病症选自由以下组成的组：糖原贮积病、粘多糖贮积症、高歇氏病、赫尔勒氏病、鞘脂贮积症、异染性脑白质营养不良，或可能受益于本文所公开的治疗和疗法的任何其它疾病或病症并且包括但不限于严重联合免疫缺陷病、威-奥二氏综合征、高免疫球蛋白M(IgM)综合征、切-希二氏病(Chediak-Higashi disease)、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨硬化症、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、镰状细胞病、全身性硬化症、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、幼年类风湿性关节炎和"Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease,"ASHEducation Book,1:319-338(2000)中所描述的那些疾病或病症，所述文献关于可以通过施用造血干细胞移植疗法治疗的病态的公开内容以全文引用的方式并入本文中。另外或替代地，“需要”造血干细胞移植的患者可能罹患或未罹患前述病态之一，但仍然展现出造血谱系内的一种或多种内源性细胞类型，诸如巨核细胞、血栓细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的水平降低(例如，与其它方面健康的受试者相比)。本领域技术人员可以容易地确定一种或多种前述细胞类型或其它血细胞类型的水平相对于其它方面健康的受试者是否降低，例如，通过流式细胞术和荧光激活细胞分选(FACS)方法以及本领域中已知的其它程序。
如本文所用，术语“接受体”是指接受移植物，诸如含有造血干细胞群体的移植物的患者。向接受体施用的移植细胞可以是例如自体、同基因或同种异体细胞。
如本文所用，术语“样品”是指取自受试者的样本(例如，血液、血液组分(例如，血清或血浆)、尿液、唾液、羊水、脑脊液、组织(例如，胎盘或真皮)、胰液、绒毛膜绒毛样品和细胞)。
如本文所用，术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中来自抗体的重链和轻链的可变结构域已经连接形成一条链。scFv片段含有单个多肽链，所述多肽链包括通过连接子隔开的抗体(或如本文所描述的双特异性结合蛋白)轻链可变区(VL)(例如，CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)和抗体(或如本文所描述的双特异性结合蛋白)重链可变区(VH)(例如，CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)。连接scFv片段的VL和VH区的连接子可以是由蛋白质氨基酸组成的肽连接子。可以使用替代性连接子以增加scFv片段对蛋白水解降解的抗性(例如，含有D-氨基酸的连接子)，以增强scFv片段的溶解度(例如，亲水性连接子，诸如含有聚乙二醇的连接子或含有重复甘氨酸和丝氨酸残基的多肽)，以改善分子的生物物理稳定性(例如，含有形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基的连接子)，或者以减弱scFv片段的免疫原性(例如，含有糖基化位点的连接子)。本领域普通技术人员还将了解，本文所描述的scFv分子的可变区可以被修饰，使得它们的氨基酸序列与它们所源自的抗体分子不同。举例来说，可以进行引起氨基酸残基的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代(例如，在CDR和/或框架残基中)，以保留或增强scFv结合至由相应抗体或双特异性结合蛋白识别的抗原的能力。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指接受针对本文所描述的特定疾病或疾患的治疗的生物体，诸如人类。举例来说，患者，诸如人类患者，可以在造血干细胞移植疗法之前接受治疗，以促进外源性造血干细胞的植入。
如本文所用，短语“大体上从血液中清除”是指在向患者施用治疗剂(诸如抗CD117双特异性抗体或其抗原结合片段)之后的时间点，此时从患者分离的血液样品中治疗剂的浓度使得治疗剂通过常规方式不可检测(例如，使得治疗剂在用于检测治疗剂的装置或测定的噪声阈值以上不可检测)。本领域中已知的多种技术可以用于检测抗体、抗体片段、双特异性抗体及其抗原结合片段，诸如本领域中已知或本文所描述的基于ELISA的检测测定。可以用于检测抗体或抗体片段、双特异性抗体及其抗原结合片段的额外测定包括免疫沉淀技术和免疫印迹测定，以及本领域中已知的其它测定。
如本文所用，短语“干细胞病症”泛指可以通过调理受试者的靶组织和/或通过消融靶组织中的内源性干细胞群体(例如，从受试者的骨髓组织消融内源性造血干细胞或祖细胞群体)和/或通过在受试者的靶组织中植入或移植干细胞而治疗或治愈的任何疾病、病症或疾患。举例来说，已经显示I型糖尿病可以通过造血干细胞移植而治愈，并且可以受益于根据本文所描述的组合物和方法进行的调理。可以使用本文所描述的组合物和方法治疗的额外病症包括但不限于镰状细胞性贫血、地中海贫血、范可尼贫血、再生障碍性贫血、威-奥二氏综合征、ADA SCID、HIV/AIDS、异染性脑白质营养不良、戴-布二氏贫血和施-戴二氏综合征。可以使用本文所描述的患者调理和/或造血干细胞移植方法治疗的额外疾病包括遗传性血液病症(例如，镰状细胞性贫血)和自身免疫病症，诸如硬皮病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。可以使用本文所描述的调理和/或移植方法治疗的额外疾病包括恶性病，诸如成神经细胞瘤或血液癌症，诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。举例来说，癌症可以是急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。使用本文所描述的调理和/或移植方法可治疗的额外疾病包括骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，受试者患有代谢贮积症或以其它方式受代谢贮积症影响。举例来说，受试者可能罹患代谢病症或以其它方式受代谢病症影响，所述代谢病症选自由以下组成的组：糖原贮积病、粘多糖贮积症、高歇氏病、赫尔勒氏病、鞘脂贮积症、异染性脑白质营养不良，或可能受益于本文所公开的治疗和疗法的任何其它疾病或病症并且包括但不限于严重联合免疫缺陷病、威-奥二氏综合征、高免疫球蛋白M(IgM)综合征、切-希二氏病、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨硬化症、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、镰状细胞病、全身性硬化症、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、幼年类风湿性关节炎和"Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease,"ASHEducation Book,1:319-338(2000)中所描述的那些疾病或病症，所述文献关于可以通过施用造血干细胞移植疗法治疗的病态的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“转染”是指通常用于将外源性DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术中的任一者，诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
如本文所用，术语“治疗”或“治疗法”是指降低疾病症状的严重度和/或频率，消除疾病症状和/或所述症状的基本病因，降低疾病症状和/或它们的基本病因的频率或可能性，以及改善或补救由疾病直接或间接引起的损害。有益的或期望的临床结果包括但不限于在本文所描述的抗体调理疗法和后续造血干细胞移植疗法后促进外源性造血细胞在患者中的植入。额外的有益结果包括在调理疗法以及向患者后续施用外源性造血干细胞移植物后，需要造血干细胞移植的患者中造血干细胞的细胞计数或相对浓度增加。本文所描述的疗法的有益结果还可以包括在调理疗法和后续造血干细胞移植疗法后，一种或多种造血谱系细胞，诸如巨核细胞、血栓细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞的细胞计数或相对浓度增加。额外的有益结果可以包括致病细胞群体，诸如癌细胞(例如，CD117+白血病细胞)或自身免疫细胞(例如，CD117+自身免疫淋巴细胞，诸如表达与自身抗原发生交叉反应的T细胞受体的CD117+T细胞)群体的数量减少。就本发明的方法针对预防病症来说，应了解，术语“预防”并不要求完全阻止疾病状态。相反，如本文所用，术语预防是指技术人员鉴定易患病症的群体的能力，使得本发明的化合物的施用可以在疾病发作之前发生。这个术语并不暗示着完全避免疾病状态。
如本文所用，术语“变体”和“衍生物”可互换使用，并且是指本文所描述的化合物、肽、蛋白质或其它物质的天然存在的、合成的和半合成的类似物。本文所描述的化合物、肽、蛋白质或其它物质的变体或衍生物可以保留或改善原始材料的生物活性。
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，诸如质粒、DNA载体、质粒、RNA载体、病毒或其它适合的复制子。本文所描述的表达载体可以含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合至哺乳动物细胞基因组中的额外序列元件。可以用于表达本发明的双特异性抗体和双特异性抗体片段的某些载体包括含有调控序列的质粒，诸如指导基因转录的启动子和增强子区域。用于表达双特异性抗体和双特异性抗体片段的其它有用载体含有多核苷酸序列，这些多核苷酸序列增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件可以包括例如5'和3'非翻译区和多腺苷酸化信号位点，以指导表达载体上携带的基因的有效转录。本文所描述的表达载体还可以含有编码用于选择含有此种载体的细胞的标志物的多核苷酸。适合的标志物的实例包括编码抗生素抗性的基因，诸如氨苄青霉素(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、卡那霉素(kanamycin)和诺尔丝菌素(nourseothricin)。
靶向T细胞抗原和HSC抗原的双特异性结合蛋白
本文所描述的组合物和方法基于T细胞介导的靶细胞耗竭，特别是作为被耗竭用于调理的靶细胞的HSC。本文中的公开内容的一个优点是双特异性结合蛋白，例如抗CD3/抗HSC双特异性抗体能够使用免疫介导的细胞毒性使HSC耗竭，并且不需要或减少需要导致一般细胞耗竭的细胞毒性剂或疗法，例如，化学疗法或照射。这种靶向方法侧重于表达与靶细胞群体相关的抗原的细胞，例如HSC，并最大限度地减少对未靶向细胞的影响。此外，通过使用本文所公开的双特异性蛋白将T细胞导向靶细胞来实现细胞耗竭。
如本文所用，术语“抗造血细胞抗体”或“抗HC抗体”是指特异性结合由造血干细胞表达的抗原，诸如CD117(例如，GNNK+CD117)的抗体。双特异性抗体或其双特异性抗原结合区可以包含来源于抗HC抗体的第一结合部分，例如，对CD117具有特异性的重链和轻链组合。
本文所公开的组合物和方法，包括双特异性剂，可以用于靶向表达任何靶特异性抗原的细胞。在某些实施方案中，本文所公开的组合物和方法对人类HSC上表达的抗原，即如下抗原具有特异性：CD7、CDw12、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD117、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349和CD350。在某些实施方案中，靶向细胞包括表达一种或多种可以靶向的标志物的人类造血干细胞，此类抗原包括CD11a、CD18、CD37、CD47、CD52、CD58、CD62L、CD69、CD74、CD97、CD103、CD132、CD156a、CD179a、CD179b、CD184、CD232、CD244、CD252、CD302、CD305、CD317或CD361。
在某些实施方案中，靶向细胞是表达一种或多种可以由本文所公开的抗CD3双特异性抗体靶向的标志物的人类造血干细胞，其中所述标志物是CD7、CDw12、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD117、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349或CD350。本公开提供了双特异性抗体，所述双特异性抗体包含结合至造血干细胞表面上表达的抗原的第一结合结构域和结合至T细胞表面上的人类CD3的第二结合结构域。在本公开的一些实施方案中，双特异性抗体结合至人类CD3ε。
在某些实施方案中，抗CD3结合结构域包含来自US 10,851,170、US 10,933,132、US 10,781,264、US 10,738,130和WO 2008/119567中描述的抗CD3抗体的抗原结合区(可变区或CDR)，每个文献特此以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，双特异性抗体的抗CD3结合结构域包含如表4中所描述的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，双特异性抗体的抗CD3结合结构域包含如表4中所描述的包含CDR1、CDR2和CDR3的重链以及包含CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
在其它实施方案中，抗CD3/抗HC双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段包含有包含轻链和/或重链可变区的抗CD3结合部分，所述轻链和/或重链可变区包含与表4中所描述的抗CD3轻链和/或重链可变区序列具有至少95％同一性，例如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD3/抗HC双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段包含修饰的轻链或重链可变区，所述可变区包含表4中所描述的抗CD3抗体的轻链和/或重链可变结构域或其变体，所述变体(i)与抗CD3抗原结合区的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失；(ii)与抗CD3抗原结合区的不同之处在于最多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失；(iii)与抗CD3抗原结合区的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失；和/或(iv)包含与抗CD3抗原结合区至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中修饰的轻链和/或重链可变区相对于抗CD3抗体的轻链和/或重链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留双特异性抗体的CD3结合特异性。
在其它实施方案中，本文所公开的双特异性剂的抗CD3抗原结合区包含可变轻链(VL)区，所述可变轻链(VL)区包含选自表4中所描述的以下序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：(a)如SEQ ID NO:60所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO:61所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:62所描绘的CDR-L3；(b)如SEQ ID NO:108所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO:109所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:110所描绘的CDR-L3；以及(c)如SEQ ID NO:129所描绘的CDR-L1、如SEQID NO:130所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:131所描绘的CDR-L3。
在其它实施方案中，本文所公开的双特异性剂的抗CD3抗原结合区包含可变重链(VH)区，所述可变重链(VH)区包含选自表4中所描述的以下序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：(a)如SEQ ID NO:51所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:52所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:53所描绘的CDR-H3；(b)如SEQ ID NO:63所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:64所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:65所描绘的CDR-H3；(c)如SEQ ID NO:72所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:73所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:74所描绘的CDR-H3；(d)如SEQ ID NO:81所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:82所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:83所描绘的CDR-H3；(e)如SEQ ID NO:90所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:91所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:92所描绘的CDR-H3；(f)如SEQ ID NO:99所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:100所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:101所描绘的CDR-H3；(g)如SEQ ID NO:111所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:112所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:113所描绘的CDR-H3；(h)如SEQ ID NO:120所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:121所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:122所描绘的CDR-H3；(i)如SEQ ID NO:132所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:133所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:134所描绘的CDR-H3；以及(j)如SEQ ID NO:141所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:142所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO:143所描绘的CDR-H3。
在其它实施方案中，本文所公开的双特异性剂的抗CD3抗原结合区包含选自由如表4的SEQ ID NO:67、69、115、117、136或138所描绘的VL区组成的组的VL区。
在其它实施方案中，本文所公开的双特异性剂的抗CD3抗原结合区包含选自由如表4的SEQ ID NO:54、56、66、68、75、77、84、86、93、95、102、104、114、116、123、125、135、137、144或146所描绘的VH区组成的组的VH区。
在某些其它实施方案中，本文所公开的双特异性剂的抗CD3抗原结合区包含VL区和VH区，所述VL区和VH区选自由表4中所描述的以下序列组成的组：(a)如SEQ ID NO:55或57所描绘的VL区和如SEQ ID NO:54或56所描绘的VH区；(b)如SEQ ID NO:67或69所描绘的VL区和如SEQ ID NO:66或68所描绘的VH区；(c)如SEQ ID NO:76或78所描绘的VL区和如SEQID NO:75或77所描绘的VH区；(d)如SEQ ID NO:85或87所描绘的VL区和如SEQ ID NO:84或86所描绘的VH区；(e)如SEQ ID NO:94或96所描绘的VL区和如SEQ ID NO:93或95所描绘的VH区；(f)如SEQ ID NO:103或105所描绘的VL区和如SEQ ID NO:102或104所描绘的VH区；(g)如SEQ ID NO:115或117所描绘的VL区和如SEQ ID NO:114或116所描绘的VH区；(h)如SEQ ID NO:124或126所描绘的VL区和如SEQ ID NO:123或125所描绘的VH区；(i)如SEQ IDNO:136或138所描绘的VL区和如SEQ ID NO:135或137所描绘的VH区；以及(j)如SEQ ID NO:145或147所描绘的VL区和如SEQ ID NO:144或146所描绘的VH区。
在本公开的其它实施方案中，抗CD3结合结构域包含单链抗体(scFv)形式中的一对本文所公开的VH区和VL区(或具有本文所公开的CDR的可变区)。VH和VL区以VH-VL或VL-VH的顺序排列。在一个实施方案中，VH区位于连接子序列的N端，并且VL区位于连接子序列的C端。
在本公开的其它实施方案中，本文所公开的双特异性剂的抗CD3抗原结合区包含选自由表4的SEQ ID NO:58、59、70、71、79、80、88、89、97、98、106、107、118、119、127、128、139、140、148或149组成的组的氨基酸序列。
抗CD117/抗CD3双特异性结合蛋白
本公开部分地基于以下发现：能够结合T细胞特异性抗原(例如，CD3)和CD117(诸如GNNK+CD117)的双特异性结合蛋白或其抗原结合片段可以用作治疗剂以(i)治疗癌症(诸如急性骨髓性白血病或骨髓增生异常综合征)和以CD117+细胞为特征的自身免疫疾病，以及(ii)促进移植的造血干细胞在需要移植疗法的患者中的植入。这些治疗活性可以例如通过抗CD117双特异性抗体或其抗原结合片段与诸如癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞等细胞的表面上表达的CD117(例如，GNNK+CD117)的结合并且随后诱导细胞死亡而引起。内源性造血干细胞的耗竭可以提供移植的造血干细胞可以归巢的生态位并且随后建立生产性造血作用。以这种方式，移植的造血干细胞可以成功地植入患者中，诸如罹患本文所描述的干细胞病症的人类患者。
因此，本文提供了结合至CD117和CD3两者的双特异性结合多肽或其片段。本文还提供了编码此类双特异性结合多肽或其片段的分离的核酸(多核苷酸)，诸如互补DNA(cDNA)。进一步提供了包含核酸(多核苷酸)的载体(例如，表达载体)或编码此类双特异性结合分子或其片段的载体(例如，表达载体)。本文还提供了制备此类双特异性结合分子、细胞和载体的方法。在其它实施方案中，本文提供了使用本文所描述的双特异性结合多肽、核酸和/或载体治疗各种血液疾病、代谢病症、癌症和自身免疫疾病等的方法和用途。另外，本文还提供了相关组合物(例如，药物组合物)、试剂盒和诊断方法。
在某些实施方案中，本文提供了特异性结合至CD117和CD3，并且引发T细胞细胞毒性以治疗各种疾病，包括但不限于血液疾病、干细胞疾病、癌症和免疫病症的双特异性结合多肽或其片段。不受任何理论约束，据信本文所描述的双特异性结合分子不仅将肿瘤结合至T细胞，它们还交联T细胞上的CD3并启动激活级联，并且以这种方式，基于T细胞受体(TCR)的细胞毒性重定向至所需的肿瘤靶标，避开主要组织相容性复合物(MHC)限制。
能够结合人类CD117的双特异性结合多肽或其片段(也称作c-Kit，mRNA NCBI参考序列：NM_000222.2，蛋白质NCBI参考序列：NP_000213.1)，包括能够结合GNNK+CD117的那些，可以与本文所描述的组合物和方法结合使用，以调理患者用于造血干细胞移植疗法。在很大百分比的群体中影响CD117的编码区或细胞外结构域的多态性当前在非肿瘤学适应症中不是众所周知的。已经鉴定出至少四种CD117同种型，有可能在肿瘤细胞中表达其它同种型。CD117同种型中的两者位于蛋白质的细胞内结构域上，并且两者存在于外部近膜区中。两种细胞外同种型GNNK+和GNNK-不同之处在于4个氨基酸序列的存在(GNNK+)或不存在(GNNK-)。据报道这些同种型对配体(SCF)具有相同的亲和力，但据报道配体与GNNK同种型的结合会增加内化和降解。GNNK+同种型可以用作免疫原以产生能够结合CD117的抗体，因为针对这种同种型产生的抗体将包括GNNK+和GNNK-蛋白质。
CD3是由γ链、δ链和两条ε链组成的T细胞共受体。在具体实施方案中，CD3是人类CD3。GenBankTM登录号NM_000073.2(SEQ ID NO:31)提供了示例性人类CD3γ核酸序列。GenBankTM登录号NP_000064.1(SEQ ID NO:32)提供了示例性人类CD3γ氨基酸序列。GenBankTM登录号NM_000732.4(SEQ ID NO:33)提供了示例性人类CD3δ核酸序列。GenBankTM登录号NP_000723.1(SEQ ID NO:34)提供了示例性人类CD3δ氨基酸序列。GenBankTM登录号NM_000733.3(SEQ ID NO:35)提供了示例性人类CD3ε核酸序列。GenBankTM登录号NP_000724.1(SEQ ID NO:36)提供了示例性人类CD3ε氨基酸序列。与本发明的抗CD117双特异性结合蛋白或其片段相关的还优选结合至T细胞表面上的人类CD3第二结合结构域，所述第二结合结构域包含如SEQ ID NO:38所描绘的VL区和如SEQ ID NO:37所描绘的VH区。
作为非限制性实例，本发明的双特异性结合分子中的免疫球蛋白可以是单克隆抗体、裸抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
在一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含如SEQ ID NO:13的氨基酸序列所示的重链可变区和如SEQ ID NO:14的氨基酸序列所示的轻链可变区。
在另一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含Ab85的重链可变区(VH)氨基酸序列的三个CDR序列和轻链可变区(LH)氨基酸序列的三个CDR序列。
在另一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含Ab85的重链可变区(VH)氨基酸序列和轻链可变区(LH)氨基酸序列。
重链可变区(VH)氨基酸序列在下文以SEQ ID NO:13提供。Ab85的VH CDR氨基酸序列在下文加下划线并且如下：NYWIG(VH CDR1；SEQ ID NO:7)；IINPRDSDTRYRPSFQG(VHCDR2；SEQ ID NO:8)；和HGRGYEGYEGAFDI(VH CDR3；SEQ ID NO:9)。
Ab85 VH序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMAIINPRDSDTRYRPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYEGYEGAFDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)
Ab85的轻链可变区(VL)氨基酸序列在下文以SEQ ID NO 14提供。Ab85的VL CDR氨基酸序列在下文加下划线并且如下：RSSQGIRSDLG(VL CDR1；SEQ ID NO:10)；DASNLET(VLCDR2；SEQ ID NO:11)；和QQANGFPLT(VL CDR3；SEQ ID NO:12)。
Ab85 VL序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIRSDLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:14)
因此，在某些实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含有包含如SEQID No:7、8和9所示的CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)的重链和包含如SEQ ID No:10、11和12所示的CDR组的轻链。
在另一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含Ab67的重链可变区(VH)氨基酸序列和轻链可变区(LH)氨基酸序列。
Ab67的重链可变区(VH)氨基酸序列以SEQ ID NO:27描述。
Figure BDA0003946591420000451
Figure BDA0003946591420000452
(SEQ IDNO:27；CDR结构域呈粗体)
Ab67的VH CDR氨基酸序列如下：FTFSDADMD(VH CDR1；SEQ ID NO:21)；RTRNKAGSYTTEYAASVKG(VH CDR2；SEQ ID NO:22)；和AREPKYWIDFDL(VH CDR3；SEQ ID NO:23)。
Ab67的轻链可变区(VL)氨基酸序列在下文以SEQ ID NO 28提供。
Figure BDA0003946591420000461
Figure BDA0003946591420000462
(SEQ ID NO:28；CDR结构域呈粗体)
Ab67的VL CDR氨基酸序列在下文加下划线并且如下：RASQSISSYLN(VL CDR1；SEQID NO:24)；AASSLQS(VL CDR2；SEQ ID NO:25)；和QQSYIAPYT(VL CDR3；SEQ ID NO:26)。
在其它实施方案中，如本文所公开的抗CD117双特异性抗体或其片段能够结合至CD117表位，诸如WO 2020/219770中所描述的一个或多个表位，这个文献的全部内容特此以引用的方式并入本文中。在其它实施方案中，如本文所公开的抗CD117双特异性抗体或其片段能够结合至CD117表位，诸如WO 2020/219748中所描述的一个或多个表位，这个文献的全部内容特此以引用的方式并入本文中。
在如本文所公开的抗CD117双特异性结合多肽或其片段的某些实施方案中包含结合至CD3的scFv，所述scFv包含本领域中已知的CD3特异性抗体的VH和VL，所述抗体诸如huOKT3(参见例如Adair等,1994,Hum Antibodies Hybridomas 5:41-47)、YTH12.5(参见例如Routledge等,1991,Eur J Immunol,21:2717-2725)、HUM291(参见例如Norman等,2000,Clinical Transplantation,70(12):1707-1712)、替利珠单抗(teplizumab)(参见例如Herold等,2009,Clin Immunol,132:166-173)、huCLB-T3/4(参见例如Labrijn等,2013,Proceedings of the National Academy of Sciences,110(13):5145-5150)、奥昔珠单抗(otelixizumab)(参见例如Keymeulen等,2010,Diabetologia,53:614-623)、博纳吐单抗(blinatumomab)(参见例如Cheadle,2006,Curr Opin Mol Ther,8(1):62-68)、MT110(参见例如Silke和Gires,2011,MAbs,3(1):31-37)、卡妥索单抗(catumaxomab)(参见例如Heiss和Murawa,2010,Int J Cancer,127(9):2209-2221)。
在某些实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段中的scFv与本领域中已知的CD3特异性抗体结合至相同的表位。在特定实施方案中，本发明的双特异性结合分子中的scFv与CD3特异性抗体huOKT3结合至相同的表位。与相同表位的结合可以通过本领域技术人员已知的测定来确定，诸如突变分析或晶体学研究。在某些实施方案中，scFv与本领域中已知的抗体竞争结合至CD3。在特定实施方案中，本发明的双特异性结合分子中的scFv与CD3特异性抗体huOKT3竞争结合至CD3。与CD3结合的竞争可以通过本领域技术人员已知的测定来确定，诸如流式细胞术。在某些实施方案中，scFv包含与本领域中已知的CD3特异性抗体的VH具有至少85％、90％、95％、98％或至少99％相似性的VH。在某些实施方案中，scFv包含本领域中已知的CD3特异性抗体的VH，所述VH包含介于1个与5个之间的保守氨基酸取代。在某些实施方案中，scFv包含与本领域中已知的CD3特异性抗体的VL具有至少85％、90％、95％、98％或至少99％相似性的VL。在某些实施方案中，scFv包含本领域中已知的CD3特异性抗体的VL，所述VL包含介于1个与5个之间的保守氨基酸取代。
本文所描述的抗CD117双特异性结合多肽或其片段还可以包括改变抗体和/或片段的特性的修饰和/或突变，诸如增加半衰期、增加或减少ADCC等的那些，如本领域中已知的。
在一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含变体Fc区，其中所述变体Fc区相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰，使得所述分子对FcγR的亲和力改变。通过晶体学研究已知Fc区内的某些氨基酸位置以与FcγR直接接触。具体来说，氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C'/E环)和氨基酸327-332(F/G)环。(参见Sondermann等,2000Nature,406:267-273)。举例来说，已经鉴定出在Fc区的氨基酸位置234和235处的氨基酸取代降低IgG抗体结合至Fc受体，特别是Fcγ受体(FcγR)的亲和力。在一个实施方案中，本文所描述的抗CD117抗体包含在L234和/或L235处包含氨基酸取代，例如L234A和L235A(EU索引)的Fc区。因此，本文所描述的抗CD117双特异性结合多肽或其片段可以包含变体Fc区，所述变体Fc区包含基于结构和晶体学分析与FcγR直接接触的至少一个残基的修饰。在一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段的Fc区(或含有其片段的Fc)根据如Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,NH1,MD(1991)中的EU索引在氨基酸265处包含氨基酸取代，这个文献以引用的方式明确并入本文中。除非另有指示，否则“Kabat中的EU索引”或“EU索引”是指人类IgG1 EU抗体的编号并且在本文中用于指Fc氨基酸位置。
在一个实施方案中，Fc区包含D265A突变。在一个实施方案中，Fc区包含D265C突变。
在一些实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段的Fc区(或其片段)根据Kabat中的EU索引在氨基酸234处包含氨基酸取代。在一个实施方案中，Fc区包含L234A突变。在一些实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段的Fc区(或其片段)根据Kabat中的EU索引在氨基酸235处包含氨基酸取代。在一个实施方案中，Fc区包含L235A突变。在又一个实施方案中，Fc区包含L234A和L235A突变。在另一个实施方案中，Fc区包含D265C、L234A和L235A突变。
在某些方面，与不包含一个或多个氨基酸取代的野生型Fc结构域相比，变体IgGFc结构域包含一个或多个氨基酸取代，使得对FcγR和/或C1q的结合亲和力降低或消除。Fc结合相互作用对于多种效应子功能和下游信号传导事件是必不可少的，包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，在某些方面，包含修饰的Fc区(例如，包含L234A、L235A和D265C突变)的双特异性结合多肽或其片段具有显著降低或消除的效应子功能。
对Fc区的亲和力可以使用本领域中已知的多种技术来确定，例如但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)；KinExA，Rathanaswami等Analytical Biochemistry,第373卷:52-60,2008；或放射免疫测定(RIA))，或通过表面等离子共振测定或其它基于动力学的测定机制(例如，BIACORETM分析或OctetTM分析(forteBIO))，以及其它方法，诸如间接结合测定、竞争性结合测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些和其它方法可以利用一种或多种所检查的组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可以在Paul,W.E.编,Fundamental Immunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中找到，其重点是抗体-免疫原相互作用。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，包括在增加量的未标记的抗原存在下将标记的抗原与所关注的抗体一起孵育，以及检测结合至标记的抗原的抗体。所关注的抗体对特定抗原的亲和力和结合解离率可以通过斯卡查德图分析从数据中确定。还可以使用放射免疫测定来确定与第二抗体的竞争。在这种情况下，在增加量的未标记的第二抗体存在下，将抗原与缀合至标记的化合物的所关注的抗体一起孵育。
在一个实施方案中，本文所描述的抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含有包含L235A、L235A和D265C(EU索引)的Fc区。本发明的双特异性结合多肽或其片段可以进一步工程化以通过引入额外的Fc突变来进一步调节抗体半衰期，诸如在(Dall'Acqua等(2006)JBiol Chem 281:23514-24)、(Zalevsky等(2010)Nat Biotechnol 28:157-9)、(Hinton等(2004)J Biol Chem 279:6213-6)、(Hinton等(2006)J Immunol 176:346-56)、(Shields等(2001)J Biol Chem 276:6591-604)、(Petkova等(2006)Int Immunol 18:1759-69)、(Datta-Mannan等(2007)Drug Metab Dispos 35:86-94)、(Vaccaro等(2005)NatBiotechnol 23:1283-8)、(Yeung等(2010)Cancer Res 70:3269-77)和(Kim等(1999)Eur JImmunol 29:2819-25)中所描述的那些，并且包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可以单独或组合产生的示例性突变是T250Q、M252Y、1253A、S254T、T256E、P2571、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R突变。
因此，在一个实施方案中，Fc区包含引起半衰期缩短的突变。具有短半衰期(本文中也称作“快”半衰期)的双特异性结合多肽或其片段在预期双特异性结合多肽或其片段用作短寿命治疗剂的某些情况下可能是有利的，例如，在本文所描述的其中施用双特异性结合多肽或其片段继之以HSC的调理步骤中。理想地，双特异性结合多肽或其片段将在递送HSC之前大体上清除，与内源性干细胞不同，HSC一般也表达CD117，但不是抗CD117双特异性结合多肽或其片段的靶标。在一个实施方案中，Fc区在位置435处包含突变(根据Kabat的EU索引)。在一个实施方案中，突变是H435A突变。在另一个实施方案中，突变是D265C突变。在又一个实施方案中，突变是H435A突变和D265C突变。
在一个实施方案中，本文所描述的抗CD117双特异性结合多肽或其片段具有等于或小于24小时、等于或小于22小时、等于或小于20小时、等于或小于18小时、等于或小于16小时、等于或小于14小时、等于或小于13小时、等于或小于12小时、等于或小于11小时、等于或小于10小时、等于或小于9小时、等于或小于8小时、等于或小于7小时、等于或小于6小时或者等于或小于5小时的半衰期。在一个实施方案中，抗体的半衰期为5小时至7小时；5小时至9小时；15小时至11小时；5小时至13小时；5小时至15小时；5小时至20小时；5小时至24小时；7小时至24小时；9小时至24小时；11小时至24小时；12小时至22小时；10小时至20小时；8小时至18小时；或14小时至24小时。
可以与本文所描述的患者调理方法结合使用的抗CD117双特异性结合多肽或其片段包括例如从ATCC登录号10716(保藏为BA7.3C.9)产生和发布的抗体部分，诸如在美国专利号5,489,516中所描述的SR-1抗体，这个专利关于抗CD117抗体的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本文所描述的抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含有包含L235A、L235A、D265C和H435A(EU索引)的Fc区。
可以与本文所描述的患者调理方法结合使用的额外抗CD117双特异性结合多肽或其片段包括美国专利号7,915,391中所描述的那些，描述了例如人源化SR-1抗体；美国专利号5,808,002，描述了例如抗CD117 A3C6E2抗体；以及例如WO 2015/050959中所描述的那些，描述了结合含有人类CD117的Pro317、Asn320、Glu329、Val331、Asp332、Lus358、Glue360、Glue376、His378和/或Thr380的表位的抗CD117抗体；以及US 2012/0288506(也作为美国专利号8,552,157公布)，描述了例如具有以下CDR序列的抗CD117抗体CK6：
具有氨基酸序列SYWIG(SEQ ID NO:1)的CDR-H1；
具有氨基酸序列IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的CDR-H2；
具有氨基酸序列HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO:3)的CDR-H3；
具有氨基酸序列RASQGISSALA(SEQ ID NO:4)的CDR-L1；
具有氨基酸序列DASSLES(SEQ ID NO:5)的CDR-L2；和
具有氨基酸序列CQQFNSYPLT(SEQ ID NO:6)的CDR-L3
CK6的重链可变区氨基酸序列以SEQ ID NO:27提供：
Figure BDA0003946591420000521
Figure BDA0003946591420000522
(SEQ ID NO:29；CDR加下划线并呈粗体)。
CK6的轻链氨基酸可变序列以SEQ ID NO:28提供：
Figure BDA0003946591420000524
Figure BDA0003946591420000523
(SEQ ID NO:30；CDR加下划线并呈粗体)。
可以与本文所描述的组合物和方法结合使用的额外抗CD117双特异性结合多肽或其片段包括US 2015/0320880中所描述的那些，诸如克隆体9P3、NEG024、NEG027、NEG085、NEG086和20376。
前述公布中的每一者关于抗CD117抗体的公开内容以引用的方式并入本文中。可以与本文所描述的组合物和方法结合使用的抗CD117双特异性结合多肽或其片段包括上文所描述的抗体及其抗原结合片段，以及上文所描述的那些非人类抗体和抗原结合片段的人源化变体和结合与上文所描述的那些相同的表位的抗体或抗原结合片段，例如，通过竞争性CD117结合测定所评估。
前述抗体的示例性抗原结合片段包括双可变免疫球蛋白结构域、单链Fv分子(scFv)、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、Fv片段、Fab片段、F(ab')2分子和串联二-scFv等。
可以使用重组方法和组合物来产生抗CD117双特异性结合多肽或其片段，例如美国专利号4,816,567中所描述。在一个实施方案中，提供了编码本文所描述的抗CD117双特异性结合多肽或其片段的分离的核酸。此种核酸可以编码组成抗体VL的氨基酸序列和/或组成抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含此种核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含此种核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下转化)：(1)包含编码组成抗体VL的氨基酸序列和组成抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码组成抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码组成抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了一种制造抗CLL-1抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码如上文所提供的抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗CD117双特异性结合多肽或其片段的重组产生，将编码例如上文所描述的抗体的核酸分离并***一个或多个载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序将此种核酸容易地分离并进行测序(例如，通过使用能够特异性结合至编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所描述的原核或真核细胞。举例来说，可以在细菌中产生抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)表达后，可以从细菌细胞糊的可溶性部分中分离抗体并且可以进一步纯化。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。举例来说，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293或293细胞，例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所描述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。对于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)。
在一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含具有与本文所公开的SEQ ID No至少95％、96％、97％或99％相同的氨基酸序列的可变区。或者，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含CDR，所述CDR包含具有本文所描述的可变区的框架区的本文所公开的SEQ ID No，所述可变区具有与本文所公开的SEQ ID No至少95％、96％、97％或99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含具有本文所公开的氨基酸序列的重链可变区和重链恒定区。在另一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含具有本文所公开的氨基酸序列的轻链可变区和轻链恒定区。在又一个实施方案中，抗CD117双特异性结合多肽或其片段包含具有本文所公开的氨基酸序列的重链可变区、轻链可变区、重量恒定区和轻链恒定区。
制备双特异性抗体的方法
双特异性抗体可以根据本领域中已知的标准方法制备，在一些实施方案中，包括全长抗体或抗体片段(例如，F(ab)2双特异性抗体等)。全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性。归因于免疫球蛋白重链和轻链的随机配对，可能产生不同抗体分子的潜在混合物，一般具有双特异性异源二聚体的一个正确配对。通常通过亲和色谱法纯化正确的异源二聚体分子。
也可以使用重链异源二聚化方法产生双特异性抗体。此类方法包括“杵臼”方法，所述方法描述于例如美国专利号7,695,936、美国专利号5,807,706和美国专利申请公布2003/0078385中，这些专利特此以全文引用的方式并入本文中。在“杵臼”方法中，通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)从第一抗体分子的界面置换一个或多个小氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)来产生“突起”。通过用具有较小侧链的氨基酸(例如，丙氨酸或苏氨酸)置换具有大侧链的氨基酸，在第二抗体分子的界面上创造与大侧链相同或相似大小的补偿“空腔”。这提供了用于提高异源二聚体的产量超过其它不需要的最终产物(诸如同源二聚体)的机制。在通过“杵臼”方法产生的双特异性抗体的许多实施方案中，Fc区含有一对杵臼取代。在一些实施方案中，第一重链(即，链A)的Fc区含有一个或多个氨基酸取代，而第二重链(即，链B)的Fc区含有一个或多个氨基酸取代。举例来说，与未修饰的链A和链B所发现的相比，已经发现IgG1 Fc区的链A和链B中的以下杵和臼取代增加了异源二聚体的形成：1)链A中的Y407T和链B中的T366Y；2)链A中的Y407A和链B中的T366W；3)链A中的F405A和链B中的T394W；4)链A中的F405W和链B中的T394S；5)链A中的Y407T和链B中的T366Y；6)链A中的T366Y和F405A以及链B中的T394W和Y407T；7)链A中的T366W和F405W以及链B中的T394S和Y407A；8)链A中的F405W和Y407A以及链B中的T366W和T394S；以及9)链A中的T366W和链B中的T366S、L368A和Y407V。类似地，改变一个或多个氨基酸残基(例如，CH3-CH3界面中的一个或多个氨基酸残基)的电荷的取代可以增强异源二聚体的形成，如WO 2009/089004中所描述，这个文献的全部内容特此以引用的方式并入本文中。此类取代在本文中称作“电荷对取代”，并且因此在A链中含有一个或多个电荷对取代的Fc区可以在B链中含有不同的取代。电荷对取代的一般实例包括以下：1)链A中的K409D或K409E和链B中的D399K或D399R；2)链A中的K392D或K392E和链B中的D399K或D399R；3)链A中的K439D或K439E和链B中的E356K或E356R；以及4)链A中的K370D或K370E和链B中的E357K或E357R。在一些实施方案中，双特异性抗体或其部分也可以使用共同的轻链产生。使用共同的轻链可以减少可能的错配数，如WO 98/50431中所描述，这个文献的全部内容以引用的方式并入。这些“杵臼”和/或“电荷对取代”中的一者或多者可以用于本文所描述的异源二聚双特异性抗体的Fc区。
在一些实施方案中，使用“杵臼”方法产生双特异性抗体的方法包括将包含具有“杵”突变的重链的第一蛋白质分子与包含具有“臼”突变的重链的第二蛋白质分子在足以允许铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起孵育。适合的条件的实例描述于美国专利申请公布2016/0046727中，这个专利的全部内容特此以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，铰链区中半胱氨酸发生二硫键异构化的最低要求可能取决于同源二聚起始蛋白质而不同，特别是取决于铰链区中的确切序列。在一些实施方案中，具有“杵”和“臼”突变的第一和第二重链CH3区的各自同源二聚相互作用足够弱以允许铰链区中的半胱氨酸在给定的条件下发生二硫键异构化。在一些实施方案中，还原条件包括添加还原剂，例如，选自由以下组成的组的还原剂：三肽谷胱甘肽(GSH)、2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基-乙醇。在其它实施方案中，根据所需的氧化还原电位描述还原条件。考虑到每个GSSG氧化的两个GSH的化学计量的氧化还原电位是氧化还原状态的定量测量。在一些实施方案中，反应在还原条件下进行，氧化还原电位在低于-50mV，诸如低于-150mV，在-150与-600mV之间，诸如在-200与-500mV之间，在-250与-450mV之间，诸如在-250与-400mV之间，在-260与-300mV之间的范围内。在本文所描述的使用“杵臼”方法产生双特异性抗体的其它实施方案中，包括在还原反应完成后恢复条件以变为非还原性或较低还原性，例如通过去除还原剂，例如通过脱盐。
使用“杵臼”方法产生的本文所提供的变体重链分子可用于产生双特异性抗体并克服上文所提及的限制和技术困难(例如，不当配对)。在一些实施方案中，对抗体内的一条重链和一条轻链进行修饰，由此天然半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸取代，并且天然非半胱氨酸氨基酸被半胱氨酸氨基酸取代。本文所提供的此类修饰在重链(HC)和轻链(LC)结构域中产生并引起HC-LC链间二硫键的重定位。在其它实施方案中，当从四种单独的多肽产生双特异性抗体时，例如，在修饰的臂对一个靶标具有结合特异性并且未修饰的臂对不同靶标具有结合特异性的情况下，四种多肽将组装成使得修饰的重链多肽与修饰的轻链适当杂交并且未修饰的重链与未修饰的轻链适当杂交。如本文所用，术语“未修饰”是指在本文所描述和/或本领域中已知的CH2和/或CH3区中不含如本文所描述的HC-LC修饰(例如，“杵臼”或半胱氨酸修饰)的重链和轻链。在一些实施方案中，本文所提供的HC-LC修饰可以与重链的进一步修饰组合，特别是在CH2和/或CH3区中的修饰，以确保适当的重链异源二聚化和/或以增强重链异源二聚体的纯化。
鉴定双特异性结合蛋白的方法
用于高通量筛选能够结合CD117(例如，GNNK+CD117)(和/或CD3)的分子的双特异性结合蛋白或其片段的文库的方法可以用于鉴定可用于治疗癌症、自身免疫疾病以及调理需要如本文所描述的造血干细胞疗法的患者(例如，人类患者)的亲和力成熟抗体。此类方法包括本领域中已知的体外展示技术，诸如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA展示等。使用噬菌体展示来分离结合生物学相关分子的配体已经例如在Felici等,Biotechnol.Annual Rev.1:149-183,1995；Katz,AnnualRev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45,1997；和Hoogenboom等,Immunotechnology 4:1-20,1998中评述，每个文献关于体外展示技术的公开内容以引用的方式并入本文中。已经构建随机化组合肽文库以选择结合细胞表面抗原的多肽，如Kay,Perspect.Drug DiscoveryDes.2:251-268,1995和Kay等,Mol.Divers.1:139-140,1996中所描述，每个文献关于抗原结合分子发现的公开内容以引用的方式并入本文中。蛋白质，诸如多聚蛋白质，已经成功地被噬菌体展示为功能性分子(参见例如EP 0349578；EP 4527839；和EP 0589877，以及Chiswell和McCafferty,Trends Biotechnol.10:80-84 1992，每个文献关于使用体外展示技术来发现抗原结合分子的公开内容以引用的方式并入本文中)。另外，功能性抗体片段，诸如Fab和scFv片段，已经以体外展示形式表达(参见例如McCafferty等,Nature 348:552-554,1990；Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982,1991；以及Clackson等,Nature 352:624-628,1991，每个文献关于用于发现抗原结合分子的体外展示平台的公开内容以引用的方式并入本文中)。这些技术尤其可以用于鉴定和改善结合CD117(例如，GNNK+CD117)(和/或CD3)的抗体的亲和力，进而可以用于使需要造血干细胞移植疗法的患者(例如，人类患者)中的内源性造血干细胞耗竭。
除了体外展示技术之外，计算建模技术可以用于经由电脑模拟来设计和鉴定结合CD117(例如，GNNK+CD117)(和/或CD3)的双特异性结合蛋白或其片段。举例来说，使用计算建模技术，本领域技术人员可以经由电脑模拟来筛选双特异性结合蛋白、抗体或抗体片段的文库中能够结合特定表位，诸如这种抗原的细胞外表位的分子。通过这些计算技术鉴定的双特异性结合蛋白、抗体或其抗原结合片段可以与本文所描述的治疗方法结合使用，诸如本文所描述的癌症和自身免疫疾病治疗方法以及本文所描述的患者调理程序。
可以使用额外的技术来鉴定结合细胞(例如，癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞)表面上的CD117(例如，GNNK+CD117)(和/或CD3)并且被细胞内化，例如，通过受体介导的内吞作用内化的双特异性结合蛋白、抗体或其抗原结合片段。举例来说，上文所描述的体外展示技术可以适于筛选结合癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞表面上的CD117(例如，GNNK+CD117)(和/或CD3)并且随后被内化的双特异性结合蛋白、抗体或其抗原结合片段。噬菌体展示代表了一种可以与这种筛选范例结合使用的此类技术。为了鉴定结合CD117(例如，GNNK+CD117)(和/或CD3)并且随后被癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞内化的双特异性结合蛋白、抗体或其片段，本领域技术人员可以修改例如Williams等,Leukemia 19:1432-1438,2005中所描述的噬菌体展示技术，这个文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。举例来说，使用本领域中已知的诱变方法，可以产生重组噬菌体文库，所述文库编码含有随机化氨基酸盒(例如，在一个或多个或所有CDR或其等效区域或双特异性结合蛋白、抗体或抗体片段中)的双特异性结合蛋白、抗体、抗体片段，诸如scFv片段、Fab片段、双链抗体、三链抗体和10Fn3结构域等。可以设计双特异性结合蛋白、抗体或抗体片段的框架区、铰链、Fc结构域和其它区域，使得它们在人类中是非免疫原性的，例如，由于具有人类种系抗体序列或相对于人类种系抗体仅展现出微小变化的序列。
使用本文所描述或本领域中已知的噬菌体展示技术，可以将含有共价结合至噬菌体颗粒的随机化双特异性结合蛋白、抗体或抗体片段的噬菌体文库与CD117(例如，GNNK+CD117)(和/或CD3)抗原一起孵育，例如，通过首先将噬菌体文库与封闭剂(诸如乳蛋白、牛血清白蛋白和/或IgG，以去除编码展现出非特异性蛋白质结合的双特异性结合蛋白、抗体或其片段的噬菌体和编码结合Fc结构域的双特异性结合蛋白、抗体或其片段的噬菌体)一起孵育，然后将噬菌体文库与造血干细胞群体一起孵育。可以将噬菌体文库与靶细胞，诸如癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞一起孵育，持续足以使抗CD117特异性双特异性结合蛋白、抗体或其抗原结合片段(例如，GNNK+CD117特异性抗体或其抗原结合片段)结合细胞表面CD117(例如，细胞表面GNNK+CD117)(和/或CD3)抗原并且随后被癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞内化的时间(例如，在4℃下30分钟至6小时，诸如在4℃下1小时)。含有对这些抗原中的一者或多者未展现出足以允许结合至癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞并且被这些细胞内化的亲和力的双特异性结合蛋白、抗体或其片段的噬菌体随后可以通过例如用冷的(4℃)0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.8)洗涤细胞来去除。结合至已经被癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞内化的双特异性结合蛋白、抗体或其片段的噬菌体可以例如通过使细胞溶解并且从细胞培养基中回收内化的噬菌体来鉴定。然后可以在细菌细胞中扩增噬菌体，例如，通过使用本领域中已知的方法在2xYT培养基中将细菌细胞与回收的噬菌体一起孵育。然后可以表征从这种培养基回收的噬菌体，例如，通过确定编码***噬菌体基因组内的双特异性结合蛋白、抗体或其片段的一个或多个基因的核酸序列。随后可以通过化学合成(例如，抗体片段，诸如scFv片段的化学合成)或通过重组表达(例如，全长抗体的重组表达)重新制备编码的双特异性结合蛋白、抗体或其片段。
可以例如使用本领域中已知的放射性核素内化测定来评估制备的双特异性结合蛋白、抗体或其片段的内化能力。举例来说，使用本文所描述或本领域中已知的体外展示技术鉴定的双特异性结合蛋白、抗体或其片段可以通过掺入放射性同位素来功能化，诸如18F、75Br、77Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I、211At、67Ga、111In、99Tc、169Yb、186Re、64Cu、67Cu、177Lu、77As、72As、86Y、90Y、89Zr、212Bi、213Bi或225Ac。举例来说，放射性卤素，诸如18F、75Br、77Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I、211At，可以使用含有亲电卤素试剂的珠粒，诸如聚苯乙烯珠粒(例如，碘化珠粒(Iodination Beads)；Thermo Fisher Scientific,Inc.,Cambridge,MA)掺入双特异性结合蛋白、抗体或其片段中。可以将放射性标记的双特异性结合蛋白、抗体或其片段与癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞一起孵育，持续足以允许内化的时间(例如，在4℃下30分钟至6小时，诸如在4℃下1小时)。然后可以洗涤细胞以去除非内化抗体或其片段(例如，使用冷的(4℃)0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.8))。内化的双特异性结合蛋白、抗体或其片段可以通过检测与回收的洗涤缓冲液的发射辐射(例如，γ-辐射)进行比较的所得癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞的发射辐射(例如，γ-辐射)来鉴定。
治疗和靶向细胞耗竭的方法
如本文所描述，可以向需要治疗的受试者施用造血干细胞移植疗法以定植或再植一种或多种血细胞类型。造血干细胞一般展现出多能性，并且因此可以分化成多种不同血液谱系，包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、血栓细胞(例如，巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，NK细胞、B细胞和T细胞)。造血干细胞另外能够自我更新，并且因此可以产生与母细胞具有同等潜力的子细胞，并且还具有再引入移植接受体中的能力，随之，它们归巢于造血干细胞生态位并重建生产性和持续性造血作用。
因此可以向造血谱系的一种或多种细胞类型有缺陷或不足的患者施用造血干细胞以在体内重构缺陷或不足的细胞群体，从而治疗与内源性血细胞群体的缺陷或耗竭相关的病态。本文所描述的组合物和方法因此可以用于治疗非恶性血红蛋白病(例如，选自由镰状细胞性贫血、地中海贫血、范可尼贫血、再生障碍性贫血和威-奥二氏综合征组成的组的血红蛋白病)。另外或替代地，本文所描述的组合物和方法可以用于治疗免疫缺陷，诸如先天性免疫缺陷。另外或替代地，本文所描述的组合物和方法可以用于治疗获得性免疫缺陷(例如，选自由HIV和AIDS组成的组的获得性免疫缺陷)。本文所描述的组合物和方法可以用于治疗代谢病症(例如，选自由糖原贮积病、粘多糖贮积症、高歇氏病、赫尔勒氏病、鞘脂贮积症和异染性脑白质营养不良组成的组的代谢病症)。
另外或替代地，本文所描述的组合物和方法可以用于治疗恶性病或增殖性病症，诸如血液癌症、骨髓增殖性疾病。在癌症治疗的情况下，可以向患者施用本文所描述的组合物和方法，以在造血干细胞移植疗法之前使内源性造血干细胞群体耗竭，在这种情况下，移植的细胞可以归巢于通过内源性细胞耗竭步骤创造的生态位并建立生产性造血作用。反过来，这可以重构在癌细胞根除期间，诸如在全身化疗期间耗竭的细胞群体。可以使用本文所描述的组合物和方法治疗的示例性血液癌症包括但不限于急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，以及其它癌症疾患，包括成神经细胞瘤。
可以用本文所描述的组合物和方法治疗的额外疾病包括但不限于腺苷脱氨酶缺乏和严重联合免疫缺陷病、高免疫球蛋白M综合征、切-希二氏病、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨质疏松症、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、全身性硬化症、全身性红斑狼疮、多发性硬化症和幼年类风湿性关节炎。
本文所描述的抗CD3/抗HC双特异性结合蛋白、抗体、其抗原结合片段和缀合物可以用于诱导实体器官移植耐受。举例来说，本文所描述的组合物和方法可以用于使来自靶组织的细胞群体耗竭或消除(例如，使来自骨髓干细胞生态位的造血干细胞耗竭)。在来自靶组织的细胞的此种耗竭之后，可以向移植接受体施用来自器官供体的干细胞或祖细胞群体(例如，来自器官供体的造血干细胞)，并且在植入此类干细胞或祖细胞之后，可以达成暂时或稳定的混合嵌合，从而实现长期移植器官耐受，而无需进一步的免疫抑制剂。举例来说，本文所描述的组合物和方法可以用于在实体器官移植接受体(例如，肾移植、肺移植、肝移植和心脏移植等)中诱导移植耐受。本文所描述的组合物和方法非常适合联合用于例如诱导实体器官移植耐受，因为低百分比的暂时或稳定的供体植入足以诱导植入器官的长期耐受。
另外，本文所描述的组合物和方法可以用于直接治疗癌症，诸如以CD117+细胞为特征的癌症。举例来说，本文所描述的组合物和方法可以用于治疗白血病，特别是在展现出CD117+白血病细胞的患者中。通过使CD117+癌细胞，诸如白血病细胞耗竭，本文所描述的组合物和方法可以用于直接治疗各种癌症。可以按这种方式治疗的示例性癌症包括血液癌症，诸如急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。
急性髓性白血病(AML)是以异常白细胞的快速生长为特征的髓系血细胞癌症，这些白细胞在骨髓中积聚并干扰正常血细胞的产生。AML是影响成人的最常见的急性白血病，并且它的发病率随着年龄增长而增加。AML的症状由白血病细胞替代正常骨髓而引起，这会导致红细胞、血小板和正常白细胞下降。作为急性白血病，AML进展迅速并且如果不及时治疗，可能在数周或数月内致命。在一个实施方案中，本文所描述的抗CD117双特异性结合蛋白用于治疗有需要的人类患者的AML。在某些实施方案中，抗CD117双特异性结合蛋白治疗使治疗的受试者中的AML细胞耗竭。在一些实施方案中，50％或更多的AML细胞耗竭。在其它实施方案中，60％或更多的AML细胞耗竭，或70％或更多的AML细胞耗竭，或80％或更多、或90％或更多、或95％或更多的AML细胞耗竭。在某些实施方案中，抗CD117双特异性结合蛋白治疗是单剂量治疗。在某些实施方案中，单剂量抗CD117双特异性结合蛋白治疗使60％、70％、80％、90％或95％或更多的AML细胞耗竭。
另外，本文所描述的组合物和方法可以用于治疗自身免疫病症。举例来说，可以向受试者，诸如罹患自身免疫病症的人类患者施用抗CD3/CD117双特异性抗体或其抗原结合片段，以杀伤CD117+免疫细胞。CD117+免疫细胞可以是自身反应性淋巴细胞，诸如表达T细胞受体的T细胞，所述T细胞受体特异性结合自身抗原并产生针对自身抗原的免疫反应。通过使自身反应性CD117+细胞耗竭，本文所描述的组合物和方法可以用于治疗自身免疫病态，诸如下文所描述的那些。另外或替代地，本文所描述的组合物和方法可以用于通过在造血干细胞移植疗法之前使内源性造血干细胞群体耗竭来治疗自身免疫疾病，在这种情况下，移植的细胞可以归巢于通过内源性细胞耗竭步骤创造的生态位并建立生产性造血作用。反过来，这可以重构在自身免疫细胞根除期间耗竭的细胞群体。
可以使用本文所描述的组合物和方法治疗的自身免疫疾病包括但不限于牛皮癣、牛皮癣关节炎、1型糖尿病(Type 1diabetes mellitus/Type 1diabetes)、类风湿性关节炎(RA)、人类全身性狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、炎性肠病(IBD)、淋巴细胞性结肠炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森氏病、普秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫内耳病(AIED)、自身免疫淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫***、巴娄病、***、大疱性类天疱疮、心肌病、恰加斯氏病、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、克罗恩氏病、疤痕性类天疱疮、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、冷凝集素病、CREST综合征、德戈斯病、盘状狼疮、自主神经异常、子宫内膜异位、原发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、特发性和/或急性血小板减少性紫癜、特发性肺纤维化、IgA神经病、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、川崎氏病、扁平苔癣、莱姆病、梅尼埃病、混合性***病(MCTD)、重症肌无力、神经性肌强直、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、沃德氏甲状腺炎、寻常天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多肌炎和皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、结节性多动脉炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、原发性无丙种球蛋白血症、雷诺现象、莱特尔氏综合征、风湿热、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、僵人综合征、高安氏动脉炎、颞动脉炎(也称为“巨细胞动脉炎”)、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、外阴痛(“外阴前庭炎”)和韦格纳氏肉芽肿病。
可以向患者(例如，罹患癌症、自身免疫疾病或需要造血干细胞移植疗法的人类患者)以多种剂型施用本文所描述的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白、抗体或其抗原结合片段。举例来说，可以向罹患癌症、自身免疫疾病或需要造血干细胞移植疗法的患者以水溶液，诸如含有一种或多种药学上可接受的赋形剂的水溶液形式施用本文所描述的双特异性抗体结合蛋白或其抗原结合片段。与本文所描述的组合物和方法一起使用的药学上可接受的赋形剂包括粘度调节剂。可以使用本领域中已知的技术对水溶液进行灭菌。
通过将抗CD117/CD3双特异性结合蛋白与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备包含如本文所描述的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的药物制剂。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下一般对接受体是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)；苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
本文所描述的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白或抗原结合片段可以通过多种途径施用，诸如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、眼内或肠道外。在任何给定情况下最适合的施用途径将取决于所施用的特定抗CD117双特异性结合蛋白或抗原结合片段、患者、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者的年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重度、患者的饮食和患者的***率。
本文所描述的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白或其抗原结合片段的有效剂量可以在例如约0.001至约100mg/kg体重/单次(例如，推注)施用、多次施用或连续施用的范围内，或用以达到抗体、其抗原结合片段的最佳血清浓度(例如，0.0001-5000μg/mL的血清浓度)。
在一个实施方案中，向人类患者施用的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的剂量为约0.1mg/kg至约0.3mg/kg。
在一个实施方案中，向人类患者施用的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的剂量为约0.15mg/kg至约0.3mg/kg。
在一个实施方案中，向人类患者施用的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的剂量为约0.15mg/kg至约0.25mg/kg。
在一个实施方案中，向人类患者施用的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的剂量为约0.2mg/kg至约0.3mg/kg。
在一个实施方案中，向人类患者施用的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的剂量为约0.25mg/kg至约0.3mg/kg。
在一个实施方案中，向人类患者施用的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的剂量为约0.1mg/kg。
在一个实施方案中，向人类患者施用的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的剂量为约0.2mg/kg。
在一个实施方案中，向人类患者施用的抗CD117/CD3双特异性结合蛋白的剂量为约0.3mg/kg。
可以每天、每周或每月一次或多次(例如，约2-10次)向罹患癌症、自身免疫疾病或经历调理疗法以准备接受造血干细胞移植的受试者(例如，人类)施用这种剂量。在造血干细胞移植前的调理程序的情况下，抗CD117双特异性结合蛋白或其抗原结合片段可以在最佳促进外源性造血干细胞植入的时间，例如，在施用外源性造血干细胞移植物前约1小时至1周(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天)或更长时间向患者施用。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供可以如何使用、制备和评价本文所描述的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹例示本发明并且不旨在限制发明者认为是其发明的范围。CD3/CD117双特异性抗体bs-Ab-1、bs-Ab-2和bs-Ab-3由图5中所描述的双特异性抗体表示。除了在以下实施例中针对双特异性抗体所描述的各种氨基酸取代之外，每个双特异性抗体在其Fc区中还包含LALA突变。这些双特异性抗体的结合区的氨基酸序列描述于表4中。
实施例1.CD117/CD3双特异性抗体bs-Ab-1的产生
使用“杵臼”异源二聚化技术，使用如下文所描述的来自抗CD117抗体Ab85的抗原结合区和来自抗CD3抗体Ab2的抗原结合区来制备具有CD117抗原结合臂和CD3抗原结合臂的双特异性抗体bs-Ab-1。
bs-Ab-1包含如SEQ ID NO:13所示的抗CD117重链可变区序列和SEQ ID NO:14所示的轻链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，T366W。使用定点诱变，将抗CD117抗体Ab85的重链序列(即，如US 2019/0153114 A1中所描述的SEQ ID NO:150，这个文献的全部内容特此以引用的方式明确并入)的Fc区进行工程化以引入以下取代，T366W(根据EU索引)。随后表达抗CD117 Ab85抗体变体，即，“Ab85 T366W”。
bs-Ab-1的CD3结合臂包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区序列和如SEQ IDNO:45所示的轻链可变区序列。将抗CD3重链进行工程化以引入以下Fc取代，T366S、L368A和Y407V。将SEQ ID NO:49所示的Ab2(抗CD3)抗体重链序列的Fc区进行工程化以引入以下取代，T366S、L368A和Y407V(氨基酸位置是指根据EU索引的Fc区)。随后表达Ab2(抗CD3)抗体变体，“抗CD3 T366S L368A Y407V”。
然后使用标准杵臼技术组装Ab85 T366W亲本抗体和抗CD3T366S L368A Y407V亲本抗体以产生双特异性异源二聚体bs-Ab-1。
在两轮冻融循环后评价bs-Ab-1的稳定性，继而使用尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析。为了评估聚集水平，将20μg bs-Ab-1注入AdvanceBio SEC
Figure BDA0003946591420000681
柱(AgilentTechnologies)中。使用280nm处的紫外吸光度检测洗脱的蛋白质，并且在两轮冻融循环后未展现出可观察到的聚集(数据未示出)。使用非还原毛细管SDS PAGE(非还原CE-SDS)进行进一步测试，这确定了部分还原的双特异性抗体的水平是最小的，(群体中的主要种类(>95％)是bs-Ab-1)。
还使用
Figure BDA0003946591420000682
平台上的生物层干涉法评估bs-Ab-1结合至人类CD117(hCD117)的能力，以确认双特异性形式不会干扰双特异性抗体的抗CD117臂。用于确定结合的方法是依照本领域中已知的那些方法，例如，Tobias等,“Biomolecular Binding KineticsAssays on the Octet Platform”,Application Note 14,22页(2013)中所阐述。使用生物层干涉装置(ForteBio)在25℃下于磷酸盐缓冲盐水(0.1％ BSA)中进行结合测定。将Bs-Ab-1以66.7nM的浓度加载于
Figure BDA0003946591420000691
抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器上。然后与33nMhCD117抗原缔合并与33nM hCD3抗原解离，使得bs-Ab-1结合至两种抗原(CD3和CD117)。确认了bs-Ab 1与hCD117的结合反应，并且使用这种方法无法检测到与hCD3抗原的结合(数据未示出)。此外，杆状病毒颗粒测定证明了bs-Ab-1未展现出非特异性结合。这些结果证明了bs-Ab-1结合hCD117的能力得以维持。
最后，使用差示扫描荧光法(DSF)评价bs-Ab-1的热稳定性。根据蛋白质热迁移试剂盒说明书(Applied Biosystems，蛋白质热迁移染料试剂盒(部件号4461146))将2微克bs-Ab-1与蛋白质热迁移缓冲液和染料组合，并且使用Life Technologies的AppliedBiosystems Quant Studio 7Flex仪器进行分析并确定每种抗体的解链温度(Tm)。数据指示了bs-Ab-1双特异性抗体显示出高固有热稳定性。
实施例2.使用抗CD117/抗CD3双特异性抗体bs-1-Ab的体外细胞杀伤测定进行的分析
在来自实施例1的bs-Ab-1存在下培养表达CD117的靶细胞(Kasumi-1细胞)持续六天，此后确定活的表达CD117的靶细胞的数目。
图1中的结果指示，与抗CD117同种型抗体(即，具有一个CD117结合臂和一个非靶向结合(同种型)臂的抗体)和抗CD3同种型抗体(即，具有一个CD3结合臂和一个非靶向结合(同种型)臂的抗体)(见图1，未观察到表达CD117的靶细胞的显著耗竭)相比，第6天bs-Ab-1在体外对杀伤表达CD117的靶细胞高度有效，这证明了表达CD117的靶细胞的显著杀伤(图1；IC50＝6.0pM)。来自实施例1的bs-Ab-1的IC50(pM)值和功效数据列于下表1中。
表1.
天 IC<sub>50</sub>(pM) 功效(％)
3 11.7 84.0
4 6.4 97.6
5 7.6 98.3
6 6.0 99.9
7 6.2 99.7
因此，bs-Ab-1对杀伤表达CD117的靶细胞高度有效。
实施例3.使用bs-Ab-1的体外细胞杀伤测定进行的分析
对于使用人类造血干细胞的体外细胞杀伤测定，在来自实施例1的bs-Ab-1、抗CD3同种型抗体(即，具有一个CD3结合臂和一个非结合(同种型)臂的抗体)或抗CD117同种型抗体(即，具有一个CD117结合臂和一个非结合(同种型)臂的抗体)存在下培养人类骨髓源性CD34+细胞持续七天。使用流式细胞术测量细胞活力。
图2中的结果指示，与抗CD117同种型抗体和抗CD3同种型抗体(图2；未观察到表达CD117的靶细胞的显著耗竭)相比，第6天来自实施例1的bs-Ab-1在体外有效杀伤原代人类CD34+骨髓细胞(图2；IC50＝15.1pM)。
来自实施例1的bs-Ab-1的IC50(pM)值和功效数据列于下表2中。
表2.
天 IC<sub>50</sub>(pM) 功效(％)
3 8737 15.3
4 233 39.3
5 35.3 49.7
6 15.1 64.8
7 23.8 70.9
因此，来自实施例1的bs-Ab-1有效杀伤表达CD117的细胞系(参见实施例2)和原代人类CD34+细胞(本实施例)。
实施例4.使用bs-Ab-1的体内耗竭测定
进行体内耗竭测定以比较与抗CD3同种型抗体、抗CD117同种型抗体和各种对照(例如，PBS(阴性对照))相比，来自实施例1的bs-Ab-1使细胞耗竭的能力。使用人源化NSG小鼠(购自Jackson Laboratories)进行体内HSC耗竭测定。以0.3mg/kg bs-Ab-1双特异性抗体、1.0mg/kg bs-Ab-1双特异性抗体或6.0mg/kg bs-Ab-1双特异性抗体的单次注射向人源化小鼠模型施用来自实施例1的bs-Ab-1双特异性抗体。另外，第0天以6mg/kg的单次注射向人源化小鼠类似地施用抗CD117同种型抗体(即，具有一个CD117结合臂和一个非靶向臂)、抗CD3同种型抗体(即，具有一个CD3结合臂和一个非靶向臂)以及抗CD117同种型抗体和抗CD3同种型抗体的组合。第21天收集骨髓并且通过流式细胞术检查。在单次施用后21天在处理的小鼠或对照小鼠中CD34+细胞(图3A和B)和CD34+CD117+细胞(图3C和D)的频率(％维持的细胞)和绝对数目示于图3A-D中。
结果指示，用来自实施例1的bs-Ab-1双特异性抗体处理的人源化NSG小鼠显示出在单次施用处理方案后21天，相对于PBS对照，骨髓中人类CD34+细胞的显著耗竭(图3A和B，图3A显示为％维持的细胞并且图3B显示为每个股骨的绝对细胞计数)。此外，结果指示，来自实施例1的bs-Ab 1双特异性抗体显示出在单次施用处理方案后21天，骨髓中人类CD34+CD117+细胞的显著耗竭(图3C和3D，图3C显示为％维持的细胞并且图3D显示为每个股骨的绝对细胞计数)。
实施例5.CD117/CD3双特异性抗体bs-Ab-2和bs-Ab-3的产生
使用表4中所描述的抗原结合序列并使用“杵臼”双特异性工程技术对CD3/CD117双特异性抗体bs-Ab-2和bs-Ab-3进行工程化。
使用如下文所描述的“杵臼”异源二聚化技术制备具有CD117结合臂和CD3结合臂的bs-Ab-2。bs-Ab-2的CD117结合臂包含SEQ IDNO:13所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:14所示的轻链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，T366Y和H435A。使用定点诱变，将抗CD117抗体Ab85的重链序列(即，如US 2019/0153114A1中所描述的SEQ ID NO:150，这个文献的全部内容特此以引用的方式明确并入)的Fc区进行工程化以引入以下取代，T366Y和H435A(氨基酸位置是指根据EU索引的Fc区)。随后表达抗CD117 Ab85变体，即，“Ab85 T366Y H435A”。
bs-Ab-2的CD3结合臂包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区序列和如SEQ IDNO:45所示的轻链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，Y407T和H435A。
将SEQ ID NO:49所示的Ab2(抗CD3)抗体重链序列的Fc区进行工程化以引入以下取代，Y407T和H435A(氨基酸位置是指根据EU索引的Fc区)。随后表达抗CD3抗体变体，“抗CD3 Y407TH435A”。然后使用标准杵臼技术组装Ab85 T366Y H435A亲本抗体和抗CD3 Y407TH435A亲本抗体以产生双特异性异源二聚体bs-Ab-2。
使用如下文所描述的“杵臼”异源二聚化技术制备具有CD117结合臂和CD3结合臂的另一种双特异性抗体，即，bs-Ab-3。bs-Ab-3的CD117结合臂包含SEQ ID NO:27所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:28所示的轻链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，T366Y H453A。使用定点诱变，将抗CD117抗体Ab67的重链序列(即，如US 2019-0144558A1中所描述的SEQ ID NO:152，这个文献的全部内容特此以引用的方式明确并入)的Fc区进行工程化以引入以下取代，T366Y和H435A(氨基酸位置是指根据EU索引的Fc区)。随后表达抗CD117 Ab67变体，即，“Ab67 T366Y H453A”。
另外，bs-Ab-3的CD3结合臂包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区序列和如SEQID NO:45所示的轻链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，Y407T和H435A。
将SEQ ID NO:49所示的Ab2(抗CD3)抗体重链序列的Fc区进行工程化以引入以下取代，Y407T H435A(氨基酸位置是指根据EU索引的Fc区)。随后表达抗CD3抗体变体，“抗CD3Y407T H435A”。然后使用标准杵臼技术组装Ab67 T366Y H453A亲本抗体和抗CD3Y407VH435A亲本抗体以产生双特异性异源二聚体bs-Ab-3。
另外，对三种单特异性抗体(即，具有一个结合臂和一个非靶向臂的抗体)进行工程化以用于对照。使用“杵臼”异源二聚化技术制备具有CD117结合臂和同种型(即，非结合)臂的第一单特异性抗体(即，具有一个结合臂和一个非靶向臂的抗体)，Ab85-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A。制备Ab85-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A的CD117结合臂以包括SEQ ID NO:13所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:14所示的轻链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，T366Y和H435A。另外，制备Ab85-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A的同种型结合臂以包括同种型抗体的重链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，Y407T和H435A。
使用“杵臼”异源二聚化技术制备具有CD117结合臂和同种型(即，非结合)臂的第二单特异性抗体(即，具有一个结合臂和一个非靶向臂的抗体)，Ab67-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A。制备Ab67-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A的CD117结合臂以包括SEQID NO:27所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:28所示的轻链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，T366Y和H435A。另外，制备Ab67-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A的同种型结合臂以包括同种型抗体的重链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，Y407T和H435A。
使用“杵臼”异源二聚化技术制备具有CD3结合臂和同种型(即，非结合)臂的第三单特异性抗体(即，具有一个结合臂和一个非靶向臂的抗体)，Ab2-Y407T-H435A-同种型-T366Y-H435A。制备Ab2-Y407T-H435A-同种型-T366Y-H435A的CD3结合臂以包括SEQ ID NO:41所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:45所示的轻链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，T366Y和H435A。另外，制备Ab2-Y407T-H435A-同种型-T366Y-H435A的同种型结合臂以包括同种型抗体的重链可变区序列，并且进行工程化以引入以下Fc取代，Y407T和H435A。
对bs-Ab-2双特异性抗体、bs-Ab-3双特异性抗体和三种对照抗体(即，Ab85-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A抗体、Ab67-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A抗体和抗CD3-Y407T-H435A-同种型-T366Y-H435A抗体)的稳定性进行稳定性评价，并且根据对双特异性抗体进行的测试发现是稳定的，包括未观察到聚集。
实施例6.使用抗CD117/抗CD3双特异性抗体的体外细胞杀伤测定
对于使用人类造血干细胞的体外细胞杀伤测定，在来自实施例5的bs-Ab-2双特异性抗体、来自实施例5的bs-Ab-3双特异性抗体、Ab85-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A抗体(来自实施例5)和抗CD3-Y407T-H435A-同种型-T366Y-H435A抗体(来自实施例5)的组合以及Ab67-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A抗体(来自实施例5)和抗CD3-Y407T-H435A-同种型-T366Y-H435A抗体(来自实施例5)的组合存在下培养人类骨髓源性CD34+细胞持续六天。使用流式细胞术测量细胞活力。
图4中的结果指示，与Ab85-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A单特异性抗体和抗CD3-Y407T-H435A-同种型-T366Y-H435A抗体的组合以及Ab67-T366Y-H435A-同种型-Y407T-H435A抗体和抗CD3-Y407T-H435A-同种型-T366Y-H435A单特异性抗体的组合(图4；未观察到CD34+细胞的显著耗竭)相比，第6天来自实施例5的bs-Ab-2双特异性抗体在体外有效杀伤原代人类CD34+骨髓细胞(图4；IC50＝6.4pM)。这些数据还证明了来自实施例5的bs-Ab-2双特异性抗体比来自实施例5的bs-Ab-3双特异性抗体更有效(图4)。功效上的差异可能归因于与bs-Ab-3表位与细胞膜的接近度(Ab67抗体的表位描述于WO 2020/219748中，这个文献的全部内容特此以引用的方式并入本文中)相比，bs-Ab-2表位与细胞膜的接近度(Ab85抗体的表位描述于WO 2020/219770中，这个文献的全部内容特此以引用的方式并入本文中)。
1nM双特异性抗体的％功效值列于下表3中。
表3.
分子 ％功效(1nM)
bs-Ab-2双特异性抗体 57
bs-Ab-3双特异性抗体 16
表4：序列汇总
Figure BDA0003946591420000751
Figure BDA0003946591420000761
Figure BDA0003946591420000771
Figure BDA0003946591420000781
Figure BDA0003946591420000791
Figure BDA0003946591420000801
Figure BDA0003946591420000811
Figure BDA0003946591420000821
Figure BDA0003946591420000831
Figure BDA0003946591420000841
Figure BDA0003946591420000851
Figure BDA0003946591420000861
Figure BDA0003946591420000871
Figure BDA0003946591420000881
Figure BDA0003946591420000891
Figure BDA0003946591420000901
Figure BDA0003946591420000911
Figure BDA0003946591420000921
Figure BDA0003946591420000931
Figure BDA0003946591420000941
Figure BDA0003946591420000951
Figure BDA0003946591420000961
Figure BDA0003946591420000971
Figure BDA0003946591420000981
Figure BDA0003946591420000991
Figure BDA0003946591420001001
Figure BDA0003946591420001011
Figure BDA0003946591420001021
其它实施方案
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文中，引用的程度如同每个独立的公布或专利申请具体地和单独地指示以引用的方式并入一样。
尽管已经结合其特定实施方案描述本发明，但应了解，能够进行进一步修改，并且本申请旨在涵盖大体上符合本发明的原理并包括虽然偏离本发明但属于本发明所属领域内的已知或常用惯例并且可以应用于上文中阐述和权利要求书的范围所列出的必要特征中的任何变型、用途或变更。
其它实施方案在权利要求书内。
序列表
<110> 美真达治疗公司(MAGENTA THERAPEUTICS, INC.)
<120> T细胞双特异性结合蛋白
<130> M103034 2210WO
<140>
<141>
<150> 62/990,281
<151> 2020-03-16
<160> 153
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 1
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 2
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 3
His Gly Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Glu Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 5
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 6
Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 7
Asn Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 8
Ile Ile Asn Pro Arg Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Arg Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 9
His Gly Arg Gly Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 10
Arg Ser Ser Gln Gly Ile Arg Ser Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 11
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 12
Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Ile Ile Asn Pro Arg Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Arg Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Arg Gly Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Gly Ile Arg Ser Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 16
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 16
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 17
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Cys Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 18
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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115 120 125
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 19
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 20
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 21
Phe Thr Phe Ser Asp Ala Asp Met Asp
1 5
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 22
Arg Thr Arg Asn Lys Ala Gly Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 23
Ala Arg Glu Pro Lys Tyr Trp Ile Asp Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 24
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 25
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 26
Gln Gln Ser Tyr Ile Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Asp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Gly Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Lys Tyr Trp Ile Asp Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ile Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Ala Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 1311
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
agtctagctg ctgcacaggc tggctggctg gctggctgct aagggctgct ccacgctttt 60
gccggaggac agagactgac atggaacagg ggaagggcct ggctgtcctc atcctggcta 120
tcattcttct tcaaggtact ttggcccagt caatcaaagg aaaccacttg gttaaggtgt 180
atgactatca agaagatggt tcggtacttc tgacttgtga tgcagaagcc aaaaatatca 240
catggtttaa agatgggaag atgatcggct tcctaactga agataaaaaa aaatggaatc 300
tgggaagtaa tgccaaggac cctcgaggga tgtatcagtg taaaggatca cagaacaagt 360
caaaaccact ccaagtgtat tacagaatgt gtcagaactg cattgaacta aatgcagcca 420
ccatatctgg ctttctcttt gctgaaatcg tcagcatttt cgtccttgct gttggggtct 480
acttcattgc tggacaggat ggagttcgcc agtcgagagc ttcagacaag cagactctgt 540
tgcccaatga ccagctctac cagcccctca aggatcgaga agatgaccag tacagccacc 600
ttcaaggaaa ccagttgagg aggaattgaa ctcaggactc agagtagtcc aggtgttctc 660
ctcctattca gttcccagaa tcaaagcaat gcattttgga aagctcctag cagagagact 720
ttcagcccta aatctagact caaggttccc agagatgaca aatggagaag aaaggccatc 780
agagcaaatt tgggggtttc tcaaataaaa taaaaataaa aacaaatact gtgtttcaga 840
agcgccacct attggggaaa attgtaaaag aaaaatgaaa agatcaaata accccctgga 900
tttgaatata attttttgtg ttgtaatttt tatttcgttt ttgtataggt tataattcac 960
atggctcaaa tattcagtga aagctctccc tccaccgcca tcccctgcta cccagtgacc 1020
ctgttgccct cttcagagac aaattagttt ctcttttttt tttttttttt tttttttttg 1080
agacagtctg gctctgtcac ccaggctgaa atgcagtggc accatctcgg ctcactgcaa 1140
cctctgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgggcag ctgggattac 1200
aggcacacac taccacacct ggctaatttt tgtattttta gtagagacag ggttttgctc 1260
tgttggccaa gctggtctcg aactcctgac ctcaagtgat ccgcccgcct c 1311
<210> 32
<211> 182
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
180
<210> 33
<211> 771
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
agagaagcag acatcttcta gttcctcccc cactctcctc tttccggtac ctgtgagtca 60
gctaggggag ggcagctctc acccaggctg atagttcggt gacctggctt tatctactgg 120
atgagttccg ctgggagatg gaacatagca cgtttctctc tggcctggta ctggctaccc 180
ttctctcgca agtgagcccc ttcaagatac ctatagagga acttgaggac agagtgtttg 240
tgaattgcaa taccagcatc acatgggtag agggaacggt gggaacactg ctctcagaca 300
ttacaagact ggacctggga aaacgcatcc tggacccacg aggaatatat aggtgtaatg 360
ggacagatat atacaaggac aaagaatcta ccgtgcaagt tcattatcga atgtgccaga 420
gctgtgtgga gctggatcca gccaccgtgg ctggcatcat tgtcactgat gtcattgcca 480
ctctgctcct tgctttggga gtcttctgct ttgctggaca tgagactgga aggctgtctg 540
gggctgccga cacacaagct ctgttgagga atgaccaggt ctatcagccc ctccgagatc 600
gagatgatgc tcagtacagc caccttggag gaaactgggc tcggaacaag tgaacctgag 660
actggtggct tctagaagca gccattacca actgtacctt cccttcttgc tcagccaata 720
aatatatcct ctttcactca gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 771
<210> 34
<211> 171
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 35
<211> 1534
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
tattgtcaga gtcctcttgt ttggccttct aggaaggctg tgggacccag ctttcttcaa 60
ccagtccagg tggaggcctc tgccttgaac gtttccaagt gaggtaaaac ccgcaggccc 120
agaggcctct ctacttcctg tgtggggttc agaaaccctc ctcccctccc agcctcaggt 180
gcctgcttca gaaaatgaag tagtaagtct gctggcctcc gccatcttag taaagtaaca 240
gtcccatgaa acaaagatgc agtcgggcac tcactggaga gttctgggcc tctgcctctt 300
atcagttggc gtttgggggc aagatggtaa tgaagaaatg ggtggtatta cacagacacc 360
atataaagtc tccatctctg gaaccacagt aatattgaca tgccctcagt atcctggatc 420
tgaaatacta tggcaacaca atgataaaaa cataggcggt gatgaggatg ataaaaacat 480
aggcagtgat gaggatcacc tgtcactgaa ggaattttca gaattggagc aaagtggtta 540
ttatgtctgc taccccagag gaagcaaacc agaagatgcg aacttttatc tctacctgag 600
ggcaagagtg tgtgagaact gcatggagat ggatgtgatg tcggtggcca caattgtcat 660
agtggacatc tgcatcactg ggggcttgct gctgctggtt tactactgga gcaagaatag 720
aaaggccaag gccaagcctg tgacacgagg agcgggtgct ggcggcaggc aaaggggaca 780
aaacaaggag aggccaccac ctgttcccaa cccagactat gagcccatcc ggaaaggcca 840
gcgggacctg tattctggcc tgaatcagag acgcatctga ccctctggag aacactgcct 900
cccgctggcc caggtctcct ctccagtccc cctgcgactc cctgtttcct gggctagtct 960
tggaccccac gagagagaat cgttcctcag cctcatggtg aactcgcgcc ctccagcctg 1020
atcccccgct ccctcctccc tgccttctct gctggtaccc agtcctaaaa tattgctgct 1080
tcctcttcct ttgaagcatc atcagtagtc acaccctcac agctggcctg ccctcttgcc 1140
aggatattta tttgtgctat tcactccctt ccctttggat gtaacttctc cgttcagttc 1200
cctccttttc ttgcatgtaa gttgtccccc atcccaaagt attccatcta cttttctatc 1260
gccgtcccct tttgcagccc tctctgggga tggactgggt aaatgttgac agaggccctg 1320
ccccgttcac agatcctggc cctgagccag ccctgtgctc ctccctcccc caacactccc 1380
taccaacccc ctaatcccct actccctcca ccccccctcc actgtaggcc actggatggt 1440
catttgcatc tccgtaaatg tgctctgctc ctcagctgag agagaaaaaa ataaactgta 1500
tttggctgca agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1534
<210> 36
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 37
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 38
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
SEQ ID NO: 39 EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 40 DIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 41 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 42 GYTFTNYY
SEQ ID NO: 43 IYPGDGNT
SEQ ID NO: 44 ARDSYSNYYFDY
SEQ ID NO: 45 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 46 QSLLNSRTRKNY
SEQ ID NO: 47 WAS
SEQ ID NO: 48 TQSFILRT
SEQ ID NO: 49 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 50 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 51 IYAMN
SEQ ID NO: 52 RIRSKYNNYATYYADSVKS
SEQ ID NO: 53 HGNFGNSYVSFFAY
SEQ ID NO: 54 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 55 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 56 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 57 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 58 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 59 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 60 GSSTGAVTSGYYPN
SEQ ID NO: 61 GTKFLAP
SEQ ID NO: 62 ALWYSNRWV
SEQ ID NO: 63 KYAMN
SEQ ID NO: 64 RIRSKYNNYATYYADSVKD
SEQ ID NO: 65 HGNFGNSYISYWAY
SEQ ID NO: 66 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 67 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 68 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 69 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 70 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 71 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 72 SYAMN
SEQ ID NO: 73 RIRSKYNNYATYYADSVKG
SEQ ID NO: 74 HGNFGNSYLSFWAY
SEQ ID NO: 75 EVQLVESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 76 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 77 EVQLLESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 78 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 79 EVQLVESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 80 EVQLLESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 81 RYAMN
SEQ ID NO: 82 RIRSKYNNYATYYADSVKG
SEQ ID NO: 83 HGNFGNSYLSYFAY
SEQ ID NO: 84 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 85 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 86 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 87 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 88 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 89 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 90 VYAMN
SEQ ID NO: 91 RIRSKYNNYATYYADSVKK
SEQ ID NO: 92 HGNFGNSYLSWWAY
SEQ ID NO: 93 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 94 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 95 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 96 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 97 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 98 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 99 KYAMN
SEQ ID NO: 100 RIRSKYNNYATYYADSVKS
SEQ ID NO: 101 HGNFGNSYTSYYAY
SEQ ID NO: 102 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 103 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 104 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 105 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 106 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 107 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 108 RSSTGAVTSGYYPN
SEQ ID NO: 109 ATDMRPS
SEQ ID NO: 110 ALWYSNRWV
SEQ ID NO: 111 GYAMN
SEQ ID NO: 112 RIRSKYNNYATYYADSVKE
SEQ ID NO: 113 HRNFGNSYLSWFAY
SEQ ID NO: 114 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 115 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 116 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 117 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 118 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 119 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 120 VYAMN
SEQ ID NO: 121 RIRSKYNNYATYYADSVKK
SEQ ID NO: 122 HGNFGNSYISWWAY
SEQ ID NO: 123 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 124 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 125 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 126 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 127 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 128 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 129 GSSTGAVTSGNYPN
SEQ ID NO: 130 GTKFLAP
SEQ ID NO: 131 VLWYSNRWV
SEQ ID NO: 132 SYAMN
SEQ ID NO: 133 RIRSKYNNYATYYADSVKG
SEQ ID NO: 134 HGNFGNSYVSWWAY
SEQ ID NO: 135 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 136 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 137 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 138 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 139 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 140 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 141 KYAMN
SEQ ID NO: 142 RIRSKYNNYATYYADSVKD
SEQ ID NO: 143 HGNFGNSYISYWAY
SEQ ID NO: 144 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 145 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 146 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 147 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 148 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 149 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 150 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMAIINPRDSDTRYRPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYEGYEGAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 151 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIRSDLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 152 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDADMDWVRQAPGKGLEWVGRTRNKAGSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAREPKYWIDFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 153 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIAPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (49)

1.一种双特异性结合多肽，所述多肽包含
结合至造血干细胞(HSC)或造血祖细胞上表达的CD117的第一抗原结合部分；以及
结合至T细胞上表达的抗原的第二抗原结合部分。
2.如权利要求1所述的双特异性结合多肽，其中所述第二抗原结合部分结合至CD3。
3.如权利要求1或2所述的双特异性结合多肽，其中所述第一抗原结合部分包含抗CD117单链可变片段(scFv)并且所述第二抗原结合部分包含抗CD3 scFv。
4.如权利要求1或2所述的双特异性结合多肽，其中所述双特异性结合多肽是双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
5.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性结合多肽，其中所述抗CD117结合部分包含
(i)包含具有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区和包含具有分别如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或
(ii)包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(iii)包含具有分别如SEQ ID NO:21、22和23所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区和包含具有分别如SEQ IDNO:24、25和26所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或
(iv)包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。
6.如权利要求2-5中任一项所述的双特异性结合多肽，其中所述抗CD3结合部分包含
(i)包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(ii)包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区。
7.一种包含CD117结合区和CD3结合区的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中所述CD117结合区包含
(i)包含具有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区和包含具有分别如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或
(ii)包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链可变区，和
包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(iii)包含具有分别如SEQ ID NO:21、22和23所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区和包含具有分别如SEQ IDNO:24、25和26所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或
(iv)包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变区，和
包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。
8.如权利要求7所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中所述CD3结合区包含
(i)如SEQ ID NO:37所示的抗CD117 VH氨基酸序列，和
如SEQ ID NO:38所示的抗CD117 VL氨基酸序列；或
(ii)包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的重链可变区，和
包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区。
9.如权利要求4、7或8中任一项所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，所述抗体或其部分包含有包含第一重链的第一CH3区和第二重链的第二CH3区的Fc区，其中所述第一CH3区和所述第二CH3区能够通过杵臼相互作用稳定缔合。
10.如权利要求4或7-9所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，所述抗体或其部分是选自由IgG、IgA、IgM、IgD和IgE组成的组的同种型。
11.如权利要求10所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中所述IgG是IgG1或IgG4。
12.如权利要求4或7-11中任一项所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中所述Fc区相对于野生型Fc区在位置L234、L235、H435或它们的组合(EU索引)处包含一个或多个氨基酸取代。
13.如权利要求12所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中在位置L234处的所述氨基酸取代是L234A。
14.如权利要求12或13所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中在位置L235处的所述氨基酸取代是L235A。
15.如权利要求12-14中任一项所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中在位置H435处的所述氨基酸取代是H435A。
16.如权利要求4或7-15中任一项所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中所述第一CH3区在位置T366、L368和Y407(EU索引)处包含氨基酸取代，并且所述第二CH3区在位置T366(EU索引)处包含氨基酸取代。
17.如权利要求16所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中在位置T366处的所述氨基酸取代是T366S。
18.如权利要求16或17所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中在位置L368处的所述氨基酸取代是L368A。
19.如权利要求16-18中任一项所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中在位置Y407处的所述氨基酸取代是Y407V或Y407T。
20.如权利要求16-19中任一项所述的双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，其中在位置T366处的所述氨基酸取代是T366W或T366Y。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
22.一种治疗人类患者的干细胞病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
23.一种治疗人类患者的免疫缺陷病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述免疫缺陷病症是先天性免疫缺陷或获得性免疫缺陷。
25.一种治疗人类患者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述代谢病症选自由糖原贮积病、粘多糖贮积症、高歇氏病、赫尔勒氏病、鞘脂贮积症和异染性脑白质营养不良组成的组。
27.一种治疗人类患者的自身免疫病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述自身免疫病症选自由以下组成的组：多发性硬化症、人类全身性狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病、治疗牛皮癣、1型糖尿病、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病、普秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫内耳病、自身免疫淋巴增生综合征、自身免疫***、巴娄病、***、大疱性类天疱疮、心肌病、恰加斯氏病、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、克罗恩氏病、疤痕性类天疱疮、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、冷凝集素病、CREST综合征、德戈斯病、盘状狼疮、自主神经异常、子宫内膜异位、原发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、特发性和/或急性血小板减少性紫癜、特发性肺纤维化、IgA神经病、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、川崎氏病、扁平苔癣、莱姆病、梅尼埃病、混合性***病、重症肌无力、神经性肌强直、眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、沃德氏甲状腺炎、寻常天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多肌炎和皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、结节性多动脉炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、原发性无丙种球蛋白血症、雷诺现象、莱特尔氏综合征、风湿热、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、僵人综合征、高安氏动脉炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、外阴痛和韦格纳氏肉芽肿病。
29.一种治疗人类患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述癌症选自由白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和成神经细胞瘤组成的组。
31.一种使人类患者中的干细胞群体耗竭的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-20中任一项所述的双特异性结合多肽、双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分。
32.如权利要求31所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用包含造血干细胞的移植物。
33.一种选择性地使有需要的人类患者中的造血干细胞(HSC)耗竭的方法，所述方法包括向有需要的所述人类受试者施用双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分，以使HSC耗竭，其中所述双特异性抗体或其双特异性抗原结合部分包含特异性结合至人类HSC细胞表面抗原的第一结合部分并且包含特异性结合至人类T细胞表面抗原的第二结合部分。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述第一抗原结合部分结合至选自由以下组成的组的人类HSC细胞表面抗原：CD7、CDwl2、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD117、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349和CD350。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述第一抗原结合部分结合至CD117。
36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述第二抗原结合部分结合至人类CD3。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述第一抗原结合部分结合至CD117，并且其中所述第一抗原结合部分包含
(i)包含具有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，并且包含有包含具有分别如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或
(ii)包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链可变区，和
包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(iii)包含具有分别如SEQ ID NO:21、22和23所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，并且包含有包含具有分别如SEQ ID NO:24、25和26所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区；或
(iv)包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变区，和
包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。
38.如权利要求47所述的方法，其中所述第二抗原结合部分结合至CD3，并且其中所述第二抗原结合部分包含
(i)包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区，和
包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(ii)包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区。
39.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段是IgG。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述IgG是IgG1或IgG4。
41.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段包含有包含第一重链的第一CH3区的Fc区，并且包含第二重链的第二CH3区，其中所述第一CH3区和所述第二CH3区能够通过杵臼相互作用稳定缔合。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述第一CH3区在位置T366、L368和Y407(EU索引)处包含氨基酸取代，并且所述第二CH3区在位置T366(EU索引)处包含氨基酸取代。
43.如权利要求42所述的方法，其中在位置T366处的所述氨基酸取代是T366S。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中在位置L368处的所述氨基酸取代是L368A。
45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其中在位置Y407处的所述氨基酸取代是Y407V或Y407T。
46.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中在位置T366处的所述氨基酸取代是T366W或T366Y。
47.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所述患者患有干细胞病症并且需要移植。
48.如权利要求47所述的方法，所述方法还包括在耗竭后向所述患者施用HSC移植物。
49.如权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述患者患有免疫缺陷病症、代谢病症、自身免疫病症或癌症。
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