CN115561355B - 羧肽酶g2的中和抗体检测方法以及基于lc-ms/ms的检测*** - Google Patents

Abstract

本发明涉及中和抗体检测技术领域，具体涉及羧肽酶G2的中和抗体检测方法以及基于LC‑MS/MS的检测***。检测方法包括如下依次进行的步骤：将样品和CPG2工作液混合并孵育，然后加入内标溶液，获得第一混合体系；将第一混合体系和MTX溶液混合并孵育，获得第二混合体系；使用沉淀剂处理第二混合体系，获得待富集处理品；使用UPLC‑MS/MS检测待富集处理品中的DAMPA。本技术方案解决了现有技术中尚无有效的检测羧肽酶G2的中和抗体的方法的技术问题，首次将配体结合、酶反应与UPLC‑MS/MS相结合的技术应用于生物样品中中和抗体检测，方法和***的精密度和灵敏度高，适合应用于评价药物免疫原性的实践操作中。

Description

羧肽酶G2的中和抗体检测方法以及基于LC-MS/MS的检测***

技术领域

本发明涉及中和抗体检测技术领域，具体涉及羧肽酶G2的中和抗体检测方法以及基于LC-MS/MS的检测***。

背景技术

对于大多数药物，不良免疫反应一般由体液免疫机制介导的免疫应答所致(一些免疫调节类药物由细胞免疫介导)，因此抗药抗体(包括中和抗体)一直是定义该类药物免疫原性的主要标准。药物的中和抗体分析试验需要根据药物的作用机制以及试验的灵敏度、选择性、精密度、药物耐受性及产生的中和抗体对受试者的影响等因素来选择。目前中和抗体检测方法主要有基于细胞的试验方法，以及基于非细胞的试验方法。基于细胞的试验方法主要包括：(1)以细胞酶反应为基础，通过中和抗体对细胞活性或增殖的影响来检测中和抗体；(2)以蛋白水解酶等为基础，通过定量分析活细胞、凋亡或死亡细胞的数量，来评估中和抗体对凋亡抑制的中和活性；(3)以细胞代谢标志物作为检测指标，用以评价中和抗体对药物作用于细胞代谢通路的影响。而基于非细胞的试验方法主要是基于中和抗体与药物靶蛋白竞争性结合药物的特性，通过测定药物与靶蛋白的结合是否被抑制来检测中和抗体。一般中和抗体检测方法开发难度大，均需个性化定制。

中和抗体检测方法与药物体内作用机制的相关性为首要考虑因素，通常采用基于细胞的中和抗体检测方法。但是，当药物在体内的作用机制与细胞关系较小，例如液中游离靶点的拮抗反应、酶反应等，或者由于生物基质干扰因素，细胞学方法的变异程度、定量范围灵敏等难以满足方法学验证和样本分析的需要时，可能采用基于非细胞的试验方法(如配体结合分析、酶反应等)。通常基于非细胞的试验方法原理是抗原与抗体结合或酶与底物反应等，然后通过免疫分析技术间接检测药物中和抗体。免疫分析技术通常检测成本较高，分析方法开发难道大，方法灵敏度和特异性高度依赖于结合试剂(如结合蛋白、适配子、抗体或酶等)的活性、纯度、制备工艺等。

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)为广谱的抗肿瘤药物，也可用于银屑病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗。MTX为非靶向治疗药物，故其发挥抗肿瘤作用的同时也会对多个器官***造成损害，其不良反应和严重程度随着MTX使用剂量的增加而增加，而MTX的清除延迟与不良反应的发生率密切相关。人体内缺乏降解MTX的酶，MTX主要以原型经肾排出，肾损伤为清除延迟的高危因素。而羧肽酶G2(Carboxypeptidse G2,CPG2)是一种细菌酶，能迅速地将MTX代谢为两个非活性代谢物：谷氨酸和2,4-氨基-N-10-甲基蝶酸(2,4-diamino-N10-methylpteroic acid,DAMPA),DAMPA细胞毒性低，可经肝脏代谢。因此，药物注射用重组羧肽酶G2实际上间接提供了一种肝解毒途径。根据CPG2在体内的作用机制，无法开发基于细胞的中和抗体检测方法，但现有的基于非细胞的试验方法开发难度大，目前尚无有效的检测羧肽酶G2的中和抗体的方法。

发明内容

本发明意在提供羧肽酶G2的中和抗体检测方法，以解决现有技术中尚无有效的检测羧肽酶G2的中和抗体的方法的技术问题。本方案公开了一种基于非细胞的与LC-MS/MS分析技术相结合的试验方法来检测药物中和抗体，以补充完善现有中和抗体检测技术，并大大降低现有检测技术成本、缩短检测周期以及提高检测通量。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

羧肽酶G2的中和抗体检测方法，用于非治疗或非诊断目的的评价药物免疫原性，包括如下依次进行的步骤：

S1：将样品和CPG2工作液混合并孵育，然后加入内标溶液，获得第一混合体系；

S2：将第一混合体系和MTX溶液混合并孵育，获得第二混合体系；

S3：使用沉淀剂处理第二混合体系，获得待富集处理品；

S4：使用UPLC富集所述待富集处理品，获得DAMPA富集样品；

S5：使用MS/MS检测和/或量化所述富集样品中的DAMPA。

本方案还提供了一种基于UPLC-MS/MS的羧肽酶G2的中和抗体检测***，包括预处理试剂组合和UPLC-MS/MS设备；所述预处理试剂组合包括中和抗体结合单元、催化反应单元和沉淀富集单元；中和抗体结合单元包括CPG2工作液和内标溶液；催化反应单元包括MTX溶液；沉淀富集单元包括甲醇。

本技术方案的原理及优点是：

本技术方案构建了一种非细胞的CPG2中和抗体的试验方法，再结合LC-MS/MS分析技术，实现了CPG2中和抗体的检测。首先通过CPG2工作液与样品37℃孵育，若样品中CPG2中和抗体含量越高，则CPG2酶活性被中和的越多；孵育后的样品加入内标和MTX工作液在冰水浴孵育，若生物样品中CPG2酶活性越高，则CPG2酶解MTX得到的DAMPA越多；生物样品再通过纯化处理(具体为萃取技术)使样品中的蛋白杂质除去，获得待富集处理品，再使用UPLC法从待富集处理品获得DAMPA富集样品，然后通过MS/MS获得碎片离子并测量碎片离子的量，测定的碎片离子的量与所述样品中DAMPA的量有关，因此可对DAMPA进行定量或者定性的检测。本发明利用配体结合试验、酶反应试验以及超高效液相色谱串联质谱/质谱法(UPLC-MS/MS)，通过研究影响CPG2与CPG2中和抗体结合、CPG2酶解MTX以及DAMPA分离的实验因素，建立了通过LC-MS/MS检测生物样品中DAMPA的量，间接检测生物样品CPG2中和抗体水平的方法。免疫分析技术相比，液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)分析技术具有方法开发难道低、检测成本低、方法特异性高、试剂无特殊要求、检测周期短通量高等优势。本技术方案开发了一种LC-MS/MS分析技术与基于非细胞的试验方法相结合的药物中和抗体检测方法，具有检测过程耗时短、相对成本低、特异性好、灵敏度高和节省劳动量的优点。

本方案的基于UPLC-MS/MS的羧肽酶G2的中和抗体检测***，包括预处理试剂组合和UPLC-MS/MS设备。首先，使用中和抗体结合单元中的CPG2工作液与样品中潜在的综合抗体进行配体结合反应，然后加入内标以供后续UPLC-MS/MS检测。然后，使用催化反应单元中的MTX溶液与配体结合反应后的CPG2反应，获得DAMPA。最后，通过UPLC-MS/MS设备定性或者定量的检测样品中的DAMPA，间接地反映出样品中CPG2的中和抗体的量。

本技术方案的***可以应用于药物CPG2免疫原性的评价，分析药物CPG2的抗药抗体(包括中和抗体)的产生情况，进而了解该药物由体液免疫机制介导的免疫应答所致的不良反应情况，对药物的安全性进行充分全面的评价。本技术方案基于非细胞的试验方法，并且不依赖于免疫分析技术，充分利用了LC-MS/MS分析技术成本低、灵敏度高以及检测耗时短等特点。

进一步，在S1中，样品为生物样品、校正因子样品、阳性对照样品和阴性对照样品中的一种；生物样品为血清、血浆和细胞组织上清中的一种，所述生物样品的来源为人、猴、犬、兔或者鼠；当生物样品为血浆时，生物样品中含有抗凝剂；所述抗凝剂包括草酸钾、肝素、氟化钠、二乙胺四乙酸钠盐和枸橼酸钠中的至少一种。

生物样品可以来源于人、猴、犬、兔或者鼠，可以为血清、血浆和细胞组织上清中的一种形式。当生物样品为血浆的时候，需要加入抗凝剂。抗凝剂的加入对于本方案的检测方法和***的检测结果不存在影响，进一步说明了本***的抗干扰效果理想。

生物样品包括空白基质，所述空白基质为个体给药前或健康个体(未给药)的血清、血浆或细胞培养上清，给药具体是指羧肽酶CPG2给药。校正因子样品为随机选择至少10个个体空白基质混合样品。校正因子是色谱法检测中常用的参数，校正因子样品旨在调整每一个分析批因酶与底物反应的程度不同或使用不同仪器而造成的响应值的差异。校正因子等于第一个分析批校正因子样品响应值除以当前分析批校正因子样品响应值，为现有技术中的常规方法。校正响应值等于仪器检测响应值乘以校正因子。

在本技术方案中，阳性对照样品和阴性对照样品分别是指含有CPG2阳性对照抗体的对照品以及含有非CPG2阳性对照抗体的对照品(可选择使用Rabbit anti-GAPDH)，并使用空白生物基质作为稀释剂。阴性对照样品还可以选用混合空白基质，即随机选择多个个体空白基质混合获得。

进一步，在S1中，孵育温度为37℃，孵育时间为2小时，并且孵育过程在600转/分钟摇床条件下进行，在孵育过程中的CPG2的工作浓度为1ng/mL。

在上述温度、时间以及浓度参数下，样品中的中和抗体可以和CPG2充分结合。在2小时的时候达到平衡转折点，样品和CPG2的孵育时间选择2小时。特别是在CPG2的工作浓度为1ng/mL的时候，能够最大限度降低背景值，对检测准确度的影响最小。

进一步，在S2中，孵育温度为0℃，孵育时间为1小时，在孵育过程中的MTX的工作浓度为40μg/mL。

在本技术方案中，0℃孵育时，DAMPA检测结果呈现良好的线性关系。MTX孵育温度选择0℃。随着MTX反应浓度的增加DAMPA检测结果逐渐增加并趋于平衡，在40μg/mL的终浓度条件下达到平衡转折点。

进一步，在S5中，使DAMPA富集样品中的含DAMPA的成分经受电离源，获得前体离子；然后使前体离子经受碰撞诱导解离生成碎片离子；所述前体离子包括质荷比为326.2的DAMPA前体离子以及质荷比为329.1的内标前体离子；所述碎片离子包括质荷比分别为176.2、160.2、133.1的DAMPA碎片离子以及质荷比分别为176.2、160.9、137.2的内标碎片离子。

采用上述技术方案，在适合生成可通过质谱法检测的DAMPA前体离子的条件下使DAMPA富集样品经受电离源，再使DAMPA前体离子经受碰撞诱导解离以生成可通过质谱法检测的一种或多种碎片离子，最后通过质谱法测定一种或多种碎片离子的量，测定的碎片离子的量与所述样品中DAMPA的量有关，因此可对DAMPA进行定量或者定性的检测。

来自色谱分析柱的液体溶剂流进入MS/MS分析器的加热喷雾器接口；并且在接口的加热带电管道内将溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。在这些过程期间，分析物DAMPA电离，形成各种前提离子。前体离子通过仪器口并且进入第一个四极杆。四极杆1和3(Q1和Q3)为滤质器，允许基于其质荷比(m/z)选择离子(即，分别选择Q1和Q3中的“前体”和“碎片”离子)。四极杆2(Q2)是碰撞室，在碰撞室内破碎离子。质谱仪的第一个四极杆(Q1)选择具有DAMPA离子的m/z的分子。使具有恰当m/z的前体离子进入碰撞室(Q2)，而具有任何其它m/z的不合需要的离子与四极杆的侧面碰撞并且被消除。进入Q2的前体离子与中性气体分子(例如氩分子)碰撞并且破碎。使生成的碎片离子进入四极杆3(Q3)，在四极杆3中选择碎片离子进行检测。

Q1选择用于m/z为326.2(DAMPA)、329.1(内标)的前体离子。破碎这些DAMPA前体离子生成m/z为176.2、160.2、133.1(DAMPA)、176.2、160.9、137.2(内标)的碎片离子。可测量来自单个前体离子的单个碎片离子的峰面积比。或者，可测量自单个前体离子的两个或更多个碎片离子的峰面积比。通过现有技术常规的计算方法，将每个碎片离子的峰面积比换算成DAMPA的量，以定性或半定量评估最初样品中的CPG2中和抗体水平。

进一步，当从S5获得的样品检测的校正后响应值大于阈值，检测结果为阴性；当从S5获得的样品检测的校正后响应值小于阈值，检测结果为阳性；所述阈值通过检测空白基质样品并经统计获得，空白基质样品为未给药的健康个体来源的生物样品或者是来自于给药前个体的生物样品；

将阳性的样品与阴性对照样品梯度混合，获得若干稀释样品；对稀释样品进行S1-S5的检测，计算获得阳性的样品的滴度值。

采用上述技术方案，阈值即为定性判断样品阴性或阳性的临界点。发明人通过检测多个不同个体的空白生物基质中CPG2中和抗体水平，检测6次的校正后响应值，进而计算确定上述阈值。阈值等于不同个体空白生物基质6次检测的校正后响应值的平均值减去其1.645倍的标准偏差(SD)，1.645表示空白个体95％百分位数的单侧90％置信区间。若生物样品检测校正后响应值大于阈值，检测结果表示阴性；若生物样品检测校正后响应值小于阈值，检测结果表示阳性。若检测结果为阳性的生物样品需要进一步半定量检测中和抗体的滴度水平。此时，则使用阴性对照样品作为稀释剂梯度稀释阳性生物样品(如2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍)后检测。滴度为样品校正后响应值小于阈值的最大稀释倍数，如2倍、4倍、8倍稀释的检测结果为阳性，16倍、32倍、64倍稀释的检测结果为阴性，则滴度结果表示为8；若2倍稀释检测结果为阴性，则滴度结果表示为小于1。

在本技术方案中，发明人通过对50个不同个体的空白生物基质进行检测，确定了本***的检测阈值为1.866176。可以通过比较生物样品的检测值与该阈值，进而判断样本中的中和抗体的情况。

进一步，中和抗体结合单元的工作温度为37℃；样品和CPG2工作液的体积比为80:20，CPG2工作液的浓度为5ng/mL；样品和内标溶液的体积比为80:50；内标为同位素d3标记的DAMPA，内标溶液的浓度为1500ng/mL；

催化反应单元的工作温度是0℃，样品和MTX溶液的体积比为80:100，MTX溶液的浓度为100μg/mL；

样品和甲醇的体积比为80:400。

中和抗体结合单元的工作温度为37℃，样品中的中和抗体可以和CPG2充分结合，有效反映出样品中的中和抗体的量。样品和CPG2工作液的体积比为80:20，CPG2工作液的浓度为5ng/mL，保证了最大限度降低背景值，减小了背景噪音对检测准确度的影响。

催化反应单元的工作温度是0℃，孵育时酶裂解速度适中，DAMPA检测结果呈现良好的线性关系，MTX孵育温度选择0℃。随着MTX反应浓度的增加DAMPA检测结果逐渐增加并趋于平衡，样品和MTX溶液的体积比为80:100，MTX溶液的浓度为100μg/mL，上述条件下可达到平衡转折点。

样品和甲醇的体积比为80:400，可保证样品中的蛋白被充分沉淀除去，保证检测准确性。本方案在样品加入了d3标记的DAMPA内标，通过与检测的内标离子的量作比较，判断DAMPA生成的离子的存在与否或存在的量。

综上，采用上述的技术方案可以充分介绍背景噪音以及非DAMPA的成分对于检测准确度的影响，保证DAMPA检测结果呈现良好的线性关系。发明人使用本技术方案的***对于高脂肪基质和溶血基质的生物样品进行了检测，发现复杂基质并不造成较大的检测偏差，说明本技术方案的抗干扰能力较强。本方案使用的生物样品类型还包括分离胶血清、促凝剂血清、二乙胺四乙酸钠盐血浆、肝素钠血浆、肝素锂血浆、枸橼酸钠血浆、氟化钠血浆，使用本法对于上述含有抗凝剂的样品进行CPG2中和抗体定性或半定量测定，基质特异性小，由于基质差异带来的检测准确度影响小，本***抗干扰能力强。本技术方案的所述预处理试剂组合(中和抗体结合单元、催化反应单元和沉淀富集单元)的各项参数设置保证了本***的上述抗干扰能力。

进一步，UPLC-MS/MS设备的UPLC参数设置为：

色谱柱：X-Bridge C18，50μm，50×2.1mm；

流动相A：0.1vol.％甲酸水溶液；

流动相B：甲醇；

洗脱条件：

洗针液：1vol.％甲酸的50vol.％甲基甲酰胺水溶液；

流速：0.4mL/min；

柱温：40℃；

进样室温度：2-8℃；

进样量：2μL。

采用上述色谱参数，可以保证DAMPA被充分富集，以供后续的串联色谱检测。

进一步，：UPLC-MS/MS设备的MS/MS参数设置为：

气帘气：30psi；

离子源气体1：40psi；

离子源气体2：50psi；

离子源温度：500℃；

加热板块：ON；

离子源电压：5500V；

CAD：9units；

电离源为电喷雾电离源；电离模式为正离子模式，扫描模式为多反应离子监测。

本方案通过“串联质谱法”(即“MS/MS”)提高MS技术的分辨率。在这种技术中，可在MS仪器中过滤由目标分子生成的前体离子(也称为母离子)，随后破碎前体离子以产生一个或多个碎片离子(也称为子离子或产物离子)，然后在第二个MS过程中分析所述碎片离子。通过精心选择前体离子，仅使某些分析物产生的离子通过到达破碎室，在那里与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。因为在一系列指定电离/破碎条件下以可重现方式生成前体和碎片离子，所以MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。

使用多反应离子监测(MRM)检测模式检测离子。当离子与检测器碰撞时，它们产生转化为数字信号的电子脉冲。将所需数据转发至计算机，计算机绘制收集离子计数与时间的图。所得质量色谱图与传统高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS)方法中生成的色谱图类似。可测量与特定离子相对应的峰下面积与目标分析物的量相关联。

综上所述，本技术方案获得的有益效果在于：

本技术方案首次提出将配体结合、酶反应与UPLC-MS/MS相结合的技术应用于生物样品中中和抗体检测。在本技术方案中，对生物样品加入CPG2和MTX孵育条件等各项条件进行了优化和摸索，选用了适合的孵育温度、时间、反应浓度以及色谱柱、柱温和流速等条件，成功地分离出DAMPA，采用UPLC-MS/MS分析技术检测酶反应产物DAMPA，间接定性或半定量检测中和抗体水平。更具体地，本技术方案通过空白基质配制阳性对照样品、阴性对照样品、校正因子样品以及蛋白质沉淀和UPLC富集待测物，来最大限度地减少未知内源物质对测定结果的干扰和影响；通过冰水浴(0℃)条件进行CPG2酶解MTX的反应，可有效防止过度酶解反应，保证了所有样品的酶解反应的一致性，为LC-MS/MS检测酶反应产物DAMPA的分析方法的重现性、精密度、灵敏度、特异性、耐药性提供了保障。本技术方案的优点主要有：单个样品进样时间短(2.5分钟)；取样量小(2μL)；高通量检测(96个样品同时制备)；方法特异性好；检测成本低等。

本方案的精密度和灵敏度很高，它可以被用作评估新药或生物类似药的临床效果和安全性的指标。灵敏度为3.95ng/mL符合国家药品监督管理局药品审评中心发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》(2021年第25号)的要求(≤100ng/mL)。本方法精密度及灵敏度全部在可接受水平内(精密度：≤15％；灵敏度：≤100ng/mL)。本方案配体结合(CPG2中和抗体中和CPG2酶活性)孵育条件、酶反应(CPG2酶解MTX)条件、色谱条件、质谱条件以及样品预处理方法的适当选取，保证了本技术方案获得理想检测效果。如果调整配体结合孵育条件、酶反应条件、色谱柱类型以及色谱参数或者调整质谱参数，均会导致检测的精密度或方法灵敏度不符合要求。

综上所述，本发明为药物免疫原性评价(中和抗体检测)提供一种新的高通量、低成本的检测策略，并更适合应用于评价药物免疫原性的实践操作中。

附图说明

图1为实施例1的检测的高浓度阳性对照样品(150ng/mL)的DAMPA典型质谱图。

图2为实施例1的检测的低浓度阳性对照样品(7.5ng/mL)的DAMPA典型质谱图。

图3为实施例1的检测的阴性对照样品的DAMPA典型质谱图。

图4为实施例1的检测的内标(DAMPA-d3)的典型质谱图。

图5为实施例2的不同CPG2浓度下十个空白个体血清样品测试结果。

图6为实施例2的不同孵育时间下不同浓度的阳性对照抗体对CPG2活性(CPG2浓度5ng/mL)的影响。

图7为实施例2的不同浓度的CPG2阳性对照抗体对CPG2(5ng/mL)的抑制曲线图。

图8为实施例2的十个空白个体血清样品(CPG2浓度5ng/mL，2小时孵育)测试结果。

图9为实施例3的不同酶反应温度(0℃和37℃)对DAMPA检测结果的影响。

图10为实施例3的不同MTX反应浓度对DAMPA检测结果的影响。

图11为实施例3的不同MTX反应(CPG2酶裂解MTX)时间对DAMPA检测结果的影响。

图12为实施例3的不含促凝剂和含促凝剂的不同空白个体血清样品对检测结果的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

对本文件中用到的术语进行统一解释如下：

术语“配体结合”指关键步骤是配体(分析物)与结合分子之间的平衡反应的试验，结合分子通常是蛋白质，如抗原和抗体结合。通常配体与结合分子是特异性结合的，但也会有非特异性的结合而干扰检测。

术语“酶反应”指酶作为催化剂进行催化的化学反应，酶的催化条件温和，在常温、常压下即可进行。酶促反应具有高度的特异性，一般只作用于特定结构的底物或一类化合物。

术语“生物样品”指可能含有目标分析物的任何样品。在优选实施方案中，生物样品包括来自人类的体液样品，优选血清。生物样品为血浆时，抗凝剂包括草酸钾、肝素、氟化钠、二乙胺四乙酸钠盐、枸橼酸钠。

术语“纯化”和“富集”并不指从样品中去除除目标分析物外的所有物质。相反，这些术语指使一种或多种目标分析物的量相对于样品中可能干扰目标分析物的检测的其它组分富集的过程。通过各种方式纯化样品可使一种或多种干扰物质，例如可能或可能不干扰通过质谱法检测所选母离子或子离子的一种或多种物质相对减少。当使用该术语时，相对减少不需要通过纯化完全去除待纯化材料中与目标分析物一起存在的任何物质。

术语“蛋白沉淀”指分析过程中对生物样品进行前处理的一种常用方式。对于富含蛋白质的样品，在进行分离、提取时要将大量干扰测定的蛋白质沉淀除去，使待测物仍留存于溶液中。

术语“超高效液相色谱法”或“UPLC”指通过在压力下迫使流动相通过固定相，通常为密集填充柱，提高分离程度的液相色谱法。术语“梯度洗脱”是在样品组分的分析周期中，流动相的组成比例和流速变化的洗脱方式。

术语“质谱法”或“MS”指通过其质量鉴定化合物的分析技术。MS指基于其质荷比或“m/z”过滤、检测和测量的方法。MS技术通常包括电离化合物以形成带电化合物；和检测带电化合物的分子量并计算质荷比。可通过任何适合方式电离并检测化合物。“质谱仪”通常包括离子发生器、质量分析器和离子检测器。一般而言，电离一个或多个目标分子，并且随后将离子引入质谱仪中，其中由于磁场和电场的组合，离子在空间上跟随取决于质量(m)和电荷(z)的途径。

术语“电离”指生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。

术语“电喷雾电离”或“ESI”指使溶液沿末端施加了高正或负电位的长度较短的毛细管通过的方法。使到达管末端的溶液蒸发(雾化)成于溶剂蒸汽中非常小的溶液液滴射流或喷雾。这种雾滴流过蒸发室。当液滴变小时，电气表面电荷密度增大，直至相同电荷之间的自然排斥引起离子以及中性分子被释放。

术语“灵敏度”指阳性对照样品检测结果持续为阳性或响应值等同于该检测方法阈值的最低浓度。常用的中和抗体分析方法的灵敏度计算方法：检测梯度稀释的阳性对照样品(至少5个浓度)，以响应值为纵坐标，浓度为横坐标，构建标准曲线。将分析方法的阈值代入标准曲线方程，计算所得的浓度即为分析方法灵敏度。

生物样品中分析物的“量”通常指反映样品体积中可检测的分析物质量的绝对值。然而，量也涵盖与另一分析物量相比的相对量。例如，样品中分析物的量可为大于样品中一般存在的分析物的对照或正常水平的量。

实施例1：阈值筛选

(1)样品制备

分别称取50个健康受试者空白基质(符合GCP要求的正规来源的健康人血清、血浆或细胞培养上清等，本实施例具体选用健康人血清进行实验测试)80μL，加入20μL浓度为5ng/mL的CPG2工作液(溶剂为4％牛血清白蛋白的PBS溶液,m/v)涡旋混匀，即在孵育过程中的CPG2的工作浓度为1ng/mL。

混匀后离心1分钟(2-8℃，1000转/分钟)，水平摇床37℃孵育2小时(600转/分钟)。

孵育完成后加入50μL浓度为1500ng/mL的DAMPA-d3内标工作液(溶剂为0.01％牛血清白蛋白的50mM Tris-HCl溶液(pH 7.4),m/v)涡旋混匀。

混匀后离心1分钟(2-8℃，1000rpm)，加入100μL MTX溶液(100μg/mL)后离心1分钟(2-8℃，1000rpm)，放置于冰水浴(0℃)孵育1小时，即在孵育过程中的MTX的工作浓度为40μg/mL。

(2)质谱分析之前富集操作

上述样品冰水浴孵育完成后加入400μL沉淀剂(甲醇)，涡旋混匀5分钟(2000转/分钟)后离心10分钟(2-8℃，4000转/分钟)。

离心完成后取上清100μL，加入400μL超纯水混匀后将样品转移至仪器进样器或2-8℃冰箱中等待进样。

将上述2μL样品引入Shimadzu LC-30AD的分析柱上(X-Bridge C18，50μm，50×2.1mm)。将UPLC梯度应用于分析柱，以将DAMPA与样品所含的其它分析物分开，获得DAMPA富集样品。流动相A是0.1％甲酸水(v/v)，流动相B是甲醇，流速0.4mL/min，柱温40℃，进样室温度4℃(可采用2-8℃的进样室温度均可取得理想效果)，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱2.5min，洗脱条件如表1所示。然后使DAMPA富集样品进行MS/MS以量化DAMPA。

表1：DAMPA液相洗脱条件

(3)通过串联MS检测并量化DAMPA

使用AB Sciex API 5500***(也可选用6500+***)进行MS/MS。离开分析柱的液体溶剂/分析物流入MS/MS分析器的ESI源接口。在接口的加热管道内溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。在正离子模式下，通过ESI电离分析物。离子进入第一个四极杆(Q1)。在Q1处观察到DAMPA的前体离子。图1是通过UPLC-MS/MS检测高浓度阳性对照样品(150ng/mL)的DAMPA典型质谱图，图2是通过UPLC-MS/MS检测低浓度阳性对照样品(7.5ng/mL)的DAMPA典型质谱图，图3是通过UPLC-MS/MS检测阴性对照样品的DAMPA典型质谱图，图4是通过UPLC-MS/MS检测内标(DAMPA-d3)的典型质谱图(直接使用实施例1的空白基质，并采用实施例1的方法进行检测)。DAMPA保留时间具体为：DAMPA约为1.1min，内标约为1.1min。其中，高浓度阳性对照样品的配制方式为：空白基质+阳性对照抗体工作液，阳性对照抗体终浓度为150ng/mL；低浓度阳性对照样品的配制方式为：空白基质+阳性对照抗体工作液，阳性对照抗体终浓度为7.5ng/mL；阴性对照样品的配制方式为：混合空白基质。阳性对照抗体为CPG2阳性对照抗体。

质谱条件具体如下：

气帘气：30psi；

离子源气体1：40psi；

离子源气体2：50psi；

离子源温度：500℃；

加热板块：ON；

离子源电压：5500V；

CAD：9units；

电离模式：ESI、正离子模式、MRM(质谱多反应监测)；

离子对：如表2所示。

表2：DAMPA及内标的质谱离子对

注：Dummy1和Dummy2为避免仪器电信号相互干扰而设置，并不参与积分计算。

在本实施例中，DAMPA前体离子包括质荷比为326.2的前体离子，质荷比为329.1的内标前体离子。质荷比为326.2的DAMPA前体离子经受碰撞诱导解离，生成质荷比分别为176.2、160.2、133.1的DAMPA碎片离子；质荷比为329.1的内标前体离子质经受碰撞诱导解离，生成质荷比分别为137.2、160.9、176.2的内标碎片离子。

表2中的离子对的选择为经过大量测试后的最优化选择。母离子一般基于待测物分子量，由于待测物的结构不同，其产生的子离子的数量以及类型不同，本技术方案选择的子离子(碎片离子)具有显著高于其他子离子的信号强度，且该信号经多次重复试验后非常稳定。上述信号强度高且稳定的子离子是指质荷比为176.2的DAMPA碎片离子、质荷比为176.2的内标碎片离子。在打碎母离子的能量选择方面，发明人使用DAMPA标准品进行了大量的质谱测试，获得了得到打碎母离子能量(碰撞电压)和信号强度的曲线图，选择最大信号强度对应的能量作为最佳打碎母离子能量。碰撞电压CE为33V时，DAMPA和内标在质谱检测中均能获得最为理想的信号强度。

(4)阈值计算

重复步骤(1)到步骤(3)试验六次，使用JMP数据分析软件分别对六次试验结果进行正态分布检验并剔除离群值。使用剔除离群值的六次试验响应值均值和SD计算阈值(响应值为：分析物DAMPA峰面积/内标DAMPA-d3峰面积)，计算公式如下：

阈值＝响应值均值-1.645×SD

50个健康受试者空白血清分别检测6次的结果如表3所示，CPG2中和抗体分析方法阈值为1.866176。血清样品(包括对照样品、空白样品、待测样品等)检测响应值大于1.866176，检测结果表示为阴性；检测响应值小于1.866176，检测结果表示为阳性。

表3：50个健康受试者空白血清筛选阈值

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在上表中，分析批2中样品编号为HuSr0232、HuSr0236检测结果为离群值，分析批3中样品编号为HuSr0233检测结果为离群值，分析批4中样品编号为HuSr0224、HuSr0226、HuSr0271检测结果为离群值，分析批5中样品编号为HuSr0237、HuSr0238检测结果为离群值，分析批6中样品编号为HuSr0224、HuSr0232检测结果为离群值，离群值不参与阈值计算。

实施例2：配体结合条件对检测的影响

采用实施例1的测试方法，在其他条件不变的情况下先后测试了十个空白个体血清样品(血清编号为HuSr0178、HuSr0179、HuSr0180、HuSr0181、HuSr0182、HuSr0183、HuSr0184、HuSr0185、HuSr0186、HuSr0187)在不同浓度的CPG2(1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL)的峰面积比，其结果如图5所示(未使用校正因子矫正峰面积比)。从图5可以看出，CPG2浓度为5ng/mL时DAMPA峰面积比最大，且信噪比最大，因此CPG2反应浓度选择5ng/mL。峰面积是指在色谱图,背景线以上部分的总峰面积，即峰高与保留时间的积分值。峰面积比是指DAMPA的峰面积和其内标峰面积的比值。而信噪比是指色谱图背景线以上部分的总峰面积与背景线峰面积的比值。DAMPA峰面积比越大，则CPG2中和抗体水平越低，即CPG2中和抗体在基线水平(健康人空白基质抗体水平)时，DAMPA峰面积比应最高，且分析物DAMPA的信噪比应最大(即检测方法灵敏度最佳)。

采用实施例1的测试方法，在其他条件不变的情况下先后测试了不同孵育时间(0小时、0.5小时、1小时、2小时、4.5小时)下不同浓度的阳性对照抗体(2.5ng/mL、20ng/mL、200ng/mL、500ng/mL)对CPG2活性(CPG2浓度为5ng/mL)的影响。其中，阳性对照抗体委托第三方生物技术公司制备，使用重庆科润生物医药研发有限公司生产的重组羧肽酶G2标准品提供给GenScript公司通过现有技术中常规的免疫动物的方法制备，更具体地：重组羧肽酶G2标准品溶液与佐剂混合后肌肉注射新西兰兔，注射一定时间后采血检测抗体效价，当抗体效价达到一定值后对兔子进行最终放血。收集到的兔血使用亲和色谱柱进行抗体纯化，得到最终的阳性对照抗体溶液。高浓度阳性对照抗体样品的配制方法为：970μL空白人血清+30μL 5000ng/mL阳性对照抗体工作液；低浓度阳性对照抗体样品的配制方法为：950μL空白人血清+50μL 150ng/mL阳性对照抗体工作液。根据实际情况选用高浓度阳性对照抗体样品或者低浓度阳性对照抗体样品，配制本实验的反应体系。

阳性对照抗体的影响情况如图6(峰面积比未校正)所示。从图6可以看出，随着孵育时间的增加不同浓度的阳性对照抗体峰面积比趋于平衡，在2小时的时候达到平衡转折点，样品和CPG2的孵育时间选择2小时。

确定最佳CPG2反应浓度和孵育时间后，采用实施例1的测试方法，在其他条件不变的情况下先后测试不同浓度的CPG2阳性对照抗体(0、2.34、4.69、9.375、18.75、37.5、75、150ng/mL)对CPG2(5ng/mL)的抑制情况，其抑制曲线如图7(峰面积比未校正)所示。同时测定了十个空白个体血清样品(CPG2浓度为5ng/mL，血清编号为HuSr0178、HuSr0179、HuSr0180、HuSr0181、HuSr0182、HuSr0183、HuSr0184、HuSr0185、HuSr0186、HuSr0187)，样品峰面积比的结果如图8所示(未使用校正因子矫正峰面积比)。从图7和图8可以看出，不同浓度的CPG2阳性对照抗体对CPG2(5ng/mL)的抑制曲线呈现良好的线性(相关系数的平方大于0.99)，以及对不同空白个体基质响应值抑制均很小，不影响生物样品的检测。

实施例3：酶反应条件对检测的影响

采用实施例1的测试方法，487μL空白基质直接加12.8μL CPG2工作液(100000ng/mL)配制成浓度为2560ng/mL的CPG2标准曲线样品，按照空白基质与CPG2标准曲线样品体积比为200:200梯度稀释2560ng/mL的CPG2标准曲线样品，配制成浓度为1280、640、320、160、80、40、20ng/mL的CPG2标准曲线样品。上述CPG2标准曲线样品分别加入内标工作液和MTX工作液后，采用实施例1的测试方法，先后测试了不同酶反应温度(0℃、37℃)对DAMPA检测结果(峰面积比)的影响，其影响情况如图9(峰面积比未校正)所示。从图9可以看出，在使用37℃的孵育温度的时候，DAMPA检测结果(峰面积比)随着CPG2的浓度变化并未显示出显著的变化。并且即使CPG2的浓度处于非常低的情况下，反应依然快速进行，在不同的CPG2的浓度的条件下，峰面积比均处于较高的水平。所以，在37℃的MTX孵育条件下，DAMPA的含量水平并不能准确反映出CPG2的浓度水平。因为CPG2的浓度水平可以体现样品中CPG2的中和抗体水平，所以，在37℃的MTX孵育条件下，DAMPA检测结果(峰面积比)并不能灵敏且准确地反映出样品中的中和抗体的水平。而在使用0℃的孵育温度的时候，DAMPA检测结果(峰面积比)随着CPG2的浓度变化并显示出非常显著的变化。所以，在0℃的条件下进行MTX孵育，可以极大地提升检测灵敏度和准确度，DAMPA检测结果呈现良好的线性关系，MTX孵育温度选择0℃。在现有技术中，酶促反应通常需要选择最适反应温度以保证酶促反应的效率(例如37℃有利于CPG2活性的发挥)。但是，本技术方案的目的在于更加准确地检测样品中的中和抗体的用量，与现有技术不同。发明人经过尝试，发现在常规的酶促反应温度下，响应信号在不同CPG2含量(或者中和抗体含量)下的差别并不大，不能实现高灵敏度和准确性的检测。发明人经过大量探索，发现0℃的孵育温度可以保证，响应信号在不同CPG2含量(或者中和抗体含量)下，呈现出显著差异，进而获得理想的线性关系，保证检测的灵敏度和准确度。

采用实施例1的测试方法，在其他条件不变的情况下先后测试了不同MTX反应浓度(3125、6250、12500、25000、50000、100000、200000ng/mL)对DAMPA检测结果(峰面积比)的影响，其影响情况如图10(峰面积比未校正)所示。从图10可以看出，随着MTX反应浓度的增加DAMPA检测结果逐渐增加并趋于平衡，在100000ng/mL的时候达到平衡转折点，MTX反应浓度选择100000ng/mL。

确定最佳MTX反应温度和浓度后，采用实施例1的测试方法，在其他条件不变的情况下先后测试了不同酶反应时间(30分钟、50分钟、60分钟、80分钟、120分钟)对DAMPA检测结果(峰面积比)的影响，其影响情况如图11(峰面积比未校正)所示。从图11可以看出，随着反应时间的增加DAMPA检测结果逐渐增加并趋于平衡，在50至60分钟的时候达到平衡转折点，MTX反应时间选择60分钟。

确定最佳MTX反应条件后，采用实施例1的测试方法，在其他条件不变的情况下先后测试不含促凝剂的不同空白个体血清样品(血清编号为HuSr0178、HuSr0179、HuSr0180、HuSr0181、HuSr0182、HuSr0183、HuSr0184、HuSr0185、HuSr0186、HuSr0187)和含促凝剂的不同空白个体血清样品(血清编号为HuSr0188、HuSr0189、HuSr0190、HuSr0191、HuSr0192)对检测结果的影响，其影响情况如图12(峰面积比未校正)所示。从图12可以看出，含促凝剂和不含促凝剂的对检测结果无影响。

实施例4：测定可报道的分析方法灵敏度

使用空白生物基质作为稀释剂分别加入不同浓度的CPG2阳性对照抗体，配制8个浓度水平(1.18-150ng/mL)的阳性对照样品按照实施例1进行检测。以响应值为纵坐标，浓度为横坐标，构建阳性对照样品标准曲线。将分析方法的校正后阈值代入标准曲线方程，计算所得的浓度即为分析方法灵敏度。分析方法灵敏度检测结果如表4所示，灵敏度为3.95ng/mL符合国家药品监督管理局药品审评中心发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》(2021年第25号)的要求(≤100ng/mL)。

表4：分析方法灵敏度测定

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实施例5：批内/批间精密度研究

使用空白生物基质作为稀释剂分别加入不同浓度的CPG2阳性对照抗体，配制阴性对照样品(NC，0ng/mL)、低浓度阳性对照样品(LPC，7.5ng/mL)和高浓度阳性对照样品(HPC，150ng/mL)。按照实施例1重复检测3次，计算分析批内和批间的精密度(％CV)，分析方法精密度检测结果如表5所示，连续三个分析批的批内和批间CV％均符合《药物免疫原性研究技术指导原则》(2021年第25号)的要求(≤20％)。

表5：分析方法批内和批间精密度考察

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实施例6：方法特异性和选择性研究

使用空白生物基质作为稀释剂分别加入不同浓度的CPG2阳性对照抗体和阴性对照抗体(Rabbit anti-GAPDH)，配制特异性阴性对照样品(NC样品，阳性对照抗体0ng/mL，阴性对照抗体150ng/mL)、特异性低浓度阳性对照样品(LPC样品，阳性对照抗体7.5ng/mL，阴性对照抗体150ng/mL)和特异性高浓度阳性对照样品(HPC样品，阳性对照抗体150ng/mL，阴性对照抗体150ng/mL)。按照实施例1进行检测，考察分析方法特异性。检测结果如表6所示，特异性考察NC样品检测结果仍为阴性，特异性考察LPC和HPC检测结果仍为阳性。

表6：分析方法特异性考察

为了评价受试者生物基质的干扰，需至少进行10个受试者给药前个体基质来评估分析方法的选择性。按照实施例1进行检测，考察分析方法选择性。检测结果如表7所示，20个受试者给药血清样品检测结果均为阴性。

表7：分析方法个体基质选择性考察

受试者给药前个体血清编号	校正后的受试者个体血清响应值
		S20012001A	2.193876
S20012004A	2.173566
		S20012007A	2.240752
S20012010A	2.236837
		S20012013A	2.236892
S20012016A	2.298223
		S20012019A	2.306113
S20012022A	2.135082
		S20012025A	2.114126
S20012028A	2.217229
		S20012031A	2.130251
S20012034A	2.122049
		S20012037A	2.200828
S20012040A	2.074978
		S20012043A	2.148611
S20012046A	2.144179
		S20012049A	2.176421
S20012052A	2.237549
		S20012055A	2.320421
S20012058A	2.317945

为了评价高脂肪基质和溶血基质对分析方法的干扰，使用空白高脂肪基质或溶血基质作为稀释剂分别加入不同浓度的CPG2阳性对照抗体，配制高脂或溶血阴性对照样品(NC，0ng/mL)、高脂或溶血低浓度阳性对照样品(LPC，7.5ng/mL)。按照实施例1进行检测，考察分析方法高脂和溶血选择性。检测结果如表8和表9所示，高脂和溶血NC样品检测结果仍为阴性，高脂和溶血LPC样品检测结果仍为阳性，且与LPC样品的偏差均小于±10％。其中，高脂基质是指健康人高脂餐后采集的空白基质。溶血基质是指：采集健康人全血，-80℃/室温冻融一次获得溶血全血，溶血全血加入到健康人空白基质中，即为溶血基质。进行高脂、溶血、添加剂(促凝剂)的基质效应评估，是为了证明检测方法的耐用性。实验证明，本技术方案适用于多种类型基质，可以对多种类型的生物样本进行准确检测。本检测方法可以排除基质效应对检测结果的干扰，主要是由于本技术方案采用了适当的样品制备方法(包括配体结合条件、酶反应条件)、质谱分析之前富集操作方式等。

表8：分析方法高脂选择性考察

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表9：分析方法溶血选择性考察

实施例7：方法稳定性研究

按照实施例6中NC、LPC和HPC样品的配制方法，配制稳定性考察NC、LPC和HPC样品。按照实施例1进行检测，考察分析方法稳定性。检测结果如表10至表12所示，稳定性NC样品检测结果仍为阴性，稳定性LPC和HPC样品检测结果仍为阳性，且与LPC和HPC样品的偏差均小于±15％。

表10：阳性对照样品储存在0℃(7.4小时)稳定性

表11：阳性对照样品在-80℃/冰水浴的4次冻融稳定性

表12：阳性对照样品储存在-80℃冰箱中136天稳定性

实施例8：未知生物样品分析

按照实施例1，分析20例受试者给药前后(药物名称：注射用重组羧肽酶G2)的60个血清样品(来源符合GCP要求)中的抗药抗体检测结果为阳性的29个血清样品的CPG2中和抗体水平。检测结果如表13所示。

表13：未知生物样品中CPG2中和抗体水平

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以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.羧肽酶G2的中和抗体检测方法，其特征在于：用于非治疗或非诊断目的的评价药物免疫原性，包括如下依次进行的步骤：

S1：将样品和羧肽酶G2工作液混合并孵育，然后加入内标溶液，获得第一混合体系；

S2：将第一混合体系和甲氨蝶呤溶液混合并孵育，获得第二混合体系；孵育温度为0℃；

S3：使用沉淀剂处理第二混合体系，获得待富集处理品；

S4：使用UPLC富集所述待富集处理品，获得DAMPA富集样品；

S5：使用MS/MS检测所述富集样品中的DAMPA；

当样品中DAMPA检测的校正后响应值大于阈值，检测结果为阴性；当样品中DAMPA检测的校正后响应值小于阈值，检测结果为阳性；所述阈值通过检测空白基质样品并经统计获得，空白基质样品为未给药的健康个体来源的生物样品或者是来自于给药前个体的生物样品。

2.根据权利要求1所述的羧肽酶G2的中和抗体检测方法，其特征在于：在S1中，样品为生物样品、校正因子样品、阳性对照样品和阴性对照样品中的一种；生物样品为血清、血浆和细胞组织上清中的一种，所述生物样品的来源为人、猴、犬、兔或者鼠；当生物样品为血浆时，生物样品中含有抗凝剂；所述抗凝剂包括草酸钾、肝素、氟化钠、二乙胺四乙酸钠盐和枸橼酸钠中的至少一种。

3.用于检测权利要求2所述的羧肽酶G2的中和抗体检测方法，其特征在于：在S1中，孵育温度为37℃，孵育时间为2小时，并且孵育过程在600转/分钟摇床条件下进行，在孵育过程中的羧肽酶G2的工作浓度为1ng/mL。

4.根据权利要求3所述的羧肽酶G2的中和抗体检测方法，其特征在于：在S2中，孵育时间为1小时，在孵育过程中的甲氨蝶呤的工作浓度为40μg/mL。

5.根据权利要求4所述的羧肽酶G2的中和抗体检测方法，其特征在于：在S5中，使DAMPA富集样品中的含DAMPA的成分经受电离源，获得前体离子；然后使前体离子经受碰撞诱导解离生成碎片离子；所述前体离子包括质荷比为326.2的DAMPA前体离子以及质荷比为329.1的内标前体离子；所述碎片离子包括质荷比分别为176.2、160.2、133.1的DAMPA碎片离子以及质荷比分别为176.2、160.9、137.2的内标碎片离子。

6.根据权利要求5所述的羧肽酶G2的中和抗体检测方法，其特征在于：

将阳性的样品与阴性对照样品梯度混合，获得若干稀释样品；对稀释样品进行S1-S5的检测，计算获得阳性的样品的滴度值。

7.一种基于UPLC-MS/MS的羧肽酶G2的中和抗体检测***，其特征在于：包括预处理试剂组合和UPLC-MS/MS设备；所述预处理试剂组合包括中和抗体结合单元、催化反应单元和沉淀富集单元；中和抗体结合单元包括羧肽酶G2工作液和内标溶液；催化反应单元包括甲氨蝶呤溶液；沉淀富集单元包括甲醇；

催化反应单元的工作温度是0℃；

当样品中DAMPA检测的校正后响应值大于阈值，检测结果为阴性；当样品中DAMPA检测的校正后响应值小于阈值，检测结果为阳性；所述阈值通过检测空白基质样品并经统计获得，空白基质样品为未给药的健康个体来源的生物样品或者是来自于给药前个体的生物样品。

8.根据权利要求7所述的一种基于UPLC-MS/MS的羧肽酶G2的中和抗体检测***，其特征在于：中和抗体结合单元的工作温度为37℃；样品和羧肽酶G2工作液的体积比为80:20，羧肽酶G2工作液的浓度为5ng/mL；样品和内标溶液的体积比为80:50；内标为同位素d3标记的DAMPA，内标溶液的浓度为1500ng/mL；

在催化反应单元中，样品和甲氨蝶呤溶液的体积比为80:100，甲氨蝶呤溶液的浓度为100μg/mL；

样品和甲醇的体积比为80:400。

9.根据权利要求8所述的一种基于UPLC-MS/MS的羧肽酶G2的中和抗体检测***，其特征在于：UPLC-MS/MS设备的UPLC参数设置为：

色谱柱：X-Bridge C18，5μm，50×2.1mm；

流动相A：0.1 vol.%甲酸水溶液；

流动相B：甲醇；

洗脱条件：

洗针液： 1 vol.%甲酸的50 vol.%甲基甲酰胺水溶液；

流速：0.4mL/min；

柱温：40℃；

进样室温度：2-8℃；

进样量：2μL。

10.根据权利要求9所述的一种基于UPLC-MS/MS的羧肽酶G2的中和抗体检测***，其特征在于：UPLC-MS/MS设备的MS/MS参数设置为：

气帘气：30 psi；

离子源气体1：40 psi；

离子源气体2：50 psi；

离子源温度：500 ℃；

加热板块：ON；

离子源电压：5500 V；

CAD：9units；

电离源为电喷雾电离源；电离模式为正离子模式，扫描模式为多反应离子监测。