CN115552015A - 经由同时敲入和基因破坏来改造免疫细胞 - Google Patents

Abstract

产生能够用作用于治疗疾病的通用嵌合抗原受体(CAR)T细胞的修饰的宿主细胞的方法。方法包括使用基因编辑技术，如基于CRISPR/Cas9的基因组编辑，在宿主细胞基因组中的特定位点如TCR或HLA基因处***编码CAR的多核苷酸。***能够失活TCR或HLA基因，从而降低可能在患者中触发移植物抗宿主病(GVHD)的基因的表达。

Description

经由同时敲入和基因破坏来改造免疫细胞

序列表

本申请包含已以ASCII格式电子提交的序列表，并在此通过引用将其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年2月25日，名为080015-1233866_(030010PC)_SL.txt，且大小为543,002字串。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是一种治疗方法，其中供体的T细胞在离体下进行基因改造以表达对肿瘤抗原特异的CAR，在培养中扩增，然后回输给患者以发挥计划的功能。CAR-T疗法代表了一种非常有前景的用于癌症治疗的细胞免疫疗法，并且现在它不仅被广泛应用于治疗血液恶性肿瘤，而且还用于治疗一些实体瘤[1,2]。迄今为止，CAR-T治疗的标准程序依赖于自体细胞移植，这种方法昂贵、耗时，并且对于患有晚期癌症患者的自体移植，通常难以产生足够质量和数量的CAR-T细胞。这些限制极大地阻碍了CAR-T疗法的应用。

使用同种异体CAR-T细胞的主要障碍是与注入具有免疫活性的同种异体T细胞相关的高风险的移植物抗宿主病(GVHD)，这些同种异体T细胞携带TCR或HLA以靶向宿主细胞。有证据表明，这可以通过抑制CAR-T细胞中TCR或HLA I类基因的表达来解决。CRISPR技术的突破使靶向基因组编辑成为可能，并为开发治疗人类疾病的新治疗策略带来了巨大希望。最近的研究还尝试采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑来破坏/敲除TCR或HLA I类基因，以生成通用CAR-T细胞[2,3]。因此，没有TRAC/TRBC或HLA I类抗原的经修饰的T细胞不能识别同种异体抗原，并避免产生GVHD。

目前的CAR-T细胞是通过使用病毒载体(主要是γ-逆转录病毒和慢病毒)将CAR盒非定义地整合到患者T细胞基因组中而产生的。经由这种策略产生的CAR-T细胞已被FDA批准的两种自体CAR-T疗法Kymriah和Yescarta^TM采用，并且在治疗难治性/复发性ALL患者中均显示出非常高的反应率[2,20]。尽管这些CAR-T疗法有效，但关于由于不同基因组区域处的随机整合导致的CAR表达的不可预测和变化的担忧仍然存在[1]。

一些研究报告了使用ZFNs[4-6]、TALENs[7]和CRISPR/Cas9[6,8,9]来生成具有TCR或HLA I类基因缺陷的通用CAR-T细胞。这些研究显示了使用TRAC缺陷型CAR-T细胞进行现成疗法的潜力。Torikai et al.进行了一项开创性研究，以通过使用ZFNs特异性阻断内源性TCR表达来生成通用T细胞[5]。Qasim et al.的另一项研究在抗CD19CAR-T细胞生成中使用了基于TALEN的编辑进行TRAC敲除，并在两名患者中评估了该产品[10]。不幸的是，两项研究的治疗效果都不令人满意。此外，一名婴儿患者由于来源于未编辑的T细胞的MHC与保留的TRAC基因不匹配而经历了移植物抗宿主病(GVHD)，这表明临床治疗需要更彻底的编辑，并还强调了基因编辑效率在临床应用中的意义。Ren J et al.进行了多重基因组编辑，以利用高编辑频率破坏TRAC和TRBC表达，并减少动物模型中的GVHD反应[9]。Eyquem etal.的另一项研究还采用了CRISPR/Cas9来靶向TRAC位点，并与含有CD19 CAR的腺相关病毒(AAV)病毒耦合，作为HDR修复的DNA模板。抗CD19 CAR的整合是在内源性TRAC启动子下驱动的，允许表达更接近TRAC生理调节下的表达，这也导致了卓越的抗肿瘤性能[8]。Chen Sidi的课题组利用类似的AAV-CRISPR-Cpf1***将双CARs(CD19和CD22)整合到TRAC和PD1位点中，以同时破坏TRAC和PD1的表达，并且双CAR敲入***产生了通用的CAR-T细胞，其在细胞因子产生和癌细胞杀伤方面具有更强的效力[6]。在成人和儿童患者中使用通用抗CD19CAR-T细胞的两项I期临床试验已经启动。简言之，将来源于健康供体T细胞的T细胞通过整合抗CD19 CAR以及敲除TRAC和CD52而进行基因改造，以允许将其应用于非HLA匹配的患者。尽管试验仍在进行中，但初步数据显示GVHD温和且发生率低，并且具有良好的抗肿瘤反应[11]。

迄今为止，通过靶向破坏TRAC位点产生通用CAR-T细胞在介导癌细胞清除，并同时降低CAR-T细胞免疫原性方面显示出巨大潜力。[6,8]。两种方法主要应用于生成通用TRAC敲除CAR-T细胞。一种方法将CAR的慢病毒或逆转录病毒递送与CRISPR/Cas9介导的靶向TRAC基因敲除相结合[12-14]，且另一种方法使用基于CRISPR/Cas9的TRAC靶向与含有CAR的AAV HDR模板配对来在TRAC位点中敲入CAR[6,8]。虽然这两种方法都产生了有效的CAR-T细胞，但前一种方法需要对CAR***和TRAC敲除进行两步基因修饰，这给制造和评估过程带来了额外的困难，并且慢病毒的随机基因组整合性质可能导致CAR-T细胞中的致癌转化、多样化的转基因表达和转录沉默[15,16]，这限制了其在临床试验中的应用。而后一种方法通过一个单一的基因靶向实现了CAR敲入和TRAC敲除，并且这大大简化了整个程序。此外，采用含有无启动子的CAR的AAV HDR模板供体可以在内源性TRAC启动子的控制下导致更安全和恒定的CAR表达[17]。因此，通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑将CAR引导至TRAC位点在生成通用CAR-T细胞方面显示出巨大的前景。

发明概述

本文描述了高效生成能够用作通用CAR-T细胞的经修饰的宿主细胞的方法和组合物。宿主细胞经改造以同时破坏编码可能触发移植物抗宿主病(GVHD)的蛋白的基因位点，并在该基因位点处***编码抗原结合蛋白的多核苷酸，其中所述抗原结合蛋白特异性结合由患病细胞，如癌症或肿瘤细胞表达的抗原。可以使用基因组编辑方法，如CRISPR技术来修饰宿主细胞。

一方面，方法是在宿主细胞基因组中的预定位点处***多核苷酸序列的体外方法，所述方法包括：

按顺序将宿主细胞与以下物质接触：

(i)供体载体，其包含：(1)编码至少一种多肽的多核苷酸序列；(2)多核苷酸序列3’端的多聚A片段；和(3)与宿主细胞基因组中靶序列的侧翼区共有相同序列的两个同源片段，一个位于多核苷酸序列的5’端，且另一个位于供体载体中多聚A片段的3’端；和

(ii)核糖核蛋白复合体(RNP)，其包含：(1)Cas核酸酶，和(2)与宿主细胞基因组中预定位点内的至少两条选定的核酸序列互补的至少两种小向导RNAs(sgRNA)。

在一些实施方案中，供体载体选自质粒、AAV病毒颗粒、腺病毒颗粒、慢病毒颗粒或DNA-纳米颗粒复合体。在一些实施方案中，供体载体还包含至少一个编码具有抗肿瘤活性的CAR的多核苷酸序列。在一些实施方案中，供体载体还包含至少一个编码特异性结合肿瘤抗原，例如，由肿瘤细胞表达的抗原的CAR的多核苷酸序列。在一些实施方案中，供体载体还包含至少一个编码抗CD19 CAR、抗CD20 CAR、抗CD22 CAR、抗CD47 CAR或抗BCMA CAR蛋白的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，供体载体还包含至少一个编码免疫检查点蛋白或抗免疫检查点蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，供体载体还包含至少一个编码报告子基因的多核苷酸序列。在一些实施方案中，供体载体还包含2A自切割序列、内部核糖体进入位点(IRES)元件，或位于至少一个基因编码序列5’端的启动子。在一些实施方案中，供体载体包含另外的控制编码CAR蛋白的序列表达的调控或连接元件，例如，位于蛋白编码序列下游或3’的调控或连接元件。

在一些实施方案中，Cas核酸酶选自蛋白质或编码蛋白质的RNA分子。在一些实施方案中，Cas核酸酶是1类内切核酸酶或2类内切核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是Cas9、Cpf1或具有基因组编辑功能的Cas直系同源物。

在一些实施方案中，表2中列出的至少两种靶向TRAC序列的小向导RNAs(sgRNA)被用于核糖核蛋白复合体中。在一些实施方案中，核糖核蛋白复合体中的至少两种小向导RNAs(sgRNA)选自与宿主细胞基因组中靶位点内的至少两条选定的核酸序列互补的任何序列。

在一些实施方案中，方法还包括检测从多核苷酸序列的转录RNA，或由多核苷酸序列编码、由宿主细胞表达的蛋白质。

在一些实施方案中，方法还包括经由体外或体内测定评估***的多核苷酸的功能。在一些实施方案中，体外测定是细胞毒性测定。在一些实施方案中，细胞毒性测定包括将表达靶抗原的靶细胞与本文所述的经修饰的宿主细胞接触，以及确定由所述细胞裂解的细胞的数量，其中多肽特异性结合靶抗原。

在一些实施方案中，体内测定包括将本文所述经修饰的宿主细胞给予活的生物体，其中所述活的生物体包含表达特异性结合多肽的靶抗原的细胞，以及检测表达靶抗原的细胞数量的减少。在一些实施方案中，活的生物体是动物、哺乳动物或人。

在一些实施方案中，宿主细胞分离自患癌的人。在一些实施方案中，宿主细胞分离自携带遗传性疾病的人。

在一些实施方案中，预定位点是TRAC、ACTB或GAPDH。

在一些实施方案中，至少两种向导RNA包含与宿主细胞基因组中预定的多核苷酸序列互补的约20个核苷酸的核酸区域。

在一些实施方案中，方法还包括将宿主细胞给予对象，以治疗对象中的疾病。在一些实施方案中，疾病是血液癌症。

另一方面，提供了经修饰的宿主细胞。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞通过本文所述的方法产生。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞是免疫细胞，如T细胞。在一些实施方案中，提供了包含本文所述经修饰的宿主细胞的药物组合物。

另一方面，提供了治疗对象各种的疾病的方法，所述方法包括：将本文所述的治疗有效量的一种或多种(或许多种)经修饰的宿主细胞给予对象。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞是分离自对象的自身免疫细胞。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞是同种异体免疫细胞。

在一些实施方案中，方法还包括检测由供体载体中的多核苷酸序列编码的RNA或蛋白质的表达。在一些实施方案中，方法还包括确认由多核苷酸序列编码的RNA或蛋白质的表达足以治疗疾病。在一些实施方案中，疾病是血液癌症。

另一方面，提供了本文所述的用于治疗疾病的一种或多种(或许多种)经修饰的宿主细胞。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞是分离自对象的自身免疫细胞。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，疾病是血液癌症。

另一方面，提供了本文所述的一种或多种(或许多种)经修饰的宿主细胞在制备用于治疗疾病的药物组合物中的应用。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞是分离自对象的自身免疫细胞。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，疾病是血液癌症。

另一方面，提供了治疗体细胞组织疾病的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：

(i)包含供体载体的第一容器，其中所述供体载体包含编码CAR的多核苷酸；

(ii)包含与宿主细胞基因组中选定的核酸序列互补的至少两种sgRNA的第二容器；和

(iii)包含Cas核酸酶的第三容器。

在一些实施方案中，试剂盒还包含Cas或CfPl蛋白，或者编码Cas或Cfpl蛋白的RNA。在一些实施方案中，试剂盒还包含说明书手册。

附图的简要说明

图1.通过不同sgRNAs靶向TRAC位点处的CRISPR/Cas9介导的HDR。

图1A.使用不同sgRNAs的基于Cas9-RNP的TRAC HDR编辑的示意图，以及用于TRAC编辑的AAV供体TRAC-800bp的设计。箭头指示T7E1测定中用于基因组PCR扩增的引物。图1B.用于在Jurkat细胞中靶向TRAC位点的不同sgRNAs的T7E1测定，并且包括没有进行TRAC编辑的对照组。图1C.用于使用AAV6 TRAC-800bp供体和不同sgRNAs在Jurkat细胞中进行TRAC靶向的流式细胞术分析。图1D.用于使用利用不同截短的或非截短的sgRNAs组装的Cas9，结合TRAC-800bp AAV6供体，在Jurkat细胞中进行TRAC靶向的流式细胞术分析。X轴表示GFP表达水平，且GFP百分比显示在流式图(flow plot)中。

图2.通过不同AAV供体在TRAC位点处进行的CRISPR/Cas9介导的HDR靶向。

图2A.使用不同AAV HDR供体，包括TRAC-800bp、TRAC-400bp和TRAC-2A-800bp供体进行的基于Cas9-RNP的TRAC靶向的示意图。图2B.用于使用A中所示的不同供体在Jurkat细胞中进行TRAC靶向的流式细胞术分析。X轴表示GFP表达水平，且GFP百分比显示在流式图中。图2C.使用TRAC-800bp-LRA、TRAC-SFFV-GFP和TRAC-EF1α-GFP供体的AAV供体的基于Cas9 RNP的TRAC靶向的流程图。图2D.用于在电穿孔后第3天(上图)和第15天(下图)使用不同AAV供体于Jurkat细胞中进行TRAC靶向的流式细胞术分析。图2E.用于在电穿孔后第15天于Jurkat细胞中进行TRAC靶向后进行TRAC蛋白检测的流式细胞术。X轴表示代表TRAC供体敲入的GFP信号，而Y轴表示提示Jurkat细胞中的TRAC表达的PE水平。图2F.显示Cas9 RNP靶向后Jurkat细胞的TRAC阳性百分比的条形图。

图3.使用用于TRAC基因破坏的AAV供体和配对的sgRNAs在Jurkat细胞和T细胞中的TRAC位点处进行的CRISPR/Cas9介导的HDR转基因整合。

图3A.用于使用与AAV供体组合的不同配对sgRNAs进行基于Cas9-RNP的TRAC靶向的示意图。(i)使用与TRAC-800bp-LRA或TRAC-800bp HDR AAV供体组合的配对sgRNAs(sg19-19bp&sg24)进行的TRAC靶向。(ii)使用与TRAC-2A-800bp供体组合的配对sgRNAs(sg19-19bp&sg24)进行的TRAC靶向。图3B.用于使用单一或配对sgRNAs(sg19-19bp&24)，并与TRAC-800bp HDR供体组合，在Jurkat细胞中进行TRAC靶向的流式细胞术分析。图3C.用于使用(sg19-19bp&24)的sgRNAs与TRAC-800bp供体或TRAC-800bp-LRAAAV供体的配对和sg5&24的sgRNAs与TRAC-2A-800bp AAV供体的配对，在Jurkat细胞中进行TRAC靶向的流式细胞术分析。图3D.用于通过sg19-19bp&24的sgRNAs与TRAC-800bp-LRA供体的配对和sg5&24的sgRNAs与TRAC-2A-800bp供体的配对，在Jurkat细胞中进行靶向的TRAC染色的流式细胞术分析。图3E.使用配对sg19-19bp&sg24并与TRAC-800bp-LRA AAV供体组合，在活化的人T细胞中进行的基于Cas9RNP的TRAC靶向的示意图。图3F.在T细胞中进行的TRAC靶向的流式细胞术分析。X轴表示GFP表达水平，且GFP百分比显示在流式图中。图3G.使用图3B中的电穿孔细胞进行的TRAC表达水平的流式细胞术分析。图3H.在第4天或电穿孔后4周，当将更高MOI的AAV6应用于转导时，在T细胞中进行的TRAC靶向的流式细胞术分析。

图4.在TRAC位点处进行的用以产生通用CAR-T细胞的CRISPR/Cas9-HDR介导的CAR敲入。

图4A.(i)使用TRAC-E2A-CAR和TRAC-SFFV-CAR的AAV病毒进行的Cas9-RNP介导的TRAC敲入的示意图。(ii)用于在人T细胞中进行慢病毒转导的Lenti-SFFV-CAR载体和Lenti-EF1α-CAR载体的示意图。图4B.使用基于Cas9 RNP的靶向在人T细胞中进行的TRAC靶向的流式细胞术分析。图4C.靶向CD19+BV173-LUC(i)和CD19-OCI-AML3-LUC(ii)细胞的不同CAR-T细胞的细胞毒性分析。包括了未经基因组修饰的T细胞来作为对照。“*”表示当与对照T细胞组相比时，p值小于0.05。实验以一式两份进行。

定义

如本文所用，术语“包括”是开放式的技术术语，并且不排除另外的元件或特征。

如本文所用，“基因”或“报告子”是指编码蛋白质产物的多核苷酸序列，其可以在适当条件下产生可检测信号，该可检测信号允许检测以指示报告子基因蛋白产物的存在和/或数量。

如本文所用，术语“细胞”是指微生物，并且包括可以是或已经是本发明的任何重组载体或分离的多核苷酸的受体的单个细胞或细胞培养物。

术语“宿主细胞”是指能够通过本文所述的方法进行修饰的细胞，并且包括来源于动物和哺乳动物的细胞，包括来源于家畜、伴侣动物、大鼠、小鼠和人的细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然、偶然或故意突变和/或变化，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或总DNA互补性上)。宿主细胞包括已将本公开的重组载体或多核苷酸引入其中的细胞，包括通过转化、转染等。

“Cas9”或(CRISPR相关蛋白9)是一种RNA引导的DNA核酸内切酶，与化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)等细菌中的CRISPR(成簇规则散布回文重复)适应性免疫***相关。化脓性链球菌利用Cas9来记忆并随后询问和切割外来DNA，如入侵噬菌体的DNA。Cas9与小向导RNA(sgRNA)复合，通过展开外来DNA并检查DNA是否包含与sgRNA的20bp间隔区互补的任何序列片段来执行此询问。如果sgRNA在DNA中发现序列互补性，它就会被Cas9切割。

如本文所用，“sgRNA”或“小向导RNA”是指能够与Cas9蛋白形成复合体并包含与靶DNA序列互补的约20个核苷酸的片段的短RNA分子，使得Cas9-sgRNA复合体在sgRNA识别靶DNA序列中的互补序列时指导Cas9切割靶DNA序列。因此，sgRNA是大约20个碱基的序列(范围从大约10-50、15-45或20-40，例如，15、20、25或30个碱基)，其对非可变支架序列的目标DNA的5’端具有特异性。

如本文所用，术语“3’-UTR”是本领域技术人员理解的术语，并且意指紧接在翻译终止密码子之后的信使RNA(mRNA)部分。mRNA分子从DNA序列转录，然后翻译成蛋白质。

如本文所用，术语“IRES”是本领域技术人员理解的术语，并且意指已知可吸引真核核糖体翻译起始复合体并因此促进翻译起始，而与常用的5’端7mG帽结构的存在无关的内部核糖体进入位点片段。

如本文所用，术语“eGFP”是本领域技术人员理解的术语，并且意指具有F64L点突变的增强型绿色荧光蛋白，其在37℃下折叠效率。因此，eGFP导致GFPs在哺乳动物细胞中的显著性能。

如本文所用，术语“Luc”是本领域技术人员理解的术语，并且意指萤火虫萤光素酶蛋白，其是催化萤光素氧化并使其产生可见光的酶。

如本文所用，术语“GAPDH”是本领域技术人员理解的术语，并且意指产生甘油醛3-磷酸脱氢酶的管家基因。GAPDH基因通常在大多数人体组织和细胞中稳定且组成型地高水平表达。因此，GAPDH通常用作蛋白质印迹的对照以检查蛋白质表达水平，或用于qPCR以检查mRNA表达水平。

术语“表达盒”或“构建体”或“载体”或“供体质粒”或“供体载体”可互换使用，并且是指当引入宿主细胞时分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。表达盒的一个实例是多核苷酸构建体，其包含编码可操作地连接至启动子，例如其天然启动子的本发明蛋白质的多肽的多核苷酸序列，其中将表达盒引入异源微生物或宿主细胞中。在一些实施方案中，表达盒包含编码本发明多肽的多核苷酸序列，其中多核苷酸靶向微生物或宿主细胞基因组中的位置，使得多核苷酸序列的表达由存在于微生物或宿主细胞中的启动子驱动。

术语“靶序列”或“靶DNA序列”在用于指代本发明的基因组序列或多核苷酸构建体(例如，供体质粒)的预定区段时，在靶序列与其对应sgRNA之间的序列同一性百分比方面类似地定义。

如本文所用，术语“CRISPR***”是指赋予对外来遗传元件抗性的原核免疫***。CRISPR是成簇的规则间隔的短回文重复序列的缩写，其是原核DNA片段，包含从质粒或噬菌体获得的短的、重复的碱基序列。这些片段可以转录成RNA并形成支架，以与CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，如Cas9)结合。组合的复合体将被引导降解由这些转录片段识别的靶序列以获得免疫。

如本文所用，术语“AAV”或“腺相关病毒”是指从天然流行的非致病性腺相关病毒发展而来的病毒载体***，该病毒是感染人类和一些其他哺乳动物物种的小病毒。AAV病毒载体具有非常低的免疫原性，可以感染***和静止细胞，并在染色体外状态下持续存在，而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特性使AAV***成为体内基因传递和基因治疗的有用工具。最近利用AAV进行基因治疗的人体临床试验已经证明了这种方法。

如本文所用，术语“AAV供体”是指用作供体模板并携带后续基因组编辑和敲入所需的可变元件组的载体。

如本文所用，术语“HDR”或“同源定向重组”或“同源重组”是指DNA修复机制。面对DNA断裂，细胞可以利用姐妹染色质或任何提供的供体，通过在断裂位点周围配对同源序列，根据完整的等位基因或模板对其进行修复。

如本文所用，术语“NHEJ”或“非同源末端连接”是指DNA修复机制。面对DNA断裂，细胞可以通过直接将DNA末端连接在一起来修复断裂位点，并且在此过程中，可能会***或删除小核苷酸。

如本文所用，术语“RNP”是本领域技术人员理解的术语，并且意指由Cas9蛋白和向导RNA寡核苷酸组成的核糖核蛋白复合体，并应用于细胞或动物模型中的基因组编辑。

如本文所用，术语“CD19”是本领域技术人员理解的术语，并且也称为CD19分子，并且它编码在除浆细胞之外的所有B谱系细胞和滤泡树突细胞中表达的跨膜蛋白。它是B淋巴细胞发育、淋巴瘤诊断的生物标志物，并且可用作白血病免疫治疗的靶标。

如本文所用，术语“TRAC”是本领域技术人员理解的术语，并且意指T细胞受体α链的恒定区。α-βT细胞受体是抗原特异性受体，其对免疫反应至关重要，且存在于T淋巴细胞的细胞表面上。

如本文所用，术语“Jurkat细胞”、“Jurkat细胞”或“Jurkat”是本领域技术人员理解的术语，并且意指人T淋巴细胞的永生化细胞系，并广泛用于研究急性T细胞白血病、T细胞信号传导和功能荧光素酶。

如本文所用，术语“活化的T细胞”是指已被CD3和CD28共刺激信号活化的T细胞。活化的T细胞通常在培养基中快速***并分泌调节或协助免疫反应的细胞因子。

如本文所用，术语“BV173”是本领域技术人员理解的术语，并且BV173意指来源于患费城染色体(Ph1)阳性急性白血病患者的细胞系。

如本文所用，术语“BV173-Luc”是本领域技术人员理解的术语。BV173-Luc细胞来源于BV173细胞，通过慢病毒转导将恒定的荧光素酶-GFP盒整合到细胞基因组中。BV173-luc细胞已证实CD19阳性，并用于检测CAR-T细胞的细胞毒性。

如本文所用，术语“OCI-AML3”是本领域技术人员理解的术语。OCI-AML3是从1987年诊断的57岁急性髓性白血病男性外周血建立的细胞系，并且细胞携带NPM1基因突变(A型)和DNMT3A R882C突变。

如本文所用，术语“OCI-AML3-Luc”是本领域技术人员理解的术语。OCI-AML3-Luc来源于OCI-AML3细胞，通过慢病毒转导将恒定的荧光素酶-GFP盒整合到细胞基因组中。BV173-luc细胞已证实CD19阳性，并用于检测CAR-T细胞的细胞毒性。

如本文所用，术语“抗原结合蛋白”是指以高亲和力结合特定靶抗原的蛋白质或多肽。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”、“CAR”或“CARs”是本领域技术人员理解的术语，其指一类包含来自特定单克隆抗体和一种或多种T细胞受体细胞内信号传导结构域的所选单链片段可变结构域的融合蛋白的抗原结合蛋白。

如本文所用，术语“CAR-T细胞疗法”是本领域技术人员理解的术语，并且意指一种治疗类型，其中涉及对患者的自体T细胞进行基因修饰，以表达对肿瘤抗原特异的CAR，然后进行离体细胞扩增和重新输注回患者中。这种T细胞基因修饰可以经由基于病毒的基因转移方法或非病毒方法发生，如基于DNA的转座子、CRISPR/Cas9技术或通过电穿孔直接转移体外转录的mRNA。

如本文所用，术语“T细胞”是本领域技术人员理解的术语，并且意指在胸腺中发育并在免疫反应中起核心作用的淋巴细胞类型。通过在细胞表面上存在T细胞受体，可以将T细胞与其他淋巴细胞区分开来。

如本文所用，术语“GVHD”是本领域技术人员理解的术语，并且意指以不同器官中的炎症为特征的综合征，具有上皮细胞凋亡和隐窝脱落的特异性。GVDH通常与干细胞移植相关，如骨髓移植发生的那些，并且也可以通过基于供体白细胞输注、病毒特异性T细胞、T细胞受体缺陷型T细胞、淋巴祖细胞和调节性T细胞的CAR疗法诱导。

如本文所用，术语“HEK293T”是本领域技术人员理解的术语，并且意指含有SV40大T-抗原的人胚肾293细胞(HEK293)的变体。该抗原允许含有SV40复制起点的转染质粒的附加体复制，这导致转染质粒的扩增和所需基因产物的延长时间表达。

如本文所用，术语“体外”是指在活生物体之外进行的方法，通常使用从其正常生物宿主或通常生物环境中分离的生物材料。

如本文所用，术语“2A自切割序列”是指最初在病毒中鉴定并可以介导核糖体跳跃事件的一类18-22个氨基酸肽。在蛋白质编码序列中包含一个或多个2A自切割序列能够从一种mRNA产生两种或更多种单独的肽产物。

如本文所用，术语“直系同源物”或“直系同源序列”是指同源核酸或氨基酸序列，其源自由物种形成事件分开的相同祖先序列。

如本文所用，术语“同源物”或“同源序列”是指源自共同祖先序列的核酸或氨基酸序列。

如本文所用，术语“同一性百分比”是指两个或更多个核酸或氨基酸序列或子序列，它们具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，例如当在比较窗，或如使用本文所述的序列比较算法或通过手动比对和目视检查测量的指定区域上针对最大对应性进行比较和比对时，在特定区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。因此，如果他们在特定区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，或者在特定区域上具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，则两个或更多个核酸或氨基酸序列或子序列被认为是“基本上相同的”。另外，两个或更多个核酸或氨基酸序列或子序列可以具有大于90％的同一性但小于100％的同一性，或其任何子范围，例如90％至99％的同一性，或95％至99％的同一性。这些定义还涉及测试序列的补充。将理解，本文公开的任何序列可以包括与参考序列基本相似的序列，即在特定区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或在特定区域上具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，除非从上下文另外明显可见的。

如本文所用，术语“序列同一性百分比”通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定，其中对于两条序列的最佳比对，与参考序列相比(其不包括添加或删除)，比较窗中的序列部分可以包含添加或缺失(即，空位)。通过以下方式计算百分比：确定两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。

对于序列比较，通常一条序列充当参考序列，测试序列与之进行比较。序列比较算法基于程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性或相似性百分比。默认程序参数是常用的，或者可以可替代地指定替代参数。

用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。例如，可以通过Smith和Waterman的局部同源算法(Adv.Appl.Math.2:482,1970)、通过Needleman和Wunsch的同源比对算法(J.Mol.Biol.48:443,1970)、通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988)、通过这些算法的计算机化实现(例如，Wisconsin遗传学软件包,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手动对齐和目视检查(参见，例如Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊))，来进行用于比较的最佳序列对齐。

适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，这些算法分别在Altschul et al.(Nuc.Acids Res.25:3389-402,1977)和Altschul et al.(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)中进行了描述。

执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字串(words)来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字串对齐时，这些字串匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域字串得分阈值(Altschul et al.,同上)。这些初始邻域字串命中充当启动搜索以查找包含它们的更长HSPs的种子。字串命中沿着每条序列在两个方向上延伸，只要可以增加累积对齐分数。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的惩罚分数；总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，将评分矩阵用于计算累积分数。在以下情况下，字串命中在每个方向上的延伸将停止：累积对齐分数从其最大达到值下降了X数量；由于一个或多个负分数残基比对的累积，累积分数变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定对齐的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用11的字长(W)、期望值(E)或10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用3的字长和10的期望值(E)，以及50的BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)比对(B)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4。

BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-87,1993)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸比较中的最小总概率小于约0.2，通常小于约0.01，且更通常小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。

发明详述

本文描述了一种基因编辑方法，其结合多种新设计的AAV供体和配对sgRNAs，用于高效生成基因敲除通用CAR-T细胞。在一些实施方案中，该方法使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑。在一些实施方案中，该方法将CAR***编码可触发移植物抗宿主病(GVHD)的蛋白质的基因位点中。在一些实施方案中，本文所述的方法在TRAC位点中产生高效的转基因敲入，并同时破坏Jurkat细胞中的TRAC表达。发明人还展示了使用在人T细胞中的TRAC位点处***抗CD19 CAR的方法的优异结果，该方法产生了具有显著抗肿瘤活性的通用CAR-T细胞。发明人出人意料地表明，基于CRISPR/Cas9的HDR编辑使用优化的AAV供体设计结合靶向TRAC位点的配对sgRNAs大大提高了编辑效率，这为高效生成高性能TRAC敲除通用CAR-T细胞以用于进一步的临床应用提供了可能性。本公开还提供了一种通用***，其可以通过将同源臂和配对的sgRNAs改变为新的靶序列以产生具有不同基因破坏的不同CAR-T细胞，或者通过改变供体中的另一CAR以靶向不同的肿瘤抗原，来容易地修饰。

本文所述的方法和组合物提供了以下优点。首先，该方法同时破坏了表达可触发GVHD的蛋白质，如由免疫活性同种异体T细胞表达的蛋白质的基因的表达。与传统的自体CAR-T疗法不同，传统的自体CAR-T疗法昂贵、耗时，且由于患有晚期癌症患者中T细胞数量不足而通常困难，本方法提供了高效生成通用CAR-T细胞，其可以实现通过使用来自健康供体的T细胞来生成同种异体CAR-T细胞而克服这些限制。本方法可以潜在地提供通用的“现成”CAR-T产物，以使临床治疗中的广泛患者受益。

其次，本方法导致CARs在特定基因位点的靶向整合，这提供了批次之间CARs的一致表达，并且可以减少CAR表达的差异，提供可重复的细胞毒性和治疗活性，并从而可能产生标准化细胞以用于现成的产品。此外，确定的CARs***还可以降低克隆效应和肿瘤发生的风险，这对于经由由于随机整合导致的慢病毒转导产生的CAR-T细胞很常见。在一些实施方案中，CAR被***TRAC位点处。

第三，目前的方法通过两个步骤产生通用CAR-T细胞，其中第一个是通过慢病毒转导将CAR随机整合到基因组中，且第二个步骤是使用基于CRISPR的方法进行单独的基因破坏或敲除步骤。当前的方法并没有避免经由慢病毒整合CAR-T的不确定性，并且由于可能贡献于GVHD的特定基因的单独的基于CRISPR的敲除，引入了额外的操作和延迟。与当前的方法相比，本文描述的方法大大简化了操作并缩短了生成通用CAR-T细胞的过程。本方法通过在特定基因位点处整合CAR并同时通过一步操作破坏该位点处的基因表达来产生通用CAR-T细胞。此外，使用本方法将CARs靶向整合到预选基因位点也显著降低了由于使用当前慢病毒转导方法的随机和不可控的CAR整合而导致的潜在T细胞肿瘤发生的风险。

第四，本方法还提供了供体载体和小向导RNA(sgRNAs)的优化设计，与当前单一的基于sgRNA的敲入方法相比，它们可以使供体整合几乎翻倍。本方法可以显著提高产量并减少用于通用CAR-T细胞生成的起始T细胞的数量。

第五，本方法提供了一种通用***，其可以通过将同源臂和配对sgRNAs更改为新的靶序列以生成具有不同基因破坏的不同CAR-T细胞，或通过在供体载体中更改为另一CAR以靶向不同抗原来轻松进行修饰。因此，该技术在生成通用CAR-T细胞或通过破坏特定基因同时高效***CAR来增强CAR-T细胞性能方面具有巨大潜力。本方法为改进CAR-T技术和拓宽其治疗各种疾病的潜力提供了巨大的潜力和价值。

在一些实施方案中，基因组编辑***包含CRISPR/Cas9介导的基因组编辑***。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑***选自针对其将CAR表达载体高效敲入特定基因中以产生通用CAR-T细胞的多种设计。在一些实施方案中，该方法在TRAC位点处***CAR，从而产生CAR-T细胞，同时破坏TRAC表达，这导致通用CAR-T细胞因将受体的靶组织识别为非自身而被禁用，从而在移植过程中引发GVHD。在一些实施方案中，本方法通过将CAR整合到TRAC位点中并同时使用一步操作破坏TRAC表达来产生通用CAR-T细胞。

之前的研究尝试过使用单一sgRNA一步生成通用CAR-T，但效率相对较低。

相反，在彻底检查靶向TRAC位点的多种sgRNAs和携带不同同源臂的几种不同AAV供体之后，本公开提供了AAV供体的优化设计和sgRNAs的使用。与当前单一的基于sgRNA的敲入方法相比，AAV供体与配对sgRNAs结合可以使供体整合几乎翻倍。使用Cas9 RNP结合HDR供体和配对sgRNAs靶向，成功满足了通用CAR-T细胞高效生成的要求，这显著提高了通用CAR-T细胞生成的产量并减少了起始T细胞的使用。

通用方法

除非另有说明，否则本文所述的方法可包括蛋白质化学、生物化学和重组DNA技术的常规方法，它们在本领域普通技术人员的技术范围内。通用方法描述于例如以下文献中：T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman和Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,当前增加)；Green&Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版,2012)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:MackPublishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)卷A和B(1992)；Current Protocols in Molecular Biology(2002-；Wiley；Online ISBN:9780471142720；DOI:10.1002/04711142727)；和Current Protocolsin Immunology(2001-；Wiley；Online ISBN:9780471142737；DOI:10.1002/0471142735)。

修饰宿主细胞的方法

一方面，本文描述了用于修饰宿主细胞的方法。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是修饰的免疫细胞，如修饰的T细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是活化的T细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是自体细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，方法是体外方法。

在一些实施方案中，宿主细胞被修饰以在宿主细胞基因组中的预定靶位点处***外源多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码蛋白质或多肽。在一些实施方案中，多核苷酸编码抗原结合蛋白(ABP)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。

宿主细胞可以使用本文所述的方法进行修饰。在一些实施方案中，方法包括在宿主细胞基因组中的预定位点(也称为“选定位点”或“靶位点”)处***编码ABP的多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括同源定向重组或同源重组。在一些实施方案中，方法包括CRISPR/Cas介导的基因编辑。在一些实施方案中，方法包括与AAV供体载体和配对sgRNAs组合的CRISPR/Cas介导的基因编辑。在一些实施方案中，CRISPR相关的(Cas)核酸酶是1类内切核酸酶或2类内切核酸酶。在一些实施方案中，Cas是Cas9。在一些实施方案中，Cas是Cpf1(现在称为Cas12a)。

在一些实施方案中，方法包括将宿主细胞与供体载体接触，所述供体载体包含：(1)编码至少一种多肽的多核苷酸序列；(2)在多核苷酸3’端的多聚A片段；和(3)与基因组中靶序列侧翼区共有相同序列的两个同源片段，一个位于多核苷酸序列的5’端，且另一个位于供体载体中多聚A片段的3’端；然后将宿主细胞与核糖核蛋白复合体(RNP)接触，所述核糖核蛋白复合体(RNP)包含：(1)Cas核酸酶，和(2)与宿主细胞基因组中预定位点内的至少两条选定的核酸序列互补的至少两种小向导RNAs(sgRNA)。

在一些实施方案中，供体载体包含调控宿主细胞中将多核苷酸序列转录成mRNA的启动子。在一些实施方案中，mRNA在宿主细胞中被翻译成多肽。在一些实施方案中，多肽包含ABP，如CAR。在一些实施方案中，CAR是抗CD19 CAR、抗CD20 CAR、抗CD22 CAR、抗CD47 CAR或抗BCMA CAR。

在一些实施方案中，***外源多核苷酸的预定位点是T细胞受体α链(TRAC)的恒定区。在一些实施方案中，预定位点是beta(β)-肌动蛋白(ACTB)位点，或3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)位点。

CRISPR/Cas基因编辑***

CRISPR-Cas基因编辑***描述于例如第8,697,359号美国专利和美国专利公开2014/0068797中。CRISPR-Cas9***起源于II型CRISPR-Cas***，它为细菌提供对病毒和质粒的适应性免疫。CRISPR相关蛋白Cas9是一种核酸内切酶，它使用RNA双链体tracrRNA:crRNA中的引导序列与DNA靶序列形成碱基对，使Cas9能够在DNA中引入位点特异性双链断裂。双tracrRNA:crRNA被设计为单向导RNA(sgRNA)，其保留了两个关键特征：通过Watson-Crick碱基配对确定DNA靶位点的5’侧序列和与Cas9结合的3’侧的双链RNA结构。这创建了一个简单的双组分***，其中sgRNA程序Cas9的引导序列发生变化，以靶向任何目标DNA序列。CRISPR-Cas9编程的简单性，连同独特的DNA切割机制、多重目标识别能力以及许多天然II型CRISPR-Cas***变体的存在，使科学家能够精确且有效地靶向、编辑、修改、调节和标记各种细胞和生物体的基因组位点。(参见Jennifer A.Doudna和EmmanuelleCharpentier,Science,2014年11月28日；第346卷,第6213期,1258096；DOI:10.1126/science.1258096)。

本领域普通技术人员将理解，CRISPR相关蛋白(Cas)基因分为两类，1类和2类，并且基于所编码蛋白质的序列相似性进一步分为至少35个家族。因此，本方法可以使用任何具有所需功能特性的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas是Cas9，或与Cas9(SEQ ID NO:2)具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，Cas9由与SEQ ID NO:1具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核酸编码。在一些实施方案中，Cas是Cas12a(Cpfl)，或与Cas12a(SEQ ID NO:4)具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的蛋白质。在一些实施方案中，CRISPR/Cas***选自具有相似活性的Cas9(Csn1)、Cas12a(Cpf1)、Cas13a(C2c2)和Cas13b(C2c6)***或其他CRISPR/Cas***。(参见Tang,Y.et al.“Class 2CRISPR/Cas:anexpanding biotechnology toolbox for and beyond genome editing.”Cell Biosci 8,59(2018))。

CAR T细胞疗法

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法(CAR T Therapy)是一种称为过继细胞疗法的免疫疗法。CAR T疗法通常涉及对患者的自体T细胞进行基因修饰，以表达对抗原特异的CAR，然后进行离体细胞扩增并重新输注回患者中。可以使用基于病毒的基因转移方法或非病毒方法对T细胞进行基因修饰，如基于DNA的转座子、CRISPR/Cas9技术或通过电穿孔直接转移体外转录的mRNA。然而，本文所述的方法允许产生可用作通用“现成”CAR-T细胞的修饰T细胞。换言之，该方法允许产生不依赖于从特定对象或患者分离的自体T细胞的修饰的T细胞，而是提供可给予多于一名对象或患者以用于治疗疾病的修饰的同种异体宿主细胞。

CAR是一种重组融合蛋白，其包含与胞内结构域偶联的抗原特异性胞外结构域，其在抗原与胞外结构域结合时提供胞内信号。因此，CARs与其他抗原结合剂不同，因为它们既可以结合MHC非依赖性抗原，又可以经由细胞内结构域转导激活信号。CARs与抗原的特异性结合通常表示为亲和力常数或相互作用的亲和力(KD)，其中KD介于约0.1皮摩尔(pM)和约10微摩尔(μM)之间，或约0.1pM至约1μM，或约0.1pM至约100纳摩尔(nM)。

适用于本公开的CAR的抗原特异性胞外结构域可以是本领域已知的任何抗原结合多肽。例如，在一些实施方案中，抗原结合结构域包含基于抗体的结合结构域，例如单链Fv(scFv)、单结构域抗体可变结构域(sdAb VH)、骆驼抗体可变结构域(cAb VHH)或其人源化形式，或鲨鱼抗体可变结构域(IgNAR VH)或其人源化形式。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含基于T细胞受体(TCR)的结合结构域，如单链TCR(scTv)，或含有可变α链和β链的单链双结构域TCR。

在一些实施方案中，CAR识别或特异性结合在肿瘤、癌症或恶性细胞上表达的抗原。在一些实施方案中，肿瘤、癌症或恶性细胞来自造血或淋巴组织的肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤或癌症是白血病，如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞白血病(CML)。在一些实施方案中，肿瘤是B细胞肿瘤或T细胞肿瘤。B细胞癌和肿瘤的非限制性实例包括B细胞淋巴瘤，其可以是惰性的(缓慢生长的)或侵袭性的(快速生长的)。大多数B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，CAR特异性结合由B细胞表达的抗原。

在一些实施方案中，CAR特异性结合CD19、CD20、CD22、CD47或B细胞成熟抗原(BCMA)。在一些实施方案中，CAR是抗CD19 CAR、抗CD20 CAR、抗CD22 CAR、抗CD47 CAR或抗BCMA CAR。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:6(抗CD19 CAR)、SEQ ID NO:8(抗CD20CAR)、SEQ ID NO:10(抗CD22 CAR)或SEQ ID NO:12(抗BCMA CAR)具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR由与SEQ ID NO:5(抗CD19 CAR)、SEQ ID NO:7(抗CD20 CAR)、SEQID NO:9(抗CD22 CAR)或SEQ ID NO:11(抗BCMA CAR)具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的核酸序列编码。本发明的CARs的各种组分的一些实例的序列以及编码它们的核酸列于表1中，其中(aa)代表氨基酸，并且(na)代表编码相应肽的核酸。并且在一些实施方案中，该设计中的CAR蛋白可以改变为具有特定靶向的其他CAR蛋白。

T细胞癌症和肿瘤的非限制性实例包括T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL)、T细胞大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病、人T细胞白血病病毒1型阳性(HTLV-1+)成体T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)和各种外周T细胞淋巴瘤(PTCLs)，包括血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)、ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤和ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，CAR特异性结合由T细胞表达的抗原。在一些实施方案中，CAR特异性结合CD9、CD7、CD5、CD2、CD30或CD4。

在一些实施方案中，CAR包含细胞内结构域，其在抗原与抗原特异性细胞外结构域结合时向T细胞提供细胞内信号。在抗原结合后，细胞内信号传导结构域激活修饰的T细胞的效应器功能。效应器功能可以包括细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌，或抗原依赖性增殖。在一些实施方案中，胞内结构域包括T细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如，β、δ、γ或ε)、MB 1链、B29、Fc RIII、Fc RI，以及信号传导分子的组合，如CD3.ζ和CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40，及以上的组合，以及其他类似的分子和片段。可以使用活化蛋白家族的其他成员的细胞内信号传导部分，例如Fc.γ.RIII和Fc.ε.RI。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是保留功能性信号转导活性的信号传导结构域的截短部分。

在一些实施方案中，抗原特异性胞外结构域通过跨膜结构域与嵌合抗原受体的胞内结构域连接。在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个共刺激结构域，和/或一个或多个间隔物。共刺激结构域可以来源于共刺激蛋白的细胞内信号传导结构域，其增强细胞因子的产生、增殖、细胞毒性和/或体内持久性。氨基酸间隔物可用于将CAR的不同结构域连接在一起，例如，间隔物可将抗原特异性细胞外结构域连接到跨膜结构域、将跨膜结构域连接到共刺激结构域、将共刺激结构域连接到细胞内结构域，或将跨膜结构域连接到细胞内结构域。例如，在抗原特异性胞外结构域和跨膜结构域之间包含间隔结构域可能会影响抗原结合结构域的柔性，并从而影响CAR功能。

在一些实施方案中，CAR包含融合至CD3ζ的CD8铰链跨膜结构域和/或41bb的共刺激信号传导结构域。其他共刺激信号传导结构域(例如，41bb、CD27、CD28或两个共刺激结构域的组合)也可用于构建不同的CARs。

在一些实施方案中，本文所述的CAR-T细胞缺乏内源性T细胞受体(TCR)信号传导。在一些实施方案中，可能需要减少或消除本文公开的CAR-T细胞中的内源性TCR信号传导。例如，当使用同种异体T细胞产生CAR-T细胞时，减少或消除CAR-T细胞中的内源性TCR信号传导可以预防或减少移植物抗宿主病(GvHD)。减少或消除内源性TCR信号传导的方法包括但不限于修饰TCR受体的一部分(例如，TCR受体α链(TRAC)等)。TRAC修饰可用于阻断TCR介导的信号传导，这可以使同种异体T细胞被修饰以表达各种CARs，并在不诱导危及生命的GvHD的情况下给予患者。

在一些实施方案中，本文所述的修饰的宿主细胞可以进一步包含一种或多种***基因。***基因通常编码一种酶，该酶选择性地将无毒前药转化为高毒代谢物，特别是消除表达该酶的细胞。如果需要，***基因可能允许在体内有效跟踪和消除CAR-T细胞。***基因的一个实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，它将无毒的抗病毒前药更昔洛韦(GCV)磷酸化为三磷酸GCV。三磷酸GCV在复制细胞中被掺入DNA中，抑制DNA合成并导致细胞死亡。其他实例包括诱导型caspase 9蛋白或CD34/胸苷激酶嵌合***基因。

治疗方法

本文公开了通过将本文所述的修饰的宿主细胞给予对象而治疗有需要对象中的疾病的方法。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是修饰的免疫细胞，如修饰的T细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是自体细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞被包括在药物组合物中。在一些实施方案中，对象是动物、哺乳动物、家畜如牛、马、绵羊、山羊或猪、伴侣动物如猫或狗，或者人。

在一些实施方案中，疾病是血液癌症。

在一些实施方案中，疾病是造血或淋巴组织的癌症或肿瘤，如本文所述。例如，在一些实施方案中，疾病是白血病，如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞白血病(CML)。在一些实施方案中，疾病是B细胞癌或肿瘤。B细胞癌和肿瘤的非限制性实例包括B细胞淋巴瘤，其可以是惰性的(缓慢生长的)或侵袭性的(快速生长的)。大多数B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，疾病是表达B细胞抗原或标志物，如CD19、CD20、CD22、CD47或B细胞成熟抗原(BCMA)的肿瘤。

在一些实施方案中，疾病是T细胞癌或肿瘤，如T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL)、T细胞大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病、人T细胞白血病病毒1型-阳性(HTLV-1+)成体T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)和各种外周T细胞淋巴瘤(PTCLs)，包括血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)、ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤和ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，疾病是表达T细胞抗原或标志物，如CD7、CD5、CD2、CD30和CD4的肿瘤。

在一些方面，方法是体外方法。例如，体外方法可以是细胞毒性测定。在一些实施方案中，将本文所述的表达由外源多核苷酸编码的多肽的修饰的宿主细胞与表达结合多肽的抗原的靶细胞接触，并确定被修饰的宿主细胞裂解或杀伤的靶细胞的数量。

在一些方面，方法是体内方法。在一些实施方案中，方法包括例如通过输注将本文所述的修饰的宿主细胞给予表达结合由外源多核苷酸编码的多肽的靶抗原的活的动物。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码特异性结合活的生物体中的抗原的嵌合抗原受体。因此，在一些实施方案中，修饰的宿主细胞表达特异性结合活的生物体中表达的抗原的CAR。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，抗原由肿瘤或癌细胞表达。

表1.Cas9、CAR蛋白和AAV供体的各种组分的序列。(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)

实施例

以下实施例仅通过说明而非限制的方式提供。本领域技术人员将容易认识到可以改变或修改的多种非关键参数以产生基本相同或相似的结果。

实施例1：使用AAV供体和用于TRAC基因破坏的单一sgRNA在TRAC位点处进行有效的CRISPR/Cas9介导的转基因整合

我们首先使用AAV供体和单一sgRNA在TRAC位点处实现了高效的CRISPR/Cas9-HDR介导的GFP转基因整合，这同时破坏了TRAC基因的表达。我们合成了5种靶向TRAC基因的第一编码外显子的不同的体外转录sgRNAs(sg19、sg5、sg15、sg11、sg12)(图1A)，并通过T7E1测定在Jurkat细胞中证实了高编辑效率(图1B)。然后，我们构建了携带800bp同源臂的AAV-TRAC-HDR-ires-GFP-800bp供体，每个臂位于无启动子的ires-GFP盒的一侧(图1A)。我们使用不同的sgRNAs和TRAC-800bp供体进行了TRAC HDR靶向，并观察到有效的GFP表达(图1C)，表明在TRAC位点中成功整合了转基因。我们还确认了在使用选定sgRNAs的截短形式时有效的编辑率(图1D)。

为了确定同源臂的最佳长度，我们构建了具有不同同源臂长度、不同共表达盒信号、有或没有启动子的不同AAV供体(图2A-图2D)。在进行TRAC靶向后，所有供体均显示出有效的编辑，其中，与其他无启动子供体相比，TRAC-800bp-LRA显示最高的编辑率(图2A-图2D)。此外，与内源性TRAC启动子相比，SFFV和EF1α启动子产生更高的GFP强度(图2C-图2E)。这些数据表明，基于Cas9-RNP的AAV供体和基于单一sgRNA的敲入可以成功地破坏人类Jurkat细胞中的TRAC表达。

实施例2：使用AAV供体和用于TRAC基因破坏的配对sgRNAs在TRAC位点处进行有效的CRISPR/Cas9介导的转基因整合

我们使用AAV供体和配对sgRNAs在TRAC位点处确认了有效的CRISPR/Cas9-HDR介导的GFP转基因整合。我们设计了另一种sgRNA(sg24)，其靶向TRAC外显子1的3’区，并且我们通过应用与配对sgRNAs(sg19-19bp&sg24或sg5&sg24)组装的Cas9 RNP以及不同的TRAC-800bp-LRA、TRAC-800bp和TRAC-2A-800bp AAV供体进行了TRAC编辑(图3A)。流式细胞术分析揭示，与单一sgRNA编辑相比，应用配对sgRNAs的编辑效率几乎翻倍，这表明配对sgRNAs靶向在TRAC位点处引入了更有效的供体整合(图3B、图3C)。一致地，配对sgRNAs靶向也在Jurkat细胞中实现了高效的TRAC敲除(图3D)。此外，我们在活化的T细胞中测试了这种方法，并在活化的T细胞中获得了相似的供体整合和TRAC敲除率(图3E-图3G)，表明T细胞中同时供体整合和TRAC破坏的成功和高频率，这为将这种新的编辑方法用于潜在的临床应用提供了巨大的价值。

实施例3：使用AAV供体和配对sgRNAs在TRAC位点处进行CRISPR/Cas9介导的CAR敲入以产生通用CAR-T细胞

我们使用AAV供体和配对sgRNAs在TRAC位点处通过CRISPR/Cas9-HDR介导的抗CD19 CAR整合验证了通用CAR-T细胞的成功和高效生成。我们基于TRAC-800bp-LRA供体的主链构建了TRAC-2A-CAR和TRAC-SFFV-CAR，并使用配对的sgRNAs(sg19-19bp&sg24)和不同的AAV供体进行了TRAC靶向(图4A)。我们通过使用TRAC-2A-CAR AAV供体和配对sgRNAs的基于Cas9-RNP的编辑方法证实了T细胞中的有效编辑(图4B)。我们还构建了Lenti-SFFV-CAR的新的慢病毒载体，并且Lenti-EF1α-CAR携带在活性启动子控制下的CAR序列。然后，我们通过Cas9 RNP靶向生成了通用CAR-T细胞，并通过慢病毒转导生成了常规CAR-T细胞(图4A)。通过TRAC靶向，相比从慢病毒转导产生的常规CAR-T细胞，使用TRAC-E2A-CAR和TRAC-SFFV-CAR的AAV供体产生的CAR-T细胞显示出相当或甚至更高的裂解百分比(图4C)。总的来说，我们成功地采用Cas9 RNP结合AAV供体和配对sgRNAs的方法，通过阻断TRAC基因表达，同时***抗CD19 CAR片段，产生了通用CAR-T细胞，并通过体外细胞毒性测定验证了TRAC阴性CAR-T细胞的潜在的抗癌作用。

实施例4：AAV包装

AAV-6***用于病毒包装[18]。在293FT细胞中以80％汇合度进行转染，并在转染后3天收集病毒。基本上，病毒是从细胞质和细胞核中提取出来的，然后以超高速进行梯度离心。最后，将病毒颗粒浓缩并用超离心100KD过滤器进一步纯化。

实施例5：慢病毒包装

在293FT细胞中以80％汇合度进行转染，并在转染后3天收集细胞培养基，并浓缩病毒颗粒，并利用100KD超离心过滤器进一步纯化。

实施例6：质粒构建

a)Cas9蛋白和sgRNA体外合成：Cas9蛋白购自Thermo Fisher(TrueCut^TM Cas9Protein v2,Thermo Fisher)，并通过GeneArt^TM Precision gRNA合成试剂盒(ThermoFisher)，根据操作说明书生成用于电穿孔的sgRNAs的体外转录(IVT)。sgRNA靶序列是根据来自网站www.casblastr.org)的输出设计的。所有sgRNA靶向信息都列于表2中。

b)抗CD19 CAR：按先前所述构建抗CD19-CAR-GFP盒[19]。简言之，从质粒(Addgene113014)扩增由前面为CD8a前导肽的对人CD19特异的单链可变片段scFV组成的抗CD19CAR，并与从T细胞cDNA扩增的41bb铰链跨膜胞内区和CD3ζ胞内域融合。然后将CAR盒与e2a-gfp盒融合，然后通过重叠PCR融合多聚A元件。随后，在Mlu1和Not1位点处将整个CAR-GFP盒***CD19-FcγCAR(Addgene 113014)的质粒中，以产生Lenti-SFFV-CAR-GFP(简称为Lenti-SFFV-CAR)质粒。

c)AAV供体：AAV供体主链购自addgene(addgene#87115)。从人基因组扩增TRAC基因的不同同源臂，并***主链中，并单独构建IRES-GFP-PA、2A-GFP-PA、SFFV-GFP-PA、EF1α-GFP-PA、2A-抗CD19CAR-GFP-PA、SFFV-抗CD19 CAR-GFP-PA、EF1α-抗CD19 CAR-GFP-PA盒，并***不同同源臂之间，以分别产生TRAC-800bp(SEQ ID NO:13)、TRAC-400bp(SEQ ID NO:14)、TRAC-2A-800bp(SEQ ID NO:15)、TRAC-800bp-LRA(SEQ ID NO:16)、TRAC-SFFV-GFP(SEQ ID NO:17)、TRAC-EF1α-GFP(SEQ ID NO:19)和TRAC-SFFV-CAR(SEQ ID NO:23)的AAV供体。所有供体信息都列于表1和图2A、图2C和图4A中。

d)慢病毒载体：在Mlu1和Not1位点处将抗CD19 CAR盒***CD19-FcγCAR(Addgene113014)的质粒中，以产生Lenti-SFFV-CAR质粒，并从质粒(Addgene 109049)扩增EF1α启动子，并在MfeI和NcoI处***Lenti-SFFV-CAR的主链中，以取代SFFV元件，以便产生Lenti-EF1α-CAR载体。

实施例7：基因组DNA提取和基因组整合的PCR检测

按照制造商的说明，使用基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)从培养细胞中提取基因组DNA。为了从肝组织中提取基因组DNA，使用Tris缓冲液和蛋白酶K在37℃下进行过夜消化，然后用75％乙醇进行纯化。按照制造商的说明，通常使用Phusion高保真DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)将200ng基因组DNA用于PCR反应。

实施例8：荧光活化细胞分选分析

荧光活化细胞分选(FACS)分析仪(BD LSRFortessa细胞分析仪)配置有单个488nm氩离子激光器(200mW)。将激光用于通过激发细胞荧光蛋白(eGFP)或细胞内的粒度来诱导光散射。在FITC-A(GFP)对数刻度上记录的门内事件提供了GFP表达水平的良好指示，且计数表明GFP阳性细胞的数量。门控区域中GFP阳性细胞相比总计数的比率定义为靶向效率。

实施例9：细胞毒性测定

可以通过先前描述的标准荧光素酶测定来检测用CAR转导的T细胞的细胞毒性[8]。表达CD19和荧光素酶的所有细胞系被用作靶细胞(T)，且具有CAR整合的T细胞被用作效应细胞(E)。将5x104个靶细胞接种在96孔板中，并与不同比例的效应细胞共培养。将每个孔中的最终体积调整为200μL。将在没有效应细胞的情况下培养的靶细胞用于确定最大荧光素酶表达(相对光单位，RLUmax)。共培养18小时后，每孔加入100μL荧光素酶底物(Promega)，并通过荧光素酶成像***检测发光。

实施例10：Cas9核糖核蛋白(RNP)组装和电穿孔

将纯化的Cas9(5μg)和体外转录的sgRNA以1:2的比例混合，并在室温下孵育约5-10分钟以进行Cas9 RNP组装。收集人类Jurkat细胞或活化的人类T细胞，并用Cas9 RNP复合体进行电穿孔。电穿孔后，向细胞加入不同类型的供体，然后直接相应地。所有AAV供体均以不同的MOI(104-106vg/细胞)添加。

实施例11：T7内切核酸酶1(T7E1)测定

通过基因组PCR扩增覆盖TRAC基因位点中的靶向区域的DNA片段，然后根据制造商的说明使用MEGAquick-spin全片段DNA纯化试剂盒(iNtRON)进行DNA纯化过程。首先，将纯化的片段变性和退火，然后在37℃下用T7E1(T7内切核酸酶1,NEB)处理1小时，以完全切割不匹配的核苷酸对。随后，使用Image J确定编辑效率。

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本申请中引用的所有专利、专利申请和其他出版物，包括GenBank登录号，均通过引用整体并入本文，用于所有目的。

Claims (32)

1.在宿主细胞基因组中的预定位点处***多核苷酸序列的体外方法，所述方法包括：

按顺序将宿主细胞与以下物质接触：

(i)供体载体，其包含：(1)编码至少一种多肽的多核苷酸序列；(2)在所述多核苷酸序列3’端的多聚A片段；和(3)与所述宿主细胞基因组中靶序列的侧翼区共有相同序列的两个同源片段，一个位于所述多核苷酸序列的5’端，且另一个位于所述供体载体中所述多聚A片段的3’端；以及

(ii)核糖核蛋白复合体(RNP)，其包含：(1)Cas核酸酶，和(2)与所述宿主细胞基因组中预定位点内的至少两条选定的核酸序列互补的至少两种小向导RNA(sgRNA)。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体选自质粒、AAV病毒颗粒、腺病毒颗粒、慢病毒颗粒或DNA-纳米颗粒复合体。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体还包含至少一个编码特异性结合肿瘤抗原的CAR的多核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体还包含至少一个编码抗CD19 CAR、抗CD20 CAR、抗CD22 CAR、抗CD47 CAR或抗BCMACAR蛋白的多核苷酸序列。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体还包含至少一个编码免疫检查点蛋白或抗免疫检查点蛋白的多核苷酸序列。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体还包含至少一个编码报告子基因的多核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体还包含2A自切割序列、内部核糖体进入位点(IRES)元件、位于至少一个基因编码序列5’端的启动子或3’调控序列。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述Cas核酸酶选自蛋白质或编码所述蛋白质的RNA分子。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述Cas核酸酶是1类内切核酸酶或2类内切核酸酶。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas9、Cpf1或具有基因组编辑活性的另一种Cas直系同源物。

11.如权利要求1所述的方法，其中表2中列出的至少两种靶向TRAC序列的小向导RNA(sgRNA)被用于所述核糖核蛋白复合体中。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述核糖核蛋白复合体中的至少两种小向导RNA(sgRNA)选自与所述宿主细胞基因组中靶位点内的至少两条选定的核酸序列互补的任何序列。

13.如权利要求1所述的方法，还包括检测从所述多核苷酸序列转录的RNA，或由所述多核苷酸序列编码、由所述宿主细胞表达的蛋白质。

14.如权利要求1所述的方法，还包括经由体外或体内测定评估所***的多核苷酸的功能。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述体外测定是细胞毒性测定，其包括将表达靶抗原的靶细胞与权利要求1所述的宿主细胞接触，以及确定由所述细胞裂解的细胞的数量，其中所述多肽特异性结合所述靶抗原。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述体内测定包括将权利要求1所述的宿主细胞给予包含表达特异性结合所述多肽的靶抗原的细胞的活的生物体，以及检测表达所述靶抗原的细胞数量的减少。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞分离自患癌的人。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞分离自携带遗传性疾病的人。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述预定位点是TRAC、ACTB或GAPDH。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种向导RNA包含与所述宿主细胞基因组中预定的多核苷酸序列互补的约20个核苷酸的核酸区域。

21.如权利要求1所述的方法，还包括将所述宿主细胞给予对象，以治疗对象中的疾病。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述疾病是血液癌症。

23.通过权利要求1所述的方法产生的经修饰的宿主细胞。

24.治疗对象中的疾病的方法，所述方法包括：

将权利要求1所述的宿主细胞或权利要求23所述的经修饰的宿主细胞给予所述对象。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述宿主细胞是分离自所述对象的自身免疫细胞。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述宿主细胞是同种异体免疫细胞。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述方法还包括检测由所述供体载体中的所述多核苷酸序列编码的RNA或蛋白质的表达。

28.如权利要求24所述的方法，其中所述方法还包括确认由所期望的基因编码的RNA或蛋白质的表达足以治疗所述疾病。

29.如权利要求24所述的方法，其中所述疾病是血液癌症。

30.用于治疗体细胞组织疾病的试剂盒，其包含：

(i)包含供体载体的第一容器，其中所述供体载体包含编码CAR的多核苷酸；

(ii)包含与所述宿主细胞基因组中选定的核酸序列互补的至少两种sgRNA的第二容器；和

(iii)包含Cas核酸酶的第三容器。

31.如权利要求30所述的试剂盒，其还包含Cas或CfPl蛋白，或者编码Cas或Cfpl蛋白的RNA。

32.如权利要求30所述的试剂盒，其还包含说明书手册。

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