CN115561211A - 用于时间分辨荧光光谱法的***、装置和方法 - Google Patents

用于时间分辨荧光光谱法的***、装置和方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于利用时间分辨光谱法进行体内或离体实时表征生物样品的装置、***和方法。光源生成光脉冲或连续光波并激发该生物样品，从而诱导响应荧光信号。多路信号分离器将该信号分解成光谱带，并向该光谱带施加时间延迟，以便利用检测器从来自单次激发脉冲的多个光谱带来捕获数据。通过对该光谱带的荧光强度大小和/或衰减进行分析而表征该生物样品。该样品可包含一种或多种外源或内源的荧光团。该装置可为具有可拆卸的一次性远端的两件式探针。该***可将荧光光谱法与其他光学光谱法或成像模式相结合。该光脉冲可聚焦在单个焦点处或在整个区域上进行扫描或图案化。

Description

用于时间分辨荧光光谱法的***、装置和方法
本申请是申请日为2017年03月31日、申请号为201780022021.5、发明名称为“用于时间分辨荧光光谱法的***、装置和方法”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2017年03月31日、申请号为PCT/US2017/025451)的分案申请。
交叉引用
本申请要求于2016年4月1日提交的第62/317,443号美国临时申请、于2016年4月1日提交的第62/317,449号美国临时申请、于2016年4月1日提交的第62/317,451号美国临时申请、于2016年4月1日提交的第62/317,452号美国临时申请、于2016年4月1日提交的第62/317,453号美国临时申请、于2016年4月1日提交的第62/317,455号美国临时申请、于2016年4月1日提交的第62/317,456号美国临时申请、于2016年4月1日提交的第62/317,459号美国临时申请、于2016年4月1日提交的第62/317,460号美国临时申请，以及于2016年6月17日提交的第62/351,615号美国临时申请的权益，这些申请通过引用并入本文。
背景技术
激光诱导荧光光谱法(LIFS)具有揭示关于有机样品的化学或生物化学组成的定性和定量信息的能力。LIFS已被应用于诊断化学和医学领域，以非侵入性地提供关于体内生物***的信息。LIFS具有优于一些其他光学技术的优点，因为它可以选择性且有效地激发有机物质中的荧光团并大大提高荧光选择性和可检测性。LIFS的其他优点包括波长可靠性、窄带宽激发、方向性和短脉冲激发。用于生物样品的LIFS检测和分类的早期方法基于对从激光光源激发后的样品收集的光的荧光强度、光谱分布和偏振的分析。然而，在至少一些情况下，这样的检测方法可能无法区分具有相似发射光谱的荧光团并且该检测方法可能缺乏时间分辨率。在早期LIFS方法的表征能力的基础上，通过加入以实时或接近实时的方式分析和表征生物样品的能力而建立了时间分辨的LIFS(TR-LIFS)技术。TR-LIFS利用短(纳秒数量级)脉冲和超短(皮秒数量级)脉冲激光技术以及高速电子元件的优点，以便允许将样品发射的实时演变予以直接记录。
TR-LIFS方法可包括对激发的生物样品的荧光寿命或荧光衰减进行监测以便表征该样品。因为在通过光脉冲激发后，光发射过程非常快速地发生(荧光衰减为纳秒数量级)，所以时间分辨的测量可以提供关于样品的分子种类和蛋白质结构的信息。虽然许多分子可能具有相似的激发和发射光谱，并且可能具有相似的荧光强度，但根据分子的结构，衰减曲线可能是不同或唯一的。因此，通过TR-LIFS对荧光衰减的分析可以区分传统LIFT无法区别的分子。TR-LIFS技术还可适应于区分激发后样品中的“早期”过程(通常是短寿命状态的直接激发或非常快速的后续反应)和“后期”过程(通常来自由持续电子布局或由初始直接激发后的反应引起的长寿命状态的延迟激发)。
可由光谱信息(例如，荧光强度)来补充荧光衰减数据，以用于复杂样品的分析。用于记录荧光衰减和荧光强度数据二者的技术采用扫描单色器从宽带样品发射信号中选择波长(一次选择一个波长)，并将经过滤的信号引导至光电检测器以供检测。然而，为了从发射信号解析出另一个波长，必须再次激发样品以便重新发射信号，并且扫描单色器必须重新调谐至新的波长。因为波长之间的切换可能是产生实时测量的速率限制因素，所以这样的重复测量可能需要大量的时间，特别在如果用户希望将样品发射信号解析成多个光谱成分时。因此，期望提供通过时间分辨和波长分辨的分析来(接近)实时地表征生物样品。
发明内容
本文所述的主题一般涉及生物样品的表征，特别涉及用于时间分辨荧光光谱法的方法、***和装置。
在第一个方面，提供了用于对生物样品进行分类或表征的装置。该装置可包含远侧部、近侧部、安置在该近侧部中并与光源耦合的激发信号传输元件、安置在该近侧部中的至少一个信号收集元件、安置在该远侧部中的远侧信号传输元件，以及光学组件。该远侧部可以是可从该近侧部上拆卸的。该光源可被配置用于生成预定波长的光脉冲，该预定波长的光脉冲被配置用于使该生物样品产生响应光信号。该激发信号传输元件可被配置用于将该光脉冲传送通过其中。当该远侧部和近侧部彼此耦合时，该远侧信号传输元件可与该激发信号传输元件和该信号收集元件相耦合。该光学组件可与该至少一个信号收集元件及该光学延迟元件光学地耦合。该远侧信号传输元件可被配置用于将该光脉冲从该激发信号传输元件引导至该生物样品。该远侧信号传输元件可被配置用于从该生物样品收集该响应光信号，并将该响应光信号引导至该至少一个信号收集元件。该光学组件可被配置用于以预定的波长范围将该响应光信号分解，以获得多个光谱带。该生物样品可响应该光谱带而得到表征(characterized)。
在进一步或其他的实施方案中，其中该光学组件包括光学延迟元件和多路信号分离器。该多路信号分离器可包含配置用于将该响应光信号分解成该光谱带的波长分解纤维(wavelength splitting fiber)。该光学延迟元件可被配置用于向该光谱带提供一种或多种时间延迟。该生物样品可响应由该光学延迟元件向该光谱带提供的一种或多种延迟而得到表征。例如，该一种或多种时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的延迟。
该波长分解滤光片可包括中性密度滤光片、带通滤光片、长通滤光片、短通滤光片、二向色滤光片、陷波滤波器、反射镜、吸收滤光片、红外滤光片、紫外滤光片、单色滤光片、二向色镜或棱镜的一种或多种。
该光学延迟元件可至少包括第一光学纤维和第二光学纤维，该第一光学纤维长于该第二光学纤维。例如，该第一光学纤维可比该第二光学纤维长30英尺、35英尺、40英尺、45英尺、50英尺、100英尺、150英尺、200英尺或250英尺。该光学纤维可包括第一复数根光学纤维，并且该第二光学纤维可包括第二复数根光学纤维，该第一复数根光学纤维和该第二复数根光学纤维的每一根纤维均具有不同的长度。
在进一步或其他的实施方案中，该光学组件包括包含多个光谱滤光片的滤光轮。将该响应光信号顺序穿过该滤光轮的光谱滤光片以产生该光谱带可在由不同光谱滤光片所生成的光谱带之间引入预定的时间延迟。该滤光轮可包含多个编码器，每个光谱滤光片与至少一个编码器相关联。该滤光轮包括旋转滤光轮。该光学组件可进一步包含镜式电流计(mirror galvometer)，以将该响应光信号选择性地聚焦至该滤光轮的至少一个光谱滤光片。
在进一步或其他的实施方案中，该响应光信号可包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在紫外光谱、可见光谱、近红外光谱或红外光谱中。
在进一步或其他的实施方案中，该激发信号传输元件可包含一根光学纤维、多根光学纤维、纤维束、透镜***、光栅扫描机构或二向色镜装置的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，该信号收集元件元件可包含一根光学纤维、多根光学纤维、纤维束、衰减器、可变电压门控衰减器、透镜***、光栅扫描机构、分束器或二向色镜装置的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，该光源可包括脉冲激光器、连续波激光器、调制激光器、可调谐激光器或LED。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲可包括激光脉冲。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧部可以是一次性且可更换的。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧信号传输元件包含用于将该光脉冲从该激发信号传输元件引导至该生物样品的中央纤维，以及用于收集来自该生物样品的响应光信号的至少一根***纤维。该远侧信号传输元件可包含用于减少该中央纤维与***纤维之间空间的污染的正面窗口，如蓝宝石窗口。该至少一根***纤维可包括多根纤维，如多个收集纤维束。该光学组件可包含多根纤维，该多根纤维包含用于将该响应光信号分解成多个光谱带的一个或多个滤光片。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧部包含手持式探针。该远侧部可包含抽吸套管。该远侧部可包含消融元件，该消融元件可被配置用于施加射频(RF)能量、热能、低温能量(cryo energy)、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种，以消融靶组织。该消融元件可被配置用于施加激光或光学能量以将该靶组织予以消融，并且该消融元件可包含该远侧信号传输元件。即，可通过与该激发信号相同的传输元件来施加该消融激光或光学能量。
在另一方面，提供了用于对生物样品进行分类或表征的探针***。该探针***可包含远侧部、与该远侧部可拆卸地耦合的近侧部、安置在该近侧部中并配置用于传送光激发信号的近侧传输元件、安置在该远侧部中并与该近侧传输元件相耦合的远侧传输元件、安置在该近侧部中并与该远侧传输元件相耦合的信号收集元件，以及光学组件。该远侧传输元件可被配置用于从该近侧传输元件接收该光激发信号并将该光激发信号传送至该生物样品。该生物样品可响应该光激发信号而生成响应光信号。该响应光信号可通过该远侧传输元件来接收。该信号收集元件可被配置用于从该远侧传输元件接收该响应光信号。该光学组件可被配置用于从该信号收集元件接收该响应光信号并将该响应光信号分解成多个光谱带。该生物样品可响应该光谱带而得到表征。
在进一步或其他的实施方案中，该光学组件包括光学延迟元件和多路信号分离器。该多路信号分离器可包含配置用于将该响应光信号分解成光谱带的波长分解纤维。该光学延迟元件可被配置用于向该光谱带提供一种或多种时间延迟。该生物样品可响应由该光学延迟元件向该光谱带提供的一种或多种延迟而得到表征。该时间延迟元件可包含不同长度的两根或更多根光学纤维。该两根或更多根光学纤维可包含第一光学纤维和第二光学纤维。该第一光学纤维可比该第二光学纤维长30英尺、35英尺、40英尺、45英尺、50英尺、100英尺、150英尺、200英尺或250英尺。该至少一种时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的延迟。
在进一步或其他的实施方案中，该光学组件包括包含多个光谱滤光片的滤光轮。使该响应光信号顺序地穿过该滤光轮的光谱滤光片以产生该光谱带可在由该不同光谱滤光片生成的光谱带之间引入预定的时间延迟。该滤光轮可包含多个编码器，并且每个光谱滤光片可与至少一个编码器相关联。该滤光轮可包括旋转滤光轮。该光学组件可进一步包含镜式电流计，以将该响应光信号选择性地聚焦至该滤光轮的至少一个光谱滤光片。
在进一步或其他的实施方案中，该响应光信号可包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧传输元件可包括光学纤维、梯度折射率透镜、球透镜、二向色滤光片、反射镜或吸收性滤光片的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧信号传输元件包含用于将该光脉冲从该激发信号传输元件引导至该生物样品的中央纤维，以及用于收集来自该生物样品的响应光信号的至少一根***纤维。该远侧信号传输元件可包含用于减少该中央纤维与***纤维之间空间的污染的正面窗口，如蓝宝石窗口。该至少一根***纤维可包括多根纤维。该多根纤维可包括多个收集纤维束。该光学组件可包含该多根纤维，并且该多根纤维可包含用于将该响应光信号分解成多个光谱带的一个或多个滤光片。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧部是一次性且可更换的。该远侧部可包含手持式探针。该远侧部可包含抽吸套管。该远侧部可包含消融元件，该消融元件可被配置用于施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种，以消融靶组织。该消融元件可被配置用于施加激光或光学能量以将该靶组织予以消融，并且该消融元件可包含该远侧信号传输元件。即，可通过与该激发信号相同的传输元件施加该消融激光或光学能量。
在另一方面，提供了用于对生物样品进行分类或表征的探针。该探针可包含远侧部和安置在远侧部中的远侧传输元件。该远侧部可与近侧部可拆卸地相耦合。该近侧部可包含安置在其中并配置用于传送光激发信号的近侧传输元件。该远侧传输元件可与该近侧传输元件相耦合。该远侧传输元件可被配置用于从该近侧传输元件接收该光激发信号并将该光激发信号传送至该生物样品。该生物样品可响应该光激发信号而生成响应光信号。该响应光信号可通过该远侧传输元件来接收。安置在该近侧部中的信号收集元件可与该远侧传输元件耦合，并且可从该远侧传输元件接收该响应光信号。光学组件可从该信号收集元件接收该响应光信号，并且可将该响应光信号分解成多个光谱带。该生物样品可响应该光谱带而得到表征。
在进一步或其他的实施方案中，该光学组件包括光学延迟元件和多路信号分离器。该多路信号分离器可包含配置用于将该响应光信号分解成该光谱带的波长分解纤维。该光学延迟元件可被配置用于向该光谱带提供一种或多种时间延迟。该生物样品可响应由该光学延迟元件向该光谱带提供的一种或多种延迟而得到表征。该时间延迟元件可包含不同长度的两根或更多根光学纤维。该两根或更多根光学纤维可包含第一光学纤维和第二光学纤维，并且该第一光学纤维可比该第二光学纤维长30英尺、35英尺、40英尺、45英尺、50英尺、100英尺、150英尺、200英尺或250英尺。该至少一种时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的延迟。
在进一步或其他的实施方案中，该光学组件包括包含多个光谱滤光片的滤光轮。使该响应光信号顺序地穿过该滤光轮的该光谱滤光片以产生该光谱带可在由该不同光谱滤光片生成的光谱带之间引入预定的时间延迟。该滤光轮可包含多个编码器，每个光谱滤光片与至少一个编码器相关联。该滤光轮可包括旋转滤光轮。该光学组件可进一步包含镜式电流计，以将该响应光信号选择性地聚焦至该滤光轮的至少一个光谱滤光片。
在进一步或其他的实施方案中，该响应光信号可包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧传输元件可包括光学纤维、梯度折射率透镜、球透镜、二向色滤光片、反射镜或吸收性滤光片的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，该近侧部或该远侧部的一个或多个可包含耦合元件，该耦合元件将该远侧传输元件与该近侧传输元件以及信号收集元件相耦合。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧传输元件包含用于将该光脉冲从该近侧传输元件引导至该生物样品的中央纤维，以及用于收集来自该生物样品的响应光信号的至少一根***纤维。该远侧传输元件可包含用于减少该中央纤维与***纤维之间空间的污染的正面窗口，如蓝宝石窗口。该至少一根***纤维可包括多根纤维。该多根纤维可包括多个收集纤维束。该光学组件可包含该多根纤维，并且该多根纤维可包含用于将该响应光信号分解成多个光谱带的一个或多个滤光片。
在进一步或其他的实施方案中，该远侧部被配置成手持式。该远侧部可包含抽吸套管。该远侧部可以是一次性的。该远侧部可包含消融元件，该消融元件可被配置用于施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种，以消融靶组织。该消融元件可被配置用于施加激光或光学能量以将该靶组织予以消融，并且该消融元件可包含该远侧信号传输元件。即，与该激发信号一样，可通过该相同传输元件来施加该消融激光或光学能量。
在另一方面，提供了用于对生物样品进行分类或表征的***。该***可包含激发信号传输元件、与该激发信号传输元件耦合并配置用于生成预定波长的光脉冲的光源、至少一个信号收集元件以及与该至少一个收集元件相耦合的光学组件，其中该光脉冲被配置用于使该生物样品产生响应光信号。该光脉冲可通过该激发信号传输元件从该光源传送至该生物样品。该响应光信号可包含第一光谱和第二光谱，该第一光谱包含荧光光谱。该至少一个信号收集元件可适应于从该生物样品收集该响应光信号。该光学组件可被配置用于从该至少一个信号收集元件接收该响应光信号。该光学组件可被配置用于将该预定波长的响应光信号的第一光谱分解，以获得光谱带。该生物样品可响应该光谱带和该第二光谱而得到表征。
在进一步或其他的实施方案中，该光学组件包括光学延迟元件和多路信号分离器。该多路信号分离器可包含配置用于将该响应光信号的第一光谱分解成第一组光谱带的波长分解纤维。该光学延迟元件可被配置用于向该第一组光谱带提供一种或多种时间延迟。可通过该多路信号分离器将该第二光谱分解以获得第二组光谱带，并且该生物样品响应该时间延迟的第一组光谱带和该第二组光谱带而得到表征。
在一些实施方案中，该光学组件可包含第二多路信号分离器。可通过该第二多路信号分离器将该第二光谱分解以获得第二组光谱带，并且该生物样品响应该时间延迟的第一组和第二组光谱带而得到表征。该第二多路信号分离器可包括分束器、吸收滤光片、低通滤光片、高通滤光片、陷波滤波器或反射镜的一种或多种。
在一些实施方案中，该生物样品响应由该光学延迟元件向该第一组光谱带提供的一种或多种延迟而得到表征。该一种或多种时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的延迟。
在进一步或其他的实施方案中，该第二光谱可包括拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在紫外光谱、可见光谱、近红外光谱或红外光谱中。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在一些实施方案中，该光源可包括脉冲激光器、连续波激光器、调制激光器、可调谐激光器或LED。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲可包括激光脉冲。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲可包括连续光波。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在另一方面，提供了用于对生物样品进行分类或表征的方法。可用预定波长的光脉冲来辐射生物样品，以导致该生物样品产生响应荧光信号。可从该生物样品收集该响应荧光信号。可在预定波长范围内分解该响应荧光信号以获得光谱带。该生物样品可响应该光谱带而得到表征。该光脉冲可包含多个脉冲，使得该脉冲的两个光子同时辐射该生物样品并组合以导致该生物样品产生该响应荧光信号。
在进一步或其他的实施方案中，用时间延迟机构向该光谱带施加至少一种时间延迟。该至少一种时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的时间延迟。该时间延迟机构可包含多根光学纤维或光学纤维束，每根纤维或纤维束具有不同的长度以提供在该光谱带的行进时间中的至少一种延迟。
在进一步或其他的实施方案中，可利用多路信号分离器并且/或者通过使该响应荧光信号穿过滤光轮而分解该响应荧光信号。使该响应光信号顺序地穿过该滤光轮的光谱滤光片以产生该光谱带可在由该不同光谱滤光片生成的光谱带之间引入预定的时间延迟。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在近红外光谱或红外光谱中。
在进一步或其他的实施方案中，可利用光电检测器来检测该光谱带。
在进一步或其他的实施方案中，可通过将一个或多个波长滤光片应用于该响应荧光信号，在该预定的波长范围内分解该响应荧光信号。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲可包括激光脉冲。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，该光源可包括脉冲激光器、连续波激光器、调制激光器、可调谐激光器或LED。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品包含靶组织，通过如向该靶组织施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种而将该靶组织消融。可响应该生物样品的表征而将该靶组织消融。可利用探针将该靶组织消融，并且该探针可被配置用该光脉冲辐射该生物样品并且还收集该响应荧光信号。
在另一方面，提供用于图像导航手术的方法。可利用预定波长的光脉冲辐射靶组织，该光脉冲被配置用于使该靶组织产生响应荧光信号。可从该生物样品收集该响应荧光信号。可以以预定的波长分解该响应荧光信号以获得光谱带。可响应该光谱带来表征该靶组织。可用成像装置对该靶组织进行成像，以产生该生物样品的图像。可将该靶组织的表征与该图像对应(register)，以生成该靶组织的光谱信息。可以显示该靶组织的该光谱信息。
在进一步或其他的实施方案中，用成像装置对该靶组织进行成像包括生成一个或多个该靶组织的术前图像或术中图像。该光谱信息可显示在该术前图像或术中图像上。
在进一步或其他的实施方案中，可通过生成MRI图像、超声图像、CT图像、OCT图像、NMR图像、PET图像或EIT图像，对预定的位置进行成像。可利用MRI扫描仪、CT扫描仪、PET扫描仪、光学相干断层摄影(OCT)装置、超声换能器、NMR成像仪或电阻抗层析成像(EIT)装置的一种或多种来生成该图像。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，对该探针的位置进行追踪。为将该靶组织的表征与该图像对应以生成该靶组织的光谱信息，可将该靶组织的表征与所追踪的探针位置以及该图像对应以生成在所追踪位置处该靶组织的光谱信息。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲可包括激光脉冲。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，该光源可包括脉冲激光器、连续波激光器、调制激光器、可调谐激光器或LED。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，可通过利用多路信号分离器和/或滤光片元件来分解该响应荧光信号而将该响应荧光信号进行分解。
在进一步或其他的实施方案中，通过如向该靶组织施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种而将该靶组织消融。可响应该靶组织的表征而将该靶组织消融。可利用探针将该靶组织消融，并且该探针可被配置用于利用该光脉冲来辐射该靶组织并且还收集该响应荧光信号。
在另一方面，提供了用于检测外源荧光分子的方法。可用预定波长的光脉冲来辐射包含外源荧光分子的生物样品，以辐射该外源荧光分子，从而导致该外源荧光分子产生响应荧光信号。可从该生物样品收集该响应荧光信号。可以以预定的波长来分解该响应荧光信号以获得光谱带。可响应该光谱带而确定该生物样品中的外源荧光分子浓度。
在进一步或其他的实施方案中，向该光谱带施加至少一种时间延迟。该至少一种时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的延迟。可利用可包含多根光学纤维或光学纤维束的时间延迟机构施加该至少一种时间延迟，每根纤维或纤维束具有不同的长度以提供在该光谱带的行进时间中的至少一种延迟。
在进一步或其他的实施方案中，利用多路信号分离器并且/或者通过使该响应荧光信号穿过滤光轮而分解该响应荧光信号。使该响应光信号顺序地穿过该滤光轮的光谱滤光片以产生该光谱带可在由该不同光谱滤光片所生成的光谱带之间引入预定的时间延迟。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在紫外光谱、可见光谱、近红外光谱或红外光谱中。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲可包括激光脉冲。
在进一步或其他的实施方案中，该外源荧光分子可包括荧光标记药物、荧光染料或荧光标记的组织标志物。该外源荧光分子可包括ICG标记的氯毒素、ICG标记的knottin、Cy5标记的knottin、Cy7标记的knottin、荧光缀合的肿瘤靶向抗体或荧光标记的肿瘤靶向部分的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，该方法可进一步包括确定该外源荧光分子在该生物样品中的分布。
在进一步或其他的实施方案中，确定该外源荧光分子的浓度可包括将该光谱带与从已知浓度的该外源荧光分子的光谱带所生成的数据进行比较。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品响应确定的该外源荧光分子浓度而得到表征。该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的组织。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品包含靶组织，通过如向该靶组织施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种而将该靶组织消融。可响应该生物样品中该外源荧光分子的确定浓度而将该靶组织消融。可利用探针将该靶组织消融，并且该探针可被配置用于利用该光脉冲来辐射该生物样品并且还收集该响应荧光信号。
在另一方面，提供了用于对生物样品进行分类或表征的装置。该装置包含与光源耦合的激发信号传输元件、与该激发信号传输元件耦合的信号调整元件、至少一个信号收集元件，以及光学组件。该光源被配置用于生成预定波长的光脉冲，该预定波长的光脉冲被配置用于使该生物样品产生响应光信号。该激发信号传输元件被配置用于将该光脉冲传送至该信号调整元件。该信号调整元件被配置用于从该激发信号传输元件接收该光脉冲并将该光脉冲引导至该生物样品。该至少一个信号收集元件被配置用于接收来自该生物样品的响应光信号。该光学组件被配置用于从该至少一个信号收集元件接收该响应光信号并将该响应光信号分解成多个光谱带。该生物样品响应该光谱带而得到表征。
任选地，该信号调整元件可被配置用于将该光脉冲塑造为一个或多个预定图案的形状。该信号调整元件可包含数字微镜装置。
在一些实施方案中，该信号调整元件可被配置用于在该生物样品的预定部分上扫描该光脉冲。该信号调整元件可包含光栅扫描机构。
在进一步或其他的实施方案中，该光学组件包括时间延迟元件和多路信号分离器。该多路信号分离器可被配置用于将该响应光信号分解成该光谱带。该时间延迟元件可被配置用于向该光谱带提供一种或多种时间延迟。该时间延迟元件可包含不同长度的两根或更多根光学纤维。该时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的延迟。
在进一步或其他的实施方案中，该光学处理元件包含配置用于将该响应光信号分解成该光谱带的滤光轮。使该响应光信号顺序地穿过该滤光轮的光谱滤光片以产生该光谱带可在由该不同光谱滤光片生成的光谱带之间引入预定的时间延迟。
在进一步或其他的实施方案中，该响应光信号可包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在另一方面，提供了用于对生物样品进行分类或表征的方法。可利用预定波长的第一图案化光脉冲来辐射生物样品，以导致该生物样品产生响应光信号。可从该生物样品收集该响应光信号。可在预定波长范围内分解该响应光信号以获得光谱带。该生物样品可响应该光谱带而得到表征。
在进一步或其他的实施方案中，可利用该预定波长的第二图案化光脉冲来辐射该生物样品，以导致该生物样品产生第二响应光信号。可从该生物样品收集该第二响应光信号。可在该预定波长范围内分解该第二响应光信号以获得第二组光谱带。该生物样品可响应该第一组光谱带和该第二光谱带而得到表征。可从该第一组光谱带和该第二光谱带生成图像。
在进一步或其他的实施方案中，该响应光信号可包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，利用时间延迟机构向该光谱带施加至少一种时间延迟。该时间延迟机构可包含多根光学纤维或光学纤维束，每根纤维或纤维束具有不同的长度以提供在该光谱带的行进时间中的延迟。该时间延迟机构可包含不同长度的两根或更多根光学纤维。该至少一种时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的延迟。
在进一步或其他的实施方案中，可利用多路信号分离器和/或滤光轮来分解该响应光信号。使该响应光信号顺序地穿过该滤光轮的光谱滤光片以产生该光谱带可在由该不同光谱滤光片生成的光谱带之间引入预定的时间延迟。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，该图案化光脉冲可包括图案化激光脉冲。
在进一步或其他的实施方案中，可利用光学掩模将该图案化光脉冲予以图案化。
在进一步或其他的实施方案中，该图案化光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该图案化光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品包含靶组织，通过如向该靶组织施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种而将该靶组织消融。可响应该生物样品中该外源荧光分子的确定浓度而将该靶组织消融。可利用探针将该靶组织消融，并且该探针可被配置用于利用该光脉冲来辐射该生物样品并且还收集该响应荧光信号。
在另一方面，提供了用于表征生物样品的方法。可利用为预定图案且预定波长的光脉冲来辐射生物样品，以导致该生物样品产生响应光信号。可从该生物样品收集该响应光信号。可在预定波长范围内分解该响应光信号以获得光谱带。该生物样品可响应该光谱带而得到表征。
在进一步或其他的实施方案中，可在至少第一位置和第二位置处于该预定的图案下辐射该生物样品。可从该第一位置收集第一光信号，并且可从该第二位置收集第二光信号。可将该第一光信号分解以获得第一组光谱带，并且可将该第二光信号分解以获得第二组光谱带。该生物样品可响应该第一组光谱带和该第二光谱带而得到表征。可从该第一组光谱带和该第二光谱带而生成图像。
在进一步或其他的实施方案中，利用时间延迟机构向该光谱带施加至少一种时间延迟。该至少一种时间延迟可包括在约5ns至约700ns范围内的延迟。
在一些实施方案中，该时间延迟机构可包含多根光学纤维或光学纤维束，每根纤维或纤维束具有不同的长度以提供在该光谱带的行进时间中的延迟。
在一些实施方案中，该时间延迟机构可包含不同长度的两根或更多根光学纤维。
在进一步或其他的实施方案中，分解该响应光信号可包括利用多路信号分离器和/或滤光轮来分解该响应光信号。使该响应光信号顺序地穿过该滤光轮的光谱滤光片以产生该光谱带可在由该不同光谱滤光片所生成的光谱带之间引入预定的时间延迟。
在进一步或其他的实施方案中，该响应光信号包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的特异性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，可以以约百分之95或更高的灵敏性表征该生物样品。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。该生物样品可包括脑组织，该脑组织可被表征为正常皮质组织、白质组织或胶质母细胞瘤组织。
在进一步或其他的实施方案中，可利用扫描机构将该光脉冲以预定的图案来辐射。
在进一步或其他的实施方案中，该光脉冲的预定波长可在约300nm至约1100nm的范围内。该光脉冲的预定波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该光谱带可在约370nm至约900nm的范围内。该光谱带可在约365nm或更小、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的范围内。该光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。
在进一步或其他的实施方案中，该生物样品包含靶组织，通过如向该靶组织施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种而将该靶组织消融。可响应该生物样品中该外源荧光分子的确定浓度而将该靶组织消融。可利用探针将该靶组织消融，并且该探针可被配置用于利用该光脉冲来辐射该生物样品并且还收集该响应荧光信号。
这些及其他实施方案在下文关于附图的描述中予以进一步详细描述。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同具体且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图简述
本公开内容的新颖特征在所附权利要求中予以具体阐述。通过参考以下其中对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1示出了根据实施方案的时间分辨荧光光谱法(TRFS)***的示意图；
图2示出了根据实施方案的多路信号分离器的示意图；
图3A-3B示出了根据实施方案的多种示例性分子的荧光发射光谱的图表；
图4示出了根据实施方案，通过多路信号分离器分解后多种示例性分子的荧光发射光谱的图表；
图5示出了根据实施方案的同步触发机构的示意图；
图6示出了根据实施方案的用于时间分辨光谱法的探针的示意图；
图7示出了根据实施方案的用于时间分辨光谱法的两件式探针的示意图；
图8示出了根据实施方案的另一种时间分辨荧光光谱法(TRFS)***的示意图；
图9A示出了根据实施方案的用于与TRFS***一起使用的高速滤光轮的示意图；
图9B示出了根据实施方案的用于与TRFS***一起使用的光束准直仪的示意图；
图10示出了根据实施方案，与可用于测量仪器响应函数(IRF)的TRFS***一起使用的滤光轮的示意图；
图11示出了根据实施方案，用于与TRFS***一起使用的具有集成编码器的滤光轮的示意图；
图12示出了根据实施方案，用于与TRFS***一起使用的具有较少死区的滤光轮的示意图；
图13示出了根据实施方案，用于与TRFS***一起使用的包含聚焦镜式电流计和光谱滤光片的光学组件的示意图；
图14A示出了根据实施方案的用于时间分辨光谱法的探针的示意图；
图14B示出了根据实施方案，图14A的探针尖端的放大端视图；
图14C示出了根据实施方案，图14A的探针尖端的放大剖视图；
图15示出了根据实施方案，包含低荧光环氧化物的用于时间分辨光谱法的探针的尖端的示意图；
图16A示出了根据实施方案，包含与激发元件耦合的短通滤光片的用于时间分辨光谱法的探针的尖端的示意图；
图16B示出了根据实施方案，具有包含短通滤光片的蓝宝石窗口的用于时间分辨光谱法的探针的尖端的示意图；
图17示出了根据实施方案的时间分辨荧光光谱法***的示意图；
图18A示出了根据实施方案，用于持续监测离体脑部样品中的NADH的时间分辨光谱***的示意图；
图18B示出了根据实施方案，用于持续监测离体脑部样品中的NADH的实验的结果；
图19A示出了根据实施方案，中风后测量了NADH水平并表征了细胞活力的离体脑部中样品位置的透视图图像；
图19B示出了根据实施方案，图19A与TTC治疗之后脑部的亮视野图像叠加的透视图图像；
图19C示出了根据实施方案，图19A中所测量的每个样品位置的相对荧光强度的图表；
图20A示出了根据实施方案，暴露于光中20分钟后各个浓度MTX的荧光强度的图表；
图20B示出了根据实施方案，暴露于光中超过20分钟的时间段后不同浓度MTX的荧光强度时间进程的图表；
图20C示出了根据实施方案，暴露于光中超过20分钟的时间段后不同浓度MTX的荧光强度时间进程的图表；
图21A示出了根据实施方案，K4-204荧光发射光谱的图表；
图21B示出了根据实施方案，K4-503荧光发射光谱的图表；
图21C示出了根据实施方案，混合有K4-503的不同浓度K4-204的荧光衰减曲线的图表；
图22A示出了根据实施方案，采用六通道时间分辨荧光光谱法的正常皮质、白质和胶质母细胞瘤(GBM)组织的荧光衰减曲线的图表；
图22B示出了根据实施方案，从荧光衰减曲线提取的参数的图表；
图22C示出了根据实施方案，从分类组的组织样品的荧光衰减曲线提取的参数的图表；
图22D示出了根据实施方案，样品的训练队列(training cohort)中组织表征的图表；
图23示出了根据实施方案，第一脑肿瘤实验中组织表征结果的图表；
图24示出了根据实施方案，第二脑肿瘤实验中组织表征结果的图表；
图25示出了根据实施方案，第三脑肿瘤实验中组织表征结果的图表；
图26示出了根据实施方案，第四脑肿瘤实验中组织表征结果的图表；
图27A-27F示出了根据实施方案，脑肿瘤的组织表征中所用的不同组织分类的代表性组织学图像；
图28示出了根据实施方案，从分类组的组织样品的荧光衰减曲线提取的参数的图表；
图29A示出了根据实施方案，正常皮质组织的分类结果的图表；
图29B示出了根据实施方案，白质组织的分类结果的图表；
图29C示出了根据实施方案，脑肿瘤组织的分类结果的图表；以及
图30A-30E示出了根据实施方案，脑组织分类的概率盒须图(box plot)。
具体实施方式
在下面的详细描述中，参考了构成本文一部分的附图。附图中，除非另有说明，相似的符号通常表示相似的部件。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意在限制。在不脱离本文所提供主题的范围的情况下，可采用其他实施方案，并可进行其他改变。容易理解的是，如本文中一般性描述并在附图中示出的本公开内容的各个方面均可以以各种各样的不同配置进行布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都涵盖于本文中。
虽然下文公开了某些实施方案和实例，但发明主题超过具体公开的实施方案延及其他替代实施方案和/或用途，并延及其修改及等同物。因此，所附权利要求的范围不受以下描述的任何特定实施方案的限制。例如，在本文所公开的任何方法或过程中，方法或过程的动作或操作可以以任何合适的顺序进行，并不一定限于任何特定公开的序列。可以以可能有助于理解某些实施方案的方式将各种操作依次描述为多个非连续操作，然而，描述的顺序不应被解释为暗示这些操作是依赖于该顺序的。此外，本文描述的结构、***和/或装置可作为集成部件或单独部件予以实现。
为了比较各个实施方案，描述了这些实施方案的某些方面和优点。不一定所有这些方面或优点都可以通过任何特定的实施方案来实现。因此，例如，可以以实现或优化本文教导的一个优点或一组优点，而无须实现本文可能另外教导或建议的其他方面或优点的方式来执行各种实施方案。
虽然对将脑组织表征为恶性或非恶性进行具体参考，但是本文公开的方法、***和装置可用于许多类型的生物样品，所述生物样品包括血液、血浆、尿液、组织、微生物、寄生虫、唾液、痰液、呕吐物、脑脊髓液或其中可以检测到化学信号的任何其他生物样品。生物样品可为固体生物样品、半固体生物样品或液体生物样品。生物样品可包括来自，仅举几例，***、肺、肾脏、脑、粘膜、皮肤、肝脏、结肠、膀胱、肌肉、乳腺、眼睛、口腔、肌肉、***、输尿管、尿道、食管、气管、胃、胆囊、胰腺、肠、心脏、脾脏、胸腺、甲状腺、卵巢、子宫、肺、阑尾、血管、骨、直肠、睾丸或子宫颈等的组织。生物样品可以是通过非手术或手术技术可取得的任何组织或器官。可以从患者收集生物样品并进行离体表征。例如，生物样品可以是在手术期间于手术室中被分析或在病理实验室中被分析的活检，以在免疫组织化学分析之前提供初步诊断。备选地，可对生物样品进行体内表征。例如，本文公开的实施方案可用于表征脑部、***或皮肤中的组织，以例如在手术切除之前区分癌组织和非癌组织。
本文公开的***、装置和方法可用于表征生物样品。例如，生物样品可被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的、发炎的，等等。本文公开的***、装置和方法可用于评估损伤后组织活力、确定肿瘤边缘、监测细胞代谢、监测血浆中的治疗药物浓度等。根据所测定的感兴趣的生物样品和分子，本文公开的***、装置和方法可适用于各种应用和用途。
尽管对采用发射的荧光光谱来表征生物样品进行具体参考，但是应理解，本文公开的***、方法和装置可用于表征具有许多光谱类型的组织。例如，生物样品响应光脉冲的激发而发射的信号可包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光谱、红外光谱或其任何组合。
图1示出了时间分辨荧光光谱法***的示意图。可采用该***利用实时或接近实时的时间分辨荧光光谱法来表征生物样品。该***可包含激发信号传输元件103、光源100、至少一个信号收集元件108、光学组件如多路信号分离器104(详述于图2)，以及光学延迟装置或元件105。该***可进一步包含检测器106、数字转换器107、光电二极管109、检测器门110或同步触发机构102(详述于图5)的一个或多个。该***可进一步包含可处理数据的计算机或处理器113。
该光源100可被配置用于生成预定激发波长的光脉冲或连续光束。可通过激发信号传输元件103例如光学纤维将光脉冲导向生物样品101，例如，患者脑部。通过光脉冲的激发可导致生物样品101产生响应光信号，该光信号可通过一个或多个信号收集元件108予以收集。然后可通过信号收集元件108将响应光信号导向多路信号分离器104，以便将该响应光信号分解成预定波长的至少两个光谱带111a-111g(即，光谱带111a、111b、111c、111d、111e、111f和111g)。然后可将光谱带111a-111g引导至光学延迟装置105，该光学延迟装置105向该光谱带111a-111g施加至少一种时间延迟，以便在记录前将该光谱带111a-111g在时间上分开。然后可将时间延迟的光谱带112a-112g(即，分别与光谱带111a、111b、111c、111d、111e、111f和111g对应的时间延迟光谱带112a、112b、112c、112d、112e、112f、112g)导向检测器106并且一次检测一个。对于每一个光谱带112a-112g，检测器106可在下一光谱带到达检测器106之前记录光谱带的荧光衰减和荧光强度。如此，可将单个激发光脉冲用于以实时或接近实时的方式从响应光信号来收集时间分辨(荧光衰减)信息以及波长分辨(荧光强度)信息二者。
光源100可包括任意数目的光源，举几个例子，如脉冲激光器、连续波激光器、调制激光器、可调谐激光器或LED。光源100的预定激发波长可在紫外光谱、可见光谱、近红外光谱或红外光谱的一个或多个中，例如在约300nm至约1100nm的范围内。光源100的预定激发波长可在约330nm至约360nm、约420nm至约450nm、约660nm至约720nm，或约750nm至约780nm的范围内。例如，如图1所示，光源100可发射约355nm的光脉冲。选择性地或组合地，光源100可发射约700nm或约710nm的光脉冲。可选择光源100的波长，使得生物样品101在被光脉冲激发时产生响应光信号。可选择光源100的波长，使得生物样品101在不被该光脉冲损伤的情况下产生响应光信号。例如，可选择紫外光来激发生物样品内的多种荧光团，并且紫外光可用于同时激发多种荧光团。但是，在至少一些情况下，长时间暴露于紫外光可导致细胞损伤。因此，在紫外光暴露存在问题的情况下，近红外或红外光可能是更安全的替代方案。可将红外光源100配置用于通过采用双光子(或多光子)技术来激发与紫外光相似范围的荧光团。例如，可将红外光源100配置用于非常快速连续地发射多个光脉冲，使得光脉冲的两个光子同时辐射生物样品101。当两个或更多个光子同时辐射生物样品101时，其能量可以叠加在一起，并且样品可以产生与响应紫外光辐射可能产生的相似的响应光信号，但潜在安全风险降低。
光源100可由内部或外部脉冲控制装置或触发装置102控制，该内部或外部脉冲控制装置或触发装置可为由光源100输出的每个光脉冲提供准确定时。可以利用光电二极管109检查每个光脉冲的定时，并利用模数转换器102例如如图5所示的NI PCIe-2320对其进行更新。触发装置102可与数字转换器107可操作地耦合，以提供关于检测器106的定时的反馈。任选地，检测器106可由检测器门110控制，该检测器门将光脉冲的定时与如本文所述的门110的开启以及检测器106的激活相耦合。
光脉冲可从光源100聚焦至激发信号传输元件103中。激发信号传输元件103可将光脉冲引向生物样品101上的预定位置或靶组织。例如，激发信号传输元件103可包括一根光学纤维、多根光学纤维、纤维束、透镜***、光栅扫描机构、二向色镜装置等或其任何组合。
光脉冲可辐射生物样品101，并导致该生物样品101发射响应光信号。该响应光信号可包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。该响应光信号可具有包含许多波长的宽光谱。例如，该响应光信号可为响应荧光信号。该响应光信号可包含荧光光谱。该响应光信号可包括荧光光谱和一种或多种其他光谱，例如拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱。本文所述的***、装置和方法可用于根据荧光光谱和/或一种或多种其他光谱来表征生物样品101。
由生物样品101发射的响应光信号可由一个或多个信号收集元件108来收集。例如，信号收集元件108可包含一根光学纤维、多根光学纤维、纤维束、衰减器、可变电压门控衰减器、透镜***、光栅扫描机构、二向色镜装置等或其任何组合。例如，信号收集元件108可包含一束多模纤维或物镜。信号收集元件108可包含阶跃折射率多模纤维束。信号收集元件108可包含渐变折射率多模纤维束。纤维或纤维束可以是柔性或刚性的。信号收集元件108可包含多根纤维，该多根纤维具有选择用于保持进入信号收集元件108的光的锥角与离开信号收集元件108并穿过纤维准直仪的光的发散角之间的平衡的数值孔径(“NA”)。较低的NA可通过减少发散角而增加与延迟纤维光学耦合的效率，而较高的NA可通过增大锥角而增加所能收集到的信号的量。
可将响应光信号引导至将该响应光信号分解成光谱带的光学组件或波长分解装置，例如，如本文所述的多路信号分离器或滤光轮。例如，响应光信号可在多路信号分离器104中经历一系列波长分解过程，以便将宽带响应光信号解析成各自具有不同中心波长的一些窄光谱带。可将多路信号分离器104配置用于根据所期望数目将响应光信号分解成任意数目个光谱带。例如，可将多路信号分离器104配置用于将响应光信号分解成七个光谱带111a-111g，以便表征包含六种荧光分子的生物样品的荧光衰减，其中第七个光谱带包含反射的激发光。
选择性地或组合地，可将响应光信号引导至滤光轮上，该滤光轮将该响应光信号分解成如本文所述的光谱带。该滤光轮可包含多个光谱滤光片。任选地，该滤光轮可包含多个编码器。每个光谱滤光片可与至少一个编码器关联。该滤光轮可包括旋转滤光轮。该滤光轮可持续旋转或以步进方式旋转。滤光轮的每次旋转可生成一组波长分辨的光谱带。滤光轮的每次后续旋转均可生成与其他组的光谱带时间上不同的后续的光谱带组。可收集一些列光谱带组，以便由响应光信号来生成时间分辨、波长分辨的数据。滤光轮可以是固定的，在这种情况下可通过镜式电流计将响应光信号按顺序引导至光谱滤光片上。与旋转滤光轮相比，固定滤光轮和镜式电流计的使用可增加***的获取速度。镜式电流计可重复其光谱滤光片的获取顺序，以便生成时间分辨、光谱分辨的数据。
可通过光学延迟元件105将波长分辨的光谱带从多路信号分离器104引导至检测器106。光学延迟装置105可向该光谱带施加一种或多种时间延迟，使得它们在时间上分开并且每一个时间延迟的光谱带均可在不同的时间到达检测器106。光学延迟装置105可提供在约5ns至约700ns范围内的延迟。例如，光学延迟装置105可提供约7.5±3ns、75±10ns、150±10ns、225±10ns、300±10ns、375±10ns、450±10ns、525±10ns、600±10ns的一种或多种延迟或其组合。可将光学延迟装置105配置用于提供期望的任何延迟或延迟组合。光学延迟装置105可包含任意数目的延迟装置。光学延迟装置105可包含多根不同长度的光学纤维，每个光谱带一根，使得每个光谱带在到达检测器106之前行进不同的距离并因此沿该光学纤维行进不同的时间量。例如，光学延迟装置105可包含两根光学纤维，其中第二光学纤维长于第一光学纤维，使得第一光谱带在第二光谱带之前到达检测器106。选择性地或组合地，可以改变除长度之外的光学纤维的物理性质，以便控制由光学延迟元件105施加的时间延迟。例如，可改变纤维的折光率。这样的物理性质还可用于确定实现期望延迟所需的纤维长度。可根据期望的延迟来确定纤维的长度。例如，可配置纤维，使得纤维的长度从第一个至最后一个按照约30英尺、约35英尺、约40英尺、约45英尺或约50英尺的增量而增加。光学延迟装置105的纤维之间的增量可以相同或不同。对于本领域技术人员显而易见的是，可以选择任何数量和任何长度的纤维以便将期望的时间延迟施加至光谱带。例如，可通过长度约5英尺、55英尺、105英尺、155英尺、205英尺、255英尺和305英尺的纤维将光谱带111a-111g导向检测器106，其中每个光谱带沿不同的光学纤维移动，这向光谱带111a-111g施加了不同的时间延迟，使得时间延迟的光谱带112a-112g在不同的时间到达检测器106。鉴于每个光谱带可能具有持续特定时间量(例如，几十纳秒数量级)的衰减曲线，可将施加至每个光谱带的时间延迟配置成足够长，以将各自的衰减曲线在时间上分离并允许检测器在生物样品101的单次激发后检测多个时间延迟的光谱带。
光谱延迟装置的多根光学纤维可包括阶跃折射率多模纤维束。光学延迟装置的多根光学纤维可包括渐变折射率多模纤维束。在一些情况下，相比于阶跃折射率纤维，渐变折射率纤维可能是优选的，因为它们通常具有随纤维长度增加的较小带宽损失，并因此可在长纤维用于本文所述的光学延迟装置时产生更强或质量更佳的信号。纤维或纤维束可以是柔性或刚性的。
在一些情况下，可在响应光信号进入光学组件例如多路信号分离器或滤光轮之前向该响应光信号施加时间延迟。在一些情况下，光学延迟元件可包括配置用于将时间延迟的响应光信号分解成光谱带的光学组件。例如，可将响应光信号引导至光学延迟元件上。光学延迟元件可向响应光信号施加一种或多种延迟，使得该响应光信号可以在时间上分开，并且在到达检测器106之前，时间延迟信号可穿过一个或多个光谱滤光片，以将时间延迟的光信号分解成时间延迟的光谱带(参见，例如，图17)。光学延迟元件可包括如本文所述的多根光学纤维，该多根光学纤维进一步包含配置用于生成多个时间延迟的光谱带的多个光谱滤光片(例如，每根光学纤维一个)。每个时间延迟的光谱带则可在不同的时间到达检测器106。
在一些情况下，例如，当光学组件包括如本文所述的滤光轮时，在到达检测器106之前可以不向光谱带施加时间延迟，并且***可以不包含光学延迟元件105。
可将检测器106配置用于从光学延迟装置105接收时间延迟的光谱带，并单独记录每一个时间延迟的光谱带。例如，检测器106可包括快速响应光电倍增管(PMT)、多通道平板光电倍增管(MCP-PMT)、雪崩光电二极管(APD)，硅PMT或本领域已知的任何其他光电检测器。检测器可以是高增益(例如，106)、低噪声、上升时间快(例如，约80皮秒)的光电检测器，例如Photek 210。可以自动控制检测器106的增益。检测器106的电压可根据检测到的响应光信号的强度而动态地变化。可以在对检测到的光谱带的强度进行分析之后并且在记录信号之前改变检测器106的电压。所记录的数据可以被数字化，以通过高速数字转换器107显示于计算机或其他数字装置上。例如，数字转换器107可以以约6.4G样品/秒的速率将所记录的数据予以数字化。例如，数字转换器107可为108ADQ Tiger。可任选地通过处理器113例如计算机处理器来分析该数据。处理器113可配置有从数字转换器107收集数据并执行本文所述的用于分析的任何方法的指令。选择性地或组合地，可使用示波器显示所记录的数据。任选的前置放大器可以在显示之前为所记录的数据提供额外的增益。检测器106可与控制该检测器106的检测器门110可操作地耦合，使得在检测器门110打开并且检测器106激活时，检测器106在较窄的检测窗口期间对信号产生响应。
来自生物样品的响应光信号可根据被激发的感兴趣分子而变化。例如，对于生物样品中高响应性或高荧光分子，响应光信号可能非常高，而对于生物样品中低响应性或低荧光分子，响应光信号可能非常低。例如，荧光团发射具有一定强度的荧光光谱，该强度基于用于对其进行激发的激发光的量子效率和/或吸收。根据荧光团所处的条件，荧光团的强度可以不同。例如，组织样品中的荧光团可具有与血液样品中或由于其环境中的差异而分离时的相同荧光团不相同的强度。为了正确地记录荧光光谱，可调整检测器的增益，使得高荧光发射不会使信号饱和并且低荧光发射不会降低信噪比。这可以通过根据先前记录的数据快速改变检测器106例如PMT的电压而实现。例如，可用两种光脉冲激发生物样品，并对记录的数据取平均值并分析以确定来自该生物样品的信号是过高或是过低。然后可基于该确定来调整电压，以便改变检测器106的增益。这样的调整可手动或通过例如处理器自动进行。这样的调整可反复进行直至达到期望的信噪比。一旦达到期望的信噪比，记录数据。
时间延迟的光谱带可包含可通过本文所述的***、装置和方法测量的荧光强度衰减数据。所测得的荧光强度衰减数据(FID(t,λ))可由来自一个或多个生物分子的荧光衰减组件以及被称为仪器响应函数(IRF(t,λ))的光学和电学转移组件函数组成。数学上，FID(t,λ)是荧光脉冲响应函数(fIRF(t,λ))与IRF(t,λ)的卷积。为评价样品的纯fIRF(t,λ)，可将IRF(t,λ)从所测得的荧光脉冲中去卷积。IRF(t,λ)描述了荧光光子所经历的光学路径和波长***特征的影响，并且可通过记录来自标准染料的极快速荧光衰减进行测量。当衰减的数量级快于来自感兴趣生物样品的荧光衰减时(例如，当脑组织为感兴趣样品时，小于70ps则足够快)，可将测得的快速衰减用作真实IRF(t,λ)的近似。可采用“内核的Laguerre扩展”来确定fIRF(t,λ)。Laguerre法是基于离散时间Laguerre函数的正交集合的扩展。Laguerre参数α(0<α<1)确定离散Laguerre函数的指数(渐近)下降速率。参数α的选择在实现准确fIRF(t,λ)估算中是重要的。可使用迭代过程来确定最佳α以恢复准确的荧光衰减。在估算α并将Laguerre内核相对于所测得的荧光衰减进行拟合之前，可将先前记录的IRF和荧光衰减在时间上对准。可通过采用IRF(t,λ)和测量FID(t,λ)两者的超级样本来实现对准。
图2示出了多路信号分离器的示意图。多路信号分离器104可包含一个或多个波长分解滤光片，其被配置用于以预定的波长范围将响应光信号分解，以获得多个光谱带。波长分解滤光片可包括中性密度滤光片、带通滤光片、长通滤光片、短通滤光片、二向色滤光片、陷波滤波器、反射镜、吸收滤光片、红外滤光片、紫外滤光片、单色滤光片、二向色镜、棱镜等的一种或多种。响应光信号可在多路信号分离器104中经历一系列波长分解过程，以便将宽带响应光信号解析成各自具有不同中心波长的一些窄光谱带。该光谱带可在约370nm至约900nm之间的范围内。
例如，可将多路信号分离器104配置用于分解包含来自内源荧光团的发射光谱的生物组织样品的响应光信号。例如，举几个例子，荧光团可包括Flavin单核苷酸(FMN)核黄素、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)核黄素、脂色素、内源性卟啉、游离烟酰胺腺苷二核苷酸(NADH)、结合的NADH或吡哆醛磷酸-谷氨酸脱羧酶(PLP-GAD)。图3A示出了这些示例性分子在被355nm激光器激发时的荧光发射光谱。由紫外光或激光光源激发的生物样品的响应光信号可被分解成在垂直虚线之间的范围内的光谱带。可将多路信号分离器104配置用于将激发的响应光信号分解成小于约365nm(包含反射的激发光)、约365nm至约410nm、约410nm至约450nm、约450nm至约480nm、约500nm至约560nm、约560nm至约600nm，以及约600nm或更大的光谱带。图3B示出了用可以被评估的UV激光器刺激的各种其他内源荧光团的荧光发射光谱，以及其在各个波长下的特征荧光衰减寿命。可将多路信号分离器配置用于将激发的响应光信号分解成与一个或多个荧光团被激发的一个或多个峰值波长对应的光谱带。例如，可将多路信号分离器配置用于检测NADH、FAD、FMN、脂褐素、PpIX、purodaxine、视黄醇、核黄素或其任何组合。可将本文所述的***、装置和方法配置用于根据荧光团的光谱发射光谱和/或荧光衰减性质来检测生物样品中任意数目或任意组合的荧光团。
如图2所示，光响应光信号可在FiberPort准直仪120等，例如，准直透镜处进入多路信号分离器104。例如，准直透镜可包括梯度折射率(GRIN)透镜，非球面透镜等。可将响应光信号引导至第一波长分解滤光片122上，该第一波长分解滤光片将该响应光信号分解成包含波长大于约495nm的光的第一光谱组分113a和包含波长小于约495nm的光的第二光谱组分113b。然后可任选地利用60mm焦距双凹透镜或消色差双色透镜124将第一光谱组分113a在到达第二波长分解滤光片126之前予以聚焦。第二波长分解滤光片126可将第一光谱组分113a分解成包含波长在约500nm至约560nm范围的光的第一光谱带111e，和包含波长大于约560nm的光的第三光谱组分113c。第一光谱带111e可穿过第一滤光片125。然后第三光谱组分113c可被第三波长分解滤光片128分解成包含波长在约560nm至约600nm范围的光的第二光谱带111f，和包含波长大于约600nm的光的第三光谱带111g。第二光谱带111f可穿过第二滤光片127。第三光谱带111g可穿过第三滤光片129。可任选地利用60mm焦距双凹透镜或消色差双色透镜130将第二光谱组分113b在到达第四波长分解滤光片132之前予以聚焦。第四波长分解滤光片132可将第二光谱组分113b分解成包含波长在约415nm至约495nm范围的光的第四光谱组分111d，和包含波长在小于约415nm范围的光的第五光谱组分113e。第四光谱组分113d可被第五波长分解滤光片134分解成包含约415nm至约450nm范围的波长的第四光谱带111c，和包含约450nm至约495nm范围的波长的第五光谱带111d。第四光谱带111c可穿过第四滤光片135。第五光谱带111d可穿过第五滤光片137。第五光谱组分113e可被第六波长分解滤光片136分解成包含约365nm至约410nm范围的波长的第六光谱带111b，和包含小于约365nm的波长的第七光谱带111a(例如，激发光)。第六光谱带111b可穿过第六滤光片133。可记录包含激发光的第七光谱带111a，以便确保响应光谱带111b-111g的准确去卷积。
图4示出了通过多路信号分离器104分解后多种示例性分子的荧光发射光谱。在向如本文所述的每个光谱带111a-111g施加时间延迟后，将检测器106用于检测波长大于355nm的激发波长的六个光谱带111b-111g(在图4中被分别标为ch1-ch6)。多路信号分离器104将代表PLP-GAD或嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)(通道1)、结合的NADH(通道2)、游离NADH(通道3)、FMN/FAD/核黄素(通道4)、脂色素(通道5)和内源卟啉(通道6)的光谱带分离。将具有在激发波长处或激发波长附近的波长的光谱带111a用于将所示数据归一化。
可将多路信号分离器104配置用于将响应光信号分解成期望的更多或更少的光谱带。在另一实例中，可将多路信号分离器104配置用于将来自包含游离和结合的NADH和PLP-GAD的生物样品的响应光信号予以分解。可通过如本文所述的约355nm的紫外光脉冲激发该生物样品。光谱带可在约400nm或更小、约415nm至约450nm、约455nm至约480nm，以及约500nm或更大的范围内。可将响应光信号从信号收集元件引导至第一波长分解滤光片上，该第一波长分解滤光片将响应光信号分解成包含大于约400nm的波长的第一光谱组分，和包含小于约400nm的波长的第一光谱带(例如，激发光)。第一光谱组分可被第二波长分解滤光片分解成包含约400nm至约500nm范围的波长的第二光谱组分，和包含大于约500nm的波长的第二光谱带。第二光谱组分可被第三波长分解滤光片分解成包含约400nm至约450nm范围(例如，约415nm至约450nm)的波长的第三光谱带，和包含约450nm至约500nm范围(例如，约455nm至约480nm)的波长的第四光谱带。
在另一实例中，可将440nm光源用于激发生物样品，并将多路信号分离器配置用于将响应光信号分解成用于表征FAD、FMN和卟啉的光谱带。
本领域技术人员将理解，光谱带可在期望的任意范围内，以便表征生物样品，并且可将多路信号分离器104的波长分解滤光片配置用于生成所述光谱带。
尽管本文描述了紫外光脉冲，但本领域技术人员将理解，光源和光脉冲可为任何期望的波长，并且可将多路信号分离器104配置用于适用任意的激发光波长。例如，但选择红外光源时，可将多路信号分离器104配置用于将响应光信号分解成生物样品的光谱带特征和包含反射的红外光的光谱带。
可将本文所述的装置、***和方法用于由包含两种不同的光谱的响应光信号来表征生物样品。该响应光信号可包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。例如，响应光信号可包括荧光光谱和拉曼光谱。可单独或组合地使用荧光光谱和拉曼光谱来表征用光脉冲辐射的生物样品，因为所述两种光谱可提供关于生物样品的不同信息，该信息可能互补。可通过如本文所述的光脉冲来激发该生物样品，并且可通过信号收集元件收集包含荧光光谱和拉曼光谱的响应光信号。信号收集元件可包含多根如本文所述的光学纤维。信号收集元件可包含如本文所述的光学纤维束。可通过第一光学纤维束来收集响应光信号。可通过第一纤维束将响应光信号引导至第一多路信号分离器。可将第一多路信号分离器配置用于分解如本文所述的荧光光谱。可将第一多路信号分离器配置用于以与荧光光谱相似的方式来分解拉曼光谱。可通过第二多路信号分离器将拉曼光谱分解成光谱带。然后可将来自荧光光谱和拉曼光谱的光谱带引导至检测器并用于表征如本文所述的生物样品。选择性地或组合地，可将响应光信号引导至第一纤维束以及第二纤维束。可通过第一纤维束将响应光信号引导至第一多路信号分离器，并通过第二纤维束引导向检测器。可通过第一纤维束将响应光信号引导至第一多路信号分离器，并通过第二纤维束引导至第二多路信号分离器。可将第一多路信号分离器配置用于分解响应光信号，使得荧光光谱在预定的波长下被分解，以获得第一组光谱带。可将第二多路信号分离器配置用于分解响应光信号，使得拉曼光谱在预定的波长下被分解，以获得第二组光谱带。可经由时间延迟机构将两组光谱带引导至检测器，并用于表征如本文所述的生物样品。第二多路信号分离器可与第一多路信号分离器基本相似，从而允许在预定光谱带范围中的变化依赖于期望的拉曼光谱信息。例如，第二多路信号分离器可包括分束器、吸收滤光片、低通滤光片、高通滤光片、陷波滤波器或反射镜的一种或多种。在检测前，可向或不向第一组光谱带、第二组光谱带或二者施加时间延迟。
本文所述的***、装置和方法可用于表征生物样品上的多个相邻位置，以产生含有关于该生物样品的光谱学信息的高分辨图像。可将信号调整元件与激发信号传输元件耦合，并配置用于从该激发信号传输元件接收光脉冲并将该光脉冲引导至该生物样品。可以以如本文所述对响应光信号进行收集、光谱分离及时间分离。可将信号调整元件例如光栅扫描机构配置用于在生物样品的整个预定部分上扫描光脉冲。可将光脉冲引导至生物样品上的第一位置，并从如本文所述的该位置从响应光信号收集时间延迟的光谱带。光栅扫描机构可用于将第二光脉冲引导至生物样品上的第二位置，以便从该第二位置收集时间延迟的光谱带。可扫描预定的图案，其中辐射的每个新位置具有新的时间延迟光谱带组，使得可以创建生物样品的预定部分的图像。可响应来自第一和第二位置以及感兴趣的任何其他位置的时间延迟光谱带而表征生物样品。选择性地或组合地，可将信号调整元件例如数字微镜装置配置用于以一种或多种预定图案对光脉冲加以塑形，并将图案化的光脉冲引导至生物样品的整个预定部分上。可用修饰有第一预定图案的光脉冲来激发该生物样品的部分，以生成第一组时间延迟的光谱带。可用修饰有第二预定图案的第二光脉冲来激发该生物样品的部分，以生成第二组时间延迟的光谱带。可配置该图案，使得可将预定数目的图案或掩模用于激发该生物样品的部分并利用压缩感测方法而进行组合，以使用比光栅扫描方法可能更少的重复或样品激发来重新创建生物样品的预定部分的图像。可响应第一组时间延迟光谱带和第二组时间延迟光谱带以及使用感兴趣的其他掩模获得的任何其他时间延迟光谱带而表征生物样品。这样的激发方法可允许在相对短的时间段内于样品区域的期望区域上检测多种感兴趣的荧光分子(例如，三种、四种、五种、六种或更多种)。
图5示出了同步触发机构的示意图。检测器106可任选地由门控制电路门控和控制，使得检测器106在检测器门110打开的限定检测窗口期间对响应光信号产生响应。门控电路和光脉冲控制可以是同步的，使得响应光信号可在单个检测窗口期间由检测器106予以记录。在单元被外部触发后，光源100可在生成光脉冲时可具有固有的延迟。例如，生成光脉冲的延迟(本文中也被称为触发延迟)可高达约85微秒。触发延迟可以超过约85微秒。在固定的延迟设置中(左图)，光源100可在t0时被触发而检测器106可在84微秒后的t1处由数字延迟装置102触发。检测器门(例如，PMT门)110可在约90纳秒后的t2时打开，并且光脉冲可在约85微秒后的t3时生成，由此允许光脉冲在检测器门110打开的检测窗口期间到达检测器(例如，PMT)106。固定的延迟设置可包括如本文所述的光电二极管109和数字转换器107。在动态的延迟设置中(右图)，通过根据为先前的光脉冲记录的延迟，修改由光脉冲控制触发的光脉冲与检测器门打开之间的延迟，检测器门打开的时机可与光脉冲同步。激光器100的每次光脉冲之间的触发延迟可以不同，并且可将反馈机构并入延迟机构中。可任选地为该***添加第二光电二极管109a，以便使光脉冲与检测器门110的打开同步。第二光电二极管109a可检测光脉冲的时机、比较外部触发的时机，并基于所检测的光脉冲时机而校正后续触发的时机。这种反馈机构可包括光源100触发时t0、光脉冲发出时t1(例如，约84微秒后)、检测器门110触发时t2(针对先前的触发延迟而调整，而并非固定)，检测器门110打开时t4，以及光电二极管记录的延迟t3的测量。可动态地设置t2，以确保当响应光信号到达检测器106以供检测时，检测器106上的电压增益为“开启”。可任选地添加第一光电二极管109，以触发数字转换器，以便减少光脉冲不作用时所收集的数据量。
图6示出了用于时间分辨光谱法的探针的示意图。探针600可用于表征如本文所述的生物样品。例如，探针600可包含激发信号传输元件103、光源100、信号收集元件108、多路信号分离器104(或如本文所述的其他光学组件)、光学延迟装置或元件105、检测器106、数字转换器107、光电二极管109、检测器门110或同步触发机构102的一种或多种。例如，探针600可包含激发信号传输元件103和多个信号收集元件108。探针600可在其近端602处与发射光脉冲的光源(未示出)可操作地耦合。可将光脉冲引导至激发信号传输元件103上(按照近端602左侧上的箭头方向)并沿之引导向探针600的远端604和生物样品。激发信号传输元件103可包含光学纤维，例如，具有0.11数值孔径(NA)的600um直径光学纤维，以及光源为紫外光或激光光源时的UV级二氧化硅芯纤维。可将光脉冲从探针600的远端604引导至生物样品上，以便辐射该样品并产生响应光信号。可通过多个信号收集元件108来收集响应光信号。多个信号收集元件108可包含六根光学纤维(参见，例如，图15)。多个信号收集元件108可包含十二根光学纤维，例如，十二根具有0.22NA的200um直径光学纤维和UV级二氧化硅芯纤维。信号收集纤维108可围绕激发信号传输纤维103排列，使得探针600具有修长的外形。可利用接近探针600的近端602的多模组合器606将信号收集纤维108捆扎成单根纤维，并且可将响应光信号引导(按照近端604右侧上的箭头方向)至多路信号分离器(未示出)或其他光学组件以将其分解成如本文所述的光谱带或引导至如本文所述的***的其他组件(如光学延迟装置或元件)。可将信号收集纤维108捆扎成多根纤维。多路信号分离器或其他光学组件可以是集成的，或在探针600的外部。然后在通过检测器检测之前，光谱带可具有通过光学延迟元件施加的一种或多种时间延迟。光学延迟元件可以是集成的，或在探针600的外部。检测器可在探针600的外部。探针600的组件可与本文所述的那些基本上相似。探针600可被配置为手持式的。探针600可包括手持式探针。探针600可以是机器人控制的，例如，通过可商购的机器人手术***控制。探针600可与抽吸套管集成，例如，以允许(接近)实时地光谱指导的手术切除。
图7示出了用于时间分辨光谱法的两件式探针的示意图。在至少一些情况下，提供包含两个部分——远侧部702和近侧部704的探针700对表征生物样品可能是有利的。两件式探针700的近侧部704可与图6中描述的探针600基本上相似。两件式探针700的远侧部702可包含远侧信号传输元件706。远侧信号传输元件706可包括光学纤维、梯度折射率透镜、球透镜、二向色滤光片、反射镜或吸收性滤光片。远侧信号传输元件706可包含光学纤维，例如，具有0.11数值孔径(NA)的600um直径光学纤维，以及光源为紫外光或激光光源时的UV级二氧化硅芯纤维。远侧信号传输元件706可与近端激发信号传输元件103以及近端信号收集元件108可操作地耦合。近侧部704和/或远侧部702可包含耦合元件，该耦合元件将远侧传输元件706与近端激发信号传输元件103以及近端信号收集元件108相耦合。可将由光源生成的光脉冲从近端激发信号传输元件103引导至远侧信号传输元件706。远侧信号传输元件706可将光脉冲引导至生物样品上，并然后从该生物样品收集响应光信号。远侧信号传输元件706可将响应光信号引导至近端信号收集元件108。近端信号收集元件108可将响应光信号引导至多路信号分离器或其他光学组件，以供如本文所述的光谱分带、时间分辨和/或检测。远侧部702可以是可从近侧部704拆卸的。远侧部702可以是一次性的。远侧部702可以是可更换的。远侧部702可被配置为手持式的。远侧部702可包含手持式探针。探针700可与抽吸套管集成，例如，以允许(接近)实时地光谱指导的手术切除。探针700可以是机器人控制的，例如，通过可商购的机器人手术***控制。远侧部702可以是机器人控制的，例如，通过可商购的机器人手术***。
图8示出了时间分辨荧光光谱法***的示意图。该***可用于采用实时或接近实时的时间分辨荧光光谱法来表征生物样品。该***可包含激发信号传输元件103、光源100、至少一个信号收集元件108，和光学组件，如包含一个或多个光谱滤光片802的滤光轮800。光学组件可包含任意个本文所述的滤光轮。该***可进一步包含光学延迟装置或元件、检测器106、数字转换器107、光电二极管109、用于将激发光脉冲的一部分引导至光电二极管109的分束器804、检测器门或如本文所述的同步触发机构的一种或多种。激发信号传输元件103、光源100、至少一个信号收集元件108、检测器106、数字转换器107、光电二极管109、检测器门、光学延迟装置或元件，以及同步触发机构可与本文所述的那些基本上相似。
光源100可被配置用于生成预定激发波长的光脉冲或连续光束。可通过激发信号传输元件103例如光学纤维将光脉冲引导向生物样品101，例如，患者脑部。通过光脉冲的激发可导致生物样品101产生响应光信号，该光信号可通过一个或多个信号收集元件108来收集。然后可通过信号收集元件108将响应光信号引导向滤光轮800，以便将该响应光信号分解成预定波长的至少两个光谱带。可任选地通过一个或多个信号收集元件108使响应光信号穿过光束准直仪，例如，如图9B所示的光束准直仪，以便使响应光信号准直并将其引导至滤光轮800的一个或多个滤光片802上。光束准直仪的使用可增大照射在检测器106的收集窗口上的面积。然后可将光谱带引导至光学延迟装置，该光学延迟装置向该光谱带施加至少一种时间延迟，以便在记录前将该光谱带在时间上分开。选择性地或组合地，滤光轮800可用于将光谱带在时间上分离。在一些情况下，没有向光谱带施加额外的时间延迟。然后可将光谱带(时间延迟的或未时间延迟的)引导向检测器106并一次导引一个光谱带。对于每一个光谱带，检测器106可在下一光谱带到达检测器106之前记录光谱带的荧光衰减和荧光强度。以这种方式，可将单个激发信号脉冲用于以实时或接近实时的方式从响应光信号收集时间分辨(荧光衰减)信息以及波长分辨(荧光强度)信息二者。
图9A示出了高速滤光轮的示意图。可将响应光信号900引导至将该响应光信号900分解成光谱带的光学组件或波长分解装置，例如，滤光轮800。响应光信号900可穿过滤光轮800。滤光轮800可包含多个光谱过滤器802，以生成光谱带。响应光信号900可穿过所述多个光谱过滤器802，以生成光谱带。滤光轮800可包括旋转滤光轮。旋转滤光轮800可为超高速滤光轮，以便快速生成光谱带，从而允许检测器106以实时或接近实时的方式采集时间分辨荧光衰减信息以及波长分辨荧光强度信息二者。旋转滤光轮800可为自由流动的滤光轮或者可以是电动的。可将旋转滤光轮800配置为持续旋转，或以步进方式旋转。旋转滤光轮800可包含一个或多个配置用于通过检测器106检测并用于编码光谱带的标识(例如，以便区分第一光谱度和第二光谱带)的编码器。
例如，响应光信号900可被滤光轮800的光谱滤光片802分解，以便将宽带响应光信号解析成各自具有不同中心波长的一些窄光谱带。可为滤光轮800配置有用于将响应光信号900分解成取决于期望数目的任意数目个光谱带的光谱滤光片802。例如，可将滤光轮800配置用于通过六个光谱波滤器802将响应光信号900反复且快速地分解成六个光谱带，以便表征包含六种荧光分子的生物样品的荧光衰减。可以使滤光轮800旋转，使得响应光信号900快速连续地穿过六个光谱滤光片802的每一个，由此生成第一组波长分辨的光谱带。滤光轮800的额外旋转可生成其他组的波长分辨的光谱带，每一组均在时间上相比于先前组而延迟。可将一个或多个编码器应用于如本文所述的滤光轮，以便帮助区分波长分辨的光谱带和/或光谱带组，从而允许该***(例如，如本文所述的计算机处理器)将光谱带在时间上对准并从响应光信号900生成时间分辨信息且波长分辨的信息。可通过滤光轮800将波长分辨的光谱带从滤光轮800引导至检测器106。
图9B示出了光束准直仪的示意图。可通过一个或多个信号收集元件108将响应光信号900传递至光束准直仪910，并可使其穿过一系列光学聚焦元件910-914，以便使响应光信号900在穿过如本文所述的滤光轮(未示出)之前瞄准。为生成5mm直径的准直的响应光信号束900，光学聚焦元件910可与一个或多个信号收集元件108间隔约14.98mm。光学聚焦元件911可距离光学聚焦元件910约60mm至约80mm，例如约80mm。光学聚焦元件911可位于距离元件912约47mm处。光学聚焦元件912可距离光学聚焦元件913约25mm。光学聚焦元件913可距离光学聚焦元件914约38.1mm。光学聚焦元件914可距离滤光轮(未示出)约20mm。光学聚焦元件910-914可沿着光束路径(可为如所示线性的或可包含角度)以如所示的不同的间隔空间隔开，以便在滤光轮上生成5mm直径准直光束900。选择性地或组合地，元件910-914可配置有本领域普通技术人员期望的不同的元件间距离，以便在距离一个或多个信号收集元件108不同距离处生成准直光束900，并且/或者生成具有不同光束直径的准直光束900。
图10示出了可用于测量仪器响应函数(IRF)的滤光轮的示意图。滤光轮1000可与本文所述的任何滤光轮基本上相似。本领域普通技术人员将理解，可根据期望将本文所述的滤光轮的任意特征进行组合。***的仪器(包括光学组件、光源、检测器、数字转换器等)可影响组织的荧光信号(或响应光信号)。这种影响被称为IRF。在许多情况下，许多组件对IRF的贡献可能随时间未显著变化，并因此可在对来自组织的信号进行测量之前提前测量并存储在计算机上，无需持续监测。所存储的IRF可用于在所收集的样品荧光衰减上进行去卷积，以便确定“真实的”衰减信号。然而，光源例如激光器的脉冲特征(例如，信号强度等)可由于激光器温度、使用期限、漂移等的变化而随时间改变。在一些情况下，可能期望将***配置成通过收集滤光轮800的每次循环期间的IRF并将新收集的IRF用于在该循环期间所收集的光谱带组的去卷积而补偿激光器脉冲质量的变化。滤光轮1000可包含一个或多个光谱滤光片，例如，如所示的6个光谱滤光片1002b-1002g，其将响应光信号分解成如本文所述的光谱带。滤光轮1000可进一步包含第七滤光片1002a，例如，可提供关于***IRF的信息的低通滤光片。第七光谱滤光片1002a可包括低通滤光片和中性密度滤光片(用于降低信号强度，因为激光强度通常比响应光信号的强度高几个数量级)，以便收集关于激光器本身的信息，以便确定滤光轮800的每个循环的IRF。
图11示出了具有集成的编码器的滤光轮的示意图。滤光轮1100可与本文所述的任何滤光轮基本上相似。本领域普通技术人员将理解，可根据期望将本文所述的滤光轮的任意特征进行组合。在一些情况下，滤光轮1100可为步进式滤光片，其采用步进电机来确定滤光片1102的准确定位，并告知***(例如，计算机处理器)哪个光谱带与哪个光谱过滤器1102对应。然而，在一些情况下，可将连续的电机用于使滤光轮1100连续旋转。使用连续电机可使信号获取速度提高和获取时间减少。可将一个或多个编码器1104集成至滤光轮1100上，以便在通过检测器获取信号时将每个光谱带“标明”为对应特定光谱滤光片1102。例如，每个过滤器1102之间可存在编码器1104，以便将每个光谱带标识为其由滤光轮1100生成。第一编码器1104a可标识可生成第一光谱带的第一滤光片1102a，并且第二编码器1104b可标识可生成第二光谱带的第二滤光片1102b，对于每个光谱带以此类推。编码器1104还可用于触发通过数字转换器的数据获取，以便开始数据采集并鉴别光谱带的波长。
图12示出了具有减少的死区的滤光轮的示意图。滤光轮1200可与本文所述的任何滤光轮基本上相似。本领域普通技术人员将理解，可根据期望将本文所述的滤光轮的任意特征进行组合。左侧示出了可包含通过固定器8022设置至滤光轮800中的一个或多个光谱滤光片802的滤光轮800。每个滤光轮802均包含在它与它的相邻滤光片之间的一些数量的死区1204。这种死区1204可防止当信号未聚焦在纤维802上时(例如，滤光轮800在相邻滤光片802之间旋转时)响应光信号的传输。在一些情况下，例如，为增加获取时间和/或确保可靠地获得数据，减少滤光轮800上死区1204的量可能是有利的。在许多情况下，当滤光轮800在滤光片802之间移动时，滤光轮800上的死区1204可能需要激光器的脉冲暂时停止。将激光器暂时停止，即使停止一微秒，可能需要时间(例如，100us的脉冲)来在重启后稳定化，这可导致在滤光片802再次正确地定位在检测器前时激光脉冲的浪费。选择性地或组合地，死区1204可导致信号缺乏和***未获取数据的时间(并因此比连续获取数据时可能达到的效率低)。右侧示出了已被配置用于减少滤光轮1200中死区的量的滤光轮1200。滤光轮1200可包含涂覆的玻璃，该涂覆的玻璃已被涂覆，以便生成其间没有死区的多个相邻的光谱区1202。由于光源可以连续发射，所以缺少死区可增加***的效率，并且由于滤光轮1200旋转经过每一个光谱滤光片1202，因此可以连续获取信号。滤光轮1200可任选地包含可具有短通滤光片和任选的中心密度滤光片的IRF滤光片区1206，以收集关于如本文所述的滤光轮1200的每一次循环的IRF的信息。
图13示出了包含聚焦镜式电流计和光谱滤光片的光学组件的示意图。可在检测器106与一个或多个信号收集元件108之间提供固定滤光轮1300，并可将聚焦镜式电流计1304用于通过该固定滤光轮1300的光谱过滤器1302将响应光信号900从信号收集元件108引导至检测器106。可通过镜式电流计1304将响应光信号顺序地引导至光谱滤光片1302上。镜式电流计1304可在x和y方向中偏移，以便以预定的顺序将响应光信号900聚焦至具有较小面积的滤光轮1300的每个滤光片1302上。滤光轮可在组成和滤光片1302类型(例如，***或涂覆)上与本文所述的任何滤光轮基本上相似。镜式电流计1304可快速移动响应光信号900，以将该信号900一次聚焦在单个滤光片1302上。与旋转滤光轮相比，固定滤光轮1300和镜式电流计1304的使用可增加***的获取速度。镜式电流计1304可重复其光谱滤光片1302的获取顺序，以便生成时间分辨、光谱分辨的数据。滤光轮1300可任选地包含可具有短通滤光片和任选的中心密度滤光片的IRF滤光片区1306，以收集关于如本文所述的镜式电流计1304的每个顺序的IRF的信息。
图14A示出了用于时间分辨光谱法的探针的示意图。图14C示出了图14A的探针尖端的放大端视图。图14C示出了图14A的探针尖端的放大视图。探针1400可与本文所述的任何探针基本上相似。例如，探针1400可包含激发信号传输元件103、光源、信号收集元件108、光学组件、光学延迟装置或元件、检测器、数字转换器、光电二极管、检测器门或同步触发机构102的一种或多种。例如，探针1400可包含激发传输元件103和一个或多个(例如，六个)信号收集元件108。激发传输元件103和一个或多个信号收集元件108可与本文所述的那些基本上相似。例如，激发传输元件103和六个信号收集元件108可包含排列的光学纤维(例如，600um，NA 0.27)，使得激发传输纤维103被定位在中央，六个信号收集元件108排列在其周围。探针1400可在其近端处与发射光脉冲的光源(未示出)可操作地耦合。可将该光脉冲引导至激发信号传输元件103上并沿之引导向探针1400的远端1402和生物样品。可将光脉冲从探针1400的远端1402引导至生物样品上，以便辐射该样品并产生响应光信号。探针1400或本文所述的任何探针的远端可包含正面窗口1404，例如，蓝宝石窗口。可将窗口1404配置用于减少激发传输元件103、一个或多个信号收集元件108，和/或探针1400的主体之间的空间的污染。选择性地或组合地，可将窗口1404配置用于在激发传输元件103的远端与样品之间提供较小的距离，以便增加达到样品并照射/辐射靶组织的较大区域的能量光束或脉冲的大小。可通过多个信号收集元件108收集响应光信号。可将响应光信号引导至光学组件(未示出)，以分解成如本文所述的光谱带。可将信号收集纤维108捆扎成多根纤维。多路信号分离器或其他光学组件可以是集成的，或在探针1400的外部。然后在由检测器检测之前，该光谱带可具有通过光学延迟元件施加的一种或多种时间延迟。光学延迟元件可以是集成的，或在探针1400的外部。检测器可在探针1400的外部。探针1400的组件可与本文所述的那些基本上相似。探针1400可被配置为手持式的。探针1400可包括手持式探针。探针1400可以是机器人控制的，例如，通过可商购的机器人手术***控制。探针1400可与抽吸套管相集成，例如，以允许(接近)实时地光谱指导的手术切除。
图15示出了包含低荧光环氧化物的用于时间分辨光谱法的探针的尖端的示意图。探针1500可与本文所述的任何探针基本上相似。本领域普通技术人员将理解，可根据期望将本文所述的探针的任意特征进行组合。探针1500的远端1502是突出显示的。探针1500可包含激发传输元件103和一个或多个(例如，六个)信号收集元件108。激发传输元件103和一个或多个信号收集元件108可与本文所述的那些基本上相似。在一些情况下，可选择用于制造光学探针如本文所述的任意探针的材料，以减少光穿过探针时材料自身的自体荧光。可用于将激发传输元件103与信号收集元件108结合的环氧化物1504可根据入射光的波长而提供较强的荧光信号。探针内环氧化物的荧光可阻碍或扰乱光学响应信号的收集和分析。在一些情况下，减少由用于结合纤维103、108的环氧化物1504生成的自体荧光的量可能是有利的。例如，可将环氧化物1504在用于结合纤维之前与炭黑或烟灰混合。环氧化物1504中的炭黑或烟灰可以吸收到达该环氧化物的光，由此降低来自环氧化物1504的荧光噪声。
图16A示出了包含与激发元件耦合的短通滤光片的用于时间分辨光谱法的探针的尖端的示意图。探针1600a可与本文所述的任何探针基本上相似。本领域普通技术人员将理解，可根据期望将本文所述的探针的任意特征进行组合。探针1600a的远端1602a是突出显示的。探针1600a可包含激发传输元件103和一个或多个(例如，六个)信号收集元件108。激发传输元件103和一个或多个信号收集元件108可与本文所述的那些基本上相似。在一些情况下，可选择用于制造光学探针如本文所述的任意探针的材料，以减少光穿过探针时材料自身的自体荧光。例如，当激发光脉冲沿着其传播时，激发传输元件103可以自发荧光。激发传输元件103的荧光可通过信号收集元件108与响应光信号一起加以收集，从而阻碍或扰乱光学响应信号并增加***的噪声量。在一些情况下，将激发传输元件103包覆有短通滤光片1603以防止激发传输元件103的自体荧光影响从组织所收集的响应光信号可能是有利的。
图16B示出了具有包含短通滤光片的蓝宝石窗口的用于时间分辨光谱法的探针的尖端的示意图。探针1600b可与本文所述的任何探针基本上相似。本领域普通技术人员将理解，可根据期望将本文所述的探针的任意特征进行组合。探针1600b的远端1602b是突出显示的。探针1600b可包含激发传输元件103和一个或多个(例如，六个)信号收集元件108。激发传输元件103和一个或多个信号收集元件108可与本文所述的那些基本上相似。作为如图16A所述包覆激发传输元件103的替代方案或与其组合，在样品与激发传输元件103之间设置短通滤光片1606以便防止激发传输元件103的自体荧光影响从组织所收集的响应光信号可能是有利的。例如，可在探针1600b的远端1602b处设置位于激发传输元件103与样品之间的其中具有短通滤光片1606的蓝宝石窗口1604。
图17示出了时间分辨荧光光谱法***的示意图。该***可用于采用实时或接近实时的时间分辨荧光光谱法来表征生物样品。该***可包含激发信号传输元件103、光源100、至少一个信号收集元件108，和光学组件，如一个或多个光谱滤光片1702。激发信号传输元件103和至少一个信号收集元件108可在探针1700中耦合在一起，该探针1700可与本文所述的任意探针基本上相似。探针1700可与抽吸套管1701相集成，例如，以允许(接近)实时地光谱指导的手术切除。该***可包含如本文所述的光学延迟装置或元件1705、检测器106、计算机或处理器113、数字转换器、光电二极管、检测器门或同步触发机构的一种或多种。该***可进一步包含电压门控衰减器1706和/或前置放大器1707。激发信号传输元件103、光源100、至少一个信号收集元件108、检测器106、数字转换器、光电二极管、检测器门，以及同步触发机构可与本文所述的那些基本上相似。光学延迟装置1705可与本文所述的那些基本上相似，例如，包含不同长度的多根纤维或纤维束以便为每个光谱带引入时间延迟。
光源100可被配置用于生成预定激发波长的光脉冲或连续光束。可通过激发信号传输元件103例如光学纤维将光脉冲引导向生物样品，例如，患者脑部。通过光脉冲的激发可导致生物样品101产生响应光信号，该光信号可通过一个或多个信号收集元件108来收集。例如，可将36个信号收集元件108捆绑在一起，以收集响应光信号。激发信号传输元件103可为如所示的36根收集纤维108的束中的中央纤维。可将连接器1703用于将36根纤维束内的每一根纤维与三个12-纤维束中对应的纤维耦合。然后可通过馈送至光学延迟装置1705中的收集纤维束耦合器1704将三个12-纤维束分解成六个6-纤维束。可通过信号收集元件108将响应光信号从样品引导向光学延迟装置1705，以便将时间延迟施加至由六个6-纤维束所收集的响应光信号。例如，六个6-纤维束的每一个均可具有与其他的6-纤维束的每一个不同的长度，以便生成如本文所述的时间延迟。该延迟纤维可为渐变折射率纤维，以便在纤维长度上维持响应光信号的带宽。然后，光学延迟装置1705可将时间延迟的响应光信号引导至配置用于将时间延迟的响应光信号分解成时间延迟的光谱带的光学组件。例如，可将时间延迟的响应光信号引导至如本文所述的多路信号分离器或滤光轮上。选择性地或组合地，光学延迟装置1705的延迟纤维可包含光学组件。例如，六个6-纤维束的每一个的近端均可包含光谱滤光片，使得每个6-纤维束均将时间延迟、波长分辨的光谱带引导至检测器106。选择性地或组合地，六个6-纤维束的每一个的近端均可涂覆有着色剂，以便生成时间延迟的光谱带。然后可将时间延迟的光谱带引导向检测器106并一次检测一个光谱带。对于每一个光谱带，检测器106可在下一光谱带到达检测器106之前记录光谱带的荧光衰减和荧光强度。如此，可将单个激发信号脉冲用于以实时或接近实时的方式从响应光信号来收集时间分辨(荧光衰减)信息以及波长分辨(荧光强度)信息二者。
本文所述的***、装置或探针的任一种均可进一步包含用于消融靶组织的消融元件。可响应如本文所述的靶组织的表征而将该靶组织予以消融。可将消融元件配置用于施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量的一种或多种，以消融靶组织。可将消融元件配置用于施加激光或光学能量以消融该靶组织。消融元件可包括激发信号传输元件。消融元件可包括本文所述的任一种探针。在两件式探针设计中，消融元件可包含近端激发信号传输元件和/或远侧信号传输元件。消融和时间分辨荧光光谱的组合可用于确定哪种组织应该在消融之前被消融，从而在消融发生时监测消融，并且/或者在消融结束后确认消融了正确的组织。在一些情况下，可将可商购的消融探针改进以从如本文所述的组织来收集荧光信号，并用于生成如本文所述的时间分辨的荧光光谱数据。
本文所述的***、装置和方法可结合图像导航的手术技术用于以(接近)实时的方式来表征生物样品，以便更好地告知外科医生。例如，可将生物样品表征为正常组织、良性组织或恶性组织，并且可将表征与在同一位置的生物样品图像对应，以便提供关于该位置的光谱信息，从而指导手术决策。可在使用期间追踪本文所述的时间分辨的光谱探针的位置。可将靶组织的表征与探针位置以及在所追踪位置处生物样品的图像对应。靶组织的成像可以在手术前、手术中和/或手术后进行。光谱信息可以与手术前、手术中和/或手术后的图像分开显示、一起显示或叠加显示。用于产生生物样品上靶组织位置的图像的成像装置可包括MRI扫描仪、CT扫描仪、PET扫描仪、光学相干断层摄影(OCT)装置、超声换能器、NMR成像仪或电阻抗层析成像(EIT)装置。该图像可包括MRI图像、超声图像、CT图像、OCT图像、NMR图像、PET图像或EIT图像。可在生物样品上的多个位置处重复组合的成像-光谱表征，或经如本文所述的多个位置进行扫描，以创建生物样品的至少一部分的较大图像，以例如定位肿瘤边缘。例如，可将通过本文所述的***、装置和方法获得的光谱信号与脑部手术期间通过神经导航生成的图像对应，以便通过更深的成像(神经导航)提供表面信息(光谱法)并更好地告知手术决定。
本文所述的时间分辨的荧光光谱***、装置和方法可主动或被动地与用于手术中定位的神经导航集成。例如，可将可商购的神经导航***，如可从爱尔兰都柏林的Medtronic plc.获得的Medtronic
Figure BDA0003807350080000501
***与本文所述的一种探针耦合，以便追踪该探针的位置。探头的被动整合可能需要在两个***之间没有其他数据交换的情况下利用
Figure BDA0003807350080000502
显示器的一部分来显示时间分辨的数据，而不是视频信号本身。探针的主动整合可能需要将神经导航与时间分辨的荧光光谱***组合，以生成组合数据。例如，本文所述的时间分辨的荧光光谱***可将数据发送至神经导航***，该神经导航***可随后将该数据显示在“SureTrak”坐标处的手术前MRI图像上。选择性地或组合地，该神经导航***可将“SureTrak”坐标发送至本文所述的***，该***可被配置用于相对于手术前MRI图像对本地软件中的坐标数据进行独立绘图。
本文所述的***、装置和方法可结合其他组织检测或诊断技术用于表征生物样品。例如，可结合组织学诊断对生物样品进行表征。可结合电阻抗分析对生物样品进行表征。例如，可结合时间分辨的光谱表征，对生物样品的特定组织类型的电阻抗特征的变化进行评估。例如，可将组织的电阻抗变化用于体内或离体检测组织样品中肿瘤细胞的存在，其可比时间分辨的光谱法的穿透性更深。本文所述的***、装置和方法可与任何其他组织检测或诊断方法组合使用，以便表征生物样品。
本文所述的***、装置和方法可用于在损伤后确定组织活力。组织样品的响应光信号的改变(根据所评估的分子相对于健康受试者的增加或减少)可指示组织活力。例如，能存活和非活的组织样品之间的NADH氧化还原状态可能不同，使得受损组织样品中NADH荧光的增加可能指示NADH积累和较差的组织活力。分析生物样品中更多分子之一可以区分多种组织类型，例如坏死组织、缺氧组织或瘢痕组织。
本文描述的***、装置和方法可用于监测生物样品中的细胞代谢。可在期望的时间段内周期性或连续地表征样品的细胞代谢，例如，细胞代谢可以以NADH氧化还原状态为特征。细胞代谢的连续监测可允许评估细胞活力和缺血条件下的细胞脆弱性。细胞代谢的连续监测可允许评估治疗剂的效果，以优化药物的治疗窗口。除了监测pH和/或氧气水平之外，细胞代谢的连续监测可用于确定细胞或组织样品的代谢状态。
本文所述的***、装置和方法可用于检测肿瘤和/或确定肿瘤的恶性度。可确定给定肿瘤类型与其正常组织对应物相比的波长衰减特症，并将其用于告知未知组织类型的表征。给定肿瘤类型的特征光谱响应对该肿瘤类型可以是特异性的，从而不仅允许将生物组织表征为癌性或非癌性，而且可以确定肿瘤类型和/或分级(例如，严重性)。本文所述的***、装置和方法可用于检测，举几个例子，已知的脑肿瘤靶向分子，如氯毒素(CTX)、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)或荧光素钠。基于从组织的总自体荧光中选择的参数，而不是基于已知分子的特异性荧光，有可能对组织进行表征。
本文所述的***、装置和方法可用于表征包含外源荧光分子的生物样品。本文所述的***、方法和装置可用于确定生物样品中外源荧光分子的浓度或分布的一种或两种。在至少一些情况下，在治疗患者时，可能对注射的荧光标记分子的分布和/或浓度是感兴趣的。例如，诊断或治疗决策能够确定注射的治疗剂在身体的特定部位中的位置或浓度是有利的。在另一个实例中，可能对注射荧光标记的肿瘤靶向分子是有兴趣的，以便确定手术切割之前、期间或之后肿瘤的边缘的位置。通过将时间延迟的光谱带与已知浓度的外源荧光分子的光谱带生成的数据进行比较，可以从该时间延迟的光谱带确定外源荧光分子的浓度。可以通过评估在生物样品上的一个或多个位置处获得的时间延迟的光谱带中由外源荧光分子发射的光谱的存在或不存在来确定外源荧光分子在生物样品内的分布。外源荧光分子可包括荧光标记的药物、荧光染料或荧光标记的组织标志物的一种或多种。外源荧光分子可包括与任何已知的药物、染料、组织标志物等缀合的任何已知的荧光部分或它们的任何组合。应当理解，用于表征生物样品的外源荧光分子的选择可取决于感兴趣的生物样品。当生物样品为待被表征为正常脑部、良性肿瘤或恶性肿瘤的脑部时，外源荧光分子可包括例如ICG标记的CTX、ICG标记的knottin、Cy5标记的knottin、Cy7标记的knottin、荧光缀合的肿瘤靶向抗体或荧光标记的肿瘤靶向部分。可将本文所述的***和装置配置用于检测感兴趣的特定荧光团。例如，可以调谐光源以激发注射的荧光标记的肿瘤标志物。可将多路信号分离器配置用于将响应光信号分解成最好地捕获荧光标签(例如，荧光团)的发射并且/或者去除组织自体荧光的波长范围。可将本文所述的***、装置和方法配置用于最佳地激发或检测生物样品中感兴趣的任何外源荧光团。
本文所述的***、装置和方法可用于以高度的特异性来表征生物样品。可以以约80％至约100％的特异性来表征生物样品。可以以约85％至约100％的特异性来表征生物样品。可以以约90％至约100％的特异性来表征生物样品。可以以约95％至约100％的特异性来表征生物样品。可以以约80％至约95％的特异性来表征生物样品。可以以约85％至约90％的特异性来表征生物样品。
本文所述的***、装置和方法可用于以高度的灵敏性来表征生物样品。可以以约80％至约100％的灵敏性来表征生物样品。可以以约85％至约100％的灵敏性来表征生物样品。可以以约90％至约100％的灵敏性来表征生物样品。可以以约95％至约100％的灵敏性来表征生物样品。可以以约80％至约95％的灵敏性来表征生物样品。可以以约85％至约90％的灵敏性来表征生物样品。
本文所述的***、装置和方法可用于检测响应光脉冲的激发时具有可检测的(例如，发射或吸收的)光谱的任何分子。例如，本文所述的***、装置和方法可用于检测荧光标记或未标记的任何分子，包括但不限于治疗剂、抗体、毒素、内毒素、外毒素、肿瘤标志物或其组合。例如，本文所述的***、装置和方法可用于检测未标记分子的固有荧光(例如，自体荧光)。
治疗剂可包括化疗剂。化疗剂的实例包括但不限于白蛋白结合的紫杉醇(nab-紫杉醇)、放线菌素、阿利维A酸、全反式视黄酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、贝伐珠单抗、Bexatotene、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、西妥昔单抗、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃坡霉素、厄洛替尼、依托泊甙、氟尿嘧啶、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊匹木单抗、伊立替康、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥沙利铂、紫杉醇、帕尼单抗、培美曲塞、利妥昔单抗、他氟泊苷、替尼泊甙、硫鸟嘌呤、托泊替坎、维A酸、戊柔比星、维罗非尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏林司他、罗米地辛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、克拉屈滨、氯法拉滨、氟尿苷、氟达拉滨、喷司他丁、丝裂霉素、伊沙匹隆、雌氮芥或它们的组合。
化疗剂可以是标记的或未标记的(例如，如果该化疗剂具有固有荧光)。例如，标签可为荧光标签。可与本文所述的***、装置和方法一起使用以标记治疗剂的荧光标签的实例包括但不限于吲哚花青绿(ICG)、姜黄素、罗丹明(如罗丹明B、罗丹明123、罗丹明6G或其变体)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素、荧光素、量子点或它们的组合。
包括治疗抗体在内的抗体可包括但不限于3F8、8H9、阿巴伏单抗、阿昔单抗、Actoxumab、阿达木单抗、阿德木单抗、Aducanumab、阿非莫单抗、阿托珠单抗、培化阿珠单抗、ALD518、阿仑珠单抗、Alirocumab、阿妥莫单抗喷替酸、Amatuximab、马安莫单抗、Anifrolumab、安芦珠单抗、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、Atinumab、Atlizumab、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、Benralizumab、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐珠单抗、Bezlotoxumab、比西单抗、Bimagrumab、Bivatuzumabmertansine、兰妥莫单抗、Blosozumab、Brentuximab vedotin、布雷奴单抗、Brodalumab、卡那奴单抗、美坎珠单抗、Cantuzumab ravtansine、Caplacizumab、卡罗单抗喷地肽、Carlumab、卡妥索单抗、cBR96-多柔比星免疫缀合物、西地珠单抗、培化舍珠单抗、西妥昔单抗、泊西他珠单抗、西妥木单抗、Clazakizumab、克立昔单抗、Clivatuzumab tetraxetan、可那木单抗、Concizumab、Crenezumab、达西珠单抗、达克珠单抗、Dalotuzumab、达雷木单抗、Demcizumab、地舒单抗、地莫单抗、阿度莫单抗、Drozitumab、Duligotumab、Dupilumab、Dusigitumab、依美昔单抗、依库珠单抗、埃巴单抗、依屈洛单抗、依法珠单抗、依芬古单抗、Eldelumab、依洛珠单抗、Elsilimomab、Enavatuzumab、培化恩莫单抗、Enokizumab、Enoticumab、Ensituximab、西依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄马索单抗、埃达珠单抗、Etrolizumab、Evolocumab、艾韦单抗、Fanolesomab、法拉莫单抗、法利珠单抗、Fasinumab、FBTA05、泛维珠单抗、非扎奴单抗、Ficlatuzumab、芬妥木单抗、Flanvotumab、芳妥珠单抗、Foralumab、福拉韦单抗、夫苏木单抗、Fulranumab、Futuximab、加利昔单抗、Ganitumab、更汀芦单抗、加维莫单抗、吉姆单抗奥佐米星、Gevokizumab、吉瑞昔单抗、Glembatumumab vedotin、戈利木单抗、Gomiliximab、Guselkumab、伊巴珠单抗、替伊莫单抗、Icrucumab、伊戈伏单抗、IMAB362、英西单抗、Imgatuzumab、Inclacumab、Indatuximabravtansine、英利昔单抗、伊诺莫单抗、伊珠单抗奥加米星、英妥木单抗、伊匹木单抗、伊妥木单抗、Itolizumab、Ixekizumab、凯利昔单抗、Lambrolizumab、Lampalizumab、来金珠单抗、来马索单抗、拉贝珠单抗、乐德木单抗、来沙木单抗、利韦单抗、Ligelizumab、林妥珠单抗、Lirilumab、Lodelcizumab、Lorvotuzumab mertansine、鲁卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗、Margetuximab、马司莫单抗、马妥珠单抗、Mavrilimumab、美泊珠单抗、美替木单抗、米拉珠单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、Mogamulizumab、莫罗木单抗、莫维珠单抗、Moxetumomab pasudotox、莫罗单抗-CD3、他那可单抗、Namilumab、他那莫单抗、Namatumab、那他珠单抗、奈巴库单抗、奈昔木单抗、奈瑞莫单抗、Nesvacumab、尼妥珠单抗、Nivolumab、巯诺莫单抗、Ocaratuzumab、奥瑞珠单抗、奥度莫单抗、奥法木单抗、Olaratumab、Olokizumab、奥马珠单抗、Onartuzumab、Ontuxizumab、莫奥珠单抗、奥戈伏单抗、Orticumab、奥昔珠单抗、Otlertuzumab、Oxelumab、Ozanezumab、Ozoralizumab、帕昔单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、Pankomab、帕诺库单抗、Parsatuzumab、帕考珠单抗、Pateclizumab、Patritumab、Pemtumomab、Perakizumab、培妥珠单抗、培克珠单抗、Pidilizumab、Pinatuzumab vedotin、平妥单抗、Placulumab、Polatuzumab vedotin、Ponezumab、普立昔单抗、Pritoxaximab、普立木单抗、PRO 140、Quilizumab、雷妥莫单抗、Radretumab、雷韦单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、雷昔库单抗、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、Roledumab、Romosozumab、罗利珠单抗、罗维珠单抗、芦利珠单抗、Samalizumab、Sarilumab、沙妥莫单抗喷地肽、Secukinumab、Seribantumab、Setoxaximab、司韦单抗、SGN-CD19A、SGN-CD33A、西罗珠单抗、西法木单抗、司妥昔单抗、Simtuzumab、西利珠单抗、Sirukumab、苏兰珠单抗、Solitomab、Sonepcizumab、松妥珠单抗、司他芦单抗、硫索单抗、Suvizumab、Tabalumab、Tacatuzumab tetraxetan、他度珠单抗、他利珠单抗、他尼珠单抗、帕他莫单抗、替非珠单抗、阿替莫单抗、替妥莫单抗、替奈昔单抗、替利珠单抗、替妥木单抗、TGN 1412、Ticilimumab(曲美木单抗)、替加珠单抗、Tildrakizumab、TNX-650、托珠单抗(atlizumab)、托利珠单抗、托西莫单抗、Tovetumab、Tralokinumab、曲妥珠单抗、TRBS07、Tregalizumab、曲美木单抗、西莫白介素单抗、妥韦单抗、Ublituximab、Urelumab、乌珠单抗、乌司奴单抗、Vantictumab、伐利昔单抗、Vatelizumab、维多珠单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、Vesencumab、维西珠单抗、伏洛昔单抗、Vorsetuzumab mafodotin、伏妥木单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、Zatuximab、齐拉木单抗、阿佐莫单抗或其组合。
抗体可以是标记或未标记的。例如，标签可为荧光标签。可与本文所述的***、装置和方法一起使用以标记治疗剂的荧光标签的实例包括但不限于ICG、姜黄素、罗丹明(如罗丹明B、罗丹明123、罗丹明6G或其变体)、GFP、萤光素、荧光素、量子点或其组合。
毒素包括但不限于α毒素、炭疽毒素、细菌毒素、白喉毒素、外毒素、百日咳毒素、志贺毒素、志贺样毒素、热稳定肠毒素、通道形成毒素、真菌毒素、霍乱毒素、蝎毒毒素、氯毒素、破伤风毒素或其组合。
毒素可以是标记或未标记的。例如，标签可为荧光标签。可与本文所述的***、设备和方法一起使用以标记治疗剂的荧光标签的实例包括但不限于ICG、姜黄素、罗丹明(如罗丹明B、罗丹明123、罗丹明6G或其变体)、GFP、萤光素、荧光素、量子点或其组合。
可采用本文所述的***、装置和方法来表征蛋白质，例如，细胞表面蛋白。可利用与细胞表面标志物结合的抗体(例如，标记或未标记的抗体)来检测蛋白质。可采用与感兴趣的蛋白质结合的siRNA(例如，标记或未标记的siRNA)检测蛋白质。可利用本文所述的***、方法和装置来检测的蛋白质的实例包括但不限于4-1BB、5T4、腺癌抗原、α-胎蛋白、膜联蛋白(例如，膜联蛋白A1、A2、A5)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人类散射因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-1、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、***I受体、整联蛋白α5βI、整联蛋白αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、***癌细胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、生腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR-2、波形蛋白或其组合。其他的实例包括但不限于AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、CD125、CD147(basigin)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fe区、IL-l、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受体、整联蛋白α4、整联蛋白α4β7、Lama glama、LFA-1(CDlla)、MEDI-528、肌肉生成抑制蛋白、OX-40、rhuMAbβ7、scleroscin、SOST、TGFβ1、TNF-α、VEGF-A、β淀粉样蛋白、MABT5102A、L-1β、CD3、C5、心肌肌球蛋白、CD41(整联蛋白α-IIb)、纤维蛋白II，β链、ITGB2(CD18)、鞘氨醇-1-磷酸酯、炭疽毒素、CCR5、CD4、凝聚因子A、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、内毒素、大肠杆菌蛋白、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、HIV-1、Hsp90、甲型流感血凝素、脂磷壁酸、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、狂犬病病毒糖蛋白、呼吸道合胞病毒、TNF-α、Lewis Y和CEA抗原、Tag72、叶酸结合蛋白或其组合。
蛋白质可以是标记或未标记的。例如，标签可为荧光标签。可与本文所述的***、设备和方法一起使用以标记治疗剂的荧光标签的实例包括但不限于ICG、姜黄素、罗丹明(如罗丹明B、罗丹明123、罗丹明6G或其变体)、GFP、萤光素、荧光素、量子点或其组合。
本发明提供了包括但不限于以下实施方式：
1.一种用于对生物样品进行分类或表征的探针***，所述***包括：
远侧部；
与所述远侧部可拆卸地耦合的近侧部；
近侧传输元件，该近侧传输元件安置在所述近侧部中并被配置用于传送光激发信号；
远侧传输元件，该远侧传输元件安置在所述远侧部中并与所述近侧传输元件相耦合，所述远侧传输元件被配置用于从所述近侧传输元件接收所述光激发信号并将所述光激发信号传送至所述生物样品，其中所述生物样品响应于所述光激发信号而生成响应光信号，并且所述响应光信号由所述远侧传输元件接收；
信号收集元件，该信号收集元件安置在所述近侧部中并与所述远侧传输元件相耦合，所述信号收集元件被配置用于从所述远侧传输元件接收所述响应光信号；以及
光学组件，该光学组件被配置用于从所述信号收集元件来接收所述响应光信号并将所述响应光信号分解成多个光谱带，其中所述生物样品响应于所述光谱带而得到表征。
2.如实施方式1所述的***，其中所述光学组件包括光学延迟元件和多路信号分离器，其中所述多路信号分离器包括被配置用于将所述响应光信号分解成所述光谱带的波长分解纤维，并且其中所述光学延迟元件被配置用于向所述光谱带提供一种或多种时间延迟。
3.如实施方式1所述的***，其中所述光学组件包括包含多个光谱滤光片的滤光轮。
4.如实施方式1所述的***，其中所述远侧部是一次性且可更换的。
5.如实施方式1所述的***，其中远侧部包含手持式探针。
6.如实施方式1所述的***，其中所述远侧部包含消融元件。
7.一种用于对生物样品进行分类或表征的探针，所述探针包括：
与近侧部可拆卸地耦合的远侧部，所述近侧部包含近侧传输元件，该近侧传输元件安置在所述近侧部中并被配置用于传送光激发信号；以及
远侧传输元件，该远侧传输元件安置在所述远侧部中并与所述近侧传输元件相耦合，所述远侧传输元件被配置用于从所述近侧传输元件接收所述光激发信号并将所述光激发信号传送至所述生物样品，其中所述生物样品响应于所述光激发信号而生成响应光信号，并且所述响应光信号由所述远侧传输元件接收，
其中安置在所述近侧部中的信号收集元件与所述远侧传输元件相耦合，并且从所述远侧传输元件接收所述响应光信号，
其中光学组件从所述信号收集元件接收所述响应光信号，并且将所述响应光信号分解成多个光谱带，并且
其中所述生物样品响应于所述光谱带而得到表征。
8.如实施方式7所述的探针，其中所述光学组件包括光学延迟元件和多路信号分离器，其中所述多路信号分离器包括被配置用于将所述响应光信号分解成所述光谱带的波长分解纤维，并且其中所述光学延迟元件被配置用于向所述光谱带提供一种或多种时间延迟。
9.如实施方式7所述的探针，其中所述光学组件包括包含多个光谱滤光片的滤光轮。
10.如实施方式7所述的探针，其中所述近侧部或所述远侧部中的一个或多个包含耦合元件，所述耦合元件将所述远侧传输元件耦合到所述近侧传输元件以及所述信号收集元件。
11.如实施方式7所述的探针，其中所述远侧传输元件包含用于将所述光脉冲从所述近侧传输元件引导至所述生物样品的中央纤维，以及用于收集来自所述生物样品的所述响应光信号的至少一根***纤维。
12.如实施方式11所述的探针，其中所述远侧传输元件包含用于减少所述中央纤维与***纤维之间空间的污染的正面窗口。
13.如实施方式7所述的探针，其中所述至少一根***纤维包括多根纤维。
14.如实施方式7所述的探针，其中远侧部被配置成手持式。
15.如实施方式7所述的探针，其中远侧部包含抽吸套管。
16.如实施方式7所述的探针，其中所述远侧部是一次性的。
17.如实施方式7所述的探针，其中所述远侧部包含消融元件。
18.如实施方式17所述的探针，其中所述消融元件被配置用于施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量中的一种或多种，以消融靶组织。
19.如实施方式18所述的探针，其中所述消融元件被配置用于施加激光能量或光学能量以消融所述靶组织，并且其中所述消融元件包含所述远侧信号传输元件。
20.一种用于对生物样品进行分类或表征的方法，所述方法包括：
用预定波长的光脉冲以预定的图案来辐射生物样品，以导致所述生物样品产生响应光信号；
收集来自所述生物样品的所述响应光信号；以及
在预定波长范围内分解所述响应光信号以获得光谱带，
其中所述生物样品响应所述光谱带而得到表征。
21.如实施方式20所述的方法，其进一步包括利用时间延迟机构向所述光谱带施加至少一种时间延迟。
22.如实施方式20所述的方法，其中分解所述响应光信号包括利用多路信号分离器来分解所述响应光信号。
23.如实施方式20所述的方法，其中分解所述响应光信号包括利用滤光轮来分解所述响应光信号。
24.如实施方式20所述的方法，其中所述响应光信号包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱的一种或多种。
25.如实施方式20所述的方法，其中所述生物样品被表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。
26.如实施方式20所述的方法，其中所述生物样品包括脑组织。
27.如实施方式20所述的方法，其中所述生物样品包括靶组织，并且其中所述方法进一步包括消融所述靶组织。
28.如实施方式27所述的方法，其中所述靶组织响应所述生物样品的表征而得以消融。
29.如实施方式27所述的方法，其中消融所述靶组织包括向所述靶组织施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量中的一种或多种。
30.如实施方式27所述的方法，其中利用探针来消融所述靶组织，所述探针被配置用于利用所述光脉冲来辐射所述生物样品并收集所述响应荧光信号。
实验实施例
图18A示出了用于持续监测离体脑部样品中的NADH的时间分辨光谱***的示意图。可评估NADH水平的变化，以确定脑部样品响应氧气耗尽、神经保护药物刺激及其他刺激时的代谢状态变化。在有氧呼吸条件下ATP生成期间，NADH被氧化成NAD+。在低氧条件下，例如，在中风后的缺氧或局部缺血区域中，NADH在细胞中积累，持续的氧气耗尽可能导致细胞死亡和NADH的降解。不同的NADH状态和水平可允许评估缺血环境中细胞的活力和脆弱性。通过测量来自NADH和NAD+的荧光发射来评估NADH水平的波动，两者都在UV光谱中强烈吸收但具有不同的荧光特征。NADH在约440nm和约460nm附近发强烈荧光，这取决于其是否与细胞色素结合。NAD+是非荧光的。可将该***配置用于检测小于约452nm的光谱带和大于约452nm的光谱带，以便分别监测脑部样品内的结合NADH群体和游离NADH群体。
该***包含以1KHz运行的Q-switched ND：YaG激光器(Teem PhotonicsPNVM02510)1804，其以约350nm的波长和约400ps全宽半最大值(FWHM)的脉冲宽度来发射激光脉冲。为了防止样品中的NADH被光漂白，激光脉冲的总能量不超过5uJ。使用定制的三叉光学探针1800将激发光传递至组织1801。探头1800包含用于传递激发光的由12根200um纤维围绕的600um中央纤维1805，以收集响应荧光信号。将十二根收集纤维的每一个彼此捆扎在一起，从而形成各六根纤维的两个束1806a，1806b。将一束收集纤维1806a耦合至每100ms监测荧光光谱的光谱仪(Ocean Optics，Maya)。另一束收集纤维1806b经由准直透镜1813耦合至多路信号分离器1808。多路信号分离器1808包含长通滤光片1809以滤掉低于约370nm的光。经过滤的光随后被分束器1810以约452nm的波长所分解，以生成小于约452nm的光谱带1811a(例如，结合的NADH)和超过约452nm的光谱带1811b(例如，游离NADH)。然后通过一组准直器1812(每个光谱带一个)收集光谱带1811a、1811b，并将其馈送至不同长度的光学延迟纤维中，以便生成如本文所述的时间延迟的光谱带。通过MCP-PMT和光谱仪二者记录时间延迟的光谱带。
收集兔脑，并将其在冷的富含氧气的Kreb-Ringer溶液1802中运送到实验室。分离出皮质1801，并将其置于伴随95％O2和5％CO2连续鼓泡1803的Kreb-Ringer溶液1802中，以维持组织活力。在组织1801上调整探针1800以利用本文所述的方法来记录荧光信号。记录结合和游离的NADH基线信号，直到来自组织样品1801的荧光达到平衡并稳定至稳态。约30分钟后，将测量剂量的50nM鱼藤酮添加1820至Kreb-Ringer浴中。鱼藤酮阻断NADH与线粒体中的细胞色素的结合。随后以10分钟的间隔添加额外剂量1822、1824的鱼藤酮(分别为1uM和50uM)。
图18B示出了用于持续监测离体脑部样品中的NADH的实验的结果。在大约两小时的时间段内，响应所添加的刺激，以接近实时(大约每100ms)的方式映射游离的NADH和结合的NADH二者的浓度。由于NADH消耗阻断导致NADH的积累，50nM鱼藤酮的添加1820提高了NADH水平。增加的鱼藤酮浓度1822、1824相似地导致所检测到的荧光的进一步增加。在约65分钟时，气体被停止1826，导致NADH水平响应缺氧而升高，直到气体在约20分钟后重新开启1828。
图19A示出了中风后测量了NADH水平并表征了细胞活力的离体脑部中的样品位置。除了实时或接近实时地监测NADH水平变化和代谢状态之外，本文的***、装置和方法可用于表征组织在缺血性损伤后是活的或非活的。缺血性中风后脑组织的变化可以改变NADH水平，并且整个组织区域的NADH评估可允许评估可能由于缺乏凋亡而在休克中但尚未经历凋亡的活细胞数目。可以抢救这样的细胞，并且可将对组织的损伤程度的了解用于告知治疗。在已经发生缺血性中风的脑组织中，存在两个主要损伤区-通常为坏死组织的核心缺血区，和含有缺血但仍然活的组织的缺血半影区。治疗的一个目标可以是减少半影区的大小，同时抢救尽可能多的神经元。在整个半影区域监测NADH可允许评估各种治疗干预的有效性。可利用本文所述的***、方法或装置在整个半影区域进行这样的监测。选择性地或组合地，如图19A所示，可利用图18A所述的***在半影区域中感兴趣的非连续位置(以1-6表示)处进行这样的监测。
采用兔脑中风模型，其中通过在大脑前动脉中注射凝块而在脑部中诱导中风。测试兔子的神经损伤，并在确认损伤后将其处死。收集兔脑，并将其在富含氧气的Kreb-Ringer***液中运送到实验室。分离出梗塞的皮质1900，并将其置于伴随95％O2和5％CO2连续鼓泡的Kreb-Ringer溶液中，以维持组织活力。在组织上调整探针以利用本文所述的方法来记录NADH荧光信号。在皮质边缘的位置1901处取得荧光强度的第一读数，然后将探针在表面上移动以在位置1902处取得第二读数，依此类推，直到取得位置1906处的第六读数。然后在将活细胞变红时，将组织浸没在TTC(2,3,5-三苯基四氮唑)溶液中。TTC是测试细胞活力的金标准，并且被用于确认基于荧光强度的活力表征。图19B示出了图19A与用TTC治疗后的皮质1900的亮视野图像的叠加。图19C示出了所测量的每个样品位置1901-1906的相对荧光强度。虽然TTC摄入显示出能存活组织与非活组织之间的急剧变化，但荧光强度数据显示出NADH自体荧光从健康组织(位置1901)到死亡组织(位置1906)下降的平滑梯度，表明TTC将已经确定死亡时活细胞的存在。因此，荧光强度数据能够检测TTC所错过的不健康组织中的活细胞。当对抢救感兴趣的活细胞时，这样的灵敏测量可用于比当前方法更好地告知治疗决策。
图20A-20C示出了暴露于光中20分钟后各个浓度MTX的荧光强度。许多抗癌药物具有最有效的治疗窗口(例如，组织或血浆浓度范围)。在该范围之外，药物在高浓度下可能对健康组织有毒性，并且/或者在低浓度下失去功效。对于给予的剂量，血浆、肿瘤组织或健康组织中的药物浓度可由于患者身高、体重、代谢和种族的变化而改变。尽管存在这些已知的药物浓度变化的贡献因素，但药物剂量目前是基于患者的重量和药物的标准药物动力学特性来计算的。本文所述的***、装置和方法可用于快速且廉价地确定血浆和/或感兴趣的组织中的药物水平或浓度，以便允许根据患者来优化给患者的剂量。除了确定浓度外，可以评估感兴趣的组织中药物的分布，以便确定药物是否到达该组织以及药物到达该组织的程度。该药物可以是荧光的，或以其他方式响应光学激发。可对药物进行荧光标记，以便促进使用本文所述的方法、***和装置的表征。
例如，甲氨喋呤(MTX)是一种在被UV光刺激时转化为荧光形式的抗癌药物。在琼脂中制备了从25ug至25ng的MTX系列稀释，并将其暴露于UV光下持续20分钟。允许发生从低荧光MYX形式向荧光MTX形式的转化直至达到饱和水平(约20分钟)。监测了琼脂凝胶的荧光密度，并利用图18A的装置随暴露时间测量了荧光MTX的积累。图20A示出了20分钟后，250ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、5ug/ml和2.5ug/ml的MTX浓度所达到的最终强度。图20B示出了超过20分钟时间段的2.5mg/ml、0.5mg/ml、250ug/ml、50ug/ml和25ug/ml MTX的荧光强度时间进程。图20C示出了超过20分钟时间段的5ug/ml、2.5ug/ml、0.5ug/ml、250ng/ml和25ng/mlMTX的荧光强度时间进程。暴露于UV光20分钟后MTX的荧光强度是琼脂凝胶中MTX浓度的良好指征。
图21A-21C示出了说明生物样品的荧光衰减可用于确定已知荧光团浓度的图表。图21A和21B分别示出了K4-201和K4-503被UV光激发时在一段波长范围内的消光系数(虚线)和荧光(实线)。如图21A和图21B分别示出的，K4-204和K4-503在被UV光激发时具有非常相似的荧光发射光谱。采用如图18A中所述的实验***，用UV光激发了不同浓度的K4-201和K4-503溶液，并记录了响应荧光衰减信号。所分析的浓度在表1中示出。
表1示出了所评估的K4-201与K4-503混合物的浓度。
表1
K4-204 K4-503
0％ 100％
10％ 90％
20％ 80％
30％ 70％
40％ 60％
50％ 50％
60％ 40％
70％ 30％
80％ 20％
90％ 10％
100％ 0％
图21C示出了混合有K4-503的不同浓度K4-204的荧光衰减曲线的图表，在虚线箭头的方向上从100％K4-204到100％K4-503。各个混合物浓度的每一个的荧光衰减曲线均是不同的。因此，这些数据可用作确定K4-204与K4-503的未知混合物的浓度的标准。可使用相似的给药或混合实验来确定感兴趣的其他荧光团混合物的荧光谱，例如，以辅助复杂生物样品的表征。
图22A-22D示出了来自用于检测脑肿瘤的时间分辨光谱***的分类训练(classification training)的结果的图表。在许多脑肿瘤中观察到的代谢状态改变可导致包括氨基酸如酪氨酸和色氨酸、结构蛋白轻胶原和弹性蛋白以及/或者酶辅因子如NADH和FAD等在内的内源荧光分子的荧光发射的变化。一些脑部中最常见的荧光团包括NADH、FAD、脂色素和卟啉。大多数内源荧光团被约280nm至约450nm范围内的光激发。利用UV辐射的脑组织激发可用于将该组织表征为肿瘤或正常组织，并且基于该组织类型的不同光谱衰减和光谱强度性质，可进一步表征肿瘤的等级和严重性。通常，当用UV光激发时，与正常组织相比，肿瘤具有较低的荧光发射。
图22A示出了采用六通道时间分辨荧光光谱法的正常皮质(NC)、白质(WM)和胶质母细胞瘤(GBM)组织的荧光衰减曲线。每个通道包含如图4所示的光谱带，该光谱带是采用包含与图2基本类似的多路信号分离器的***从如本文所述的响应光信号分解的。对于每个通道，示出了整个荧光衰减曲线以及一部分衰减的放大(blown-up)插图。用约355nm的UV光激发脑组织样品，并记录了组织响应自体荧光的衰减。利用配置用于收集六个光谱带的时间分辨光谱***进行实验。该***包含以1KHz运行的Q-switched ND：YaG激光器(TeemPhotonics PNVM02510)，其以约350nm的波长和约400ps FWHM的脉冲宽度发射激光脉冲。将光脉冲的能量输出调整为5uJ。利用定制的可灭菌三叉光学探针将激发光传递至组织。除了由刚性不锈钢管制成的7cm远侧部之外，探头在其整个长度(约3米)上是柔性的，这有助于探针的安装和微操作。在探针远端的前方加入具有在对立侧的两个狭缝的垫片，以允许探针与组织接触，并同时与组织保持约3mm的固定距离，以便改善光收集并稳定探针。垫片上的两个狭缝使得外科医生能够应用抽吸管并维持明亮的视野场。探头包含用于传递激发光的中心600um激发纤维，该中心纤维由收集响应荧光信号的12根200um收集纤维所围绕。激光通过标准的SMA连接器与探针的激发纤维耦合。将十二根收集纤维捆绑在一起，并组合成单根600um纤维。激发纤维与收集纤维之间的中心到中心的间隔为480um。收集纤维的远端形成直线，以便促进与多路信号分离器的耦合。收集纤维以10°的角度倾斜，以便增加激发与收集之间的重叠，从而实现较小的组织与探针距离。收集纤维与多路信号分离器耦合，该多路信号分离器将响应光信号分解成七个如本文所述的光谱带(包括包含激发波长的带)。然后通过一组准直器(每个光谱带一个)收集光谱带，并将其馈送至不同长度的光学延迟纤维中，以便生成如本文所述的时间延迟的光谱带。光学延迟纤维被配置成具有从约5英尺的第一纤维开始的50英尺的长度增量。通过MCP-PMT(Photek 210型，上升时间80ps)记录时间延迟的光谱带。在通过数字转换器(SPDevices ADQ-108，8Giga-样品/秒)数字化之前，通过快速前置放大器(Photek PA200-10型，2GHz)将所记录的数据放大，并将其传输至计算机处理器。利用如本文所述的定时和同步电路来控制该***。配置该***，使得其被包含在标准尺寸的内窥镜盒(cart)中。利用医疗级隔离变压器(
Figure BDA0003807350080000671
ISB-170A)将***组件与主电源屏蔽，以确保较低的电子噪声。***的总体时间分辨率约为150ps。
在已知疾病状态的一系列分类训练样品(如通过组织学确定的)之后，训练该***将未知样品分类为正常皮质、白质或GBM。从正在经历GBM手术切除的九名患者取得训练样品。利用与图6所述的探针基本类似的定制纤维光学探针将UV光传递至肿瘤部位。使探针定位在感兴趣的区域上，并对脑组织进行光谱学询问。在该部分进行活检，并进行组织病理学分析来确认诊断并验证分类结果。训练样品包括10个正常皮质样品、12个白质样品，和13个GBM样品。图22A示出了每种样品类型的平均荧光衰减曲线。
当表征未知样品时，不同测量波长中所计算的荧光衰减函数可包含不同的荧光成分。每种成分可具有单指数、双指数或多指数的衰减函数。为了将复杂组织分类为肿瘤或正常组织，常规的荧光寿命标量值可能尚显不足。为解决这一问题，可将不同波长范围(即，用于不同光谱带的)内的衰减函数转化为具有mxn维度的二维光谱寿命矩阵(SLM)，其中m为测量中所用的光谱带的数目，而n为所用的衰减点的数目。例如，当评估了六个光谱带时，m可为六，并且当不同的衰减点覆盖快速、平均和缓慢衰减响应时，n可为三。可以得出每个响应光信号的SLM，并将其用作分类算法的输入。
对于训练样品，从针对每个检测通道所检测到的光谱带衰减数据确定一组参数τ(0.1)-τ(0.7)。图22B示出了从代表性荧光衰减曲线得出的参数的示意图。利用Laguerre去卷积评估了每个光谱带的衰减。确定了每个样品的每个光谱带的参数τ(0.1)-τ(0.7)，并将其用于准确地确定荧光衰减的快速、正常和缓慢成分，而不是将完整的荧光衰减曲线用于表征。通过分别在0.2、0.4和0.6强度水平上将归一化的fIRF交叉，从衰减点得出三个寿命值τ(0.2)、τ(0.4)和τ(0.6)，并分别将其作为缓慢、正常和快速衰减的代表用作分类算法的输入。图22C示出了在每个通道从训练样品得出的寿命参数。误差线含有六个光谱带中的寿命值的平均值和标准偏差。正常皮质表现出比白质或GBM更快的衰减。
图22D示出了所得出的参数是如何用于区分训练样品中的组织类型以创建分类算法的。该***生成该组织样品的光谱寿命(衰减)信息，该信息被机器训练算法用作签名以供组织分类。将具有三组分类器集的线性判别分析(LDA)用于分析所收集的六个光谱带的荧光衰减，以将训练组之间的统计学意义的差别最大化，其中输出被发送至任一训练组。例如，NC分类器将WM和GBM测量分在“非NC”组中。WM和GBM组采用相同的过程，其中“非WM”包括NC和GBM而“非GBM”则包括WM和NC。这些子分类器能够区分训练组，并将训练样品分类为正常皮质、白质或GBM。
表2示出了训练样品的分类准确率。采用时间分辨光谱法将来自5名患者的46个组织样品分类为NC(n＝25)、WM(n＝12)或GBM(n＝9)，并通过利用组织病理学予以确认。几乎每个样品的分类都是准确的，只有一个假阴性。
表2
Figure BDA0003807350080000681
图23-26示出了初步体内组织表征和诊断实验的结果。利用如图22A-22D中训练的时间分辨光谱***进行实验。对于每个实验位置，要求外科医生进行初步诊断。然后将纤维光学探针定位在实验位置的患者的暴露脑组织上方3mm处，并如本所述收集时间分辨的光谱学数据。利用由训练集生成的分类系数(例如，分类器)，如图22A-22D一样将样品数据分类为WM/非WM、NC/非NC或GM/非GBM，以便表征该组织。然后将样品的分类数据紧挨着训练集绘图，以便将组织表征可视化。样品数据以围绕有虚线圆圈的方式示出，以便将其与训练数据点相区分。在光谱学分析后，在实验位置对组织进行活检，并进行组织病理学分析。将该***用于根据图22A-22D中确定的训练分类器将组织分类为NC、WM或GBM。
图23示出了脑肿瘤实验1中组织表征的结果。外科医生最初将组织位置诊断为肿瘤。活检样品位置的组织学分析揭示，该区域为正常皮质组织。如先前所述对患者进行光谱学评估，并且时间分辨的分类以极高的置信度将该位置表征为正常白质(WM)。
图24示出了脑肿瘤实验2中组织表征的结果。外科医生最初将组织位置诊断为肿瘤。神经导航也显示该位置为肿瘤。活检样品位置的组织学分析揭示，该区域为正常白质。光谱学分析和时间分辨的分类以极高的置信度将该位置表征为正常WM。
图25示出了脑肿瘤实验3中组织表征的结果。外科医生最初将该组织位置诊断为除GBM外的一些物质，虽然其不完全正常，具有确定的一些胶质变性和坏死。活检样品位置的组织学分析揭示，该区域为GBM。光谱学分析和时间分辨的分类以极高的置信度将该位置表征为GBM。
图26示出了脑肿瘤实验4中组织表征的结果。外科医生最初将组织位置诊断为肿瘤。神经导航也显示该区域为GBM。活检样品位置的组织学分析揭示，该区域为GBM。光谱学分析和时间分辨的分类以极高的置信度将该位置表征为GBM。
图27-30示出了利用五种子分类器的分类训练的结果。在多个位置对十名患者进行了评价，总计测定了75个组织样品。利用配置用于收集六个光谱带的时间分辨光谱***进行实验。该***与本文所述的用于体内测量的***基本相似。该***包含以1KHz运行的Q-switched ND：YaG激光器(Teem Photonics PNVM02510)，其以约355nm的波长和约350psFWHM的脉冲宽度发射激光脉冲。将光脉冲的能量输出调整为5uJ。利用定制的可灭菌三叉光学探针将激发光传递至组织。除了由刚性不锈钢管制成的7cm远侧部之外，探头在其整个长度(约3米)上是柔性的，这有助于探针的安装和微操作。在探针远端的前方加入具有在对立侧的两个狭缝的垫片，以允许探针与组织接触，并同时与组织保持约3mm的固定距离，以便改善光收集并稳定探针。垫片上的两个狭缝使得外科医生能够应用抽吸管并维持明亮的视野场。探头包含用于传递激发光的中心600um激发纤维，该中心纤维由收集响应荧光信号的12根200um收集纤维所围绕。激光通过标准的SMA连接器与探针的激发纤维耦合。将十二根收集纤维捆绑在一起，并组合成单根600um纤维。激发纤维与收集纤维之间的中心到中心的间隔为480um。收集纤维的远端形成直线，以便促进与多路信号分离器的耦合。收集纤维以10°的角度倾斜，以便增加激发与收集之间的重叠，从而达到较小的组织与探针的距离。收集纤维与多路信号分离器耦合，该多路信号分离器将响应光信号分解成七个如本文所述的光谱带(包括包含激发波长的带)。然后通过一组准直器(每个光谱带一个)收集光谱带，并将其馈送至不同长度的光学延迟纤维中，以便生成如本文所述的时间延迟的光谱带。光学延迟纤维被配置成具有从约5英尺的第一纤维开始的50英尺的长度增量。通过MCP-PMT(Photek 210型，上升时间80ps)记录时间延迟的光谱带。在通过数字转换器(SPDevicesADQ-108，7Giga-样品/秒，8位分辨率)数字化之前，通过快速前置放大器(Photek PA200-10型，2GHz)将所记录的数据放大，并将其传输至计算机处理器。利用如本文所述的定时和同步电路来控制该***。配置该***，使得其被包含在标准尺寸的内窥镜盒(cart)中。利用医疗级隔离变压器(
Figure BDA0003807350080000701
ISB-170A)将***组件与主电源屏蔽，以确保较低的电子噪声。***的总体时间分辨率约为150ps。用于记录每个样品的荧光的时间约为1秒，并且随后紧接着确定了具体的肿瘤分类。
组织的分析被最初建立为对如本文所述的三种组织类型——NC、WM和GBM进行分类。然而，根据75个组织样品的组织荧光发射数据，鉴别出白质(WM1和WM2)和神经胶质瘤(GBM1和GBM2)的两个不同的子类。因此，三种组织类型代表了用于分类算法的训练的五种分类器。该***生成该组织样品的光谱寿命(衰减)信息，该信息被机器训练算法用作签名以供组织分类。将具有五组分类器集的线性判别分析(LDA)用于分析所收集的六个光谱带的荧光衰减，以将训练组之间的统计学意义的差别最大化，其中输出被发送至任一训练组。例如，NC分类器将WM1、WM2、GBM1和GBM2测量分在“非NC”组中。针对WM1、WM2、GBM1和GBM2组采用相同的过程。例如，“非WM1”包括NC、WM2、GBM1和GBM2。这些子分类器能够区分训练组，并将训练样品分类为正常皮质、WM1、WM2、GBM1或GBM2。
图27A-27F示出了表征WM1与WM2以及GBM1与GBM2的特征的代表性组织学图像。在20X下对载玻片进行成像。WM1样品(参见图27A)显示没有水肿，细胞构成较低。观察到神经元具有核仁，带有蓝色细胞质。这些正常细胞2701略大于具有“模糊”外观的肿瘤细胞2702。WM1的另一实例(参见图27B)显示出罕见的非典型核2703。聚集的核2703被认为是异常的，并且是低级神经胶质瘤的特征。WM2(参见图27C)显示出水肿2704(以载玻片上的白色孔洞为特征)的迹象。GBM1(参见图27D)显示出活的神经胶质瘤，其还含有代表血管中血红蛋白的红色斑纹2705。GBM1样品还显示出有丝***像和细胞质。GBM2(参见图27E)常含有坏死2706，一些带有更有活力的区域，但大部分是坏死的。在一些情况下，GBM2同时具有水肿和坏死二者(参见图27F)。左半侧的样品更有活力，而右半侧的样品是坏死的。中心附近的凝血血管2707可能是有活力的。
采用留一交叉验证方法来确定分类算法的预测准确性。将线性判别分析(LDA)用作算法的监督分类器。LDA找出了在组之间的数据中呈现最大方差，同时将同一集的成员之间的方差最小化的判别函数线。留一分类器采用由六个光谱带代表的75个光谱测量值，包括其寿命组分。将一个组织样品从数据集中移出，剩下的74个测量值组成该“训练集”。将训练集数据输入LDA模型中，该LDA模型随后从结果计算出判别函数线。将来自所移出的组织样品的数据输入LDA算法中，并进行组织型预测。重复这一过程，按顺序且一次一个地将每个组织样品移出。将分类算法的预测与从取自组织样品位置的活检的病理学询问获得的诊断(GBM n＝19，白质n＝22，正常皮质n＝3)或通过神经导航***对应的前MRI 3D图像获得的诊断(正常皮质n＝30)进行比较，以便评估该算法区分组织类型的能力。在远离该肿瘤的位置获取了由神经导航确认的正常皮质训练数据。对准确性、灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值都进行了测试和分析。
为了将每个未知的样品进行分类，获得了与每个组织组对应的五个概率值(PV)。例如，利用将未知数据分类至特定组织组并预测属于每一类的后验概率(P)的线性判别模型(例如，NC相对于WM1、NC相对于WM2、NC相对于GBM1，和NC相对于GBM2)，采用二进制集合的四个子分类器获得了NC的概率值(PVNC)。4个子分类器的每一个均提供了与特定组织组对应的独立的P。对NC的四个后验概率(例如，P(x＝NC/vs.WM1)、P(x＝NC/vs.WM2)、P(x＝NC/vs.GBM1)、P(x＝NC/vs.GBM2))取平均值，以获得PVNC。采用相同的方法计算剩余组织类别的PV(PVWM1、PVWM2、PVGBM1、PVGBM2)。
如本文所述的，通过分别在0.2、0.4和0.6强度水平上将归一化的fIRF交叉，从衰减点得出三个寿命值τ(0.2)、τ(0.4)和τ(0.6)，并分别将其作为缓慢、正常和快速衰减的代表用作分类算法的输入。图28示出了在每个通道从训练样品得出的寿命参数。误差线含有六个光谱带中的寿命值的平均值和标准偏差。正常皮质表现出比白质或GBM更快的衰减。白质和胶质母细胞瘤二者的寿命都表现出比正常皮层值更高的标准差。因此，在两个单独的子集中收集WM和GBM的每一个。大多数具有更短寿命的白质样品(WM1)含有如图27A所示的、没有水肿或具有增加的细胞构成的白质，而具有更长寿命的第二组(例如，WM2)则由如图27C所示的具有水肿的白质组成。病理学还确认，具有更长寿命的胶质母细胞瘤组(例如，GBM2)是来自胶质母细胞瘤与坏死细胞的混合物的产物，而具有更短衰减的胶质母细胞瘤组(例如，GBM1)表现出较少的坏死。
图29A-29C示出了75个组织样品的每一个的体内收集的人脑数据的分类结果图(例如，概率条形图)。通过病理学诊断将分类结果分组，以比较分类算法的预测准确性。图29A示出了正常皮质组织的结果，图29B示出了白质组织的结果，而图29C则示出了GBM组织的结果。通过病理学鉴别了34个正常皮质样本、14个WM1样品、8个WM2样品、13个GBM1样品和6个GBM2样品。每个条均代表特定组织类型相比于其他四种组织类型类别的概率的平均值。根据如本文所述计算的全部组织类别的PV的比较，分类算法对每个未知样品进行分配。当相应组织类别的PV具有相比于其他组织组的值的最高值时，将未知样品分配为确定的组织类别。当两个或更多个组织类型的概率彼此相似(或在彼此5％以内)时，将该组织分类为“浸润”。利用本文所述的留一法将所有测量的NC样品分类为确定的NC，因为在所有情况下NC的概率都接近1而第二高的概率至多为0.75。WM与GBM之间的区分更加复杂，因为GBM的患病率在WM区域中增加。例如,5号和6号WM1样品(图29B中示出)具有几乎相等的为WM1和GBM1的概率，因此它们的分类器输出为WM与GBM的浸润。
图30A-30E示出了图29A-29C的脑组织分类样品的概率盒须图。对于每种组织类型，将每个分类器(NC、WM1、WM2、GBM1和GBM2)对组合样品的平均概率进行作图。如每种组织类型接近1的概率值所表明的，以极高的概率和较低的变异性对正常皮质、WM2和GBM2样品进行分类。WM1和GBM1样品表现出样品间较高的变异性，但尽管如此，也能够在几乎所有情况下通过光谱学分析进行正确表征。时间分辨的光谱***以100％灵敏性、96％特异性、90％阳性预测值和100％阴性预测值运行。
表3示出了脑肿瘤实验5的组织表征的结果。
表3
Figure BDA0003807350080000741
评估了单个患者的6个位置。在时间分辨的分类和活检之前，外科医生对组织位置进行了诊断。活检的样品位置的组织学分析可用作确定性诊断，以供比较。将通过时间分辨光谱***(TRFS)的组织表征、外科医生在活检时的诊断预测和每个活检的病理学诊断进行比较。TRFS预测100％正确地地鉴别了该组织，而外科医生则未能区分肿瘤与肿瘤浸润的白质。
表4示出了脑肿瘤实验6的组织表征的结果。
表4
Figure BDA0003807350080000742
Figure BDA0003807350080000751
评估了单个患者的十七个位置。在时间分辨的分类和活检之前，外科医生对组织位置进行了诊断。活检的样品位置的组织学分析可用作确定性诊断，以供比较。将通过时间分辨光谱***(TRFS)的组织表征、外科医生在活检时的诊断预测和每个活检的病理学诊断进行比较。TRFS预测正确表征了12/15样品中的组织，而外科医生则正确预测了6/14样品的诊断。两个样品(4号和17号活检)难以解释。
表5示出了实验6中TRFS***和外科医生的真阳性、真阴性、假阳性和假阴性的数目。
表5
TRFS 外科医生
真阳性 6 5
真阴性 6 1
假阳性 1 7
假阴性 2 1
表6示出了实验6中TRFS***和外科医生的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。
表6
TRFS 外科医生
灵敏性 75％ 83％
特异性 85％ 12.5％
阳性预测值 85％ 41％
阴性预测值 75％ 50％
TRFS***具有比该外科医生更高的特异性、阳性预测值和阴性预测值。在该实验中，外科医生具有比TRFS***稍高的灵敏性。这可能是由于该***是被训练用于仅鉴别属于该分类器的纯样品，因此在感兴趣的样品是混合类型时表现得不可预测。额外的分类算法训练可改善组织表征。
在另一个实例中，将本文所述的探针和/或***用于在从患者活检、切除或提取之后对生物样品进行表征。例如，从正在经历脑部手术的患者切除组织样品。用户将探针定位在所切除的组织样品的一个或多个感兴趣位置上、上方或附近。然后利用本文所述的六通道探针***激发该组织样品，以便将该组织样品表征为癌症或非癌症，并且/或者表征病变的严重程度(例如，临床分级，恶性或良性)。将组织的表征用于实时告知通过外科医生的进一步手术干预，并提供与未来治疗决策相关的信息。在另一实例中，切除组织，并制备用于组织病理学检查(例如，冷冻、固定和/或包埋在包埋介质中)。在染色用于组织病理学诊断之前或之后，采用时间分辨的光谱法对该组织进行表征，以作为快速的初步评估，该快速的初步评估在病理学分析进行时传达给外科医生。在另一实例中，从患者收集体液如血液或脑脊髓液，并评估感兴趣的标志物如荧光标记的治疗化合物或癌细胞的存在或不存在。将时间分辨的光谱***配置用于以较高的信噪比优先地或最佳地从荧光标签收集所发射的光。根据时间分辨的光谱法、荧光强度或其组合来确定荧光标记的治疗化合物的浓度或荧光标记的癌细胞的数目。
在另一个实例中，将本文所述的探针和/或***用于以非侵入式或轻微侵入式的方式来表征皮肤下的生物样品，例如，血液或肌肉。将时间分辨的光谱***配置用于发射穿透至皮肤下的光，并检测通过皮肤发射的光。任选地将该***配置成考虑到由皮肤引起的散射或将不想要的自体荧光的记录最小化。用户将该探针定位在皮肤上感兴趣的位置附近。该探针发射穿透皮肤的波长的光(例如，UV、可见光或IR，取决于感兴趣样品的激发/发射性质以及皮肤下样品的深度)，并将该样品激发。收集所发射的光，并将其用于表征该生物样品。例如，静脉注射荧光标记的治疗剂，并且使用配置用于检测荧光标签的探针***非侵入式地测量(连续地，或在注射后的一个或多个预定时间点)血浆浓度。在另一个实例中，静脉注射荧光标记的治疗剂，并且非侵入式地监测(连续地，或在注射后的一个或多个预定时间点)分散至感兴趣的真皮下区域的治疗剂，以评估组织渗透并告知未来的给药方案。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变形、改变和替换。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案均可用于实施本发明。旨在用以下权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (32)

1.一种用于对样品进行分类或表征的***，所述***包括：
a.传输元件，该传输元件被配置用于将光激发信号传送至所述样品，其中所述样品响应于所述光激发信号而生成响应光信号，并且其中所述传输元件被进一步配置用于接收远侧传输元件；
b.信号收集元件，该信号收集元件耦合到所述传输元件，以从所述传输元件接收所述响应光信号；
c.光学组件，该光学组件被配置用于从所述信号收集元件接收所述响应光信号并且该光学组件包括滤光轮，该滤光轮包括将所述响应光信号分解成多个时间上不同的光谱带的多个光谱滤光片，其中所述滤光轮被配置用于向所述多个时间上不同的光谱带中的每个光谱带提供一种或多种时间延迟；
d.检测器，该检测器被配置用于接收所述多个时间上不同的光谱带，以记录所述多个时间上不同的光谱带的时间分辨信息和波长分辨信息；以及
e.处理器，该处理器耦合到所述检测器并且被配置用于利用时间分辨荧光光谱法，基于所述多个时间上不同的光谱带，接近实时或实时地表征所述样品。
2.如权利要求1所述的***，其中所述响应光信号包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的***，其中所述样品包括生物样品。
4.如权利要求3所述的***，其中所述处理器被配置用于将所述生物样品表征为正常的、良性的、恶性的、瘢痕组织、坏死的、缺氧的、活的、非活的或发炎的。
5.如权利要求1所述的***，其进一步包括手持式探针，该手持式探针包括至少所述传输元件。
6.如权利要求5所述的***，其中所述手持式探针进一步包括消融元件。
7.如权利要求6所述的***，其中所述探针被配置用于向所述样品施加射频(RF)能量、热能、低温能量、超声能量、X射线能量、激光能量或光学能量中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的***，其中所述检测器包括光电倍增管。
9.如权利要求1所述的***，其中所述处理器被配置用于基于所述多个时间上不同的光谱带，通过确定所述样品中分子的浓度或分布中的一种或多种来表征所述样品。
10.如权利要求9所述的***，其中所述分子包括外源荧光分子或内源荧光分子中的一种或多种。
11.如权利要求1所述的***，其中所述处理器被配置用于在约100ms或更短的时间内表征所述样品。
12.如权利要求1所述的***，其中所述光谱滤光片中的一个或多个包括编码器，以将标识符编码到所述时间上不同的光谱带中的一个或多个中。
13.如权利要求1所述的***，其进一步包括扫描机构，该扫描机构耦合到所述传输元件，以在所述样品的预定部分上扫描脉冲光信号。
14.如权利要求1所述的***，其中所述信号收集元件或所述光学组件中的一个或多个包括具有0.22数值孔径的一根或多根光学纤维。
15.如权利要求1所述的***，其中所述信号收集元件或所述光学组件中的一个或多个以至少一个数值孔径和光通道的总横截面积为特征，并且其中在传送光的所述信号收集元件或光学组件中的一个或多个的位置处，所述至少一个数值孔径的平方乘以所述总横截面积为0.018mm2。
16.如权利要求15所述的***，其中所述总横截面积是基于所述一根或多根光学纤维的数量和所述一根或多根光学纤维的直径的。
17.如权利要求1所述的***，其中可自动调整所述检测器的增益。
18.如权利要求1所述的***，其中所述样品从患者的手术程序获得。
19.一种用于对样品进行分类或表征的方法，所述方法包括：
a.用预定波长的至少一个光脉冲辐射样品，以导致所述样品产生响应光信号；
b.收集来自所述样品的所述响应光信号；以及
c.用包括多个光谱滤光片的滤光轮分解预定波长范围内的所述响应光信号，以获得对应于所述多个光谱滤光片的多个时间上不同的光谱带，其中所述滤光轮被配置用于向所述多个时间上不同的光谱带中的每个光谱带提供一种或多种时间延迟；
d.接收所述多个时间上不同的光谱带，以记录所述多个时间上不同的光谱带的时间分辨信息和波长分辨信息；以及
e.利用时间分辨荧光光谱法，基于所述多个时间上不同的光谱带，接近实时或实时地表征所述样品。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述时间上不同的光谱带中的每个光谱带关于另一个光谱带是时间延迟的。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述响应光信号包括荧光光谱、拉曼光谱、紫外-可见光光谱或红外光谱中的一种或多种。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述检测器包括光电倍增管。
23.如权利要求19所述的方法，其中表征所述样品包括基于所述多个时间上不同的光谱带确定所述样品中分子的浓度或分布中的一种或多种。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述分子包括外源荧光分子或内源荧光分子。
25.如权利要求19所述的方法，其中所述样品在约100ms或更短的时间内得到表征。
26.如权利要求19所述的方法，其进一步包括利用所述光谱滤光片中的一个或多个将标识符编码到所述时间上不同的光谱带中的一个或多个中。
27.如权利要求19所述的方法，其进一步包括在所述样品的预定部分上扫描所述至少一个光脉冲。
28.如权利要求19所述的方法，其中从所述样品收集所述响应光信号包括将所述响应光信号穿过光学组件，该光学组件包括具有0.22数值孔径的一根或多根光学纤维。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述光学组件以至少一个数值孔径和光通道的总横截面积为特征，并且其中在传送光的所述光学组件的位置处，所述至少一个数值孔径的平方乘以所述总横截面积为0.018mm2。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述总横截面积是基于所述一根或多根光学纤维的数量和所述一根或多根光学纤维的直径的。
31.如权利要求19所述的方法，其中可自动调整所述检测器的增益。
32.如权利要求19所述的方法，其中所述样品从患者的手术程序获得。
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