CN115581808B - 一种在心脑血管支架材料表面制备聚硫辛酸铜涂层的方法及含有该涂层的心脑血管支架材料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在心脑血管支架材料表面制备聚硫辛酸铜涂层的方法及含有该涂层的心脑血管支架材料。其主要为解决当前心脑血管药物洗脱支架面临的内皮化延迟的问题。该方法包括心脑血管支架材料预处理和聚硫辛酸铜涂层制备两个步骤，其技术路线是，将含硫辛酸和无水氯化铜的无水乙醇溶液浸涂/旋涂/喷涂到心脑血管支架材料表面上，之后干燥，完成聚硫辛酸铜涂层的制备。本申请获得的心脑血管支架材料表面聚硫辛酸铜涂层致密均匀、附着力强、能抑制血小板的粘附和变性、显著促进内皮细胞的生长和粘附。本发明方法可操作性强，效果好，有望取代当前负载雷帕霉素及其衍生物的心脑血管药物洗脱支架，为心脑血管支架材料的表面涂层提供了一种新方法。

Description

一种在心脑血管支架材料表面制备聚硫辛酸铜涂层的方法及 含有该涂层的心脑血管支架材料

技术领域

本发明属于心脑血管支架材料表面处理领域，具体涉及一种在心脑血管支架材料表面制备聚硫辛酸铜涂层的方法及含有该涂层的心脑血管支架材料。

背景技术

近年来，随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变及人口迅速老龄化，心脑血管病导致的病死率占比逐年上升。心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是中老年人健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。药物洗脱支架是目前心脑血管疾病介入治疗的重要方法。目前，药物洗脱的心脑血管支架材质主要为钴铬合金、镍钛合金、316L不锈钢、聚乳酸、镁合金、锌合金、铁合金等。药物洗脱支架植入血管内病变部位后，通过包被于心脑血管支架表面的聚合物涂层携带药物，药物自聚合物涂层中通过洗脱方式有控制地释放，从而抑制局部平滑肌细胞增殖或预防血栓形成，将支架内再狭窄发生率降低至10%以内。

然而，当前药物洗脱支架的包被涂层主要由聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚己内酯等少数聚酯负载的雷帕霉素及其衍生物或者紫杉醇等药物组成。一方面，这些聚合物及其降解产物自身没有任何治疗效果，有时还会带来额外的副作用。另一方面，该药物洗脱涂层尽管能够有效抑制平滑肌细胞的增殖，但同样也抑制内皮细胞的生长，导致内皮化延迟。此外，药物洗脱支架的涂层构成成本较高，还会增加患者的经济负担。

为了解决传统载抑制内膜增生类药物的支架植入后内皮化延迟，从而易引起晚期血栓和晚期再狭窄等不良事件的问题。本申请设想如果聚合物本身能够提供额外的治疗效果，将是很有希望的医用涂层材料。众多来源于动植物的天然小分子化合物具有独特的生物活性，如果成功将其开发成具有治疗效果的医学材料，将为新型医药用材料的创新提供新的途径。硫辛酸，作为一种B族维生素，普遍存在于生物体内。Beata[Oxidative Medicineand Cellular Longevity, 2015(2015), 1-11] 和Hu [Cardiology Plus, 5(2020),109-117] 等报道硫辛酸能够间接调节血脂水平，降低动脉粥样硬化的风险，它能够降低主动脉黏附分子和促炎因子的表达，还能起到抗氧化的作用。

进一步，设计的硫辛酸基聚合物涂层通过络合铜离子（Cu²⁺），可促进人体释放一氧化氮（NO），因为Cu²⁺离子能够催化内源性亚硝基硫醇供体产生NO分子。NO作为内皮细胞分泌的一种重要生物活性因子，在天然血管内皮细胞功能发挥中具有至关重要的作用。NO具有抑制血小板粘附/聚集、抑制平滑肌细胞增殖、抗炎、清除自由基、预防动脉粥样硬化及促进损伤内膜修复等多重生物学功能。因此，本申请将聚硫辛酸涂层和Cu²⁺离子结合到一起，并成功将其制备到心脑血管支架材料表面，实现支架植入后的抗凝血，快速原位内皮化，以达到降低急性血栓，抑制平滑肌过度增殖和避免晚期不良事件的目的。

发明内容

为解决当前药物洗脱支架面临的内皮化延迟的问题，本发明目的在于提供一种在心脑血管支架材料表面制备聚硫辛酸铜涂层的方法，其操作简单，成本较低，且所制备出的聚硫辛酸铜涂层均匀致密，附着力强。该涂层涂覆的心脑血管支架材料能显著促进内皮细胞增殖，实现快速内皮化并具备抗血栓形成的效果，可减少晚期支架血栓的发生。本申请中表面有聚硫辛酸铜涂层的心脑血管支架材料具有多功能性，适用性广的优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种在心脑血管支架材料表面制备聚硫辛酸铜涂层的方法，包括以下步骤：

（1）使用砂纸将心脑血管支架材料打磨至表面平整光滑，使用去离子水和无水乙醇依次冲洗，吹干，得到预处理的心脑血管支架材料，备用；

（2）将硫辛酸溶于醇类溶剂，随后加入无水氯化铜，搅拌，得到前驱体溶液，将聚硫辛酸铜涂层制备到预处理的心脑血管支架材料表面，干燥，即在心脑血管支架材料表面形成聚硫辛酸铜涂层。

上述心脑血管支架材料，具体地，选自：镁合金、锌合金、铁合金、316L不锈钢、聚乳酸、镍钛合金或钴铬合金；

较好地，上述醇类溶剂为无水甲醇或无水乙醇；

较好地，所述溶液中硫辛酸的浓度为0.1 g/mL ~ 0.3 g/mL，添加的无水氯化铜与硫辛酸单体的摩尔比为1: 100~5000。

较好地，聚硫辛酸铜涂层的制备方式为浸涂、旋涂、喷涂。

进一步地，还包括在预处理的心脑血管支架材料表面制备氟化镁转化层，具体过程为：将镁合金浸入氢氟酸溶液中，室温反应40~50h，清洗干净，干燥，即得，在氟化镁涂层上再制备聚硫辛酸铜涂层，氢氟酸溶液浓度为35~40wt%。

聚硫辛酸铜涂层的厚度为4μm~6μm，氟化镁转化层的厚度为1.5μm~3 μm。

上述制备方法制得的表面有聚硫辛酸铜涂层的心脑血管支架材料。

上述心脑血管支架材料在在心脑血管支架制备中的应用。

上述技术方案直接带来的技术效果是，成本较低，操作简单，所获得的心脑血管支架材料表面聚硫辛酸铜涂层致密均匀，附着力强，能抑制血小板的粘附和变性，显著促进内皮细胞的增殖。本发明方法可操作性强，效果好，为心脑血管支架材料的表面涂层提供了一种新方法。

附图说明

图1为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的SEM图像；

图2为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的EDS图；

图3为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的Raman谱图；

图4为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的FT-IR谱图；

图5为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的微纳米划痕实验；

图6为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的动电位极化曲线图；

图7为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的催化NO生成实验；

图8为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的血小板粘附实验的激光共聚焦图片；

图9为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的内皮细胞增殖实验；

图10为实施例2所制得的聚硫辛酸铜涂层的SEM图像；

图11为实施例2所制得的聚硫辛酸铜涂层的厚度测试。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明所使用的心脑血管支架材料均可通过郑州大学材料研究中心或商业渠道购买获得。

实施例1：

一种在镁合金心脑血管支架材料表面制备聚硫辛酸铜涂层的方法，包括以下步骤：

镁合金心脑血管支架材质为Mg-2.0Zn-0.5Y-0.5Nd镁合金（牌号为ZE21B，具体制备过程可参考专利CN201110043303.8） ，制备方法如下：

第一步，镁合金预处理步骤

将镁合金切成直径10 mm，厚度为3 mm的圆柱，打磨至光滑平整，以去除其表面氧化层，用去离子水和无水乙醇依次冲洗，吹干，备用；

第二步，氟化镁转化层的制备

在24孔板（直径约为1.5 cm，孔深约为2 cm，可盛放约3.3 mL的溶液）中加入2 mL浓度为40wt%的氢氟酸溶液；

将打磨后的Mg-2.0Zn-0.5Y-0.5Nd镁合金置于含氢氟酸溶液的24孔板中；

将24孔板放入通风橱中，温度为室温，时间为48 h。随后取出具有氟化镁转化层的镁合金材料，用去离子水和无水乙醇依次冲洗，去除残留的氢氟酸，吹干；

第三步，聚硫辛酸铜涂层的制备

配制0.15 g/mL硫辛酸溶液，溶剂为无水乙醇，随后添加无水氯化铜，无水氯化铜与硫辛酸的摩尔比为1: 1000；

将具有氟化镁转化层的镁合金材料浸入到含53 mL硫辛酸和氯化铜的混合溶液的烧杯（量程为100 mL）中5 s，取出，随后置于烘箱中，在40 ℃条件下烘干30 min，即得。

将所制得的修饰有氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的镁合金试样装入样品袋中，封存备用。

对实施例1中所获得镁合金心脑血管支架材料表面氟化镁-聚硫辛酸铜涂层进行扫描电

镜(SEM)观察、能谱分析(EDS)、拉曼(Raman)光谱分析、傅立叶红外光谱分析(FT-IR)、附着力测试、动电位极化曲线分析、NO释放实验分析、血小板粘附测试、内皮细胞增殖测试，结果如图1至图9所示。

图1为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的SEM图像，由图1可以看出氟化镁-聚硫辛酸铜涂层表面膜层致密，均匀性良好。

图2为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的EDS图，由图2可以发现样品含有适量的Mg元素和少量的F元素，说明成功在镁合金表面制备了氟化镁转化层。此外，还可以发现样品表面S元素含量最高，也有一定量C和O元素的出现，这对应于聚硫辛酸铜中所含的元素，说明氟化镁-聚硫辛酸铜涂层成功被制备到样品表面。未探测出Cu元素的存在，可能归因于其含量过低。

图3为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的Raman谱图，如图3所示，对于硫辛酸单体，508 cm^-1处的特征峰对应于二硫键。聚硫辛酸铜样品中二硫键的特征峰***为两个不同的峰（506 cm^-1和519 cm^-1），这证实了硫辛酸开环聚合为聚硫辛酸。

图4为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的FT-IR谱图。如图4所示，在硫辛酸单体光谱中，1694 cm^-1处的强吸收峰表明存在C=O伸缩振动峰，这可能来自硫辛酸单体的羧酸基团。相比较于硫辛酸单体中C=O峰，聚硫辛酸铜涂层中的C=O峰移动到的较高的1703cm^-1，这是因为氢键二聚体羧基基团与Cu²⁺离子配位，增强了聚硫辛酸铜涂层中C=O的拉伸。此外，在红外光谱图上新出现的位于1624 cm^-1 的吸收峰是配位后羧基的不对称伸缩振动吸收峰，进一步证实了Cu²⁺离子与羧酸基团形成了较强的配合物。

图5为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的微纳米划痕实验。微纳米划痕试验以恒定的划痕速率（2 mm/min）进行，通过将线性载荷增加到5 N（5 N/min的载荷速率），直到划痕长度达到2 mm。如图5所示，可以观察到，氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的附着强度约为603.0 mN，表明该涂层具有较强的粘结力。此外，划痕深度的变化在一定程度上可以反映涂层的厚度。氟化镁-聚硫辛酸铜样品外层的聚硫辛酸铜涂层和内层的氟化镁转化层的厚度分别约为5.5 μm和2.0 μm。

图6为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的动电位极化曲线图。具体的测试步骤如下，使用电化学工作站进行相关的电化学测试，电解液为Hank's平衡盐溶液，温度为37 ℃。所有电化学测量均在传统的三电极***中进行，该***中，铂片作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极和暴露面积为0.78 cm²的样品作为工作电极。在电化学测试之前，测量样品的开路电位 10 min，直到开路电位达到稳定状态。然后，以1.0 mV∙s⁻¹的恒定扫描速率记录了样品从-2.0 V到0.0 V的动电位极化曲线，并通过塔菲尔（Tafel）外推法获得相应的电化学参数。如图6所示，对比结果可以发现，带有氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的镁合金试样相对于镁合金基体，自腐蚀电流密度明显降低，由2.90 × 10^-5 A/cm²降低至9.16×10^-8 A/cm²，下降了接近3个数量级。以上结果说明氟化镁-聚硫辛酸铜涂层显著提高了镁合金的耐蚀性能。

图7为实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的催化NO生成实验。该实验具体实验步骤如下，使用NO试剂盒评估NO的生成率。简言之，氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的镁合金试样浸入含有NO供体（260 mM SNAP和120 mM GSH）的2 mL PBS（pH 7.4）中。将含有NO供体的纯PBS用于对照组。在37 ℃下孵育0.5、1.0和2.0 h后，使用NO试剂盒用于测量浸泡溶液中产生的NO的浓度。测试过程严格按照试剂盒手册进行。用Griess试剂染色后，使用紫外分光光度计在540 nm处测量浸泡溶液的吸光度。试剂盒测量NO生成量的原理是，样品催化NO供体释放的NO很容易被氧化成NO₂ ^¯，NO₂ ^¯与Griess试剂能快速形成粉色的重氮化合物。如图7所示，对于对照组，由于NO供体的自分解，在测试期间NO的释放呈现出缓慢且线性的曲线（0.5 h，5.050 μM；1.0 h，6.735 μM；2.0 h，10.105 μM）。相比之下，氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的存在导致了较高浓度的NO生成 （0.5 h，59.895 μM；1.0 h，113.013 μM；2.0 h，115.956 μM），表明Cu²⁺离子具有对NO供体分解的催化作用。

图8为玻璃、镁合金和实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的血小板粘附实验的激光共聚焦图片。具体方案为，从健康志愿者中提取2 mL外周血，并将3.2%的柠檬酸钠添加到新鲜血液中以获得抗凝血全血。然后，通过离心血液（1000 r/min，10 min）分离富含血小板的血浆。将含血小板的血浆（5 μL）滴在每个样品上，并在37 ℃下孵育60 min，将干净的载玻片用作对照组。使用生理盐水润洗未吸附的富含血小板的血浆，并使用4%多聚甲醛在室温下将样品上粘附的血小板固定，时间为10 min，然后用生理盐水洗涤。最后，采用激光扫描共聚焦显微镜观察血小板在样品上的吸附行为。如图8所示，大量血小板粘附在玻璃表面（对照组），一些血小板伸出伪足，表明典型的活化状态，证明实验中血小板功能正常，该方法可靠有效。一些血小板出现在镁合金表面上，但粘附的血小板数量显著低于玻璃表面上的血小板数量，并且没有激活的血小板。在氟化镁-聚硫辛酸铜涂层样品中没有观察到血小板粘附的迹象，这表明该样品可以显著抑制血小板粘附和聚集，进而起到抗凝血作用。

图9为镁合金、实施例1第二步得到氟化镁转化层、氟化镁-外消旋聚乳酸/雷帕霉素涂层（药物洗脱支架涂层）、实施例1所制得的氟化镁-聚硫辛酸铜涂层的内皮细胞增殖实验。其中，氟化镁-外消旋聚乳酸/雷帕霉素涂层的制备方法参考Yuan[Materials Scienceand Engineering C, 80(2017), 1-6] 的相关论文，但稍加修改。氟化镁转化层与实施例1中操作一致。此外，将170 mg外消旋聚乳酸（重均分子量约为100000 g/moL）和30 mg雷帕霉素溶于20 mL二氯甲烷溶剂中，搅拌5 min，完全溶解。随后，通过旋涂技术将外消旋聚乳酸/雷帕霉素涂层制备到氟化处理的镁合金表面，干燥去除二氯甲烷，待用，所制备的外消旋聚乳酸/雷帕霉素涂层的厚度约为5.2 μm。内皮细胞增殖实验的实验过程如下所述。本申请通过间接法（即浸提液）评估所有样品的促内皮化性能。用胰蛋白酶消化内皮细胞以获得单细胞悬浮液，细胞计数后将细胞浓度调整为4×10⁴ cells/mL。然后，用紫外线（UV，波长为254nm，灭菌温度为27℃）分别照射所有样品的正面和背面60 min，并根据固定的表面积/溶液体积比（1.25 cm²/mL，according to ISO 10993-5）制备样品的浸提液。将内皮细胞（4×10³ cells /孔）接种到96孔板中，并在加湿培养箱（37℃，95% 相对湿度，5% CO₂）中培养过夜。然后，加入含浸提液的培养基（V_浸提液:V_{完全培养基}＝1:1），分别培养内皮细胞12、24和72h。培养完成后，除去培养基，然后用PBS清洗每个孔。向每个孔中加入100 μL含有10% CCK-8的新培养基，在细胞培养箱（37℃，95% 相对湿度，5% CO₂）中培养2 h。随后，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值。如图9所示，可以看出，培养24和72 h后，氟化镁-聚硫辛酸铜涂层样品表现出比镁合金、氟化镁、以及氟化镁-外消旋聚乳酸/雷帕霉素样品更高的OD值，表明该样品对的内皮细胞的增殖有显著的促进作用。

实施例2：

一种316L不锈钢心脑血管支架材料表面聚硫辛酸铜涂层的制备方法，包括以下步骤：

心脑血管支架材质为医用316L不锈钢，制备方法如下：

第一步，316L不锈钢预处理步骤

将316L不锈钢切成10 × 10 × 1 mm的正方形片状，打磨至光滑平整，用去离子水和无水乙醇依次冲洗，吹干，备用；

第二步，聚硫辛酸铜涂层的制备

配制0.2 g/mL硫辛酸溶液，溶剂为无水乙醇，随后添加无水氯化铜，无水氯化铜与硫辛酸的摩尔比为1:500；

将316L不锈钢片材料浸入到含53 mL硫辛酸和氯化铜的混合溶液的100 mL烧杯（量程为100 mL）中5 s，取出，随后置于烘箱中，在40 ℃条件下烘干30 min，即得。

将所制得的修饰有聚硫辛酸铜涂层的316L不锈钢片装入样品袋中，封存备用。

对实施例2中所获得316L不锈钢心脑血管支架材料表面聚硫辛酸铜涂层进行扫描电镜(SEM)观察，结果如图10所示。

图10为实施例2所制得的聚硫辛酸铜涂层的SEM图像。

如图10所示，可见聚硫辛酸铜涂层在316L不锈钢表面完整覆盖，均匀性良好。

图11为实施例2所制得的聚硫辛酸铜涂层的厚度测试。为了测量准确，本申请采用相同的方法将聚硫辛酸铜涂层制备到316L不锈钢圆盘上（直径为40 mm，厚度为2 mm）。如图所示，制备的聚硫辛酸铜涂层的厚度为5.8 μm。

以上所述仅是本发明的部分实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种在心脑血管支架材料表面制备聚硫辛酸铜涂层的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）使用砂纸将心脑血管支架材料打磨至表面平整光滑，使用去离子水和无水乙醇依次冲洗，吹干，得到预处理的心脑血管支架材料，备用；

（2）将硫辛酸溶于醇类溶剂，随后加入无水氯化铜，搅拌，得到前驱体溶液，将聚硫辛酸铜涂层制备到预处理的心脑血管支架材料表面，干燥，即在心脑血管支架材料表面形成聚硫辛酸铜涂层；所述醇类溶剂中硫辛酸的浓度为0.1 g/mL ~ 0.3 g/mL，无水氯化铜与硫辛酸单体的摩尔比为1: 100~5000。

2.如权利要求1所述制备聚硫辛酸铜涂层的方法，其特征在于，步骤（1）中心脑血管支架材料为镁合金或锌合金或铁合金或316L不锈钢或聚乳酸或镍钛合金或钴铬合金。

3.如权利要求1所述制备聚硫辛酸铜涂层的方法，其特征在于，所述醇类溶剂为无水甲醇或无水乙醇。

4.如权利要求1所述制备聚硫辛酸铜涂层的方法，其特征在于，聚硫辛酸铜涂层的制备方式为浸涂、旋涂或喷涂。

5.如权利要求1所述制备聚硫辛酸铜涂层的方法，其特征在于，还包括在预处理的心脑血管支架材料表面制备氟化镁转化层，具体过程为：将预处理的心脑血管支架材料浸入氢氟酸溶液中，室温反应40~50h，清洗干净，干燥，即得，在氟化镁转化层上再制备聚硫辛酸铜涂层，氢氟酸溶液浓度为35~40wt%。

6.权利要求1至5任一所述的制备方法制得的表面有聚硫辛酸铜涂层的心脑血管支架材料。

7.权利要求6所述心脑血管支架材料在心脑血管支架制备中的应用。