CN115656350A - 一种确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式的方法，包括以下步骤：将修饰的透明质酸寡糖与还原剂混合，得到还原产物；将还原产物进行液相色谱串联质谱检测，以得到分离的修饰寡糖；将分离的修饰寡糖进行二级或三级串联质谱检测，以得到检测结果；基于检测结果确定所述交联透明质酸的修饰位点和交联方式。本申请的方法可以将各种修饰的透明质酸寡糖充分分离，并进一步对分离的修饰的透明质酸寡糖进行质谱检测并解析，从而确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式。
Description
技术领域
本申请属于检测技术领域，具体地，涉及一种确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种线性非硫酸化糖胺聚糖，由重复二糖单元：d-葡萄糖醛酸(1→3)--d-N乙酰氨基葡萄糖(1→4)组成(如图1所示)。透明质酸存在于所有脊椎动物中，一级结构具有保守性，其变化仅在于聚合物的分子量和多分散性指数。人类的皮肤、眼睛和细胞外基质中富含透明质酸。由于带有大量负电荷，透明质酸具有很强的亲水性，因此可以作为空间填料、润滑剂和渗透缓冲液。然而，天然透明质酸的机械性能差、在体内会被迅速降解和清除，限制了其作为生物材料的应用。为了改善透明质酸的机械性能，增加抗透明质酸酶降解的能力，通常对其进行化学改性或交联以形成水凝胶。
制备交联透明质酸最常用的方法是在碱性条件下将透明质酸与交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)反应，在透明质酸和交联剂之间产生稳定的共价醚键。在交联过程中，BDDE的环氧基团与透明质酸分子上的亲核基团反应，形成1,4-丁二醇二(丙烷-2,3-二元醇)醚(BDPE)衍生物。一些BDDE交联剂分子两端都以游离羟基形式存在，一些BDDE分子仅在一端与透明质酸结合，一些BDDE分子两端均与透明质酸结合(如图2，a-c所示)。
透明质酸每的个亲核基团均可以和BDDE发生反应，透明质酸的二糖单元上有7个位点，包括糖醛酸(HexA)2、3号位C原子以及N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)1、4、6号位C原子连接的羟基、HexA的羧基、以及GlcNAc的酰胺基(如图3所示)。目前，尚不清楚与BDDE发生反应的修饰位点，因此也无法准确确定透明质酸和BDDE的交联方式。
不同的修饰位点和交联方式可能会影响交联透明质酸的机械性能，进而影响交联产品的品质和应用范围。确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式对交联透明质酸产品的生产和应用具有重要的指导意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本申请提供一种确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式的方法。
具体来说，本申请涉及如下方面：
1.一种确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将修饰的透明质酸寡糖与还原剂混合，得到还原产物；
将所述还原产物进行液相色谱串联质谱分析，以得到分离的修饰寡糖；
将所述分离的修饰寡糖进行二级或三级串联质谱检测，以得到检测结果；
检测结果确定所述交联透明质酸的修饰位点和交联方式。
根据项1所述的方法，其特征在于，所述修饰的透明质酸寡糖通过酶解交联透明质酸得到，所述交联透明质酸是通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联的透明质酸。
3.根据项1所述的方法，其特征在于，所述二级或三级串联质谱检测的碎裂模式包含碰撞诱导解离(CID)、高能碎裂解离(HCD)中的一种或两种。
.根据项3所述的方法，其特征在于，碰撞诱导解离(CID)的碰撞能量为15-40，高能碎裂解离(HCD)的碰撞能量为40-80。
5.根据项1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱检测的色谱条件为：使用多孔石墨化碳色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为甲酸铵或乙酸铵水溶液，流动相B为甲酸铵或乙酸铵的乙腈水溶液。
质谱条件为：负离子扫描模式，鞘气流速为10-20arb，辅助气流速为0-5arb，喷雾电压为3-4KV，毛细管温度为250-350℃，离子透镜电压为30-70％V。
7.根据项4所述的方法，其特征在于，流动相A中甲酸铵或乙酸铵水溶液中甲酸铵或乙酸铵的浓度为5-10mM。
.根据项4所述的方法，其特征在于，3.根据项1所述的鉴定方法，其特征在于，流动相B中甲酸铵或乙酸铵的乙腈水溶液中甲酸铵或乙酸铵的浓度为5-10mM，乙腈浓度为90-95wt％。
9.根据项4所述的方法，其特征在于，液相色谱的色谱柱柱温为25-35℃。
10.根据项4所述的方法，其特征在于，液相色谱串联质谱检测中流动相的流速为0.2-0.4mL.min-1。
本申请的方法可以将各种修饰的透明质酸寡糖充分分离，并进一步对分离的修饰的透明质酸寡糖进行质谱检测并解析，从而确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式。
附图说明
图1显示透明质酸分子结构。
图2显示BDDE在交联透明质酸中的存在形式。
图3显示不饱和透明质酸二糖可能的修饰位点。
图4显示交联透明质酸降解产物中占比最高的四类悬挂(2-B、4-B)和交联修饰(2-B-2、4-B-2)片段的示意结构。
图5显示BDDE分子的R-S绝对构型。
图6显示不饱和透明质酸二糖α和β异头体的NaBH4还原。
图7显示使用实施例1的分离方法得到的修饰的透明质酸寡糖在色谱中的分离情况。
图8显示使用实施例2的分离方法得到的修饰的透明质酸寡糖在色谱中的分离情况。
图9显示使用对比例1的分离方法得到的修饰的透明质酸寡糖在色谱中的分离情况。
图10显示使用对比例2的分离方法得到的修饰的透明质酸寡糖在色谱中的分离情况。
图11显示2-B结构中各色谱峰碎片离子图。
图12显示4-B结构中各色谱峰碎片离子图。
图13显示2-B-2结构中各色谱峰产生的特定碎片离子的提取离子流图。
图14显示4-B-2结构中各色谱峰产生的特定碎片离子的提取离子流图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。
理论上，每个HA二糖单元中有7个位点可以和BDDE发生反应，包括糖醛酸(HexA)2、3号位C原子以及N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)1、4、6号位C原子连接的羟基、HexA的羧基、以及GlcNAc的酰胺基(如图3所示)。脱质子化的羟基比羧基和酰胺基都具有更强的亲核性，此外，在碱性条件下，任何与HA羧酸基形成的酯都可能发生水解。因此，羟基是最可能和BDDE发生反应，并与交联剂形成稳定醚键的位点。不同羟基与BDDE结合能力的相对趋势尚不明确，但可能与伯醇和仲醇之间的空间差异、聚合物的构象效应、羟基酸度的差异以及反应条件差异等因素相关。
由于BDDE交联的HA分子量大且在水中的溶解度差，在对其进行交联度表征时，通常采用工具酶(例如可以为透明质酸酶或硫酸软骨素酶ABC等)将其降解为大小不同的寡糖片段，酶解过程中寡糖产物己糖醛酸4、5号位C原子之间会形成一个碳碳双键(如图3所示)。寡糖片段可以分为悬挂修饰片段和交联修饰片段两种，降解产物中占比最高的四类悬挂(2-B、4-B)和交联修饰(2-B-2、4-B-2)片段的示意结构如图4。
需要指出的是，如上所述，由于BDDE与HA糖单元的连接方式有多种，图4仅展示了某一类结构(如2-B)中的一种交联情况(2-B(GlcNAc-OH6))。此外，由于BDDE交联剂的2’和2”位C原子存在不同的绝对构型(R或S)(如图5所示)，某一种特定的寡糖(如2-B(GlcNAc-OH6))也可能受到BDDE绝对构型的影响，形成不同的异构体。
另一方面，位于寡糖链末端的糖单元在形成半缩醛的过程中存在C1的异构化现象，导致两个非对应异构体(α和β)形成，这样的异构体互为异头体(anomers)。以不饱和透明质酸二糖为例，GlcNAc一号位C原子连接的羟基可能与六号位C原子位于糖环平面的同侧或者异侧，分别形成β和α异头体(如图6)。异头体的存在进一步增加了修饰的透明质酸寡糖的分离和结构分析的难度。
针对现有技术存在的问题，本申请提供一种确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式的方法，包括以下步骤：
将修饰的透明质酸寡糖与还原剂混合，得到还原产物；
将所述还原产物进行液相色谱串联质谱(LC-MS，或称为液相色谱-质谱联用)检测，以得到分离的修饰寡糖；
将所述分离的修饰寡糖进行二级或三级液相色谱串联质谱检测，以得到检测结果；
基于检测结果确定所述交联透明质酸的修饰位点和交联方式。
在本申请中，修饰的透明质酸寡糖是指有化学修饰的透明质酸寡糖。例如可以为使用透明质酸酶或硫酸软骨素酶酶解交联透明质酸得到的各种透明质酸寡糖。
在一个具体的实施方式中，所述交联透明质酸是通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联的透明质酸。其中，这种交联透明质酸降解后得到的占比最高的主要的修饰的透明质酸寡糖如图4所示，包括2-B、4-B、2-B-2、4-B-2四类结构。
在本申请中，将修饰的透明质酸寡糖与还原剂混合，得到还原产物，所述的还原剂可以是本领域常用的还原剂，本领域技术人员可以进行常规选择，例如，可以是硼氢化钠(NaBH4)。具体操作时，可以使用过量的硼氢化钠与修饰的透明质酸寡糖反应，然后将剩余未参与反应的硼氢化钠中和。
如上所述，位于寡糖链末端的糖单元在形成半缩醛的过程中存在C1的异构化现象，导致两种异头体α和β的形成。为消除两种异构体对色谱分离的影响，可以采用还原剂将寡糖末端的糖单元还原并形成开环结构(如图6所示)。需要指出的是，若异头C上的羟基被BDDE修饰则无法发生还原反应。
LC-MS以液相色谱作为分离***，质谱为检测***。样品中的各组分在液相色谱部分相互分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质核比分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。
其中，液相色谱-质谱联用技术中使用多孔石墨化碳色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱。在一个具体的实施方式中，多孔石墨化碳色谱柱为Hypercarb多孔石墨化碳色谱柱。
流动相A为甲酸铵或乙酸铵水溶液，流动相B为甲酸铵或乙酸铵的乙腈水溶液。
在一个具体的实施方式中，流动相A为甲酸铵水溶液，其中甲酸铵的浓度为5-10mM，例如可以为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。
在一个具体的实施方式中，可以调节流动相A的pH为2.5-3.5，例如可以为2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5。可以使用常规的酸、碱或缓冲液调节流动相A的pH，例如可以使用甲酸。
在一个具体的实施方式中，流动相A为乙酸铵水溶液，其中乙酸铵的浓度为5-10mM，例如可以为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。
在一个具体的实施方式中，可以调节流动相A的pH为2.5-3.5，例如可以为2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5。可以使用常规的酸、碱或缓冲液调节流动相A的pH，例如可以使用乙酸。
在一个具体的实施方式中，流动相B为甲酸铵的乙腈水溶液，其中甲酸铵的浓度为5-10mM，例如可以为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。乙腈浓度为90-95wt％，例如可以为90wt％、91wt％、92wt％、93wt％、94wt％、95wt％。
在一个具体的实施方式中，可以调节流动相B的pH为2.5-3.5，例如可以为2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5。可以使用常规的酸、碱或缓冲液调节流动相A的pH，例如可以使用甲酸。
在一个具体的实施方式中，流动相B为乙酸铵的乙腈水溶液，其中乙酸铵的浓度为5-10mM，例如可以为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。乙腈浓度为90-95wt％，例如可以为90wt％、91wt％、92wt％、93wt％、94wt％、95wt％。
在一个具体的实施方式中，可以调节流动相B的pH为2.5-3.5，例如可以为2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5。可以使用常规的酸、碱或缓冲液调节流动相A的pH，例如可以使用乙酸。
在一个具体的实施方式中，流动相A为5mM甲酸铵水溶液，并使用甲酸调节pH为3，流动相B为5mM甲酸铵的乙腈水溶液，并使用甲酸调节pH为3，乙腈浓度为90wt％。
在一个具体的实施方式中，流动相A为5mM乙酸铵水溶液，并使用乙酸调节pH为3，流动相B为5mM乙酸铵的乙腈水溶液，并使用乙酸调节pH为3，乙腈浓度为90wt％。
在一个具体的实施方式中，本申请的梯度洗脱过程可以分为五个阶段，具体为：
第一阶段，流动相A和流动相B的体积比为(90-100)：(10-0)；
第二阶段，流动相A和流动相B的体积比为(75-85)：(25-15)；
第三阶段，流动相A和流动相B的体积比为(40-50)：(60-50)；
第四阶段，流动相A和流动相B的体积比为(0-10)：(100-90)；
第五阶段，流动相A和流动相B的体积比为(90-100)：(10-0)。
在一个具体的实施方式中，本申请的梯度洗脱过程可以分为五个阶段，具体为：
第一阶段，流动相A和流动相B的体积比为95：5；
第二阶段，流动相A和流动相B的体积比为78：22；
第三阶段，流动相A和流动相B的体积比为45：55；
第四阶段，流动相A和流动相B的体积比为0：100；
第五阶段，流动相A和流动相B的体积比为95：5。
在一个具体的实施方式中，本申请的梯度洗脱过程为：
第一阶段，0-3min，流动相A和流动相B的体积比为95：5；
第二阶段，3-100min，流动相A和流动相B的体积比为78：22；
第三阶段，100-105min，流动相A和流动相B的体积比为45：55；
第四阶段，105-115min，流动相A和流动相B的体积比为0：100；
第五阶段，115-140min，流动相A和流动相B的体积比为95：5。
在一个具体的实施方式中，液相色谱-质谱联用技术中色谱柱的柱温为25-35℃，例如可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。
在一个具体的实施方式中，液相色谱-质谱联用技术中使用的流动相的流速为0.2-0.4mL.min-1，例如可以为0.2mL.min-1、0.3mL.min-1、0.4mL.min-1。
在一个具体的实施方式中，液相色谱-质谱联用技术的质谱条件为：
负离子扫描模式，鞘气流速为10-20arb，辅助气流速为0-5arb，喷雾电压为3-4KV，毛细管温度为250-350℃，离子透镜电压为50％V。
在一个具体的实施方式中，液相色谱-质谱联用技术的质谱条件为：
负离子扫描模式，鞘气流速为15arb，辅助气流速为3arb，喷雾电压为3.5KV，毛细管温度为275.00℃，离子透镜电压为50％V。
对分离的修饰寡糖进行质谱检测可以采用在线二级串联质谱(LC-MS/MS)或在线三级串联质谱(LC-MS/MS/MS)对分离得到的修饰的寡糖进行碎裂，并通过碎片离子鉴定交联剂的修饰位点与交联方式。
结构解析常用的碎裂模式种类较多，例如，有电子捕获碎裂(ECD)、电子转移碎裂(ETD)、碰撞诱导解离(CID)、电子脱离解离(EDD)碰撞活化解离(CAD)等，不同的碎裂模式碎裂机理与碎裂效率不同。本申请分离的修饰的透明质酸寡糖包含多种之前尚无报道的寡糖结构，现有文献中没有相应的碎裂模式和碎裂条件，因此，为获得结构信息更为丰富的修饰的透明质酸寡糖碎片离子，发明人通过大量的实验研究和创造性工作才得以确定碎裂模式种类。
本申请中，所述二级或三级串联质谱检测的碎裂模式包含碰撞诱导解离(CID)、高能碎裂解离(HCD)中的一种或两种。
在一个具体的实施方式中，采用碰撞诱导解离(CID)碎裂模式。
在一个具体的实施方式中，采用高能碎裂解离(HCD)碎裂模式。
在一个具体的实施方式中，采用碰撞诱导解离(CID)和高能碎裂解离(HCD)两种碎裂模式。
在一个具体的实施方式中，碰撞诱导解离(CID)的碰撞能量为15-40。
在一个具体的实施方式中，高能碎裂解离(HCD)的碰撞能量为40-80。
在一个具体的实施方式中，CID模式下串联质谱的参数设定如下：Iso width(m/z)为3.0，归一化碰撞能量为25，Act Q,0.25,作用时间为10ms。
在一个具体的实施方式中，HCD模式下串联质谱的参数设定如下：Iso width(m/z)为3.0，归一化碰撞能量为60，Act Q,0.25，作用时间为0.1ms。
目前并没有方法可以确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式，本申请的方法可以将BDDE修饰的各种透明质酸寡糖进行充分分离，并进一步通过二级或三级液相色谱串联质谱解析，确定透明质酸二糖单元与BDDE发生交联反应的糖单元或特定羟基位点，从而确定透明质酸和BDDE的交联方式。
实施例
实施例1
(1)交联透明质酸的酶解
酶解缓冲液：取二水合磷酸二氢钠约2.74g，无水磷酸氢二钠约0.35g，精密称定，置同一100ml量瓶中，加水溶解并定量稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml置100ml量瓶，用水定量稀释至刻度，摇匀，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.6，置121℃灭菌10分钟，放冷，即得。
透明质酸酶溶液(1万单位/ml)：取透明质酸酶(5万单位)1支(华熙生物科技股份有限公司)，转移至5ml容量瓶，用酶解缓冲液定量稀释至刻度，摇匀，即得。
酶解液即供试品溶液：取交联透明质酸粉末或水凝胶适量(华熙生物科技股份有限公司)(相当于交联透明质酸约10mg)，精密称定，置20ml顶空瓶中，加1ml酶解缓冲液，0.5ml水，密封，压盖，置烘箱121℃灭菌10分钟，放冷，用注射器取透明质酸酶溶液(1万单位/ml)1ml,注射进顶空瓶，置水浴恒温振荡器中，设置温度42℃，转速190rpm，酶解24h，转移至5ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液0.5ml洗涤顶空瓶一次，用水适量洗涤顶空瓶一次，洗涤液并入同一量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
(2)样品纯化
将以上得到的酶解液转移至超滤管(500μl，截留分子量为10kDa)，5000rcf条件下离心20min。向上管中加入400μl H2O，5000rcf条件下离心20min，保留底管中滤液。通过以上两次离心提高修饰的透明质酸寡糖的回收率，最终得到的修饰的透明质酸寡糖样品的浓度约为1mg/ml。
(3)样品还原
样品瓶中取步骤(2)中得到的滤液4ml，向其中缓慢加入0.5M NaBH4溶液0.3ml(NaBH4溶液现配现用)，42℃反应1h(每隔20分钟震荡1次)。反应完成后向样品瓶中加入0.5M乙酸0.35ml，中和剩余未参与反应的NaBH4。将上述样品冻干，并复溶于200μl H2O中，修饰的透明质酸寡糖的最终浓度约为20mg/ml。
(4)LC-MS分离
使用LC-MS分离步骤(3)中得到的修饰的透明质酸寡糖。具体的LC-MS中使用的色谱条件如下：
色谱柱：Hypercarb多孔石墨化碳色谱柱(柱长150cm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)。
色谱条件：流动相A：5mM甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至3.0；流动相B：5mM甲酸铵90％乙腈水溶液，用甲酸调节pH至3.0；柱温：26℃；流速：0.2mL.min-1；洗脱梯度见表1。进样量为3μl。
表1
| 序号 | 时间(min) | A(％) | B(％) | 曲线 |
| 1 | 0 | 95 | 5 | 5 |
| 2 | 3 | 78 | 22 | 5 |
| 3 | 100 | 45 | 55 | 5 |
| 4 | 105 | 0 | 100 | 5 |
| 5 | 115 | 0 | 100 | 5 |
| 6 | 115.01 | 95 | 5 | 5 |
| 7 | 140 | 95 | 5 | 5 |
其中0-18min，115-140min的洗脱液引入废液，其余部分引入质谱。
质谱条件(LTQ-Orbitrap,Thermo Fisher Scientific)为：负离子扫描模式；鞘气流速15arb；辅助气流速3arb；喷雾电压3.5KV；毛细管温度275.00℃；离子透镜电压为50％V。
LC-MS得到的修饰的透明质酸寡糖的分离情况如图7所示。
由图7可以看出，2-B在色谱中呈现5个色谱峰；4-B在色谱中呈现3个色谱峰。2-B-2被还原后又可以进一步分成两类结构，第一类结构的m/z为963.36(z＝-1)，该类结构中两个位于二糖还原端的GlcNAc糖单元均被NaBH4还原而形成开环结构；第二类结构的m/z为961.35(z＝-1)，该类结构中两个位于二糖还原端的GlcNAc糖单元仅有一个被NaBH4还原而形成开环结构，说明另一个未被还原的GlcNAc糖单元1号位C连接的羟基被BDDE分子修饰。与2-B-2类似，4-B-2被还原后也可以进一步分成两类结构，第一类结构的m/z为670.74(z＝-2)，该类结构中两个位于四糖和二糖还原端的GlcNAc糖单元均被NaBH4还原而形成开环结构；第二类结构的m/z为669.73(z＝-2)，该类结构中两个位于寡糖还原端的GlcNAc糖单元仅有一个被NaBH4还原而形成开环结构，说明另一个未被还原的GlcNAc糖单元1号位C连接的羟基(-OH1)被BDDE分子修饰。由透明质酸酶的作用机理可知，2-B-2与4-B-2中还原端的GlcNAc(-OH1)被BDDE修饰的结构可能来源于透明质酸糖链的还原端。
实施例2
实施例2与实施例1的不同在于，不包括实施例1中的步骤(3)样品还原，即将步骤(2)中得到的修饰的透明质酸寡糖样品直接进行LC-MS分离，其他步骤和检测条件和实施例1相同。
LC-MS得到的修饰的透明质酸寡糖的分离情况如图8所示。由图8可以看出，各组分无法进行充分的分离。这是由于不进行样品还原会造成两个方面的影响：第一，由于异头体的存在，目标物结构复杂程度加倍，各个异头体峰相互影响，导致色谱分离不充分；第二，2-B-2和4-B-2中两种不同类型的结构(图7)还原前质核比完全相同，无法通过提取粒子流图(EIC)进行区分，导致谱图复杂程度增加。
实施例3
对实施例1分离得到的透明质酸寡糖进行质谱检测，采用碰撞诱导解离(CID)与高能碎裂解离(HCD)两种碎裂模式。CID模式下串联质谱的参数设定如下：Iso width(m/z)为3.0，归一化碰撞能量为25，Act Q,0.25,作用时间为10ms。HCD模式下串联质谱的参数设定如下：Iso width(m/z)为3.0，归一化碰撞能量为60，Act Q,0.25，作用时间为0.1ms。根据透明质酸寡糖的碎裂情况，通过诊断离子判断各修饰的透明质酸寡糖的结构和修饰位点。图11为2-B结构中各色谱峰碎片离子图，图12为4-B结构中各色谱峰碎片离子图，图13为2-B-2结构中各色谱峰产生的特定碎片离子的提取离子流图，图14为4-B-2结构中各色谱峰产生的特定碎片离子的提取离子流图。
将上述结果总结为表2-表4。其中，表2为2-B与4-B的解析结果，表3为2-B-2的解析结果，表4为4-B-2的解析结果。下面选取代表性色谱峰，对表中修饰位点/寡糖结构的表述方式进行说明。2-B峰1的结构表述为△GlcA-GlcNAc(开环，-OH4)，其中“△GlcA”表示4、5号位C原子之间形成了一个双键的葡萄糖醛酸；“GlcNAc(开环，-OH4)”表示被NaBH4还原，形成了开环结构的N-乙酰葡萄糖胺，且该糖单元四号位C原子连接的羟基与BDDE交联剂结合。2-B-2(963.36)峰1-5、7、9的结构表述为GlcNAc(开环)-B-GlcNAc(开环)，表述两个不饱和透明质酸二糖之间通过BDDE交联剂连接，且与BDDE结合的糖单元均为被NaBH4还原，形成了开环结构的N-乙酰葡萄糖胺。
表2
表3
表4
对比例1
对比例1对比例1与实施例1的不同仅在于，具体的色谱条件不同，其他步骤和检测条件和实施例1相同。
具体地，对比例1和实施例1的区别仅在于使用的流动相A和流动相B不同。其中，对比例1的使用的流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液。
LC-MS得到的修饰的透明质酸寡糖的分离情况如图9所示。由图9可以看出，各修饰的透明质酸寡糖组分洗脱不充分或分离度差，无法实现有效的分离。
对比例2
对比例2与实施例1的不同仅在于，使用的色谱柱不同，其他步骤和检测条件和实施例1相同。
具体地，对比例2与实施例1的区别仅在于使用的色谱柱不同。其中对比例2中使用的色谱柱为氨基柱BEH Amide色谱柱(2.1mm×150mm,1.9μm)。
LC-MS得到的修饰的透明质酸寡糖的分离情况如图10所示。由图10可以看出，各修饰的透明质酸寡糖组分分离度差，无法实现各组分的有效分离。
对比例3
对比例3与实施例3的不同仅在于，采用不同的碎裂能量，其他步骤和检测条件和实施例3相同。
对实施例1分离得到的透明质酸寡糖进行质谱检测，采用CID或HCD碎裂模式。CID碎裂模式下归一化碰撞能量为小于15或大于40，HCD碎裂模式下归一化碰撞能量为设置为小于40或大于80。在该碰撞能量下，母离子未能充分碎裂或碎片离子强度过低无法与仪器噪声区分。上述碎裂条件不能实现目标物交联方式与修饰位点的解析。
Claims (10)
1.一种确定交联透明质酸的修饰位点和交联方式的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将修饰的透明质酸寡糖与还原剂混合，得到还原产物；
将所述还原产物进行液相色谱串联质谱分析，以得到分离的修饰寡糖；
将所述分离的修饰寡糖进行二级或三级串联质谱检测，以得到检测结果；
基于所述检测结果确定所述交联透明质酸的修饰位点和交联方式。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰的透明质酸寡糖通过酶解交联透明质酸得到，所述交联透明质酸是通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联的透明质酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二级或三级串联质谱检测的碎裂模式包含碰撞诱导解离(CID)、高能碎裂解离(HCD)中的一种或两种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，碰撞诱导解离(CID)的碰撞能量为15-40，高能碎裂解离(HCD)的碰撞能量为40-80。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱检测的色谱条件为：使用多孔石墨化碳色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为甲酸铵或乙酸铵水溶液，流动相B为甲酸铵或乙酸铵的乙腈水溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱检测的质谱条件为：负离子扫描模式，鞘气流速为10-20arb，辅助气流速为0-5arb，喷雾电压为3-4KV，毛细管温度为250-350℃，离子透镜电压为30-70％V。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，流动相A中甲酸铵或乙酸铵水溶液中甲酸铵或乙酸铵的浓度为5-10mM。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，流动相B中甲酸铵或乙酸铵的乙腈水溶液中甲酸铵或乙酸铵的浓度为5-10mM，乙腈浓度为90-95wt％。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，液相色谱的色谱柱柱温为25-35℃。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，液相色谱串联质谱检测中流动相的流速为0.2-0.4mL.min-1。
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