CN115598086A - 评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学工程领域，涉及评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器及应用。包括太赫兹超材料芯片，太赫兹超材料芯片设置在用于培养细胞的容器内；太赫兹超材料芯片为由若干传感单元形成阵列形状的金膜，每一行传感单元通过连接导体串联；所述传感单元为电感电容谐振器结构，所述电感电容谐振器结构的两电极之间形成检测通道,所述检测通道为曲折状。本发明提供的太赫兹超材料生物传感器能够快速、原位、无标签和无破坏性地同时检测肿瘤治疗的增殖抑制和凋亡促进能力，从而评估辅助治疗的疗效，指导制定个体化治疗方案。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，涉及评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
由于胶质瘤细胞的高度异质性和侵袭性，导致个体间对同一辅助治疗(放疗、化疗等)的敏感性不同，从而使得辅助治疗的效果并不理想，因此，迫切需要快速准确的检测技术及方法来评估辅助治疗的疗效，以指导个体化治疗。
增殖和凋亡是评估辅助治疗疗效的两个最重要的肿瘤生物学特征。增殖是活细胞的***过程，状态变化不大，而凋亡是一种程序化的细胞死亡，有细胞萎缩、染色质固缩等现象。因此，细胞凋亡不仅改变了活细胞的数量，也改变了肿瘤细胞的介电常数。据发明人研究了解，现有的技术很难同时快速准确地检测肿瘤细胞的增殖和凋亡。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器及应用，本发明提供的太赫兹超材料生物传感器能够快速、原位、无标签和无破坏性地同时评估肿瘤治疗的增殖抑制和凋亡促进能力，从而指导制定个体化辅助治疗方案。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器，包括太赫兹超材料芯片，所述太赫兹超材料芯片设置在用于培养细胞的容器内；所述太赫兹超材料芯片为由若干传感单元形成阵列形状的金膜，每一行传感单元通过连接导体串联；所述传感单元为电感电容谐振器结构，所述电感电容谐振器结构的两电极之间形成检测通道,所述检测通道为曲折状。
本发明采用金制备太赫兹超材料芯片，能够使形成的生物传感器在太赫兹频率下具有更好的生物相容性和低损耗的特性。在谐振频率下，电场被高度限制在电容器电极之间，因此该区域是能对外界环境的微小变化做出敏感响应的区域。该生物传感器在对胶质瘤细胞进行检测时，其谐振频率会随着的细胞的数量和状态的变化而变化，从而实现对细胞数量和状态的检测。本发明通过设置曲折状的检测通道，增加敏感区有效面积，从而增加检测的稳定性。
另一方面，一种上述评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器的制备方法，包括如下制备太赫兹超材料芯片的过程：
在衬底表面涂覆光刻胶层，将刻有与太赫兹超材料芯片相同图案的掩膜覆盖于光刻胶层表面，再进行紫外光刻，然后采用电子束蒸发法在紫外光刻后的模板上镀一层金膜，去除多余的光刻胶即得。
第三方面，一种上述评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在检测胶质瘤细胞的凋亡率中的应用。
第四方面，一种上述评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在同时监测胶质瘤细胞的增殖和凋亡中的应用。
第五方面，一种上述评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在评估辅助治疗疗效中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明采用叉指电容设计的超材料生物传感器，能够有效提高面积比，其谐振频率对细胞数量和状态变化引起介电常数的变化非常敏感。经过实验表明，各种活细胞和凋亡细胞组成的固定数量的胶质瘤细胞对太赫兹超材料生物传感器显示不同，揭示了不同细胞状态下的不同折射率。最后，在各种疗法下，结合基础生物学实验，不同数量的胶质瘤细胞在原位被表征出来。确定了活细胞、凋亡细胞数量与频移之间的关系，这相应地首次揭示了肿瘤细胞的增殖、凋亡率和频移之间的关系。因此，本发明可用于快速、原位、无标签和无破坏性地评估肿瘤治疗的增殖抑制和凋亡促进能力，从而指导胶质瘤个体化治疗。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为为本发明实施例的太赫兹超材料芯片的传感单元的结构；
图2为本发明实施例中太赫兹超材料芯片的制作流程示意图，Ⅰ、旋涂，在清洁的石英衬底上旋转涂覆光刻胶90秒，转速4000转/分，Ⅱ、紫外线光刻技术，超材料图案从掩膜板转移到衬底上，Ⅲ、显影，转移后的超材料图案会在显影液中显现出来，Ⅳ、蒸镀，用电子束蒸发法蒸发金薄膜；
图3为本发明实施例中太赫兹超材料芯片的表征图，a、制备的生物传感器图像，b、集成聚二甲基硅氧烷(PDMS)细胞培养腔的超材料生物传感器，c、裸太赫兹超材料芯片，d、无PDMS空腔培养胶质瘤细胞的太赫兹超材料芯片，e、在PDMS空腔内培养胶质瘤细胞的太赫兹超材料芯片；
图4，a、THz-FDS检测定量不同凋亡率的胶质瘤细胞示意图，b、c，生物传感器与3×104U251细胞分别经(b)TMZ和(c)IR培养48h后检测细胞凋亡的THz光谱，d,e，分别用(d)0、400、800、1600μM TMZ和(e)0、6、9、12Gy IR处理胶质瘤细胞48h后，流式细胞术检测胶质瘤细胞的代表性图像和凋亡率，f,g,EdU细胞增殖实验结果和(f)48h TMZ和(g)48h IR处理后U251胶质瘤细胞EdU阳性细胞％。EdU阳性细胞％定性预测增殖率，比例尺,200微米，数据用平均值±SD表示(n＝3，**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)；
图5为使用所提出的太赫兹超材料生物传感器检测治疗中的胶质瘤细胞的示意图；
图6为本发明实施例中增殖实验的表征结果图，a、不同数量的U251细胞培养后在生物传感器上的图像(初始数量为n0，培养后数量为nc)，b、定量可变U251细胞生物传感器的太赫兹光谱，c、Δf与细胞数n0和nc的关系；
图7为本发明实施例中不同辅助治疗方法治疗胶质瘤细胞的过程示意图；
图8为本发明实施例中增殖、凋亡检测结果图，a-b、根据公式(4)在0、400、800和1600μM TMZ(a)处理和在0、6、9和12Gy IR(b)照射下U251胶质瘤活细胞和凋亡细胞数，n0＝3×104U251细胞，c、测定TMZ作用下U251细胞的太赫兹透射率，d、TMZ处理下Δf凋亡细胞与活细胞数量间的关系，e、TMZ处理下Δf与增殖率、凋亡率间的关系，f、测量U251细胞在红外照射下的太赫兹透射率，g、IR处理下Δf凋亡细胞与活细胞数量间的关系，h、IR作用下UΔf与增殖率、凋亡率间的拟合关系，i、j分别为1600μM TMZ、120μM LOM、2μM ETO(IC50剂量)(i)和6Gy IR(j)处理48小时的U251、LN229和A172胶质瘤细胞系的Δf；
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有技术难以同时快速准确地检测肿瘤细胞的增殖和凋亡，从而检测胶质瘤细胞对辅助治疗的敏感性，本发明提出了评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器及应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器，包括太赫兹超材料芯片，所述太赫兹超材料芯片设置在用于培养细胞的容器内；所述太赫兹超材料芯片为由若干传感单元形成阵列形状的金膜，每一行传感单元通过连接导体串联；所述传感单元为电感电容谐振器结构，所述电感电容谐振器结构的两电极之间形成检测通道,所述检测通道为曲折状。研究表明，本发明提供的太赫兹超材料生物传感器能够确定活细胞、凋亡细胞数量与频移之间的关系，从而能够快速、原位、无标签和无破坏性地评估肿瘤治疗的增殖抑制和凋亡促进能力，且与基础生物学实验有良好的一致性。
本发明所述的曲折状，例如m形、z形、蛇形、波浪形等。本发明实施例采用m形检测通道进行验证，效果良好。
在一些实施例中，太赫兹超材料芯片设置在石英基板表面。采用石英基板能够保证生物传感器的生物相容性和低损耗的特性。
在一些实施例中，所述容器包括培养腔，所述太赫兹超材料芯片作为培养腔的底，所述培养腔的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。采用PDMS制成的培养腔，能够进一步提高细胞生长和分布的均匀性。
在一些实施例中，每平方毫米的太赫兹超材料生物传感器上有150～250个传感单元。
在一些实施例中，谐振频率为370～380GHz。
在一些实施例中，金膜的厚度为80～120nm。
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器的制备方法，包括如下制备太赫兹超材料芯片的过程：
在衬底表面涂覆光刻胶层，将刻有与太赫兹超材料芯片相同图案的掩膜覆盖于光刻胶层表面，再进行紫外光刻，然后采用电子束蒸发法在紫外光刻后的模板上镀一层金膜，去除多余的光刻胶即得。
在一些实施例中，包括太赫兹超材料芯片与容器组装的过程，将太赫兹超材料芯片放置于容器底部上表面，然后将容器侧壁与容器底部粘结。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在检测胶质瘤细胞的凋亡率中的应用。
例如在制备或构建检测胶质瘤细胞的凋亡率的***中的应用。
本发明的第四种实施方式，提供了一种上述评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在同时监测胶质瘤细胞的增殖和凋亡中的应用。
例如在制备或构建同时监测胶质瘤细胞的增殖和凋亡的***中的应用。
本发明的第五种实施方式，提供了一种上述评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在评估辅助治疗疗效中的应用。
例如在制备或构建评估辅助治疗疗效的***中的应用。
评估辅助治疗疗效优选为评估辅助治疗胶质瘤疗效。
本发明所述的应用，可以是疾病的诊断与治疗为目的，也可以以非疾病的诊断与治疗为目的。以非疾病的诊断与治疗为目的中，例如对胶质瘤细胞的增殖和凋亡的科学研究。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
太赫兹超材料生物传感器的设计：
本实施例的太赫兹超材料芯片周期性的电感电容耦合谐振器组成。采用HFSS和有限元方法对所设计的超材料生物传感器进行了仿真和优化。采用周期边界，即完美电导体(PEC)和完美磁导体(PMC)进行模拟。
太赫兹超材料芯片的传感单元如图1a所示。
太赫兹超材料芯片的制作流程，如图2所示。
首先，用迪康溶液、去离子水、丙酮、乙醇清洗石英衬底并用氮***将其吹干；然后将清洁干燥的石英转移并固定在旋涂仪上，在表面旋涂厚度大约1μm的AR-P 5350光刻胶层；将涂有光刻胶的石英片放在热板上110℃烘烤3分钟至光刻胶完全烤干；将刻有与太赫兹超材料芯片相同图案的掩膜板和烘干的石英片都固定到紫外光刻机，进行7秒钟紫外光刻后，在石英片的光刻胶层就形成了所需要的图案；从紫外光刻机上取下石英片，放入5350显影液浸泡20秒，取出后在去离子水里浸泡1分钟来去除表面残留的显影液后，用氮***轻轻吹干，显微镜下观察形貌是否完整；然后采用电子束蒸发法在有完整形貌的石英片上镀一层100nm厚的金膜；丙酮剥离掉剩余的光刻胶，得到完整的超材料金属图案，器件制备完。
PDMS腔体制备：
PDMS溶液和固化剂购自道康宁。将PDMS溶液与固化剂按10:1的质量比混合。然后，用真空烘箱去除气泡30分钟。在将混合溶液倒入模具之前，在模具表面喷洒脱模剂，以便于PDMS腔体取出。在70℃的热板上烘烤120分钟后，将PDMS腔体从模具中取出。
将太赫兹超材料芯片与PDMS腔体组装如图3b所示。
太赫兹检测：
用Toptica THz-FDS TeraScan 1550对带或不带胶质瘤细胞的超材料芯片进行表征，如图7所示。在THz测试前，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗MTMs 90秒，然后在氮气流下轻轻吹干60秒。每个样品的无标签测试耗时5分钟。
表征结果：
太赫兹超材料生物传感器：
图5显示了使用该生物传感器对胶质瘤细胞的检测。可以看出，随着细胞数量和状态的变化，超材料生物传感器的谐振频率也会发生变化。通常情况下，基于平行板电容的电感电容耦合谐振器的谐振频率为
其中L和C分别是等效电感和电容。在谐振频率下，电场被高度限制在电容器电极之间，以达到高灵敏度在理论上，C对电容电极之间的介电常数ε很敏感，并根据公式(1)ε操纵谐振频率f0，这是提出的生物传感器的关键物理机制。
图3a展示了含有若干超材料单元的生物传感器。为了进一步提高细胞生长和分布的均匀性，设计了一个带有聚二甲基硅氧烷(PDMS)的培养腔，并集成到MTM生物传感器上，如图3b所示。图3c-e是超材料芯片的显微镜下图像，细胞在有和没有PDMS腔的超材料芯片表面培养。很明显，PDMS腔使胶质瘤细胞分布更均匀。
增殖检测：
将48小时辅助治疗下的胶质瘤细胞增殖和凋亡率分别定义为ηp和ηa。48小时是"生物材料和实验方法"中标准生物测定的建议时间。因此，培养后的活细胞和凋亡细胞的数量可以估计为
nl＝n0×(1+ηp-ηa)和na＝n0×ηa， (4)
n0为初始细胞量。在没有辅助治疗的情况下ηp大约是一个固定的数值，在治疗的情况下被抑制，在没有治疗的情况下ηa通常是百分之几，在治疗的情况下显著提高。本实施例以U251细胞系为例，研究THz MTMs对胶质瘤细胞的检测。通过细胞计数法和流式细胞术分别可以得到总细胞数nc和凋亡率ηa，增殖率ηp由nc和ηa根据式(4)得到，并用EdU细胞增殖试验得到的相对增殖率来验证。
首先，将不同浓度的U251细胞200-μl悬液置于带PDMS空腔的生物传感器上培养8小时，其分布如图6a所示。然后，用THz-FDS对细胞生物传感器进行表征。图6b描述了不同初始数n0的特征透射率，图6c描述了Δf与细胞数的关系。随着从0增加到6×104cell，谐振频率逐渐向低频偏移。考虑到胶质瘤细胞在8小时内的增殖和凋亡情况，在相同培养条件下，用标准生物学方法测定48小时后胶质瘤细胞的增殖和凋亡率。活细胞数估计为nl＝n0×(1+ηp-ηa)(8/48)，nc大约等于nl，由于8h后凋亡率可以忽略不计(小于0.7％)。在这种情况下，Δf和细胞数的拟线性公式可以分别拟合为Δf＝14.21×n0和Δf＝12.36×nl。另外两种胶质瘤细胞系的实验数据见表1，趋势一致。
不同斜率的拟合关系在一定程度上反映了不同胶质瘤细胞系的细胞体积和增殖率。在Δf和nc的关系中，A172细胞系的斜率大于LN229，说明A172胶质瘤细胞比LN229细胞更大，增殖速度更快。
表1 未治疗的太赫兹超材料生物传感器培养8小时胶质瘤细胞的检测
细胞凋亡检测：
为了研究凋亡细胞的影响，用MTM生物传感器检测了四组在不同治疗条件下培养的3×104U251细胞，这些细胞由不同数量的活细胞和凋亡细胞组成。如图4a所示，将处理48h后从培养板消化的细胞标准化，得到3×104细胞，在生物传感器上再培养5小时，获得良好的粘附，然后用THz-FDS对细胞进行表征。透光率特征见图4b、c。流式细胞仪测得在TMZ和放疗处理下的凋亡率，分别见图4d、e。由于治疗剂量的增加，随着细胞凋亡增强，Δf逐渐降低。这说明凋亡细胞的折射率比活细胞小。但是，活细胞数量的减少也导致更小的Δf，这意味着Δf不能和na直接相关。此外，在消化和再植过程中，凋亡细胞可能会崩溃，活细胞可能会增殖，这给该方法带来了额外的误差。
增殖、凋亡检测：
如图7所示，3×104胶质瘤细胞在生物传感器上培养48小时后，采用THz-FDS直接测量。作为参照组，3×104(b0)胶质瘤细胞在相同治疗条件下于48孔板中培养，用细胞计数器计算肿瘤细胞总数(nc)，ηp可根据上一步得到的式(4)计算。计算得到的nl,na,ηp,和ηa如图8a,b和表3所示，显示出良好的增殖抑制和凋亡促进能力。计算得到的增殖率与图4f、g中的EdU细胞增殖实验结果趋势一致。U251细胞在TMZ和IR处理下的特征透射率如图8c、f所示。可以看出，随着处理剂量的增加，随着活细胞数量的减少、凋亡细胞数量的增加以及总细胞数量的减少，其Δf呈下降趋势，如图8a、b所示。根据细胞计数和生物实验，在图8d、g中绘制了不同处理下Δf与nl、na的关系。可以得到关系曲线的拟合公式Δf＝A1×nl+A2×na+A3，其中A1,A2和A3为常数。Δf与ηp和ηa的关系可以拟合为Δf＝B1×ηp+B2×ηa+B2，其中B1,B2和B3也是常数(图8e、h)。因此，只要Δf是用太赫兹MTMs表征，ηp和ηa就可以得到与之相拟合的关系。对其他胶质瘤细胞系在各种辅助治疗下的关系，如表3、4所示，也发现了类似的现象。这是THz MTMs首次被证明可以同时检测肿瘤细胞的凋亡和增殖率。
表2 不同辅助治疗下培养48h胶质瘤细胞的THz MTMs检测
表3 不同辅助治疗下三种细胞系Δf、nl和na的关系
Δf:谐振频移；nl:活胶质瘤细胞数量；na:凋亡胶质瘤细胞数量。
表4 不同辅助治疗下三种细胞系Δf、ηp和ηa的关系
Δf:谐振频移；nl:活胶质瘤细胞数量；na:凋亡胶质瘤细胞数量。
总之，治疗下由活细胞和凋亡细胞诱导的太赫兹MTMs的频率偏移可以用于原位、准确、快速和无标记地评估辅助治疗疗效。Δf越小，疗效越好。U251、LN229和A172细胞在三种药物IC50剂量和临床常用放疗剂量下的对应Δf情况如图8i,j所示。注意，Δf不只是单个生物指标(增殖或凋亡)的疗效指标，而是联合响应的疗效指标。在不添加任何标记的情况下，每次实验仅需5分钟，比流式细胞术短24倍，比EdU细胞增殖法短60倍。因此，该方法能够很好地检测各种治疗方法下肿瘤细胞的增殖和凋亡特征，并有可能指导外科医生制定胶质瘤患者的个性化治疗方案。
结论，本发明提出了一种新的太赫兹超材料方法来同时监测胶质瘤细胞的增殖和凋亡，并评估辅助治疗的疗效。首先，本发明证明了特征频移Δf是胶质瘤细胞数量变化和状态变化的综合响应。然后，通过生物学实验，拟合活细胞和凋亡细胞数量与Δf之间的关系，同时揭示增殖率和凋亡率与Δf之间的关系。在治疗条件下，Δf,nl和na之间的关系拟合为Δf＝A1×nl+A2×na+A3。对应的，Δf与ηp和ηa的关系可以拟合为Δf＝B1×ηp+B2×ηa+B3。因此，该方法可以同时监测胶质瘤细胞的增殖和凋亡，准确、原位、无标记、无电离辐射、快速评估胶质瘤细胞对辅助治疗的敏感性。
本发明提出的频移方法在检测治疗疗效方面是非特异性和快速的。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器，其特征是，包括太赫兹超材料芯片，所述太赫兹超材料芯片设置在用于培养细胞的容器内；所述太赫兹超材料芯片为由若干传感单元形成阵列形状的金膜，每一行传感单元通过连接导体串联；所述传感单元为电感电容谐振器结构，所述电感电容谐振器结构的两电极之间形成检测通道,所述检测通道为曲折状。
2.如权利要求1所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器，其特征是，所述检测通道为m形。
3.如权利要求1所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器，其特征是，太赫兹超材料芯片设置在石英基板表面。
4.如权利要求1所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器，其特征是，所述容器包括培养腔，所述太赫兹超材料芯片作为培养腔的底，所述培养腔的材质为PDMS。
5.如权利要求1所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器，其特征是，金膜的厚度为80～120nm。
6.一种权利要求1～5任一所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器的制备方法，其特征是，包括如下制备太赫兹超材料芯片的过程：
在衬底表面涂覆光刻胶层，将刻有与太赫兹超材料芯片相同图案的掩膜覆盖于光刻胶层表面，再进行紫外光刻，然后采用电子束蒸发法在紫外光刻后的模板上镀一层金膜，去除多余的光刻胶即得。
7.如权利要求6所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器的制备方法，其特征是，包括太赫兹超材料芯片与容器组装的过程，将太赫兹超材料芯片放置于容器底部上表面，然后将容器侧壁与容器底部粘结。
8.一种权利要求1～5任一所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在检测胶质瘤细胞的凋亡率中的应用。
9.一种权利要求1～5任一所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在同时监测胶质瘤细胞的增殖和凋亡中的应用。
10.一种权利要求1～5任一所述的评估胶质瘤术后疗效的太赫兹超材料生物传感器在评估辅助治疗疗效中的应用。
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