CN115552033A - 生物聚合物的测序方法 - Google Patents

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CN115552033A CN202180032277.0A CN202180032277A CN115552033A CN 115552033 A CN115552033 A CN 115552033A CN 202180032277 A CN202180032277 A CN 202180032277A CN 115552033 A CN115552033 A CN 115552033A
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Abstract

本公开提供了与生物聚合物测序相关的装置、***和方法。具体而言，本公开涉及使用生物电子装置对多核苷酸进行测序的方法，所述生物电子装置基于当(例如具有独特电荷的)互补核苷酸多磷酸单体被掺入到模板多核苷酸中时的电流波动获得聚合酶活性的生物电子签名(例如电流幅度水平)。

Description

生物聚合物的测序方法
政府支持
本发明是在由美国国家卫生研究院颁发的R21 HG010522下借助政府资助进行的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请
本申请要求2020年4月30日提交的美国临时专利申请号63/018,352的优先权和权益，所述申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
技术领域
本公开提供了与生物聚合物测序相关的装置、***和方法。具体而言，本公开涉及使用生物电子装置对多核苷酸进行测序的方法，所述生物电子装置基于当具有独特电荷的互补核苷酸多磷酸单体被掺入到模板多核苷酸中时的电流波动获得聚合酶活性的生物电子签名(signature)。
背景技术
当蛋白质执行其各种功能时，产生作为这些功能的基础的运动。开发测量与活性蛋白质产生的波动相对应的电学特征的装置、***和方法的能力可以作为蛋白质功能的无标签检测和分析的基础。例如，监测活性酶的功能波动可以提供一种快速而简单的筛选影响酶的功能的候选药物分子的方法。在其他情况下，监测处理生物聚合物(例如，碳水化合物、多肽、核酸等等)的蛋白质波动的能力可以揭示关于它们的构象变化以及这些变化如何与功能相关的新信息。另外，可以开发利用活性蛋白质产生的电学特征的诊断和分析装置，从而提供利用生物力学性质进行实际应用的新方式。
发明内容
本公开的实施方案包括一种使用生物电子装置对多核苷酸进行测序的方法。根据这些实施方案，所述方法包括将模板多核苷酸引入到生物电子装置中。在一些实施方案中，生物电子装置包含与第一电极和第二电极中的至少一个功能性偶联的聚合酶。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含四种核苷酸多磷酸单体的溶液引入到包含模板多核苷酸的装置中。在一些实施方案中，存在于溶液中的四种核苷酸多磷酸单体中的至少三种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的电荷。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于当每个互补核苷酸多磷酸单体被掺入到模板多核苷酸中时的电流波动获得聚合酶活性的生物电子签名。在一些实施方案中，生物电子签名的至少一个特征鉴定被掺入到模板多核苷酸中的每个互补核苷酸多磷酸单体。
在一些实施方案中，生物电子签名包括对应于聚合酶处于闭合状态的闭合时段。
在一些实施方案中，生物电子签名的至少一个特征包括电流幅度水平。
在一些实施方案中，存在于溶液中的核苷酸多磷酸单体中的至少一种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的负电荷。在一些实施方案中，存在于溶液中的核苷酸多磷酸单体中的至少两种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的负电荷。在一些实施方案中，存在于溶液中的核苷酸多磷酸单体中的至少三种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的负电荷。在一些实施方案中，负电荷由至少一个附加的磷酸基团相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至20个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，至少一种核苷酸多磷酸单体上的独特负电荷对应于相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体的电流幅度水平增加或降低的电流幅度水平。
在一些实施方案中，存在于溶液中的核苷酸多磷酸单体中的至少一种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的正电荷。在一些实施方案中，存在于溶液中的核苷酸多磷酸单体中的至少两种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的正电荷。在一些实施方案中，存在于溶液中的核苷酸多磷酸单体中的至少三种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的正电荷。在一些实施方案中，至少一种核苷酸多磷酸单体上的独特正电荷对应于相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体的电流幅度水平增加或降低的电流幅度水平。
在一些实施方案中，聚合酶的核酸外切酶活性被禁用。
在一些实施方案中，使用包含链霉亲和素的接头将聚合酶与第一电极和第二电极功能性偶联。
在一些实施方案中，接头连接至聚合酶的非活性的区域。
在一些实施方案中，所述方法包括在第一电极与第二电极之间施加100mV或更小的电压偏压。
在一些实施方案中，标准核苷酸三磷酸单体包括腺嘌呤(dATP)、胞嘧啶(dCTP)、鸟嘌呤(dGTP)和胸腺嘧啶(dTTP)。
在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极包含金、钯、铂、银、铜或其任何合金。
在一些实施方案中，所述装置包括至少部分地覆盖第一电极和/或第二电极的顶表面的介电层。
在一些实施方案中，第一电极和第二电极定位成使得在两个电极之间形成约1nm至约50nm的间隙。
本公开的实施方案包括一种生物电子装置，所述生物电子装置包括由间隙间隔开的第一电极和第二电极，以及经由包含独特电荷的接头连接至所述第一电极和所述第二电极的蛋白质。在一些实施方案中，独特的电荷调节通过蛋白质的电导。
在一些实施方案中，所述接头包含肽或多肽。在一些实施方案中，所述接头包含链霉亲和素。在一些实施方案中，所述蛋白质是生物素化的。
在一些实施方案中，接头包含独特的负电荷。在一些实施方案中，独特的负电荷通过添加与链霉亲和素偶联的谷氨酸部分、天冬氨酸部分或其组合赋予。在一些实施方案中，独特的负电荷增加通过蛋白质的电导。
在一些实施方案中，接头包含独特的正电荷。在一些实施方案中，独特的正电荷通过添加与链霉亲和素偶联的精氨酸部分、组氨酸部分、赖氨酸部分或其组合赋予。在一些实施方案中，独特的正电荷增加或降低通过蛋白质的电导。
在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极包含金、钯、铂、银、铜或其任何合金。
在一些实施方案中，所述蛋白质选自由以下各项组成的组：聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶。
在一些实施方案中，所述接头连接至所述蛋白质的非活性区域。
在一些实施方案中，接头包含与多谷氨酸部分偶联的链霉亲和素，蛋白质包含聚合酶，并且第一电极和第二电极包含钯、铂或其任何合金。
本公开的实施方案还包括一种使用本文描述的任何生物电子装置调节通过蛋白质的电子电导的方法。
附图说明
图1：脱氧核苷酸多磷酸实例的表示，其中不同数量的磷酸对每种脱氧核苷酸多磷酸贡献不同量的电荷。
图2：示出聚合酶分子的电子电导如何取决于局部电荷(以表面电位表示)的代表性图表。
图3A-3B：通过掺入脱氧核苷酸三磷酸的聚合酶测量的电流对时间的代表性图表。图3A展示各种特征的持续时间取决于所掺入的核苷酸，但电流的幅度则不然。图3B展示四种核苷酸中的每一种携带的不同量电荷导致聚合酶闭合状态下的不同电流水平。序列读数显示在迹线上方。
图4：六谷氨酸突变型链霉亲和素骨架结构的代表性图，示出了连接至每个链霉亲和素单体C末端的带电荷尾部(E6)。
图5A-5B：使用Pd电极在2.5nm间隙处测量的野生型(图5A)和六谷氨酸突变型链霉亲和素(图5B)的代表性电导分布。
图6A-6B：使用野生型链霉亲和素(图6A)和六谷氨酸突变型链霉亲和素(图6B)的桥接电极对的链霉亲和素连接的Φ29聚合酶的代表性图。在每个图下方的图表中提供了在4.5nm间隙处使用Pd电极测量的对应电导分布。
具体实施方式
在以下详细描述中，参照了构成其一部分的附图，并且在附图中通过说明展示了可实施的实施方案。应理解，在不脱离本发明范围的情况下，可使用其他实施方案并且可进行结构或逻辑上的改变。因此，以下详细描述不应被理解为限制性的，并且实施方案的范围由随附权利要求和其等效物限定。
可以以有助于理解实施方案的方式将各种操作依次描述为多个离散操作；然而，描述的顺序不应被解释为暗示这些操作是依赖于顺序的。
除非另有说明，否则按照常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes IX,published by Jo nes and Bartlet,2008(ISBN0763752223)；Kendrew等人(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,publishedby Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0632021829)；和Robert A.Meyers(编),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN 9780471185710)；以及其他类似参考文献。
下文描述了用于实践或测试本公开的合适方法和材料。这些方法和材料仅为示例性的，并非意在限制性的。可以使用与本文描述的那些相似或等效的其他方法和材料。例如，本公开所属领域中众所周知的常规方法在各种通用和更具体的参考文献中进行了描述，包括例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989；Sambrook等人,Molecu lar Cloning:ALaboratory Manual,第3版.,Cold Spring Harbor Pr ess,2001；Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(和2000年增刊)；Ausubel等人,Sh ort Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methodsfro m Current Protocols in Molecular Biology,第4版,Wiley&Sons,1999；Harlow andLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Sp ring Harbor Laboratory Press,1990；以及Harlow and Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1999。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的，并非旨在限制性的。
本章节中和本文的整个公开内容中所使用的章节标题仅用于组织目的，并非旨在限制性的。
1.定义
为了便于查看本公开的各种实施方案，下面提供对特定术语的以下解释。如本文所定义和使用的所有定义应理解为高于字典定义、以引用的方式并入的文档中的定义和/或所定义术语的普通含义。
如本文在说明书和权利要求中所用的不定冠词“一个”和“一种”，除非明确指明相反，否则应理解为意指“至少一个/一种”。
如本文在说明书和权利要求中所用的短语“和/或”应理解为意指这样结合的元件中的“任一者或两者”，即，在一些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的元件。用“和/或”列出的多个元件应以相同的方式解释，即“一个或多个”这样结合的元件。除了以“和/或”子句特别标识的元件之外，可以任选地存在其他元件，无论与那些特别标识的元件相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，提及“A和/或B”，当与诸如“包含”之类的开放式语言结合使用时，在一个实施方案中，仅指代A(任选地包括除B之外的元素)；在另一个实施方案中，仅指代B(任选地包括除A之外的元素)；在又一个实施方案中，指代A和B两者(任选地包括其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中所用的“或”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或者“和/或”应解释为具有包容性，即包括元件数量或列表中的至少一者，但也包括多于一者，以及任选地另外的未列出项目。只有明确指出相反的术语，诸如“中仅一个”或“中恰好一个”，或者当在权利要求中使用时的“由......组成”，将指代包括元件数量或列表中的恰好一个元件。一般而言，如本文所用的术语“或”，当前面带有排他性术语时，诸如“中任一个”、“中一个”、“中仅一个”或“中恰好一个”，仅应解释为表示排他性的备选项(即“一个或另一个但不是它们二者”)。当在权利要求中使用时的“基本上由……组成”应具有在专利法领域中使用的普通含义。
如本文在说明书和权利要求中所用，在提及一个或多个元件的列表时，短语“至少一个”应理解为意指选自元件列表中的任何一个或多个元件的至少一个元件，但是不一定包括元件列表中特别列出的每个和所有元件中的至少一个，并且不排除元件列表中的元件的任何组合。此定义还允许除在短语“至少一个”所指的元件列表中特别标识的元件之外的元件可以任选地存在，无论与那些特别标识的元件相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指代至少一个、任选地包括多于一个的A，而不存在B(并且任选地包括除B之外的元件)；在另一个实施方案中，指代至少一个、任选地包括多于一个的B，而不存在A(并且任选地包括除A之外的元件)；在又一个实施方案中，指代至少一个、任选地包括多于一个的A，和至少一个、任选地包括多于一个的B(并且任选地包括其他元件)；等等。
在权利要求以及上述说明书中，诸如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等所有过渡性短语均应被理解为是开放式的，即表示包括但不限于。只有过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭式或半封闭式过渡性短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所陈述。
如本文所用，“生物样品”通常是指从受试者获得的含有基因组DNA、RNA(诸如mRNA)、蛋白质或其组合的生物样品。实例包括但不限于唾液、外周血、尿液、组织活检、手术标本和尸检材料。在实施方案中，生物样品是体液，诸如血液，或其成分，诸如血浆或血清。
如本文所用，“生物聚合物”通常是指聚合物(例如，由活生物体产生或合成产生的)。生物聚合物包含经共价键合以形成更大结构的单体单元。生物聚合物主要分为三类，根据使用的单体单元和形成的生物聚合物的结构进行分类：多核苷酸(RNA和DNA)，它们是由13个或更多个核苷酸单体构成的长聚合物；多肽，它们是氨基酸的短聚合物；和多糖，它们通常是线性键合的聚合碳水化合物结构。生物聚合物的其他实例包括橡胶、木栓质、黑色素和木质素。
如本文所用，“分离的”生物组分(例如，诸如核酸分子、蛋白质或细胞)已基本上从该组分天然存在的生物体细胞或生物体本身中的其他生物组分(诸如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞)中分离或纯化出来。已“分离”的核酸分子和蛋白质可以理解为已通过标准纯化方法纯化。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。
如本文所用，“突发”通常是指电流流的一部分，其中测量的电流相对于暂停更频繁地在两个水平之间变化，通常在暂停时间的一半时间内处于高状态。突发中各峰的测量电流大于通过分子的基线电流的约20％。通常，当核苷酸被掺入到模板序列中时，会观察到突发。
如本文所用，“修饰”、“化学修饰”或“经化学修饰”通常是指涉及改变分子的化学成分或结构的多种不同过程中的任一种。例如，可以对聚合酶进行化学修饰，从而与第一电极和第二电极形成化学键。在一个实例中，经化学修饰电极是一种电极，其表面经过化学转化以改变电极的性质，诸如其物理、化学、电化学、光学、电学和/或传输特性。如本文所提供，化学修饰还可涉及对聚合酶进行化学改变，使其与结合到电极的接头(例如，生物素/链霉亲和素、HaloTag等)相容。在其他实施方案中，可以经由蛋白质合成产生修饰。例如，当从编码蛋白质和修饰(例如接头)的多核苷酸合成时，聚合酶可以设计成包含一种或多种修饰(例如接头)。
如本文所用，“接触”和“进行接触”可以包括以直接物理结合的方式放置，包括固体与液体形式。“进行接触”可以包括两种不同物质之间的特定化学接触(例如，共价键，或与特定氨基酸残基具有特定配体相互作用的非共价键)。
如本文所用，“互补性”或“互补的”通常是指核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或其他非传统类型与另一核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中可与第二个核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基百分比(例如10个中有5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”通常表示核酸序列的所有连续残基将与第二个核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。如本文所用的“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域内为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补程度，或指两个核酸在严格条件下杂交。
如本文所用，“电流流(current stream)”通常是指随时间产生的电流信号，诸如从本公开的生物电子装置产生的电流信号。
如本文所用，“标记”通常是指能够例如通过ELISA、分光光度法、流式细胞术或显微术来检测的剂。例如，标记可以(间接或直接)连接至核酸分子或蛋白质，从而允许检测核酸分子或蛋白质。标记的实例包括但不限于放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶及其组合。例如，在Sambrook等人(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)和Ausubel等人(In CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1998)中讨论了标记方法和选择适于各种目的的标记的指导。
如本文所用，术语“接头”或“连接的”是指直接或间接接合在一起。例如，第一部分可以共价或非共价(例如，静电地)连接至第二部分。这包括但不限于将一个分子与另一个分子共价键合、一个分子与另一个分子非共价键合(例如静电键合)、一个分子与另一个分子通过氢键合非共价键合、一个分子与另一个分子通过范德华力非共价键合，以及此类偶联的任何和所有组合。间接连接是可能的，诸如通过使用“接头”(位于两个部分之间的分子或原子组)。在若干实施方案中，连接的组分以化学或物理方式结合，使得组分不能自由地彼此分散。例如，两种组分可以彼此共价结合，使得两种组分不能单独分散或扩散。在若干实施方案中，连接的组分以化学或物理方式结合，使得组分不能自由地彼此分散。例如，两种组分可以彼此共价结合，使得两种组分不能单独分散或扩散。
如本文所用，术语“非天然存在”和“工程化”可互换地表示人工参与。当涉及核酸分子或多肽时，这些术语通常表示核酸分子或多肽至少基本上不含与它们在自然界中天然相关的以及在自然界中发现的至少一种其他组分。
如本文所用，“核酸”通常是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，其可以包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸分子杂交的天然核苷酸的类似物。在一个实例中，核酸分子是单链(ss)DNA或RNA分子，诸如探针或引物。在另一个实例中，核酸分子是双链(ds)核酸。在另一个实例中，核酸是修饰的DNA或RNA分子，诸如异种核酸(XNA)。术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸组合，并且包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTG、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸，诸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。如本文进一步描述的，核酸可以包括脱氧核苷酸多磷酸单体(dNxP)，诸如与它们对应的标准脱氧核苷酸三磷酸单体相比具有改变的电荷的那些。
如本文所用，“多肽”、“肽”和“蛋白质”通常是指其中单体是通过酰胺键接合在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，L-异构体在自然界中是优选的。术语多肽特别旨在涵盖天然存在的蛋白质，以及重组或合成产生的蛋白质。本文所用的基本上纯化的多肽是指基本上不含其他蛋白质、脂质、碳水化合物或与其天然相关的其他材料的多肽。在一个实施方案中，多肽至少50％，例如至少80％不含其他蛋白质、脂质、碳水化合物或与其天然相关的其他材料。在另一个实施方案中，多肽至少90％不含其他蛋白质、脂质、碳水化合物或与其天然相关的其他材料。在另一个实施方案中，多肽至少95％不含其他蛋白质、脂质、碳水化合物或与其天然相关的其他材料。
提供功能相似的氨基酸的保守氨基酸取代表为本领域普通技术人员所熟知。以下六组是被视为相互保守取代的氨基酸实例：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
非保守氨基酸取代可能由以下项的变化引起：(a)取代区域中氨基酸主链的结构；(b)氨基酸的电荷或疏水性；或(c)氨基酸侧链的体积。通常预期会对蛋白质特性产生最大变化的取代是：(a)亲水残基取代(或被取代成)疏水残基；(b)脯氨酸取代(或被取代成)任何其他残基；(c)具有大侧链的残基，例如苯丙氨酸，取代(或被取代成)不具有侧链的残基，例如甘氨酸；或(d)具有正电侧链的残基，例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基，取代(或被取代成)电负性残基，例如谷氨酰基或天冬氨酰基。变体氨基酸序列可以例如与天然氨基酸序列80、90或甚至95或98％一致。用于确定一致性百分比的程序和算法可以在NCBI网站上找到。
如本文所用，“探针”通常是指核苷酸的短序列，诸如长度为至少8、至少10、至少15、至少20或至少21个核苷酸，其可用于通过分子杂交检测是否存在互补序列。在特定实例中，寡核苷酸探针包括允许检测寡核苷酸探针:靶序列杂交复合物的标记。实验室标准和值可以基于已知或确定的总体值来设置，并且可以以图表或表格的形式提供，允许比较测量的、实验确定的值。
如本文所用，“引物”通常是指短核酸分子，例如长度为10-100个核苷酸的DNA寡核苷酸，诸如长度为5、6、7、8、9、10、11、12或更多。引物可以通过核酸杂交与互补的靶核酸链退火，从而在引物与靶核酸链之间形成杂交体。引物可用于扩增核酸序列，诸如通过PCR或本领域已知的其他核酸扩增方法。
如本文所用，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，它旨在作为一个相对术语。因此，例如，纯化的蛋白质制剂是其中所指的蛋白质比细胞内其自然环境中的蛋白质更纯的制剂。例如，将蛋白质制剂纯化为使得蛋白质占制剂总蛋白质含量的至少50％。类似地，纯化的寡核苷酸制剂是其中寡核苷酸比在包括寡核苷酸的复杂混合物的环境中更纯的制剂。化合物的纯度可以例如通过高效液相色谱法(HPLC)或其他常规方法来确定。
如本文所用，“重组”通常是指重组核酸或蛋白质，它具有非天然存在的序列或具有通过两个其他分开的序列区段的人工组合而产生的序列。此人工组合常常通过化学合成或通过人工操作核酸的分开的区段(例如通过基因工程技术)来完成。术语重组包括仅通过添加、取代或缺失天然核酸分子或蛋白质的一部分而改变的核酸和蛋白质。
如本文所用，术语“受试者”包括人类和非人类动物。“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“基本一致性”或“基本上一致”通常指核酸或其片段，当与另一核酸(或其互补链)在适当的核苷酸***或缺失下最佳比对时，指核苷酸序列具有至少约95％序列一致性，如通过任何众所周知的序列一致性算法诸如FASTA、BLAST或Gap来测量，如下所讨论。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本一致性的核酸分子可以编码具有与参考核酸分子所编码的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”是指两个肽序列在诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重最佳比对时，具有至少95％序列一致性，甚至更优选至少98％或99％序列一致性。优选地，不一致的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代。一般来说，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列一致性百分比或相似程度以针对取代的保守性质来校正。进行这种调整的手段对于本领域技术人员来说是众所周知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，以引用的方式并入本文。具有化学特性相似的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链半胱氨酸和蛋氨酸。优选保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445(以引用的方式并入本文)公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”的替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，也称为序列一致性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量匹配相似序列。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit等程序，这些程序可以在默认参数下使用，以确定密切相关的多肽，诸如来自不同物种生物体的同源多肽之间，或野生型蛋白质与其突变体之间的序列同源性或序列一致性。参见例如GCG 6.1版。多肽序列也可以使用FASTA使用默认或推荐参数进行比较，FASTA是GCG 6.1版中的一个程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜索序列之间的最佳重叠区的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000)上文)。当将本发明的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-402，每个文献都以引用的方式并入本文。
如本文所用，“变体”通常是指通过氨基酸的***、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“SNP”是指为单核苷酸多态性的变体。“生物活性”的代表性实例包括被特定抗体结合或促进免疫反应的能力。变体还在本文中用于描述其氨基酸序列与参考蛋白质的氨基酸序列基本上一致并保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守性取代，即用具有相似特性(例如，带电区域的亲水性、程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸，在本领域通常被认为涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示可产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情况下氨基酸的亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，已报道这是一种与抗原性和免疫原性密切相关的有用度量。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可产生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本领域中所理解的。可利用具有在±2内的亲水性值的氨基酸彼此进行取代。氨基酸的疏水性指数与亲水性值受所述氨基酸的具体侧链影响。与所述观察一致，应理解与生物功能相容的氨基酸取代依赖于氨基酸的相对相似性，特别是所述氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。
如本文所用，“暂停”通常是指电流流的一部分，其中所测量电流的波动被相邻特征持续时间的大约两倍的较慢特征中断。通常，在核苷酸被掺入到模板序列中之前和之后观察到暂停，并且相对于电流的相邻脉冲而言的暂停的持续时间随着核苷酸三磷酸浓度的降低而增加。
如本文所用，“聚合酶”通常是指合成长链聚合物或核酸的酶。通过使用碱基配对相互作用来拷贝DNA模板链或通过半梯复制来拷贝RNA，DNA聚合酶和RNA聚合酶分别用于组装DNA和RNA分子。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。下面描述了优选的方法和材料，尽管与本文描述的那些相似或等效的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用的方式整体并入。本文公开的材料、方法和实施例仅仅是说明性的而不是旨在作为限制性的。
如本文所述，所公开的实施方案仅出于说明性目的而不是限制性的。其他实施方案是可能的并且被本公开所覆盖，这将从本文所包含的教导中显而易见。因此，本公开的广度和范围不应受上述实施方案中的任一者的限制，而应仅根据本公开所支持的权利要求及其等效物来限定。此外，本公开的实施方案可以包括方法、组合物、***和设备/装置，其可以进一步包括来自任何其他公开的方法、组合物、***和装置的任何和所有元件，包括对应于检测蛋白质活性的任何和所有元件。换句话说，来自一个或另一个公开的实施方案的元件可以与来自其他公开的实施方案的元件互换。此外，可以通过将本文公开的一个和/或另一个特征与在以引用的方式并入的材料中公开的方法、组合物、***和装置以及它们的一个或多个特征组合来实现一些另外的实施方案。此外，公开的实施方案的一个或多个特征/元件可以被去除，并且仍然产生可授予专利的主题(并因此产生本公开的另外更多的实施方案)。此外，一些实施方案对应于与现有技术的教导相比，具体地缺少一个和/或另一个元件、结构和/或步骤(如适用)的方法、组合物、***和装置，因此表示可授予专利的主题并且可与现有技术教导区分开(即，针对此类实施方案的权利要求可以包含负面限制，以指出缺少现有技术教导的一个或多个特征)。
2.生物聚合物的测序方法
本公开的实施方案包括与生物聚合物测序相关的装置、***和方法。具体而言，本公开涉及使用生物电子装置对多核苷酸进行测序的方法，所述生物电子装置基于当(例如具有独特电荷的)互补核苷酸多磷酸单体被掺入到模板多核苷酸中时的电流波动获得聚合酶活性的生物电子签名(例如电流幅度水平)。
如本文进一步描述的，本公开的装置、***和方法可用于生成感兴趣酶的生物电子签名，生物电子签名可用于确定任何生物聚合物(例如，多核苷酸)的序列。在一些实施方案中，感兴趣酶可以是聚合酶，并且当聚合酶将核苷酸单体添加到模板多核苷酸链中时，聚合酶的生物电子签名的各个方面可以用于确定该模板多核苷酸的序列。例如，聚合酶活性的生物电子签名可以基于当每个互补核苷酸单体被掺入到模板多核苷酸中时的电流波动。在一些实施方案中，生物电子签名是基于当具有独特电荷的互补核苷酸多磷酸单体被掺入到模板多核苷酸中时对应于聚合酶活性的电流幅度水平生成的。在一些实施方案中，用于生成生物电子签名的生物电子装置包含与第一电极和第二电极两者功能性偶联的聚合酶。术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸组合，并且包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTG、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸，诸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。
在一些实施方案中，用于对生物聚合物进行测序的方法包括使用生物电子装置鉴定被掺入到核酸(例如，DNA)的模板链中的核苷酸碱基。根据这些实施方案，所述方法包括将模板多核苷酸引入到生物电子装置中。在一些实施方案中，生物电子装置包含与第一电极和第二电极中的至少一个功能性偶联的聚合酶。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含四种核苷酸多磷酸单体(例如dNxP)的溶液引入到包含模板多核苷酸的装置中。在一些实施方案中，存在于溶液中的四种核苷酸多磷酸单体中的至少三种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的电荷。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于当每个互补核苷酸多磷酸单体被掺入到模板多核苷酸中时的电流波动获得聚合酶活性的生物电子签名。在一些实施方案中，生物电子签名的至少一个特征鉴定被掺入到模板多核苷酸中的每个互补核苷酸多磷酸单体。
正如本领域普通技术人员在受益于本公开的教导后将容易地认识到和理解，本文描述的方法可以与感测酶(例如，聚合酶)的开放和闭合状态的持续时间的任何生物电子装置一起使用。示例性装置包括但不限于美国专利号10,422,787和PCT申请号PCT/US2019/032707中公开的生物电子装置和***，这两个专利均以引用的方式整体并入本文用于所有目的。此外，基于本公开内容，本领域普通技术人员将容易地认识到和理解，前述实施方案同样适用于(并且包括)用rNTP替代dNTP和使用RNA聚合酶对RNA进行测序。
此外，本领域普通技术人员将容易地认识到和理解，本文描述的方法可以与涉及生物聚合物测序的其他方法结合使用。特别地，PCT申请号PCT/US21/19428(其以引用的方式整体并入本文)中公开的各种实施方案描述了当DNA聚合酶主动延伸模板时产生的电流波动的解释，以及信号特征(例如，生物电子签名)可以如何就被掺入的核苷酸进行解释，以及因此，这些信号如何读取模板的序列。这种方法利用了信号的随时间变化的特征。例如，聚合酶保持在低电流状态的时间反映了溶液中核苷酸三磷酸的浓度。如果特定核苷酸三磷酸的浓度较低，则聚合酶必须保持开放更长的时间才能捕获正确的核苷酸，并且由于聚合酶的开放构象对应于更低的电流，与开放状态相关的电流骤降(dip)持续时间更长。另外，在PCT申请号PCT/US20/38740(其以引用的方式整体并入本文)中公开的各种实施方案描述了碱基堆积聚合速率常数差异如何反映在闭合状态(高电流状态)中，因此这些状态的持续时间也可以用来指示四种核苷酸中的哪一种正被掺入。可能希望能够使用信号的幅度作为对确定序列的附加贡献。此外，PCT申请号PCT/US21/17583(其以引用的方式整体并入本文)中公开的各种实施方案描述了利用限定的电位使感兴趣蛋白质(例如，聚合酶)的电导最大化的方法，这可以用作制造用于直接测量蛋白质活性的增强型生物电子装置的基础。
根据上述实施方案，本公开包括使用具有独特电荷(例如，相对于它们对应的标准核苷酸三磷酸单体更正或更负)的核苷酸多磷酸(例如，dNxP)产生生物电子签名来进行测序的方法，所述生物电子签名可用于鉴定被掺入到模板多核苷酸中的每个互补核苷酸多磷酸单体(参见例如图1)。在一些实施方案中，生物电子签名包括对应于聚合酶处于闭合状态(例如核苷酸掺入)的闭合时段。在一些实施方案中，生物电子签名的至少一个特征包括电流幅度水平，诸如基于掺入具有相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体具有独特电荷的特定核苷酸多磷酸单体的电流幅度水平的变化(例如，增加或降低)(图3A-3B)。如本文进一步描述的，聚合酶的电导变化取决于局部电荷(以表面电位表示；参见图2)，所述局部电荷可以通过具有独特电荷的核苷酸多磷酸单体而改变，并为鉴定哪种单体已被掺入到特定模板核酸中从而确定该模板核酸的序列提供了基础。
在一些实施方案中，存在于溶液(例如，包含生物电子装置和模板核苷酸的溶液)中的核苷酸多磷酸单体中的至少一种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体具有独特的负电荷。在一些实施方案中，存在于溶液(例如，包含生物电子装置和模板核酸的溶液)中的核苷酸多磷酸单体中的至少两种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体具有独特的负电荷。在一些实施方案中，存在于溶液(例如，包含生物电子装置和模板核苷酸的溶液)中的核苷酸多磷酸单体中的至少三种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体具有独特的负电荷。在一些实施方案中，存在于溶液(例如，包含生物电子装置和模板核苷酸的溶液)中的核苷酸多磷酸单体中的全部四种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体具有独特的负电荷。
在一些实施方案中，负电荷由至少一个附加的磷酸基团相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体赋予(图1)。在一些实施方案中，负电荷由1至20个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至19个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至18个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至17个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至16个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至15个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至14个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至13个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至12个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至11个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至10个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至9个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至8个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至7个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至6个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至5个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至4个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至3个附加的磷酸基团赋予。在一些实施方案中，负电荷由1至2个附加的磷酸基团赋予。
如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，其他化学部分的添加也可以用于改变核苷酸多磷酸单体的电荷(例如，改变成比其对应的标准核苷酸多磷酸单体更负)，只要它们不干扰聚合酶的功能。另外，如Dellafiore,M.A.等人,Front.Chem.,2016年5月4日(https://doi.org/10.3389/fchem.2016.00018)和Duffy,K.等人,BMC Biology,2020年9月2日(https://doi.org/10.1186/s12915-020-00803-6)以及Mc Kenzie,L.K.等人,Chem.Soc.Rev.,2021年3月1日(https://doi.org/10.1039/D0CS01430C)所公开，可以根据各种策略获得任何修饰的核酸(例如修饰的核碱基、糖或磷酸)。如Fujino,T.等人,J.Org.Chem.2016年8月31日(https://doi.org/10.1021/acs.joc.6b01618)所证明，磷酸电荷可以用***键联消除，并且如Vaish,N.K.等人,Biochemistry,2003年7月4日(https://doi.org/10.1021/bi027354i)所证明，可以掺入带正电荷的尿苷。
适用于测序方法的各种修饰核苷酸的设计策略通常要求：修饰的核苷酸不干扰碱基对相互作用(Watson-Crick和Hoogsteen)；修饰的核苷酸是对应DNA或RNA聚合酶的底物；修饰的核苷酸的引入在序列的任何位置处都是有效的；并且修饰的序列是对应聚合酶的模板。
在一些实施方案中，至少一种核苷酸多磷酸单体上的独特负电荷对应于相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体的电流幅度水平增加或降低的电流幅度水平。例如，如图2所示，取决于峰值电导水平，核苷酸多磷酸单体上的附加负电荷(例如，降低的电位)可以对应于生物电子签名中电流幅度水平的增加(例如，图2中201的右侧)，或者可以对应于生物电子签名中电流幅度水平的降低(例如，图2中201的左侧)。因此，在一些实施方案中，至少一种脱氧核苷酸多磷酸单体上的独特负电荷对应于相对于其对应的标准脱氧核苷酸三磷酸单体的电流幅度水平增加的电流幅度水平。在其他实施方案中，至少一种脱氧核苷酸多磷酸单体上的独特负电荷对应于相对于其对应的标准脱氧核苷酸三磷酸单体的电流幅度水平降低的电流幅度水平。
类似地，在一些实施方案中，存在于溶液(例如，包含生物电子装置和模板核苷酸的溶液)中的核苷酸多磷酸单体中的至少一种相对于其对应的标准核苷酸多磷酸单体具有独特的正电荷。在一些实施方案中，存在于溶液(例如，包含生物电子装置和模板核苷酸的溶液)中的核苷酸多磷酸单体中的至少两种相对于其对应的标准核苷酸多磷酸单体具有独特的正电荷。在一些实施方案中，存在于溶液(例如，包含生物电子装置和模板核苷酸的溶液)中的核苷酸多磷酸单体中的至少三种相对于其对应的标准核苷酸多磷酸单体具有独特的正电荷。在一些实施方案中，存在于溶液(例如，包含生物电子装置和模板核苷酸的溶液)中的核苷酸多磷酸单体中的全部四种相对于其对应的标准核苷酸多磷酸单体具有独特的正电荷。如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，任何化学部分的添加都可以用于改变核苷酸多磷酸单体的电荷(例如，改变成比其对应的标准核苷酸多磷酸单体更正)，只要它们不干扰聚合酶的功能。
在一些实施方案中，至少一种核苷酸多磷酸单体上的独特正电荷对应于相对于其对应的标准核苷酸多磷酸单体的电流幅度水平增加或降低的电流幅度水平。例如，如图2所示，取决于电导峰值，核苷酸多磷酸单体上的附加正电荷(例如，增加的电位)可以对应于生物电子签名中电流幅度水平的降低(例如，图2中201的右侧)，或者可以对应于生物电子签名中电流幅度水平的增加(例如，图2中201的左侧)。因此，在一些实施方案中，至少一种核苷酸多磷酸单体上的独特正电荷对应于相对于其对应的标准核苷酸多磷酸单体的电流幅度水平降低的电流幅度水平。在其他实施方案中，至少一种核苷酸多磷酸单体上的独特正电荷对应于相对于其对应的标准核苷酸多磷酸单体的电流幅度水平增加的电流幅度水平。
根据这些实施方案，各自携带不同电荷的修饰核苷酸的实例包括但不限于脱氧核苷酸多磷酸(dNxP)。图1中提供了四种示例性dNxP的结构。在此实例中，示出了脱氧腺苷三磷酸101的化学结构，即正常的三磷酸形式。这里，“x”是指与核苷酸连接的磷酸的数量；对于101，x＝3。参考数字102、103和104对应于具有附加磷酸基团的脱氧核苷酸。在此实例中，102对应于相对于101携带一个附加电子电荷的脱氧胸苷四磷酸(x＝4)；103对应于相对于101携带三个附加电荷的脱氧胞苷己基磷酸(x＝6)；以及104对应于相对于101携带六个附加电荷的脱氧鸟苷壬基磷酸(x＝9)。图1中提供的这些结构仅为示例性说明。如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，存在许多其他修改正常核苷酸的三磷酸上电荷的方式，包括但不限于在或接近pH 7.0时添加胺基团以诱导正电荷或添加羧酸的硫酸以产生负电荷。进一步的变化也是可能的，例如，通过改变pH以电离连接至脱氧核苷酸的部分。
信号幅度调节的示例性机制在图2中示出。此实例展示了Φ29聚合酶的以纳米西门子(nS)为单位电导作为其在标准氢电极(NHE)标度上以mV为单位的电位的函数。实线是洛伦兹函数拟合：
Figure BDA0003918369440000231
其中E是电位，E0＝259mV并且2Γ＝183mV。远离洛伦兹的峰201或尾202，电导强烈依赖于电位。电导对电位的最大依赖性区域，
Figure BDA0003918369440000232
203在峰的正电位侧出现在
Figure BDA0003918369440000233
或约320mV，如标记204所示。在此区域，斜率，
Figure BDA0003918369440000234
nS/mV。区域205和区域206中的斜率相似，区域205标记聚合酶与Pd电极和Au电极接触时的电位，区域206标记聚合酶与Pt电极和Au电极接触时的电位。
结合带电荷分子的聚合酶的电位变化ΔV可以根据半径为a的球体的库仑充电能和介电常数ε来估计。取电荷为e的N个单位，电子上的电荷，
Figure BDA0003918369440000235
其中ε0是自由空间的介电常数，8.85x 10-12F/m。磷酸链将结合在聚合酶的催化位点，其中相对介电常数(permittivity)ε,(也称为介电常数(dielectric constant))约为4。取Φ29聚合酶的半径为3.5nm，则每单位增加电子电荷的电位偏移为～50mV/e。对应的电导偏移，ΔG为
Figure BDA0003918369440000241
导致约2.5nS的电导变化。这是从三磷酸(如图1中的101)到四磷酸(如图1中的102)的一个容易测量的变化。对于较大数量磷酸的偏移可能会小于此等式使用相对介电常数值4所给出的值。例如，长的多磷酸(诸如104)会突伸到周围的溶剂中，其中介电常数将接近80，从而将电位变化减少80/4＝20倍。在这种情况下，每个添加磷酸的电位偏移将减少到50mV/20或2.5mV，因此链中最后的磷酸仅贡献0.135nS，小得多，但仍然是可测量的量。
在一些实施方案中，本公开的生物电子装置包括用金和铂电极操作的聚合酶，其处于电位206。当聚合酶捕获x>3的dNxP时，聚合酶上的负电荷相对于它捕获常规dNTP的情况增加，从而将其电位偏移到较低的值；并因此，在聚合酶的闭合构象期间(在此期间与模板互补的dNxP被结合)增加电导。因此，只要在最极端值处的偏移电位位于峰201一侧的范围207中，增加的负电荷的影响就通过增加的电导来区分每个核苷酸，顺序为使用图1中所示的dNxP实例，脱氧鸟苷壬基磷酸(x＝9)>脱氧胞苷己基磷酸(x＝6)>脱氧胸苷四磷酸(x＝4)>脱氧腺苷三磷酸(x＝3)。
另外，图3说明了在所有四种脱氧核苷酸三磷酸都存在的情况下获得的信号301。这里，核苷酸的化学身份仅在开放302或闭合303状态的持续时间内是明显的，如PCT申请号PCT/US21/19428中所公开。然而，当每个dNxP携带独特的电荷时，闭合状态下的电流水平表明其身份，如304所示。在刚刚给出的实例中，最高电导状态表示掺入了“g”碱基305，下一个水平306，表示掺入了“c”碱基，下一个，307，表示“t”碱基，以及最低的，308，表示“a”碱基。
3.生物电子装置和***
根据上述方法，本公开的生物电子装置和***通常包括第一电极和第二电极，它们被配置为与待分析的样品(例如，生物聚合物样品)接触。在一些实施方案中，例如当电极是平面的时，第一电极和/或第二电极不需要介电层。在其他实施方案中，第一电极和/或第二电极可以具有介电层。在一些实施方案中，第一电极和/或第二电极包含选自金、银、铜、铂、钯和钌(或其任何合金)的金属。在一些实施方案中，金属是钯。在一些实施方案中，本公开的方法包括在第一电极与第二电极之间施加100mV或更小的电压偏压。本领域普通技术人员基于本公开将认识到，根据本文所述的各种方法，本公开的生物电子装置和***可以用于通过类似技术对DNA和RNA聚合物进行测序(例如，使用依赖于RNA的RNA聚合酶和各自带有独特电荷的四种不同核糖核苷酸对RNA聚合物进行测序)。
在一些实施方案中，第一电极与第二电极之间的间隙为约1.0nm至约50.0nm的宽度。在一些实施方案中，第一电极与第二电极之间的间隙为约1.0nm至约40.0nm的宽度。在一些实施方案中，第一电极与第二电极之间的间隙为约1.0nm至约30.0nm的宽度。在一些实施方案中，第一电极与第二电极之间的间隙为约1.0nm至约20.0nm的宽度。在一些实施方案中，所述间隙具有约1.0nm至约10.0nm的宽度。在一些实施方案中，所述间隙具有约1.0nm至约7.5nm的宽度。在一些实施方案中，所述间隙具有约1.0nm至约5.0nm的宽度。在一些实施方案中，所述间隙具有约4.0nm至约5.0nm的宽度。
在一些实施方案中，聚合酶可以在一个实施方案中连接至一个电极，在另一个实施方案中连接至两个电极。聚合酶可以直接或间接地连接至电极。在一些实施方案中，聚合酶通过接头连接至电极。在一些实施方案中，聚合酶通过与连接至电极的配体相互作用而间接连接至电极。在一些实施方案中，聚合酶被修饰以掺入配体结合位点。在一些实施方案中，聚合酶是生物素化聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶包含Avitag。在一些实施方案中，聚合酶是生物素化聚合酶并且通过链霉亲和素连接至电极。在一些实施方案中，聚合酶被修饰以掺入允许其他化学基团点击化学连接至电极的氨基酸残基(例如，4-叠氮基-L-苯丙氨酸)。在一些实施方案中，聚合酶的核酸外切酶活性被禁用。在一些实施方案中，接头连接至聚合酶的非活性的区域。
当聚合酶连接至两个电极时，两个连接点之间的距离为至少约1nm至约聚合酶的总体大小。在一个实施方案中，所述距离为约1nm至约10nm。在另一个实施方案中，所述距离为约3nm至约7nm。在另一个实施方案中，所述距离为约5nm至约6nm。在一些实施方案中，所述距离为约2nm至约8nm。
在聚合酶连接至两个电极的情况下，当聚合酶经历从开放到闭合的构象变化时，两个连接点不得相对移动。许多聚合酶的晶体结构目前可获得开放和封闭两种形式(参见，例如，//www.rcsb.org/)。因此，当选择两个连接点时，两个残基之间分开的距离必须与用于接触聚合酶的电极之间的间隙相似，诸如在约1nm与约10nm之间。例如，在一些实施方案中，此距离在2nm与8nm之间。在实施方案中，两个连接点在开放和闭合形式中具有相同的原子坐标，在半纳米的程度以内。
在一些实施方案中，聚合酶掺入了***的柔性序列。任何肽都可以用作柔性序列，只要(a)它不形成α螺旋或β折叠，并且(b)序列中的残基不会实质性改变相对于未修饰聚合酶pI的pI。预期可以使用附加的聚合酶，只要修饰的聚合酶有效地起作用，这可以通过滚环扩增测定来确定。
在一些实施方案中，所述装置还包括核酸模板。核酸模板在一个实施方案中可以是DNA模板，在另一个实施方案中可以是RNA模板。为了使聚合酶以最大速度操作并且为了易于处理电信号，应当理解聚合酶不被DNA模板形成的二级结构拖延或阻碍，诸如当模板包含单链区域时。
如本文进一步描述的，活性感兴趣蛋白质的生物电子签名的各种特征或特性可以用于确定生物聚合物的序列。如本领域技术人员基于本公开将认识到的，获得生物电子签名和提取本文所述的各种特征的方法可以用于使用任何对应的感兴趣酶来确定任何生物聚合物的序列，所述感兴趣酶包括但不限于聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶。根据这些实施方案，本公开还提供了生物电子装置和***，其中改变了感兴趣蛋白质上的电荷以调节蛋白质复合物(例如，感兴趣蛋白质和对应接头)的总电导。例如，在配置有铂电极的生物电子装置中的给定蛋白质复合物的电导可以通过改变蛋白质复合物的电荷(例如，使电位偏移)而调节(例如，增加)到与金电极提供的电导相似。因此，本公开的实施方案包括生物电子装置，所述生物电子装置包括由间隙间隔开的第一电极和第二电极，以及经由包含独特电荷的接头连接至第一电极和第二电极的蛋白质(例如，聚合酶)。在一些实施方案中，独特的电荷以增强生物电子装置的功能(例如，生物聚合物的测序)的方式调节通过蛋白质的电导。
在一些实施方案中，用于产生本公开的生物电子装置的接头包括肽或多肽。在一些实施方案中，所述接头包含链霉亲和素。在一些实施方案中，接头包含经修饰以具有正电荷或负电荷(例如，用多谷氨酸)的链霉亲和素。在一些实施方案中，感兴趣蛋白质是生物素化的。在一些实施方案中，接头包含独特的负电荷。在一些实施方案中，独特的负电荷通过添加与链霉亲和素偶联的谷氨酸部分、天冬氨酸部分或其组合(包括衍生物、变体和聚合物)赋予。在一些实施方案中，独特的负电荷增加通过蛋白质的电导。在一些实施方案中，接头包含独特的正电荷。在一些实施方案中，独特的正电荷通过添加与链霉亲和素偶联的精氨酸部分、组氨酸部分、赖氨酸部分或其组合(包括衍生物、变体和聚合物)赋予。在一些实施方案中，独特的正电荷增加或降低通过蛋白质的电导。
如本文进一步描述的，电荷对电子传输的影响通过比较用野生型链霉亲和素获得的电导与用在包含链霉亲和素四聚体的四个单体中的每一个的C末端含有附加六谷氨酸(六个负电荷)尾的链霉亲和素分子获得的电导来证明。图4包括六谷氨酸突变型链霉亲和素的骨架结构的代表性图，其示出了在靠近生物素配体从蛋白质单体中产生的位置连接至标记为(1、2、3、4)的每个链霉亲和素单体的C末端的带电荷尾部(E6)。四个六谷氨酸尾401、402、403和404被标记为E6。
图5A-5B包括了使用Pd电极在2.5nm间隙处测量的野生型(图5A)和六谷氨酸突变型链霉亲和素(图5B)的代表性电导分布。在每种情况下(501、502)的最高电导峰对应于电极之间的期望最大键合。这些测量是用Pd电极进行的。对于野生型，最高峰的电导为6.8nS。对于E6突变体，它为21.38nS。因此，增加24个电子电荷后，电导增加了14.58nS。这大约是每个电子电荷0.6nS，小于上面估计的最大值，但足够大，可以很容易地测量。
电导的电荷调节带来了几个优点，包括但不限于，使用电极增加复合物的电导，这些电极的静止电位使它们远离电导对电位曲线的峰值(参见，例如图2)。使用金或金-钯组合电极可以获得峰值电导，但金在许多半导体工艺中作为电极材料具有各种限制。因此，使用诸如Pt或Pd或其他贵金属等其他金属是有利的，但这样做会导致信号减弱。因此，如本文所提供的，可以通过改变蛋白质复合物的电荷(例如，使用修饰的链霉亲和素作为接头)来恢复或增强信号。
图6A-6B包括了使用野生型链霉亲和素(图6A)和六谷氨酸突变型链霉亲和素(图6B)的桥接电极对的链霉亲和素连接的Φ29聚合酶的代表性图。在每个图下方的图表中提供了在4.5nm间隙处使用Pd电极测量的对应电导分布。图6A和6B中的图表包括了通过野生型链霉亲和素502偶联到生物素化电极501的双生物素化Φ29 503聚合酶的电导分布。对于本实例中使用的Pd电极，峰值电导506为6.61nS。图6B示出了在Pd电极上测量的相同复合物的电导分布，但是使用六谷氨酸突变型链霉亲和素作为连接器504。电导峰值507增加到11.22nS。尽管本文针对链霉亲和素分子证明了这种效果，但它可以容易地应用于用作连接器的任何其他类型的蛋白质分子，如本领域普通技术人员基于本公开所认识到的。
根据上述实施方案，聚合酶可以使用包含链霉亲和素的接头与第一电极和第二电极功能性偶联。在一些实施方案中，聚合酶是生物素化的。在一些实施方案中，接头连接至聚合酶的非活性的区域。在一些实施方案中，聚合酶以及第一电极和第二电极是生物素化的，并且接头包含链霉亲和素分子，所述链霉亲和素分子包含至少两个生物素结合位点。在一些实施方案中，聚合酶的核酸外切酶活性被禁用。在一些实施方案中，所述间隙具有约1.0nm至约20.0nm的宽度。在一些实施方案中，所述第一电极和所述第二电极由介电层间隔开。在一些实施方案中，所述方法包括在第一电极与第二电极之间施加100mV或更小的电压偏压。
本公开的实施方案还包括一种用于聚合酶活性的直接电测量的***。根据这些实施方案，所述***包括以下中的任一者：本文所述的生物电子装置、用于引入能够与聚合酶相互作用的dNTP的装置、用于在第一电极与第二电极之间施加100mV或更低的电压偏压的装置以及用于监测dNTP通过聚合酶被掺入到模板多核苷酸中时发生的波动的装置。
正如本领域普通技术人员在受益于本公开的教导后将容易地认识到和理解，本文描述的方法可以与感测酶(例如，聚合酶)的开放和闭合状态的持续时间的任何生物电子装置一起使用。示例性装置包括但不限于美国专利号10,422,787和PCT申请号PCT/US2019/032707中公开的生物电子装置和***，这两个专利均以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

Claims (35)

1.一种使用生物电子装置对多核苷酸进行测序的方法，所述方法包括：
(a)将模板多核苷酸引入到生物电子装置中，其中所述生物电子装置包含与第一电极和第二电极中的至少一个功能性偶联的聚合酶；
(b)将包含四种核苷酸多磷酸单体的溶液引入到包含所述模板多核苷酸的所述装置中，其中存在于所述溶液中的所述四种核苷酸多磷酸单体中的至少三种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体具有独特的电荷；以及
(c)基于当每个互补核苷酸多磷酸单体被掺入到所述模板多核苷酸中时的电流波动获得聚合酶活性的生物电子签名；
其中所述生物电子签名的至少一个特征鉴定被掺入到所述模板多核苷酸中的每个所述互补核苷酸多磷酸单体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物电子签名包括对应于所述聚合酶处于闭合状态的闭合时段。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物电子签名的所述至少一个特征包括电流幅度水平。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中存在于所述溶液中的所述核苷酸多磷酸单体中的至少一种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的负电荷。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中存在于所述溶液中的所述核苷酸多磷酸单体中的至少两种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的负电荷。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中存在于所述溶液中的所述核苷酸多磷酸单体中的至少三种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的负电荷。
7.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述负电荷由至少一个附加的磷酸基团相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体赋予。
8.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述负电荷由1至20个附加的磷酸基团赋予。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中存在于所述溶液中的所述核苷酸多磷酸单体中的至少一种相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体包含独特的正电荷。
10.如权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述至少一种核苷酸多磷酸单体上的独特负电荷对应于相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体的电流幅度水平增加或降低的电流幅度水平。
11.如权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述至少一种核苷酸多磷酸单体上的独特正电荷对应于相对于其对应的标准核苷酸三磷酸单体的电流幅度水平增加或降低的电流幅度水平。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述模板多核苷酸是DNA。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述聚合酶的核酸外切酶活性被禁用。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述聚合酶使用包含硫代链霉亲和素的接头与所述第一电极和所述第二电极功能性偶联。
15.如权利要求14所述的方法，其中接头连接至所述聚合酶的非活性的区域。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述第一电极与所述第二电极之间施加100mV或更小的电压偏压。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述标准核苷酸三磷酸单体包括腺嘌呤(dATP)、胞嘧啶(dCTP)、鸟嘌呤(dGTP)和胸腺嘧啶(dTTP)。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述第一电极和/或所述第二电极包含金、钯、铂、银、铜或其任何合金。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述装置包括至少部分地覆盖所述第一电极和/或所述第二电极的顶表面的介电层。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述第一电极和所述第二电极被定位成使得在所述两个电极之间形成约1nm至约50nm的间隙。
21.一种生物电子装置，其包括：
由间隙间隔开的第一电极和第二电极；以及
经由包含独特电荷的接头连接至所述第一电极和所述第二电极的蛋白质；
其中所述独特电荷调节通过所述蛋白质的电导。
22.如权利要求21所述的装置，其中所述接头包含肽或多肽。
23.如权利要求21或权利要求22所述的装置，其中所述接头包含链霉亲和素。
24.如权利要求21至权利要求23中任一项所述的装置，其中所述蛋白质是生物素化的。
25.如权利要求21至权利要求24中任一项所述的装置，其中所述接头包含独特的负电荷。
26.如权利要求25所述的装置，其中所述独特的负电荷通过添加与所述链霉亲和素偶联的谷氨酸部分、天冬氨酸部分或其组合赋予。
27.如权利要求25或权利要求26所述的装置，其中所述独特的负电荷增加通过所述蛋白质的电导。
28.如权利要求21至24中任一项所述的装置，其中所述接头包含独特的正电荷。
29.如权利要求28所述的装置，其中所述独特的正电荷通过添加与所述链霉亲和素偶联的精氨酸部分、组氨酸部分、赖氨酸部分或其组合赋予。
30.如权利要求28或权利要求29所述的装置，其中所述独特的正电荷增加或降低通过所述蛋白质的电导。
31.如权利要求21至30中任一项所述的装置，其中所述第一电极和/或所述第二电极包含金、钯、铂、银、铜或其任何合金。
32.如权利要求21至31中任一项所述的装置，其中所述蛋白质选自由以下各项组成的组：聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶。
33.如权利要求21至32中任一项所述的装置，其中所述接头连接至所述蛋白质的非活性区域。
34.如权利要求21至33中任一项所述的装置，其中所述接头包含与多谷氨酸部分偶联的链霉亲和素，所述蛋白质包含聚合酶，并且所述第一电极和所述第二电极包含钯、铂或其任何合金。
35.一种使用权利要求21至34中任一项所述的装置调节通过蛋白质的电子电导的方法。
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