CN115521240A - 一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115521240A
CN115521240A CN202210622055.0A CN202210622055A CN115521240A CN 115521240 A CN115521240 A CN 115521240A CN 202210622055 A CN202210622055 A CN 202210622055A CN 115521240 A CN115521240 A CN 115521240A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dimethyltryptamine
solution
dimethyl
hapten
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210622055.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115521240B (zh
Inventor
刘成
王海剑
高佳怡
高飞
陆维克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Alltest Biotech Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Alltest Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Alltest Biotech Co ltd filed Critical Hangzhou Alltest Biotech Co ltd
Priority to CN202210622055.0A priority Critical patent/CN115521240B/zh
Priority to PCT/CN2022/116739 priority patent/WO2023231208A1/zh
Publication of CN115521240A publication Critical patent/CN115521240A/zh
Priority to US18/360,822 priority patent/US20230393159A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN115521240B publication Critical patent/CN115521240B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/14—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
    • C07D209/16—Tryptamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及二甲基色胺检测领域，为解决现有技术下使用液相色谱‑串联质谱检测二甲基色胺对仪器及操作人员要求高，不易推广，其检测速度慢的问题，公开了一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用，所述二甲基色胺半抗原由N,N‑二甲基‑5‑羟色胺作为前驱体与戊二酸酐反应得到。由该二甲基色胺半抗原得到的二甲基色胺人工抗原可用于得到二甲基色胺单克隆抗体和二甲基色胺胶体金‑荧光检测试纸，该试纸灵敏度高，可快速检测尿液、血液、唾液与毛发中二甲基色胺，对仪器要求低，操作简便，利于对毒品检测的广泛推广。

Description

一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及二甲基色胺检测领域，尤其涉及一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
二甲基色胺(Dimethyltryptamine、DMT)的结构上与神经递质血清素、5-甲氧基二甲基色胺、蟾毒色胺和脱磷酸裸盖菇素类似，是一类色胺类致幻剂。人体内可自然地在大脑中由色胺-N-转甲基酶催化产生痕量的DMT，但其具体功能不明。DMT在人类胚胎第49天开始分泌，有人认为这是灵魂的开始，甚至有说法认为DMT是脑中松果体产生的，能够调整人类大脑的频率接收频率，让人类可以感知非物质界。某些北美及南美巫师要通灵时，会吃一些含有DMT成份的药草，以求进入似乎能与神灵对话的精神恍惚状态。北美洲的印第安人在宗教祭祀中使用一种由死藤提取出主要成分为DMT的死藤水(Ayahusca)，后因其使人产生欣快感而逐渐被滥用，被人称为“宗教致幻剂”。实际上DMT有成瘾性，吸食DMT后会让人性情大变，长期使用还会使人出现精神症状，在我国DMT属于国家一类管制***，是一种***。
为禁毒需要，执法人员通过检测二甲基色胺及其代谢物的残留情况来甄别吸毒嫌疑人。目前，通常使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对毛发中二甲基色胺及其代谢物进行定性与定量分析，例如2020年5月29日发布实施的司法行政行业标准《毛发中二甲基色胺等16种色胺类新精神活性物质及其代谢物的液相色谱-串联质谱检验方法》(SF/T0065-2020)就指定使用液相色谱-串联质谱进行检测DMT。该方法分离分析能力强，灵敏度高，结果可靠、精确，但串联质谱仪结构复杂，对环境的温度、湿度要求高，维护成本高。质谱仪是高精密仪器，需要经过专门培训的技术员才可以操纵，且测试速度慢，因此不利于对毒品检测的广泛推广。因此，需要开发一种简便高效的二甲基色胺检测方法。
发明内容
本发明为了克服现有技术下使用液相色谱-串联质谱检测二甲基色胺对仪器及操作人员要求高，不易推广，其检测速度慢的问题，提供一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法，二甲基色胺半抗原可特异性识别二甲基色胺，与载体蛋白结合后得到二甲基色胺半抗原的人工抗原，将该二甲基色胺抗原应用于胶体金荧光检测试纸中可实现快速检测尿液、血液、唾液与毛发中二甲基色胺，检测的灵敏度高，准确度好。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种二甲基色胺半抗原，其分子结构式如式(I)所示，
Figure BDA0003675025090000021
二甲基色胺半抗原拥有二甲基色胺的分子结构特征，由该半抗原得到的人工抗原可被动物免疫活性细胞所识别产生可特异性结合二甲基色胺的抗体。
一种二甲基色胺半抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将N,N-二甲基-5-羟色胺作为前体溶于苯，加入三氟乙酸酐后加热反应，反应后将反应液冷却至室温，除去苯得到淡黄色油状物A；
(2)将淡黄色油状物A溶于吡啶中，加入戊二酸酐再加热反应，反应后将反应液冷却至室温，除去吡啶后，分离得到的黄色油状物即为二甲基色胺半抗原。
作为优选，所述步骤(1)为将N,N-二甲基-5-羟色胺作为前体溶于苯中得到浓度为(0.15-0.20)mmol/mL的溶液，置于0℃以下搅拌5min，再缓慢加入三氟乙酸酐，N,N-二甲基-5-羟色胺与三氟乙酸酐的摩尔比为1：(1-1.2)，缓慢升温至室温搅拌反应1h，然后在78℃下搅拌反应3h，反应后将反应液冷却至室温，将有机溶剂减压蒸干得到淡黄色油状物A。
为了尽可能的保护二甲基色胺的活性位点，增加该抗原的免疫原性和反应原性，故选择N,N-二甲基-5-羟色胺作为合成二甲基色胺人工抗原的前体，N,N-二甲基-5-羟色胺结构为
Figure BDA0003675025090000022
制备过程中使用三氟乙酸酐保护氨基，使用戊二酸酐进攻5位上的羟基，得到带有羧基的DMT衍生物即二甲基色胺半抗原。在反应过程中可以使用薄层色谱法监测淡黄色油状物的生成情况，使用的层析液为乙酸乙酯，产物Rf＝0.9。
作为优选，所述步骤(2)为将淡黄色油状物A用吡啶溶解，再加入戊二酸酐，淡黄色油状物A和戊二酸酐的摩尔比为1：1，以105℃回流搅拌反应18h，反应结束后，将反应液冷却至室温，减压蒸干溶剂，通过薄层色谱分离得到的黄色油状物即二甲基色胺半抗原。
在二甲基色胺半抗原的合成反应中可以使用薄层色谱法监测淡黄色油状物的生成情况以判断是否可以反应是否完全，使用的层析液中各组分的体积比为二氯甲烷：氨水：95％乙醇：1,4-二氧六环＝10:1:8:1，产物Rf＝0.2。
一种二甲基色胺人工抗原，由二甲基色胺半抗原与载体蛋白耦合得到，其分子结构式如式(II)所示，
Figure BDA0003675025090000031
其中protein为载体蛋白。
作为优选，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白和鸡卵清白蛋白中的一种。
一种二甲基色胺人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
包括如下步骤：
(1)将二甲基色胺半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中得到浓度为(0.045-0.050)mmol/mL的溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺和环己基碳酰二亚胺，室温搅拌反应15h，然后以离心取上清液记为A液，二甲基色胺半抗原、环己基碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1-1.2)：(1.1-1.3)；
(2)将载体蛋白溶于PBS缓冲液中，并记为B液，B液中载体蛋白的浓度为5mg/mL；
(3)将A液缓慢滴加到B液中，滴加过程中保持搅拌，在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液，A液与B液的体积比为1:10；
(4)将人工抗原混合液置于透析袋中在碱性透析液中透析2-3次，每次透析时间为24h，再转入PBS缓冲液中透析6-7次，每次透析时间大于2h，透析结束后离心取上清液即得到二甲基色胺人工抗原；
PBS缓冲液浓度为0.1mol/L，pH为7.2-7.4，碱性透析液为pH为11.95-12.05范围内的碳酸钠溶液。
二甲基色胺半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺及N,N-环己基碳二酰亚胺反应得到活性酯，该活性酯与载体蛋白偶联得到二甲基色胺人工抗原，此反应过程保护了二甲基色胺的活性位点，增加该抗原的免疫原性和反应原性，进行动物免疫时易获得相应的抗体，为后续检测试剂的制备提供保证。可通过紫外扫描透析结束后离心得到的上清液鉴定半抗原与BSA是否偶联成功。
二甲基色胺人工抗原在制备二甲基色胺单克隆抗体中的应用。
作为优选，所述二甲基色胺单克隆抗体的制备步骤包括：将二甲基色胺人工抗原经PBS缓冲液稀释至1～1.2mg/mL，与免疫佐剂按体积比1:1～1.2混合，然后在小鼠皮下注射，每隔2～3周反复免疫，分离血清用间接ELISA法检测血清中抗体效价，待达到抗体效价<1:128后，采集血清纯化制得多克隆抗体；然后利用免疫的小鼠的骨髓瘤细胞与脾脏B细胞在促融剂聚乙二醇的作用下融合，通过单克隆细胞技术进行筛选，在小鼠腹腔注射接种杂交瘤细胞2周后收集腹水得到二甲基色胺单克隆抗体。
二甲基色胺人工抗原在制备二甲基色胺胶体金-荧光检测试纸中的应用。
作为优选，所述检测线使用二甲基色胺人工抗原为原料点膜获得，所述质控线用羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG为原料点膜获得，所述结合垫使用二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物与二甲基色胺单克隆抗体-荧光素复合物喷洒在结合垫上获得。
本发明的二甲基色胺胶体金-荧光检测试纸检测灵敏度高，可检出的浓度达1000ng/mL，因本发明的二甲基色胺检测试剂条检测原理使用了竞争法，所以检测线的显色强度与样本中二甲基色胺的浓度呈负相关。因同时运用胶体金与荧光标记，可同时进行定性定量检测。使用者肉眼观察胶体金在NC膜上的聚集显色情况，在质控线出现的情况下，T线出现则为阴性，T线不出现则为阳性，若要进行定量检测，可使用荧光免疫分析仪进行定量分析。
作为优选，所述质控线和检测线经以下过程制成：使用1.0mg/mL的羊抗兔IgG与0.1mg/mL的羊抗鼠IgG，以1.0μL/cm的喷量喷点在硝酸纤维素膜上作为质控线，使用0.2mg/mL的二甲基色胺抗原，以1.0μL/cm的喷量喷点在硝酸纤维素膜上作为检测线。
作为优选，所述二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物的制备步骤包括：调节胶体金溶液pH值为7.6，加入二甲基色胺单克隆抗体溶液，搅拌后加入1％PEG2000缓冲液，100000g4℃离心60min，去沉淀用含PEG2000缓冲液重悬，重复2～3次得到胶体金标记蛋白，然后凝胶过滤法对胶体金标记蛋白进行纯化，以含有BSA、叠氮化钠的PBS缓冲液洗脱，收集得到二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物。
作为优选，所述二甲基色胺单克隆抗体-荧光素复合物的制备步骤包括：用0.025mol/L pH9.0 CB将二甲基色胺单克隆抗体稀释为10mg/mL，装入透析袋内，将透析袋浸没于Alexa
Figure BDA0003675025090000041
染料液内，Alexa
Figure BDA0003675025090000042
染料液为Alexa
Figure BDA0003675025090000043
染料溶于PBS缓冲液配成的5μg/mL的溶液，Alexa
Figure BDA0003675025090000044
染料液为抗体溶液体积的10倍，在4℃下，在电磁搅拌器缓慢搅拌下，结合18-24h后取出，标记过程完成，将透析袋内结合物用Sephadex G-25或Sephadex G-50柱层析，得到二甲基色胺单克隆抗体-荧光素复合物。
作为优选，所述结合垫的制备步骤包括：将二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物稀释在含牛血清白蛋白的PBS缓冲液中至复合物初始OD值的1/4～1/3，再与二甲基色胺单克隆抗体-荧光素复合物以3:1混合，1.0μL/cm的喷量均匀喷洒在结合垫上。
作为优选，所述结合垫制备时还包括向含牛血清白蛋白的PBS缓冲液中加入50mg/mL海藻糖和200mg/mL蔗糖。
通过添加蔗糖和海藻糖有效保持二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物的活性，延长结合垫的有效期，提高产品性能。
因此，本发明具有如下有益效果：(1)以N,N-二甲基-5-羟色胺为前体合成二甲基色胺半抗原和二甲基色胺人工抗原，制备过程中二甲基色胺的活性位点不会被破坏，得到的抗原的免疫原性和反应原性好，进行动物免疫时易获得相应的抗体，并且可用于制备二甲基色胺胶体金-荧光检测试纸；(2)本发明提供的二甲基色胺胶体金-荧光检测试纸，灵敏度高，胶体金检出限为1000ng/mL，检测线的显色强度和二甲基色胺的浓度呈现负相关性，可快速检测尿液、血液、唾液与毛发中二甲基色胺，既可以通过肉眼定性检测，也可以选择上机检测荧光强度定量检测样品中二甲基色胺浓度，相比于液相色谱-串联质谱法更加方便快捷，对仪器要求低，操作简便，利于对毒品检测的广泛推广。
具体实施方式
下面结合具体实施方法对本发明做进一步的描述。
下述实施例中使用的PBS缓冲液由14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L配制得到，其pH为7.4；碱性透析液的配制过程为：质量分数为0.5％的碳酸钠水溶液用2mol/L的NaOH溶液调节为pH＝12.00。
实施例1
(1)二甲基色胺半抗原的制备：
A、向50mL单口圆底烧瓶中加入0.98mmol N,N-二甲基-5-羟色胺作为前体，再加入5mL苯溶解，置于0℃的冰水浴中搅拌5min，再缓慢加入1.08mmol三氟乙酸酐，缓慢升温至室温搅拌反应1h，然后在78℃油浴中搅拌反应3h，使用薄层色谱监测其反应情况，层析液为乙酸乙酯，产物Rf＝0.9，当基本完全反应后结束反应，将反应液冷却至室温，在50℃、-0.1MPa下将反应液减压蒸干得淡黄色油状物A；
B、将上一步得到的0.94mmol淡黄色油状物A置于50mL单口圆底烧瓶中，加入10mL吡啶溶解，再加入0.94mmol戊二酸酐，置于105℃的油浴中回流搅拌反应18小时，使用薄层色谱监测其反应情况，层析液为二氯甲烷：氨水：95％乙醇：1,4-二氧六环＝10:1:8:1，产物Rf＝0.2。反应大部分完成后结束反应，将反应液冷却至室温，减压蒸干溶剂，通过薄层色谱分离得黄色油状物，溶剂和洗脱剂为无水乙醇，层析液为二氯甲烷：氨水：95％乙醇：1,4-二氧六环＝10:1:8:1，产物Rf＝0.2，黄色油状物即为二甲基色胺半抗原；
(2)二甲基色胺人工抗原的制备：
A、将0.36mmol步骤(1)制得的二甲基色胺半抗原置于25mL单口圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)7.5mL，再加入环己基碳酰二亚胺(DCC)0.43mmol和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.43mmol，室温搅拌反应15h，反应结束，以8000r/min、4℃离心15min取上清液记为A液；
B、称取0.375g牛血清白蛋白(BSA)溶于75mLPBS溶液中，得到BSA溶液记为B液；
C、在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到免疫原和包被原DMT-BSA即人工抗原混合液，通过紫外扫描鉴定半抗原与BSA是否偶联成功；
D、将偶联成功的人工抗原混合液移入透析袋，搅拌条件下，在碱性透析液中透析24h，重复透析两次；
E、将碱性透析过的人工抗原混合液在PBS溶液中透析7次，每次透析时间为2h，透析结束后离心，取上清液即得到二甲基色胺人工抗原。
实施例2
(1)二甲基色胺半抗原的制备：N,N-二甲基-5-羟色胺与三氟乙酸酐的摩尔比为1:1，其余制备条件同实施例1；
(2)二甲基色胺人工抗原的制备：二甲基色胺半抗原、DCC和NHS的摩尔比为1:1:1.1，其余制备条件同实施例1。
实施例3
(1)二甲基色胺半抗原的制备：N,N-二甲基-5-羟色胺与三氟乙酸酐的摩尔比为1:1.2，其余制备条件同实施例1；
(2)二甲基色胺人工抗原的制备：二甲基色胺半抗原、DCC和NHS的摩尔比为1:1.2:1.3，其余制备条件同实施例1。
实施例4
二甲基色胺单克隆抗体的制备：
将实施例1得到的二甲基色胺抗原经PBS缓冲液稀释至1mg/mL，与免疫佐剂按体积比1:1混合，然后在小鼠皮下注射，每隔2周反复免疫，分离血清用间接ELISA法检测血清中抗体效价，待达到抗体效价<1:128后，采集血清纯化制得多克隆抗体；然后利用免疫的小鼠的骨髓瘤细胞与脾脏B细胞在促融剂聚乙二醇的作用下融合，通过单克隆细胞技术进行筛选，在小鼠腹腔注射接种杂交瘤细胞2周后收集腹水得到二甲基色胺单克隆抗体。
实施例5
二甲基色胺单克隆抗体的制备：使用实施例2得到的二甲基色胺抗原制备二甲基色胺单克隆抗体，其余制备过程同实施例4。
实施例6
二甲基色胺单克隆抗体的制备：使用实施例3得到的二甲基色胺抗原制备二甲基色胺单克隆抗体，其余制备过程同实施例4。
实施例7
二甲基色胺胶体金荧光检测试纸的制备：
A、检测线和质控线：使用0.2mg/mL的实施例1得到的二甲基色胺抗原，以1.0μL/cm的喷量喷点在硝酸纤维素膜上作为检测线，使用1.0mg/mL的羊抗兔IgG与0.1mg/mL的羊抗鼠IgG，以1.0μL/cm的喷量喷点在硝酸纤维素膜上作为质控线；
B、二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物：将实施例4得到的二甲基色胺单克隆抗体溶于胶体金溶液中得到的二甲基色胺单克隆抗体溶液，调节胶体金溶液pH值为7.6，加入1mL的二甲基色胺单克隆抗体溶液，搅拌后加入1％PEG2000缓冲液10mL，以100000g的离心力在4℃下离心60min，去沉淀用含PEG2000缓冲液重悬，重复3次得到胶体金标记蛋白，然后凝胶过滤法对胶体金标记蛋白进行纯化，以含有1％BSA、0.02％叠氮化钠的PBS缓冲液洗脱，收集得到二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物；
C、二甲基色胺单克隆抗体-荧光素复合物：用0.025mol/L pH9.0 CB将实施例4得到的二甲基色胺单克隆抗体稀释为10mg/mL得到抗体溶液，装入透析袋内；将口袋扎紧，仅留少许空隙；用PBS缓冲液将Alexa
Figure BDA0003675025090000071
染料配成5μg/mL的Alexa
Figure BDA0003675025090000072
染料液，以抗体溶液体积的10倍的使用量盛于烧杯内；将透析袋浸没于Alexa
Figure BDA0003675025090000073
染料液内，放4℃下，在电磁搅拌器缓慢搅拌下，结合24h后取出，标记过程完成，吸取透析袋内结合物，用Sephadex G-25柱层析，去除游离Alexa
Figure BDA0003675025090000074
染料；
D、结合垫：将二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物稀释在含1％BSA、50mg/mL海藻糖和200mg/mL蔗糖的PBS缓冲液中至复合物初始OD值的1/3，以1.0μL/cm的喷量均匀喷洒在结合垫上；将二甲基色胺单克隆抗体-荧光素复合物以1.0μL/cm的喷量均匀喷洒在结合垫上；E、组装：将点完膜的片材底板与结合垫、样品垫、吸水纸组装成大卡，切条后得到二甲基色胺胶体金荧光检测试纸条。
实施例8
二甲基色胺胶体金荧光检测试纸的制备：二甲基色胺抗原为实施例2得到的二甲基色胺抗原，二甲基色胺单克隆抗体为实施例5得到的二甲基色胺单克隆抗体，其余制备过程与实施例7相同。
实施例9
二甲基色胺胶体金荧光检测试纸的制备：二甲基色胺抗原为实施例3得到的二甲基色胺抗原，二甲基色胺单克隆抗体为实施例6得到的二甲基色胺单克隆抗体，其余制备过程与实施例7相同。
配制不同浓度的二甲基色胺溶液，使用实施例8制成的二甲基色胺胶体金荧光检测试剂条对样品进行功能性检测，使用胶体金比色卡判断检测线的显色强度，每个浓度重复测定5次，取平均值，结果如表1所示。
表1.二甲基色胺胶体金荧光检测试纸的显色强度。
样品浓度(ng/mL) T线强度 荧光强度F
0 G9 2301±43
250 G6.5 1395±22
500 G5 846±17
750 G4 513±12
1000 G3.5 311±13
1250 G3 189±12
1500 G2 114±8
1750 G2 69±4
3000 G1 6±1
该胶体金荧光检测试纸的结果判读采用比色卡法，G1-G10表示T线胶体金显色程度，其中肉眼观测G1为T线不显色，表示强阳性；G10为T线显深色，表示强阴性。通过上机检测可得到测试不同浓度样品下荧光强度大小，荧光强度与二甲基色胺的浓度呈负相关性，样品中二甲基色胺浓度越高，荧光强度越弱，且在一定范围内呈反比例关系。从表1可以看出，本发明制备的检测试纸的检出浓度可以低至1000ng/mL，灵敏度高，可通过肉眼观察得到结果，也可以通过荧光强度检测进行定量分析。
使用实施例7-9制成的二甲基色胺胶体金荧光检测试剂条对118例临床尿液样本进行功能性检测。临床尿液样本中阴性73例，阳性45例，二甲基色胺浓度分布在1000～2000ng/mL。检出结果如表2所示。
表2.临床样本检测结果。
Figure BDA0003675025090000091
从表2可以看出，本发明的二甲基色胺胶体金荧光检测试纸对临床样本的检测准确率较高，总体准确度高于90％。

Claims (10)

1.一种二甲基色胺半抗原，其特征是，其分子结构式如式(I)所示，
Figure FDA0003675025080000011
2.一种如权利要求1所述的二甲基色胺半抗原的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)将N,N-二甲基-5-羟色胺作为前体溶于苯，加入三氟乙酸酐后加热反应，反应后将反应液冷却至室温，除去苯得到淡黄色油状物A；
(2)将淡黄色油状物A溶于吡啶中，加入戊二酸酐再加热反应，反应后将反应液冷却至室温，除去吡啶后，分离得到的黄色油状物即为二甲基色胺半抗原。
3.根据权利要求2所述的一种二甲基色胺半抗原的制备方法，其特征是，所述步骤(1)为将N,N-二甲基-5-羟色胺作为前体溶于苯中得到浓度为(0.15-0.20)mmol/mL的溶液，置于0℃以下搅拌5min，再缓慢加入三氟乙酸酐，N,N-二甲基-5-羟色胺与三氟乙酸酐的摩尔比为1：(1-1.2)，缓慢升温至室温搅拌反应1h，然后在78℃下搅拌反应3h，反应后将反应液冷却至室温，将有机溶剂减压蒸干得到淡黄色油状物A。
4.根据权利要求2所述的一种二甲基色胺半抗原的制备方法，其特征是，所述步骤(2)为将淡黄色油状物A用吡啶溶解，再加入戊二酸酐，淡黄色油状物A和戊二酸酐的摩尔比为1：1，以105℃回流搅拌反应18h，反应结束后，将反应液冷却至室温，减压蒸干溶剂，通过薄层色谱分离得到的黄色油状物即二甲基色胺半抗原。
5.一种二甲基色胺人工抗原，其特征是，由权利要求1所述二甲基色胺半抗原与载体蛋白耦合得到，其分子结构式如式(II)所示，
Figure FDA0003675025080000012
其中protein为载体蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种二甲基色胺人工抗原，其特征是，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白和鸡卵清白蛋白中的一种。
7.一种如权利要求5或6所述的二甲基色胺人工抗原的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)将二甲基色胺半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中得到浓度为(0.045-0.050)mmol/mL的溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺和环己基碳酰二亚胺，室温搅拌反应15h，然后以离心取上清液记为A液，二甲基色胺半抗原、环己基碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1-1.2)：(1.1-1.3)；
(2)将载体蛋白溶于PBS缓冲液中，并记为B液，B液中载体蛋白的浓度为5mg/mL；
(3)将A液缓慢滴加到B液中，滴加过程中保持搅拌，在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液，A液与B液的体积比为1:10；
(4)将人工抗原混合液置于透析袋中在碱性透析液中透析2-3次，每次透析时间为24h，再转入PBS缓冲液中透析6-7次，每次透析时间大于2h，透析结束后离心取上清液即得到二甲基色胺人工抗原；
PBS缓冲液浓度为0.1mol/L，pH为7.2-7.4，碱性透析液为pH为11.95-12.05范围内的碳酸钠溶液。
8.如权利要求5所述的二甲基色胺人工抗原在制备二甲基色胺单克隆抗体中的应用。
9.如权利要求5所述的二甲基色胺人工抗原在制备二甲基色胺胶体金-荧光检测试纸中的应用。
10.根据权利要求9所述的二甲基色胺胶体金-荧光检测试纸，其特征是，所述检测线使用二甲基色胺人工抗原为原料点膜获得，所述质控线用羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG为原料点膜获得，所述结合垫使用二甲基色胺单克隆抗体-胶体金复合物与二甲基色胺单克隆抗体-荧光素复合物喷洒在结合垫上获得。
CN202210622055.0A 2022-06-01 2022-06-01 一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 Active CN115521240B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210622055.0A CN115521240B (zh) 2022-06-01 2022-06-01 一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
PCT/CN2022/116739 WO2023231208A1 (zh) 2022-06-01 2022-09-02 一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
US18/360,822 US20230393159A1 (en) 2022-06-01 2023-07-28 Dimethyltryptamine hapten, artificial antigen and preparation methods and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210622055.0A CN115521240B (zh) 2022-06-01 2022-06-01 一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115521240A true CN115521240A (zh) 2022-12-27
CN115521240B CN115521240B (zh) 2024-05-28

Family

ID=84696079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210622055.0A Active CN115521240B (zh) 2022-06-01 2022-06-01 一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN115521240B (zh)
WO (1) WO2023231208A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116478060A (zh) * 2023-03-07 2023-07-25 杭州同舟生物技术有限公司 一种地佐辛半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102258987A (zh) * 2011-04-11 2011-11-30 江苏大学 壳聚糖载体的dmt单克隆抗体免疫亲和柱的制备及应用
CN105131106A (zh) * 2015-07-27 2015-12-09 苏州博源医疗科技有限公司 5-羟基吲哚乙酸免疫原、抗体和检测试剂及制备方法
CN113387867A (zh) * 2021-07-15 2021-09-14 南华大学 一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物及其制备与应用
US20210403425A1 (en) * 2020-06-30 2021-12-30 Field Trip Psychedelics Inc. Tryptamine prodrugs
CN113979914A (zh) * 2021-11-03 2022-01-28 公安部第三研究所 合成***素半抗原化合物及其制备方法和用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102627696B (zh) * 2012-04-11 2013-09-25 杭州博林生物技术有限公司 一种苯环利定人工抗原的制备方法
CN105367647A (zh) * 2014-08-21 2016-03-02 艾博生物医药(杭州)有限公司 一种甲基***人工抗原的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102258987A (zh) * 2011-04-11 2011-11-30 江苏大学 壳聚糖载体的dmt单克隆抗体免疫亲和柱的制备及应用
CN105131106A (zh) * 2015-07-27 2015-12-09 苏州博源医疗科技有限公司 5-羟基吲哚乙酸免疫原、抗体和检测试剂及制备方法
US20210403425A1 (en) * 2020-06-30 2021-12-30 Field Trip Psychedelics Inc. Tryptamine prodrugs
CN113387867A (zh) * 2021-07-15 2021-09-14 南华大学 一种氨基甲酸酯类邻氨基苯甲酸色胺衍生物及其制备与应用
CN113979914A (zh) * 2021-11-03 2022-01-28 公安部第三研究所 合成***素半抗原化合物及其制备方法和用途

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116478060A (zh) * 2023-03-07 2023-07-25 杭州同舟生物技术有限公司 一种地佐辛半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115521240B (zh) 2024-05-28
WO2023231208A1 (zh) 2023-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070254323A1 (en) Malachite green derivatives for immunoassay reagents to detect malachite green
CN111187346B (zh) 一种检测氟虫腈及其代谢物的胶体金试纸条及其制备方法
CN108508215A (zh) 一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN108912090B (zh) 一种快速检测交链孢酚和交链孢酚单甲醚总量的试纸条
CN108196054B (zh) 一种检测甘草酸的试纸条及其制备方法和应用
CN110441512B (zh) 一种乙基麦芽酚半抗原以及乙基麦芽酚的胶体金免疫层析检测装置
CN109061146B (zh) 一种检测啶虫脒的试纸条及其制备方法和应用
CN115521240A (zh) 一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
CN111978271B (zh) 噻螨酮半抗原及其制备方法、噻螨酮抗原、抗体及其应用
US6946547B2 (en) Ecstasy-class analogs and use of same in detection of ecstasy-class compounds
CN112409242B (zh) 一种氨氯地平半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN113109560A (zh) 一种用于氟啶虫酰胺农药速测的试纸条及其制备方法及检测方法
CN112250641A (zh) 双氢克尿噻半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN111766388A (zh) 一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN117126123A (zh) 用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用
CN109061158B (zh) 一种检测啶虫脒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN113582923B (zh) 一种喹哪啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用
US20230393159A1 (en) Dimethyltryptamine hapten, artificial antigen and preparation methods and application thereof
CN114014774A (zh) 一种氟胺酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
CN110117286B (zh) 一种杂环胺8-MeIQx半抗原、抗体及其制备方法和应用
CN112979784A (zh) 一种检测苯氧乙酸类药物的试剂盒及其制备方法和应用
US20190204306A1 (en) Method and System for Detection of Natural High Intensity Sweeteners that Contain Hydroxyl Groups
CN114591243B (zh) 一种安替比林半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN116425759B (zh) 一种用于食品中多种那非类药物同时检测的半抗原、人工抗原及其应用
CN114605322B (zh) 一种右美沙芬半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant