CN1156179A - 豆科植物增产用高效根瘤菌种 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从土壤中分离选育出了高效的豆科植物固氮根瘤菌种，在载体中培养后制成根瘤菌肥，并且利用豆油、花生油作为接种用的粘接剂，接种到豆科植物上，可使豆科植物增产。
Description
本发明涉及豆科植物固氮的高效根瘤菌种，以及以此制备菌肥及使豆科植物增产的方法。
豆科植物在栽培中能有效利用根瘤菌种，不但能收到明显的增产效果，而且大大降低氮肥的使用量。根瘤菌属是寄生在豆科植物根部的好气性杆菌。根瘤菌能直接侵入到豆科植物的根部寄生，吸取植物营养制造根瘤，通过根瘤菌的固氮作用，不断地向植物提供所需的氮，彼此产生共生关系。
1888年霍雷吉尔和维尔法瓷首先发表了利用根瘤菌固氮作用，对豆科植物有增产效果，可用于农业生产的理论。
根瘤菌的生存受土壤的特性和环境影响比较敏感，而且，其固氮能力的差异也很大，如用于苜蓿的根瘤菌在酸性土壤的生命力很差，这一点早已得到证实。根瘤菌对氢离子浓度反应，也就是在酸性土壤中生存能力差，这一事实也早已被证实。
用于花生的根瘤菌在多年栽培花生土壤中，根瘤生存数仍很少。若想利用根瘤菌使花生增产必须有待于接种花生根瘤菌，接种后花生的茎和叶的生长茂盛，茎叶做为饲料也有很大的经济价值。花生根瘤菌对小豆，绿豆也有同样的增产效果。
大豆根瘤菌的存活率虽然在土壤中比苜蓿和花生根瘤菌多，但是，自然界中的大豆根瘤菌的固氮能力很低，所以靠土壤中的本地根瘤菌是很难起到增产的作用。然而，这种本地原有的大豆根瘤菌比外地选用的优秀的根瘤菌，对大豆根系的侵入能力强。所以，必须选育生命力强，固氮能力高的根瘤菌是大豆增产的必要手段。
本发明目的在于选育一种有高效固氮能力的根瘤菌以及提高菌种生存率的粘接剂。
本发明者在多年对豆科植物的栽培实验过程中，终于优选出能提高产量，又能减少生产费用，生命力强的高效固氮根瘤菌和能有效利用根瘤菌，并能保证提高菌种生存率的粘接剂。本发明所选育的根瘤菌种是利用花生油或豆油作为粘接剂对豆科植物的种子接种，能保证根瘤菌的成活率提高，可广泛生产和使用。
接种后的种子发芽期和保证根瘤菌的成活率能提供存活条件。在这一点上豆油和花生油具有很好的条件。
本发明是栽培豆科植物时选用高效固氮根瘤菌种，使用于苜蓿、花生、小豆、绿豆、大豆时能保证增产效果，这种菌种具有很高的固氮作用和很强的生存能力，又选用了最适宜的接种粘接剂，是针对于农业增产而研究发明的。
根据本发明，提供了即使在贫瘠的土壤或已耕地上仍具有强生存能力和高固氮能力的新的根瘤菌种。
又根据本发明，可以提供为了把根瘤菌种接种在豆科植物种子而使用的粘接剂。
又根据本发明，可以提供能提高粘接剂效率的拌种袋。
又根据本发明，可以提供由根瘤菌种和粘接剂和拌种袋组成的成套的产品包装。
本发明的根瘤菌是分布在苜蓿、花生、大豆的共生根瘤菌中，收集和培育后筛选出的固氮能力高的苜蓿根瘤菌种(Rhizofium meliloti)DK-01；(Rhizofium meliloti)DK-02，；花生根瘤菌种(Rhizobium arachis)DK-11；大豆根瘤菌种(Rhizofium japonicum)DK-21。
另外，根据本发明，种植苜蓿、花生、大豆等种子接种时，不但考虑农家利用方便，而且把能提高接种效果和保证根瘤菌成活率的花生油、豆油、棉籽油等植物油和矿物油用做根瘤菌接种的粘接剂。
因此，把植物油作为粘接剂，给根瘤菌接种时，既使多少推迟一下插种的时间情况下，也不会影响到附着在种子上的菌种成活的数量，所以，不但能得到播种作业的时间，而且能提高根瘤菌的实际使用率，减少接种剂的浪费等方面具有优点。
并且，油类粘接剂在根瘤菌的工厂生产过程中，一同装在产品包装内，所以对农家使用根瘤菌更方便。
根瘤菌的培养载体的制备采用常规的办法。即干燥的草炭土、木炭、蛭石、矿物质土壤、适量的底肥，将它们粉碎成微粉，过筛100目以上，用碳酸钙和适量的水混合，调节酸碱度为PH6.5～7.0，装在特殊透气密封袋中，用121℃和1Kg/cm2蒸气压力下2小时连续灭菌二次后，作为根瘤菌接种载体使用。
选育好的根瘤菌种，接种在常用YEM的培养液中，在30±2℃条件下培养，使培养液每1ml中生存1亿个根瘤菌，将这样的根瘤菌培养液20ml无菌接种在灭菌的载体包装袋内，将接种后的载体充分搅匀后，在30±2℃的暗室内，培养两周能使每克载体中有出108个根瘤菌为止。
此菌种冷藏于4℃避光条件下，可保存5～6个月。为了能够在更广泛的土壤环境下，获得适应性和亲和性都优秀的根瘤菌种，可以把本发明的几种根瘤菌放在菌种包装袋里，按适当的比例混合接种使用效果更佳。此时，豆科植物的接种粘接剂用花生油、豆油、矿物油等粘接剂混合使用，这样接种的种子，接种后立即播种为宜。
为了使农家更方便地利用根瘤菌种，根据本发明的根瘤菌种和生产过程中，在菌种包装内，把粘接剂和接种用包装袋等同时提供。
以下，根据实施例详细说明本发明。
实施例1、固氮能力强的根瘤菌的分离
把土壤中分布的根瘤菌从苜蓿草、花生、大豆等根瘤上，在如表一组成的YEM培养基中分离后，将这些菌在灭菌的试管中或无菌包装内的植物接种试验，出现根瘤形成及固氮活性，从而判定根瘤菌的菌种特性。
表1、根瘤菌分离用YEM培养基的组成(调整PH为6.8)
| 酵母浓度 | 1.0克 | NaCl | 0.2g |
| Mannitol | 10.0克 | Fecl3.6H2O | 2.0mg |
| K2HPO4 | 0.5克 | 琼脂 | 15.0g |
| MgSO47H2O | 0.2克 | 蒸馏水 | 1.01 |
从其中进一步选育过程中，筛选出固氮能力高的苜蓿根瘤菌种(Rhizofium meliloti)DK-01；(Rhizofium meliloti)DK-02；花生根瘤菌(Rhizobium arachis)DK-11；大豆根瘤菌(Rhizofium japonicum)DK-21；四个菌种已于1996年11月26日，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，编号分别为：①NO.0282-1，②NO.0282-2，③NO.0282-3，④NO.0282-4，其微生物学特性如表2。
表2、固氮菌的微生物学特性
| 菌种 | 细胞形态 | 深色反应 | 运动性 | 培养液反应 | 生长速度 | 氧反应 |
| 苜蓿根瘤菌DK-01 | 杆菌 | 阴性 | 阳性 | 酸性 | 快 | 好氧 |
| 苜蓿根瘤菌DK-02 | 杆菌 | 阴性 | 阴性 | 酸性 | 快 | 好氧 |
| 花生根瘤菌DK-11 | 杆菌 | 阴性 | 阴性 | 碱性 | 慢 | 好氧 |
| 大豆根瘤DK-21 | 杆菌 | 阴性 | 阴性 | 酸性 | 快 | 好氧 |
实施例2：苜蓿根瘤菌(Rhizofium meliloti)DK-01的接种效果比较。
苜蓿根瘤菌Km 2011作为对照将它与本发明的苜蓿根瘤菌(Rhizofium meliloti)DK-01分别在草炭载体中培养，培养温度为25-30℃，培养时间为10-15天，以花生油作为粘接剂接种在苜蓿后，在贫瘠的土壤中试验固氮力和生存力比较如表3显示。
表3、在贫瘠的土壤中苜蓿根瘤菌(Rhizofium meliloti)DK-01的接种效果比较
| 根瘤菌 | 固氮能力CHnm01/周 | 干草量Kg/10株 | 生存根瘤菌数个数/g土壤 |
| 未接种 | — | 5.3 | — |
| 苜蓿根瘤菌Km2011* | 120 | 14.2(100) | 3.1×103 |
| 苜蓿根瘤菌DK-01** | 236 | 22.9(157) | 3.1×104 |
*对照根瘤菌 **本发明根瘤菌
如表3显示，本发明根瘤菌比对照根瘤菌，固氮能力和生存力非常优越。
实施例3：苜蓿根瘤菌种(Rhizofium meliloti)DK-02接种效果比较。
把苜蓿根瘤菌种TAL1327作为对照，把本发明的苜蓿根瘤菌(Rhizofium meliloti)DK-02，在木炭载体中培养，培养温度为25-30℃，培养时间为10-15天，把矿物油做为粘接剂使用，在苜蓿上接种后，在耕种地上试验固氮力和生存力，其结果如表4显示。
表4、在耕种地上牧蓄草(Rhizofium meliloti)DK-02的接种效果比较
| 根瘤菌 | 固氮力 CHnm01/周 | 茎叶重量 mg/株 | 备注 |
| TAL1327 | 145(100) | 54(100) | 对照菌 |
| DK-02 | 788(543) | 64(119) | 本发明菌 |
如表4，本发明的根瘤菌比对比的根瘤菌在已耕地上的固氮力更好，而且也有利于植物更好的发育，从而使收获后茎叶重量增加，提高饲料的利用价值。
实施例4：花生根瘤菌种(Rhizobium arachis)DK-11的接种效果比较
1、把花生根瘤菌TAL1000作为对照把本发明的花生根瘤菌种，在草炭载体中培养后，把花生油作为粘接剂在花生上接种后，检查一下固氮力和数量增加效果，其结果如表5示。
2、目前为止，农家一贯使用的无接种和利用本发明的花生根瘤菌种YCK15接种剂接种的情况对照后，检验一下花生增收效果，其结果如表6显示。
表5、花生根瘤菌种(Rhizobium arachis)DK-11的接种效果
| 区 域 | 根瘤数个/株 | 固氮能力C2H4nm01/周 | Kg/10a | |
| 未施氮肥 | TAL1000**DK-11 | 393638 | 2.84(100)3.63(128) | 354.5(100)423.1(119) |
| 施肥3Kg/10a | TAL1000**DK-11 | 447572 | 1.46(100)2.53(73) | 362.1(100)378.3(104) |
*试验包装的基准，花生根瘤菌密度：5.8×103个/土壤1g
**对比根瘤菌
表6、花生根瘤菌(Rhizobium arachis)DK-11的花生增收效果
| 区 | 土性 | 备注 | ||
| 平场 | ||||
| 未接种、施肥3Kg/10a | 310 | 245 | 277(100) | |
| 接种、未施肥 | 445 | 325 | 385(139) | 接种后效果比惯用法增收39％ |
*试验包装的花生根瘤菌密度2×102个/1g(土壤)
实施例6：大豆根瘤菌种(Rhizofium japonicum)DK-21的接种效果
把大豆根瘤菌USDA110用作为对照，把本发明的大豆根瘤菌DK-21在木炭培养土中培养，培养温度为25-30℃，培养时间为10-15天，把豆油作为粘接剂在大豆上接种后，评价固氮力和根瘤形成能力，其结果如表7显示。
表7、大豆根瘤菌(Rhizofium japonicum)DK-21的固氮力和能力
| 根瘤菌 | 根瘤菌mg/株 | 固氮力 | 茎叶重量 | 根瘤菌形成能力 |
| USDA 110DK-21 | 159218 | 42.0(100)57.4(137) | 1.97(100)2.19(111) | 1187 |
| 备注 | Leonard jar 试验 | POT试验 | ||
*对比根瘤菌 **本发明根瘤菌
如表7，本发明的大豆根瘤菌(Rhizofium japonicum)DK-21比对比菌不但固氮力强，而且根瘤菌形成能力也好。
并且，收获后茎叶会增多，饲料能有效地利用。
对本发明的豆科植物根瘤菌接种剂，具有如下所述优点：
第一、农家利用方便。
第二、可以用低廉的价钱，在任何土壤环境中来增加苜蓿草、花生、大豆等的收获量。
第三、使用根瘤菌剂可以使用收获量增大，其效果在贫瘠土地上最适用，效果最好。
第四、在作物的全生长过程中，可以安定地寄托固氮效果，无需化学肥料施肥。
第五、把花生根瘤菌在小豆、绿豆上接种，可以增加它们的收获量。
第六、可以减少对作物的损害，从而方便收获时机械收割的作业。
Claims (7)
1、一种苜蓿根瘤菌种(Rhizofium meliloti)DK-01，其保藏号为CGMCC NO.0282-1。
2、一种苜蓿根瘤菌种(Rhizofium meliloti)DK-02，其保藏号为CGMCC NO.0282-2。
3、一种花生根瘤菌种(Rhizobium arachis)DK-11，其保藏号为CGMCC NO.0282-3。
4、一种大豆根瘤菌种(Rhizofium japonicum)DK-21，其保藏号为CGMCC NO.0282-4。
5、一种根瘤菌肥，其特征是将权利要求1-4任一次所述的菌种在载体中培养后得到的。
6、根据权利要求5所述根瘤菌肥，其中所述载体按下列方法制得：将干燥的草炭土、木炭、蛭石、矿物质土壤，适量的底肥，粉碎成微粉，过筛100目以上，用碳酸钙和适量的水混合，调节酸碱度为PH 6.5～7.0，灭菌。
7、一种利用权利要求6的菌肥使作物增产的方法，其特征在于使用权利要求6所述根瘤菌肥，以花生油或矿物油或豆油作为粘接剂接种于豆科植物上。
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