CN115595342A - 一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，属于氨基酸发酵技术领域。为了提高色氨酸的产量和转化率，降低副产物合成，本发明提供了一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，所述方法是在利用大肠杆菌发酵生产色氨酸的过程中，当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量在发酵过程前期从高峰开始缓慢下降至目标值时，通过补加复合氮料分阶段控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量。该方法可实现产酸和转化率之间平衡，实现提高产酸和转化率的目标，适用于大规模工业化生产。

Description

一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法
技术领域
本发明属于氨基酸发酵技术领域，具体涉及一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法。
背景技术
L-色氨酸又名α-氨基吲哚基丙酸，分子式：C11H12N2O2，是人体重要的神经递质-5-羟色胺的前体，也是人体的必需氨基酸之一，具有良好营养价值和药用价值，作为大宗氨基酸发酵产品广泛用于饲料、医药和保健等行业。
L-色氨酸的生产主要是利用基因工程技术改造的大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌作为生产菌株通过微生物发酵法来实现工业化制造。微生物发酵法具有原料价格低廉，工艺控制简单，产品质量可靠等优点。近年来，如何低成本、高效生产色氨酸产品是国内各主要氨基酸生产厂家推进技术持续进步的关键，因此，为了降低成本，增加效益，不仅对培养基营养成分而且对发酵过程控制的合理性提出了更高的要求。
好氧发酵过程中菌体对氧的消耗能力大小能够反映出呼吸代谢的强弱。尤其对于高好氧的色氨酸发酵过程，控制氧消耗速率的水平高低对大肠杆菌代谢底物生成菌体、产物和副产物有重要的影响，最终会影响色氨酸产品浓度和转化率，因此合理地控制氧消耗速率是实现高产和高转化率的关键。尽管一些文献报道过控制溶氧或者摄氧率对发酵过程表达色氨酸有所提高，但是均未充分考虑发酵过程中细胞浓度对单位菌体的氧消耗造成的影响；也未见通过连续补料控制发酵过程中单位菌体干重量单位时间消耗的氧物质的量实现色氨酸发酵过程优化控制并提高色氨酸发酵产量及改善其转化率的报道。
发明内容
为了提高色氨酸的产量和转化率，降低副产物合成，本发明提供了一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，所述方法是在利用大肠杆菌发酵生产色氨酸的过程中，当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量在发酵过程前期从高峰开始缓慢下降至5.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为2.5-4.0mmol/h/g。
进一步地限定，所述复合氮料的组成为氨基酸粉0.2g/L，玉米浆干粉0.3g/L，酵母粉0.2g/L、硫酸铵0.03g/L，消泡剂0.01g/L，余量为水，pH8.0。
进一步地限定，所述发酵过程中采用搅拌联动，控制溶氧不低于20％。
进一步地限定，所述发酵过程中，当发酵2-4h后发酵液中葡萄糖浓度低于1.0g/L时开始补加浓度为650g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度维持在0.01-0.2g/L。
进一步地限定，当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量将至5.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料分阶段控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量。
进一步地限定，所述分阶段控制是指在发酵8-20h时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.5-4.0mmol/h/g；在发酵20-32h时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.0-3.5mmol/h/g；在发酵32h至发酵结束时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为2.5-3.0mmol/h/g。
进一步地限定，所述发酵前还包括对大肠杆菌进行斜面培养、一级种子培养和二级种子培养；
斜面培养基的组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L和四环素0.05g/L，余量为水；
种子培养基的组成为葡萄糖10g/L，酵母粉4g/L，柠檬酸0.5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，VB1 1mg/L，生物素0.35mg/L，七水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁2.8mg/L，微量元素混合溶液2mL/L，余量为水；
发酵选用的培养基组成为葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸2.5g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁2.8g/L，七水硫酸亚铁90mg/L，VB15mg/L，生物素2mg/L，微量元素混合溶液4mL/L。
进一步地限定，所述一级种子培养是将斜面培养后的菌体接种于种子培养基中，于37℃，220rpm，摇瓶培养10-12h。
进一步地限定，所述二级种子培养是将一级种子液按照1％的接种量接种于种子培养基中，于36-37℃，通气比0.5VVM，200rpm，罐压0.03-0.05MPa，pH7.0-7.2，溶氧≥30％的条件下培养10-12h。
进一步地限定，所述发酵是将二级种子液按照10％的接种量接种于发酵培养基中，于36-37℃，通气比1.0VVM，溶氧≥20％，罐压0.03-0.05MPa，pH 6.8-7.0的条件下培养36-40h。
本发明中所述的比氧消耗速率是指单位菌体干重单位时间消耗的氧物质的量。
本发明的有益效果：
本发明通过控制补料速率实现调节菌体代谢活力，达到控制比氧消耗速率的目的，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、和常规依据溶氧和pH来补糖和补氨的常规补料方式相比，本发明在于通过连续补料实现发酵过程比氧消耗速率从初始培养利用后达到高峰下降不同的比氧消耗速率后开始连续补料，维持菌体代谢活性，在进入色氨酸合成阶段后，不断补充有效碳氮营养，维持合适的比氧消耗速率可实现产物合成稳定，高速产酸持续增加，菌体代谢稳定好。采用自动化控制技术后，可直接依据比氧消耗速率控制策略放大到工业生产规模。
2、本发明连续补料分阶段控制比氧消耗速率可实现提高色氨酸转化率调整，并减少了副产物，有利于产品质量控制。尤其根据实际工业化生产需求，可实现控制不同阶段的比氧消耗速率来控制碳原子在产物、菌体和维持之间转化，在维持比氧消耗速率在3.5-4.0mmol/h/g条件下，利于菌体生长和维持菌体代谢活性，而副产物合成较多；在维持比氧消耗速率在2.5-3.0mmol/h/g以上条件下，利于色氨酸合成，但是底物转化为CO2释放会导致转化率下降，菌体后续容易发生衰老死亡导致提前放罐；而维持比氧消耗速率3.0-3.5mmol/h/g条件下，可实现产酸和转化率之间平衡，实现提高产酸和转化率的目标。
附图说明
图1为各实施例发酵过程中比氧消耗速率的变化曲线；
图2为各实施例发酵过程中副产物谷氨酸含量的变化曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例和附图对本发明做进一步的说明，但不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明使用的产色氨酸的大肠杆菌公开于申请号为2016111887431，发明名称为一种清液发酵培养基及提高L-色氨酸的方法的中国专利申请中，其菌株保藏编号为CGMCCNO.11073。
本发明涉及的培养基如下：
斜面培养基的组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L和四环素0.05g/L，余量为水；
种子培养基的组成为葡萄糖10g/L，酵母粉4g/L，柠檬酸0.5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，VB1 1mg/L，生物素0.35mg/L，七水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁2.8mg/L，微量元素混合溶液2mL/L，余量为水；
发酵培养基组成为葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸2.5g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁2.8g/L，七水硫酸亚铁90mg/L，VB15mg/L，生物素2mg/L，微量元素混合溶液4mL/L；
复合氮料的组成为氨基酸粉0.2g/L，玉米浆干粉0.3g/L，酵母粉0.2g/L、硫酸铵0.03g/L，消泡剂0.01g/L，余量为水，pH8.0。
实施例1：
本实施例提供了一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，该方法包括斜面培养，一级种子培养，二级种子培养和发酵四个阶段，具体如下：
斜面培养：将取自保菌管中的大肠杆菌接种于无菌斜面培养基上，培养温度为37℃，培养时间为2天。
一级种子培养：刮取1cm2的经斜面培养的大肠杆菌菌体接种于装有已灭菌的100mL种子培养基的三角瓶(500mL)中，并用8层纱布封口包扎。培养条件：37℃，220rpm，培养10h。
二级种子培养：在15L种子罐中装入10L种子培养基，进行消毒灭菌后，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后采用压差法将培养好的一级种子液100mL(接种量1％)接种于种子罐中进行培养，培养条件为36℃，通气比0.5VVM，初始搅拌转速200rpm，罐压0.03-0.05MPa，pH 7.0，溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于30％，培养周期为10h。
发酵培养：在50L发酵罐中投入20L发酵培养基，发酵培养基经灭菌、冷却后将二级种子液移入发酵罐中进行培养，接种量为10％，培养条件为温度36℃，通气比1.0VVM，初始转速200rpm，溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于20％，罐压0.03-0.05MPa，通过补加复合氮料和通氨水来控制pH在6.8，培养周期36h。
补料控制策略：发酵过程中，当发酵2-4h后发酵液中葡萄糖浓度低于1.0g/L时开始补加浓度为650g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度维持在0.01-0.2g/L。当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量在发酵过程前期从高峰开始缓慢下降至5.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.5-4.0mmol/h/g。
在发酵过程中，使用上海舜禹衡平有限公司的过程质谱仪PASS2000测定发酵尾气中CO2、O2、N2、Ar气体成分，使用汉密尔顿公司在线活细胞分析仪在线测定的电容值数据，并利用上海快谱智能有限公司开发的“众知”发酵工艺分析软件包实现连续计算发酵过程比氧消耗速率。
以上所述发酵过程结束后，对发酵液的相关指标进行测定和分析，结果为发酵效价为52.3g/L，转化率为18.3％。
实施例2：
本实施例提供了一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，该方法包括斜面培养，一级种子培养，二级种子培养和发酵四个阶段，具体如下：
斜面培养：将取自保菌管中的大肠杆菌接种于无菌斜面培养基上，培养温度为37℃，培养时间为2天。
一级种子培养：刮取1cm2的经斜面培养的大肠杆菌菌体接种于装有已灭菌的100mL种子培养基的三角瓶(500mL)中，并用8层纱布封口包扎。培养条件：37℃，220rpm，培养12h。
二级种子培养：在15L种子罐中装入10L种子培养基，进行消毒灭菌后，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后采用压差法将培养好的一级种子液100mL(接种量1％)接种于种子罐中进行培养，培养条件为37℃，通气比0.5VVM，初始搅拌转速200rpm，罐压0.03-0.05MPa，pH 7.2，溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于30％，培养周期为12h。
发酵培养：在50L发酵罐中投入20L发酵培养基，发酵培养基经灭菌、冷却后将二级种子液移入发酵罐中进行培养，接种量为10％，培养条件为温度37℃，通气比1.0VVM，初始转速200rpm，发酵过程溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于20％，罐压0.03-0.05MPa，通过补加复合氮料和通氨水来控制pH在7.0，培养周期40h。
补料控制策略：当发酵2-4h后发酵液中葡萄糖浓度低于1.0g/L时开始补加浓度为650g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度维持在0.01-0.2g/L。当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量在发酵过程前期从高峰开始缓慢下降至6.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.0-3.5mmol/h/g。
在发酵过程中，使用上海舜禹衡平有限公司的过程质谱仪PASS2000测定发酵尾气中CO2、O2、N2、Ar气体成分，使用汉密尔顿公司在线活细胞分析仪在线测定的电容值数据，并在上海快谱智能有限公司开发的“众知”发酵工艺分析软件包上实现连续计算发酵过程比氧消耗速率。
以上所述发酵过程结束后，对发酵液的相关指标进行测定和分析，结果为发酵效价为58.3g/L，转化率为19.3％。
实施例3：
本实施例提供了一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，该方法包括斜面培养，一级种子培养，二级种子培养和发酵四个阶段，具体如下：
斜面培养：将取自保菌管中的大肠杆菌接种于斜面培养基上无菌斜面培养基上，培养温度为37℃，培养时间为2天。
一级种子培养：刮取1cm2的经斜面培养的大肠杆菌菌体接种于装有已灭菌的100mL种子培养基的三角瓶(500mL)中，并用8层纱布封口包扎。培养条件：37℃，220rpm，培养11h。
二级种子培养：在15L种子罐中装入10L种子培养基，进行消毒灭菌后，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后采用压差法将培养好的一级种子液100mL(接种量1％)接种于种子罐中进行培养，培养条件为37℃，通气比0.5VVM，初始搅拌转速200rpm，罐压0.03-0.05MPa，pH 7.1，溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于30％，培养周期为11h。
发酵培养：在50L发酵罐中投入20L发酵培养基，发酵培养基经灭菌、冷却后将二级种子液移入发酵罐中进行培养，接种量为10％，培养条件为温度37℃，通气比1.0VVM，初始转速200rpm，发酵过程溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于20％，罐压0.03-0.05MPa，通过补加复合氮料和通氨水来控制pH在6.9，培养周期38h。
补料控制策略：当发酵2-4h后发酵液中葡萄糖浓度低于1.0g/L时开始补加浓度为650g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度维持在0.01-0.2g/L。当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量在发酵过程前期从高峰开始缓慢下降至5.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为2.5-3.0mmol/h/g。
在发酵过程中，使用上海舜禹衡平有限公司的过程质谱仪PASS2000测定发酵尾气中CO2、O2、N2、Ar气体成分，使用汉密尔顿公司在线活细胞分析仪在线测定的电容值数据，并在上海快谱智能有限公司开发的“众知”发酵工艺分析软件包上实现连续计算发酵过程比氧消耗速率。
以上所述发酵过程结束后，对发酵液的相关指标进行测定和分析，结果为发酵效价为48.2g/L，转化率为16.8％。
实施例4：
本实施例提供了一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，该方法包括斜面培养，一级种子培养，二级种子培养和发酵四个阶段，具体如下：
斜面培养：将取自保菌管中的大肠杆菌接种于无菌斜面培养基上，培养温度为37℃，培养时间为2天。
一级种子培养：刮取1cm2的经斜面培养的大肠杆菌菌体接种于装有已灭菌的100mL种子培养基的三角瓶(500mL)中，并用8层纱布封口包扎。培养条件：37℃，220rpm，培养11h。
二级种子培养：在15L种子罐中装入10L种子培养基，进行消毒灭菌后，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后采用压差法将培养好的一级种子液100mL(接种量1％)接种于种子罐中进行培养，培养条件为37℃，通气比0.5VVM，初始搅拌转速200rpm，罐压0.03-0.05MPa，pH 7.1，溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于30％，培养周期为11h。
发酵培养：在50L发酵罐中投入20L发酵培养基，发酵培养基经灭菌、冷却后将二级种子液移入发酵罐中进行培养，接种量为10％，培养条件为温度37℃，通气比1.0VVM，初始转速200rpm,发酵过程溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于20％，罐压0.03-0.05MPa，通过补加复合氮料和通氨水来控制pH在6.9，培养周期38h。
补料控制策略：当发酵2-4h后发酵液中葡萄糖浓度低于1.0g/L时开始补加浓度为650g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度维持在0.01-0.2g/L。当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量在发酵过程前期从高峰开始缓慢下降至5.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料分阶段控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量：在发酵8-28h时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.5-4.0mmol/h/g；在发酵28-38h时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.0-3.5mmol/h/g。
在发酵过程中，使用上海舜禹衡平有限公司的过程质谱仪PASS2000测定发酵尾气中CO2、O2、N2、Ar气体成分，使用汉密尔顿公司在线活细胞分析仪在线测定的电容值数据，并在上海快谱智能有限公司开发的“众知”发酵工艺分析软件包上实现连续计算发酵过程比氧消耗速率。
以上所述发酵过程结束后，对发酵液的相关指标进行测定和分析，结果为发酵效价为60.8g/L，转化率为20.5％。
实施例5：
本实施例提供了一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，该方法包括斜面培养，一级种子培养，二级种子培养和发酵四个阶段，具体如下：
斜面培养：将取自保菌管中的大肠杆菌接种于无菌斜面培养基上，培养温度为37℃，培养时间为2天。
一级种子培养：刮取1cm2的经斜面培养的大肠杆菌菌体接种于装有已灭菌的100mL种子培养基的三角瓶(500mL)中，并用8层纱布封口包扎。培养条件：37℃，220rpm，培养11h。
二级种子培养：在15L种子罐中装入10L种子培养基，进行消毒灭菌后，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后采用压差法将培养好的一级种子液100mL(接种量1％)接种于种子罐中进行培养，培养条件为37℃，通气比0.5VVM，初始搅拌转速200rpm，罐压0.03-0.05MPa，pH 7.1，溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于30％，培养周期为11h。
发酵培养：在50L发酵罐中投入20L发酵培养基，发酵培养基经灭菌、冷却后将二级种子液移入发酵罐中进行培养，接种量为10％，培养条件为温度37℃，通气比1.0VVM，初始转速200rpm，发酵过程溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于20％，罐压0.03-0.05MPa，通过补加复合氮料和通氨水来控制pH在6.9，培养周期38h。
补料控制策略：当发酵2-4h后发酵液中葡萄糖浓度低于1.0g/L时开始补加浓度为650g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度维持在0.01-0.2g/L。当单位菌体干重量单位时间消耗的氧物质的量在发酵过程前期从高峰开始缓慢下降至5.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料分阶段控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量：在发酵8-20h时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.5-4.0mmol/h/g；在发酵20-32h时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.0-3.5mmol/h/g；在发酵32h至发酵结束时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为2.5-3.0mmol/h/g。
在发酵过程中，使用上海舜禹衡平有限公司的过程质谱仪PASS2000测定发酵尾气中CO2、O2、N2、Ar气体成分，使用汉密尔顿公司在线活细胞分析仪在线测定的电容值数据，并在上海快谱智能有限公司开发的“众知”发酵工艺分析软件包上实现连续计算发酵过程比氧消耗速率。
以上所述发酵过程结束后，对发酵液的相关指标进行测定和分析，结果为发酵效价为62.8g/L，转化率为21.5％。
对比例：
本对比例提供了一种初始的发酵生产色氨酸的方法，该方法包括斜面培养，一级种子培养，二级种子培养和发酵四个阶段，具体如下：
斜面培养：将取自保菌管中的大肠杆菌接种于无菌斜面培养基上，培养温度为37℃，培养时间为2天。
一级种子培养：刮取1cm2的经斜面培养的大肠杆菌菌体接种于装有已灭菌的100mL种子培养基的三角瓶(500mL)中，并用8层纱布封口包扎。培养条件：37℃，220rpm，培养11h。
二级种子培养：在15L种子罐中装入10L种子培养基，进行消毒灭菌后，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后采用压差法将培养好的一级种子液100mL(接种量1％)接种于种子罐中进行培养，培养条件为37℃，通气比0.5VVM，初始搅拌转速200rpm，罐压0.03-0.05MPa，pH 7.1，溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于30％，培养周期为11h。
发酵培养：在50L发酵罐中投入20L发酵培养基，发酵培养基经灭菌、冷却后将二级种子液移入发酵罐中进行培养，接种量为10％，培养条件为温度37℃，通气比1.0VVM，初始转速200rpm，发酵过程溶氧通过调整风量和转速全程控制在不低于20％，罐压0.03-0.05MPa，通过氨水来控制pH在6.9，培养周期38h。
补料控制策略：未采用复合氮料补加来实现比氧消耗速率进行发酵过程控制，当发酵2-4h后发酵液中葡萄糖浓度低于1.0g/L时开始补加浓度为650g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度维持在0.01-0.2g/L。氨水根据pH自控流加，控制pH不低于6.9，不高于7.0。
在发酵过程中，使用上海舜禹衡平有限公司的过程质谱仪PASS2000测定发酵尾气中CO2、O2、N2、Ar气体成分，使用汉密尔顿公司在线活细胞分析仪在线测定的电容值数据，并在上海快谱智能有限公司开发的“众知”发酵工艺分析软件包上实现连续计算发酵过程比氧消耗速率。
以上所述发酵过程结束后，对发酵液的相关指标进行测定和分析，结果为发酵效价为43.5g/L，转化率为15.9％。
结果分析：为了研究比氧消耗速率对色氨酸发酵的影响，通过实施例1-3分别控制不同的比氧消耗速(实施例1控制在3.5-4.0mmol/h/g，实施例2控制在3.0-3.5mmol/h/g，实施例3控制在2.5-3.0mmol/h/g)。结合实施例1-3对应的发酵效价和转化率可知：比氧消耗速率存在着最佳控制范围。通过比较分析实施例1-3的色氨酸浓度和转化率可知，实施例3维持2.5-3.0mmol/h/g的比氧消耗速率，产酸速率和转化率均较低，说明补加葡萄糖主要用于了菌体生长，而由于TCA循环产生的还原力和能量最终的电子受体为氧，因此在低的比氧消耗速率条件下，明显是葡萄糖代谢产生的中间代谢物和色氨酸合成前体物质被抽走用于菌体合成利用了，反而不利于色氨酸合成，而副产物乳酸、乙酸和谷氨酸没有太明显的过量积累(见图2)；而实施例1中维持3.5-4.0mmol/h/g的比氧消耗速率，从其对应的发酵效价和转化率可以看出维持高的比氧消耗速率下，TCA循环速度较快，产酸比有明显提高，但是由于TCA循环周转速率快的情况明显看到副产物谷氨酸的积累明显较高，说明TCA循环中的中间体α-酮戊二酸转化而成了谷氨酸；而实施例2维持3.0-3.5mmol/h/g的比氧消耗速率的结果出乎意料，其产酸和转化率明显好于实施例1和实施例3，说明在发酵过程中维持合适的比氧消耗速率对于细胞内代谢平衡有着重要作用，也就是说菌体生长、色氨酸合成以及TCA循环平衡存在着最佳控制比例。此外，实施例2中的谷氨酸比实施例1中有了下降趋势。鉴于此，在实施例1-3的基础上考虑到不同发酵阶段对比氧速率的需求不同，结合实施例1-3的发酵结果，而设计的实施例4和5为分阶段控制比氧消耗速率。实施例4为两阶段控制比氧消耗速率，实施例5为三阶段控制比氧消耗速率。发酵结果可知，采用分阶段控制比氧消耗速率其色氨酸浓度和转化率均高于实施例1-3，而且副产物谷氨酸没有明显积累，反而提高了转化率。各实施例在发酵过程中的比氧消耗速率变化见图1。主要副产物谷氨酸的含量结果见图2。实施例6为初始工艺对照，过程中没有采用复合氮料补加控制比氧消耗速率控制。明显看到在28h后比氧消耗率维持明显低于实施例1-5只有1.5-1.8mmol/h/g水平。说明在后期菌体代谢能力比较差，菌体消耗的葡萄糖更多的作为能源消耗掉，反观色氨酸合成速率较低。没有明显积累副产物谷氨酸。
本发明不局限于给出5个实施例，如采用本发明专利类似工艺策略进行组分改善或发酵效价提高均属于本发明专利保护范围内。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法，其特征在于，所述方法是在利用大肠杆菌发酵生产色氨酸的过程中，当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量降至5.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为2.5-4.0mmol/h/g。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合氮料的组成为氨基酸粉0.2g/L，玉米浆干粉0.3g/L，酵母粉0.2g/L、硫酸铵0.03g/L，消泡剂0.01g/L，余量为水，pH8.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中采用搅拌联动，控制溶氧不低于20％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中，当发酵2-4h后发酵液中葡萄糖浓度低于1.0g/L时开始补加浓度为650g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中发酵液葡萄糖浓度维持在0.01-0.2g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当单位菌体干重单位时间消耗的氧的量将至5.0mmol/h/g时，通过补加复合氮料分阶段控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分阶段控制是指在发酵8-20h时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.5-4.0mmol/h/g；在发酵20-32h时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为3.0-3.5mmol/h/g；在发酵32h至发酵结束时，控制单位菌体干重单位时间消耗的氧的量为2.5-3.0mmol/h/g。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵前还包括对大肠杆菌进行斜面培养、一级种子培养和二级种子培养；
斜面培养基的组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L和四环素0.05g/L，余量为水；
种子培养基的组成为葡萄糖10g/L，酵母粉4g/L，柠檬酸0.5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，VB11 mg/L，生物素0.35mg/L，七水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁2.8mg/L，微量元素混合溶液2mL/L，余量为水；
发酵选用的培养基组成为葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸2.5g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁2.8g/L，七水硫酸亚铁90mg/L，VB15 mg/L，生物素2mg/L，微量元素混合溶液4mL/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述一级种子培养是将斜面培养后的菌体接种于种子培养基中，于37℃，220rpm，摇瓶培养10-12h。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述二级种子培养是将一级种子液按照1％的接种量接种于种子培养基中，于36-37℃，通气比0.5VVM，200rpm，罐压0.03-0.05MPa，pH7.0-7.2，溶氧≥30％的条件下培养10-12h。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵是将二级种子液按照10％的接种量接种于发酵培养基中，于36-37℃，通气比1.0VVM，溶氧≥20％，罐压0.03-0.05MPa，pH6.8-7.0的条件下培养36-40h。
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