CN115515626A - 用于检测冠状病毒的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

在某些实施方案中，本文描述了测定样品中的冠状病毒靶核酸的区段的方法。在一些实施方案中，所述靶核酸来自SARS‑CoV‑2的基因或其变体。在一些实施方案中，本文所述的方法包括a)使所述样品与：i)检测剂核酸；和ii)包含可编程核酸酶和非天然存在的引导核酸的组合物接触，和b)测定信号的变化，其中所述信号的变化是由所述可编程核酸酶裂解所述检测剂核酸产生的。本文还提供了用于进行本文所述的测定冠状病毒靶核酸区段的方法的装置。

Description

用于检测冠状病毒的组合物和方法
交叉引用
本申请要求保护2020年2月6日提交的美国临时申请No.:62/971,206、2020年3月5日提交的美国临时申请No.:62/985,814、2020年6月17日提交的美国临时申请No.:63/040,473、2020年11月13日提交的美国临时申请No.:63/113,779以及2021年1月15日提交的美国临时申请No.:63/138,284的优先权和权益，所述临时申请各自的全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
新出现的病毒反复出现大规模流行病，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、SARS和MERS冠状病毒、H1N1流感病毒、埃博拉病毒(EBOV)、寨卡病毒(ZIKV)和SARS-CoV-2。冠状病毒可容易地从个体或环境传播至个体。已经报告了来自具有亚临床或轻度症状的受感染个体的冠状病毒的人际传播。缺乏快速、易得和准确的分子诊断测试阻碍了对包括冠状病毒在内的新兴病毒威胁的公共卫生应对。冠状病毒的检测(特别是在感染的早期阶段)可为治疗或干预提供指导，以减少病痛的进展或传播。提高疾病检测测定的灵敏度可提供较早检测，从而减少传播。
发明内容
在各个方面，本公开提供了一种测定样品中的冠状病毒靶核酸的区段的方法，所述方法包括：a)使所述样品与：i)检测剂核酸；和ii)组合物接触，所述组合物包含可编程核酸酶和与所述靶核酸的区段杂交的非天然存在的引导核酸，其中在所述非天然存在的引导核酸与所述冠状病毒靶核酸的所述区段杂交后，所述可编程核酸酶裂解所述检测剂核酸；以及b)测定信号的变化，其中所述信号的所述变化由所述检测剂核酸的裂解而产生。
在一些方面，所述冠状病毒靶核酸来自SARS-CoV-2。在一些方面，所述靶核酸来自SARS-CoV-2的变体，例如本文所述的英国(UK)或南非变体。在一些方面，所述冠状病毒靶核酸来自E基因、N基因或它们的组合。在一些方面，所述冠状病毒靶核酸来自E基因、N基因、S(刺突)基因或它们的组合。在一些方面，所述冠状病毒靶核酸具有SEQ ID NO:179–SEQ IDNO:184中的任一项的序列。在一些方面，所述冠状病毒靶核酸来自S基因并且包含本文表11中描述的任何突变。在一些方面，所述引导核酸是引导RNA。在一些方面，所述引导核酸与SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:219中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。在一些方面，所述引导核酸选自SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:219中的任一项。在一些方面，所述引导核酸选自本文表15中所列的那些中的任一者。在一些方面，所述引导核酸与本文表15中所列的序列中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
在一些方面，所述方法还包括扩增所述冠状病毒靶核酸。在一些方面，扩增所述冠状病毒靶核酸包括使所述样品与用于扩增的试剂接触。在一些方面，使所述样品与用于所述扩增的试剂接触在使所述样品与所述检测剂核酸和所述组合物接触之前发生。在一些方面，使所述样品与用于所述扩增的试剂接触与使所述样品与所述检测剂核酸和所述组合物接触同时发生。在一些方面，所述扩增包括热循环扩增。在一些方面，所述扩增包括等温扩增。
在一些方面，所述扩增包括转录介导的扩增(TMA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)、链置换扩增(SDA)、环介导的扩增(LAMP)、指数扩增反应(EXPAR)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、简单方法扩增RNA靶标(SMART)、单引物等温扩增(SPIA)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、铰链起始的引物依赖性核酸扩增(HIP)、切口酶扩增反应(NEAR)、改进的多重置换扩增(IMDA)或逆转录酶聚合酶链反应。在一些方面，所述扩增包括环介导的扩增(LAMP)。
在一些方面，所述用于扩增的试剂包括扩增引物、聚合酶和dNTP。在一些方面，所述用于扩增的试剂包括FIP引物、BIP引物、LF引物和LB引物。在一些方面，所述扩增引物选自SEQ ID NO:194–SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:202–SEQ ID NO:205。在一些方面，所述引物选自本文表14中列出的那些。在一些方面，所述方法还包括使所述冠状病毒靶核酸逆转录。在一些方面，所述逆转录包括使所述样品与用于逆转录的试剂接触。在一些方面，所述用于逆转录的试剂包括逆转录酶、寡核苷酸引物和dNTP。在一些方面，使所述样品与用于逆转录的试剂接触在使所述样品与所述检测剂核酸与所述检测剂核酸和所述组合物接触之前发生，在使所述样品与所述用于扩增的试剂接触之前发生，或在两者之前发生。
在一些方面，使所述样品与用于逆转录的试剂接触与使所述样品与所述检测剂核酸与所述检测剂核酸和所述组合物接触同时发生，与使所述样品与所述用于扩增的试剂接触同时发生，或与两者同时发生。在一些方面，所述方法还包括通过使对照核酸与第二检测剂核酸和组合物接触来测定对照序列，所述组合物包含可编程核酸酶和与所述对照核酸的区段杂交的非天然存在的引导核酸，其中在所述非天然存在的引导核酸与所述对照核酸的所述区段杂交后，所述可编程核酸酶裂解所述检测剂核酸。
在一些方面，所述对照核酸是RNA酶P。在一些方面，所述对照核酸具有SEQ ID NO:220的序列。在一些方面，所述引导核酸与SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:219具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。在一些方面，所述引导核酸是SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:219。
在一些方面，所述方法在侧流条上进行。在一些方面，所述侧流条包括样品垫区域、对照线和测试线。在一些方面，所述方法还包括将所述样品添加至所述样品垫区域。在一些方面，在所述对照线处检测未裂解的报告分子的存在或不存在，并且在测试线处呈现裂解的报告分子的存在或不存在。在一些方面，所述方法在微流体盒中进行。在一些方面，所述方法还包括使所述样品裂解。在一些方面，使所述样品裂解包括使所述样品与裂解缓冲液接触。
在一些方面，所述可编程核酸酶包含RuvC催化结构域。在一些方面，所述可编程核酸酶是V型CRISPR/Cas效应蛋白。在一些方面，所述V型CRISPR/Cas效应蛋白是Cas12蛋白。在一些方面，所述Cas12蛋白包含Cas12a多肽、Cas12b多肽、Cas12c多肽、Cas12d多肽、Cas12e多肽、C2c4多肽、C2c8多肽、C2c5多肽、C2c10多肽和C2c9多肽。在一些方面，所述Cas12蛋白与SEQ ID NO:18–SEQ ID NO:60中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。在一些方面，所述Cas12蛋白选自SEQ ID NO:18–SEQ ID NO:60。
在一些方面，所述V型CRIPSR/Cas效应蛋白是Cas14蛋白。在一些方面，所述Cas14蛋白包含Cas14a多肽、Cas14b多肽、Cas14c多肽、Cas14d多肽、Cas14e多肽、Cas14f多肽、Cas14g多肽、Cas14h多肽、Cas14i多肽、Cas14j多肽或Cas14k多肽。在一些方面，所述Cas14蛋白与SEQ ID NO:61–SEQ ID NO:152中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
在一些方面，所述Cas14蛋白选自SEQ ID NO:61–SEQ ID NO:152。在一些方面，所述V型CRIPSR/Cas效应蛋白是CasФ蛋白。在一些方面，所述CasФ蛋白与SEQ ID NO:221–SEQ ID NO:268中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。在一些方面，所述CasФ蛋白选自SEQ ID NO:221–SEQ ID NO:268。在一些方面，所述方法还包括体外转录经扩增的冠状病毒靶核酸。在一些方面，所述体外转录包括使所述经扩增的冠状病毒靶核酸与用于体外转录的试剂接触。
在一些方面，所述用于体外转录的试剂包括RNA聚合酶、引物和NTP。在一些方面，所述可编程核酸酶包含HEPN裂解结构域。在一些方面，所述可编程核酸酶是VI型CRISPR/Cas效应蛋白。在一些方面，所述VI型CRISPR/Cas效应蛋白是Cas13蛋白。在一些方面，所述Cas13蛋白包含Cas13a多肽、Cas13b多肽、Cas13c多肽、Cas13c多肽、Cas13d多肽或Cas13e多肽。在一些方面，所述Cas13蛋白与SEQ ID NO:153–SEQ ID NO:170中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。在一些方面，所述Cas13蛋白选自SEQ ID NO:153–SEQ ID NO:170。
在一些方面，所述方法还包括多于一种冠状病毒靶核酸的多重检测。在一些方面，所述方法还包括多于一种冠状病毒靶核酸和对照核酸的多重检测。在一些方面，所述多重检测在试管、孔板、侧流条或微流体盒中进行。在一些方面，样品裂解、逆转录、扩增、体外转录、检测或它们的任何组合在单个体积中进行。在一些方面，样品裂解、逆转录、扩增、体外转录、检测或它们的任何组合在单独体积中进行。
在各个方面，本公开提供了一种包含非天然存在的引导核酸的组合物，所述非天然存在的引导核酸与SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:177中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
在一些方面，所述引导核酸选自SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:177中的任一项。在一些方面，所述组合物还包含本文公开的任何检测剂核酸。在一些方面，所述组合物还包含本文公开的任何可编程核酸酶。在一些方面，所述组合物还包含本文公开的任何用于扩增的试剂。在一些方面，所述组合物还包含本文公开的任何用于逆转录的试剂。在一些方面，所述组合物还包含本文公开的任何用于体外转录的试剂。在一些方面，所述组合物还包含本文公开的任何裂解缓冲液。在一些方面，所述组合物还包含本文公开的任何对照核酸。在一些方面，所述组合物还包含本文公开的任何引导核酸。在一些方面，其中所述组合物存在于本文公开的任何侧流条中。在一些方面，其中所述组合物存在于本文公开的任何微流体盒中。
在一些方面，本文还描述了一种装置，所述装置包括：样品接口，所述样品接口被配置为接收包含目标冠状病毒序列的样品；与所述样品接口和检测室流体连通的通道，所述通道包括一个或多个可移动机构以将所述样品分离成多个液滴，其中所述检测室被配置为接收所述多个液滴并使所述多个液滴与设置在所述检测室表面上的至少一个可编程核酸酶探针接触，其中所述至少一个可编程核酸酶探针包含与可编程核酸酶复合的引导核酸；以及多个传感器，所述多个传感器通过检测由所述至少一个可编程核酸酶探针裂解所述至少一个目标序列的靶核酸区域时产生的信号来确定所述目标冠状病毒序列的存在。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，就如每个单独的公布、专利或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入的程度一样。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的附图。在阐述请求并支付必要的费用后，本事务所将提供具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。本公开的新颖特征在随附权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述使用公开原理的说明性实施方案的详细描述和附图将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1示意性地示出了使用逆转录和环介导等温扩增(RT-LAMP)和靶向Cas12 DNA核酸内切酶的CRISPR反式报告子(DETECTR)反应制备和检测样品中SARS-CoV-2(“2019-nCoV”)的存在或不存在的步骤。
图2示出了用不同引物组(“2019-nCoV-组1”至“2019-nCoV-组12”)扩增并使用LbCas12a和针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA检测的SARS-CoV-2 N-基因的DETECTR测定结果。较短时间来获得结果指示阳性结果。对于所有引物组，对于具有更多靶序列的样品获得结果的时间较短，从而表明所述测定对所述靶序列灵敏。
图3示出了对于0fM和5fM样品，图2中绘制的DETECTR反应的单独迹线。在每个图中，0fM迹线在基线上方不可见，从而表明几乎没有非特异性检测。
图4示出了对含有N-基因、E-基因或无靶标(“NTC”)并使用针对SARS-CoV-2的E-基因的引物组(“2019-nCoV-E-组13”至“2019-nCoV-E-组20”)或针对SARS-CoV-2的N-基因的引物组(“2019-nCoV-N-组21”至“2019-nCoV-N-组24”)扩增的样品的DETECTR反应的获得结果的时间。用于特异性检测SARS-CoV-2 E-基因的表现最佳的引物组是SARS-CoV-2-E-组14。
图5示出了用引物组1(“2019-nCoV-组1”)扩增并使用LbCas12a和针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(“R1763–CDC-N2-SARS-CoV-2”)或针对SARS-CoV的N-基因的gRNA(“R1766–CDC-N2-SARS”)检测的SARS-CoV-2 N-基因的DETECTR测定结果。
图6示出了用于确定DETECTR反应中使用针对SARS-CoV-2的N-基因的引物组(“2019-nCoV-N-组1”)扩增的SARS-CoV-2的检测限的DETECTR反应的结果。对含有15,000、4,000、1,000、500、200、100、50、20或0个SARS-CoV-2 N-基因靶核酸拷贝的样品进行了检测。N-基因RNA的凝胶在下文示出。
图7示出了使用POP7样品引物组扩增RNA酶P(GGAGTATTGAATAGTTGGGAATTGGAACCCCTCCAGGGGGAACCAAACATTGTCGTTCAGAAGAAGACAAAGAGAGATTGAAATGAAGCTGTTGATTTCAACACACAAATTCTGGTGGTAGATGAAAGCAAAGCAAGTAAGTTTCTCCGAATCCCTAGTCAACTGGAGGTAGAGACGGACTGCGCAGGTTAACTACAGCTCCCAGCATGCCTGAGGGGCGGGCTCAGCGGCTGCGCAGACTGGCGCGCGCGGACGGTCATGGGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTGTTGCTATCAATCATATCGTTGACTTTAAGGAAAAGAAACAGGAAATTGAAAAACCAGTAGCTGTTTCTGAACTCTTCACAACTTTGCCAATTGTACAGGGAAAATCAAGACCAATTAAAATTTTAACTAGATTAACAATTATTGTCTCGGATCCATCTCACTGCAATGTTTTGAGAGCAACTTCTTCAAGGGCCCGGCTCTATGATGTTGTTGCAGTTTTTCCAAAGACAGAAAAGCTTTTTCATATTGCTTGCACACATTTAGATGTGGATTTAGTCTGCATAACTGTAACAGAGAAACTACCATTTTACTTCAAAAGACCTCCTATTAATGTGGCGATTGACCGAGGCCTGGCTTTTGAACTTGTCTATAGCCCTGCTATCAAAGACTCCACAATGAGAAGGTATACAATTTCCAGTGCCCTCAATTTGATGCAAATCTGCAAAGGAAAGAATGTAATTATATCTAGTGCTGCAGAAAGGCCTTTAGAAATAAGAGGGCCATATGACGTGGCAAATCTAGGCTTGCTGTTTGGGCTCTCTGAAAGTGACGCCAAGGCTGCGGTGTCCACCAACTGCCGAGCAGCGCTTCTCCATGGAGAAACTAGAAAAACTGCTTTTGGAATTATCTCTACAGTGAAGAAACCTCGGCCATCAGAAGGAGATGAAGATTGTCTTCCAGCTTCCAAGAAAGCCAAGTGTGAGGGCTGAAAAGAATGCCCCAGTCTCTGTCAGCACTCCCTTCTTCCCTTTTATAGTTCATCAGCCACAACAAAAATAAAACCTTTGTGTGATTTACTGTTTTCATTTGGAGCTAGAAATCAATAGTCTATAAAAACAGTTTTACTTGCAATCCATTAAAACAACAAACGAAACCTAGTGAAGCATCTTTTTAAAAGGCTGCCAGCTTAATGAATTTAGATGTACTTTAAGAGAGAAAGACTGGTTATTTCTCCTTTGTGTAAGTGATAAACAACAGCAAATATACTTGAATAAAATGTTTCAGGTATTTTTGTTTCATTTTGTTTTTGAGATAGGGTCTTTGTTGCTCAGGCTGGAGTACAGTGGCATAATCACAGCTCACTGCAACCTCAATCCTGGGCTCAAGTGATCCTCCCGCTTCAGCCTCTCAAGCAGCGGGAACTACAGGTGTGCACTACCACACCTGGCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTGTAGAGACATGGTCTCACTATGTTGCTGAGGCTGGTCTCAAACTCCTAGGATCAAGCCATCCTCCCGCTTTGGCCTCCTAAAGTGCTGGGATTACATGAGCCACCACATGCAGCCAGATGTTTGAATATTTTAAGAGCTTCTTTCGAAAGTTTCTTGTTCATACTCAAATAGTAGTTATTTTGAAGATATTCAAACTTATATTGAAGAAGTGACTTTAGTTCCTCTTGTTTTAAGCTTCTTTCATGTATTCAAATCAGCATTTTTTTCTAAGAAATTGCTATAGAATTTGTGGAAGGAGAGAGGATACACATGTAAAATTACATCTGGTCTCTTCCTTCACTGCTTCATGCCTACGTAAGGTCTTTGAAATAGGATTCCTTACTTTTAGTTAGAAACCCCTAAAACGCTAATATTGATTTTCCTGATAGCTGTATTAAAAATAGCAAAGCATCGGACTGA，SEQ ID NO:220)。使用LAMP扩增样品。使用针对RNA酶P的gRNA(“R779”)和Cas12变体(SEQ ID NO:28)进行DETECTR反应。样品含有HeLa总RNA或HeLa基因组DNA。
图8示出了多重DETECTR反应的获得结果的时间。样品含有体外转录的SARS-CoV-2的N-基因(“N-基因IVT”)、体外转录的SARS-CoV-2的E-基因(“E-基因IVT”)、HeLa总RNA或无靶标(“NTC”)。使用针对SARS-CoV-2 N-基因(“组1”)、SARS-CoV-2 E-基因(“组14”)或RNA酶”(“RNA酶P”)的一个或多个引物组对样品进行扩增。
图9示出了使用针对SARS-CoV-2 N-基因(“组1”)、SARS-CoV-2E-基因(“组14”)或RNA酶P(“RNA酶P”)的引物组的不同组合的多重DETECTR反应的获得结果的时间。对含有体外转录的SARS-CoV-2的N-基因(左，“N-基因IVT”)或体外转录的SARS-CoV-2的E-基因(右，“E-基因IVT”)的样品进行了测试。
图10示出了使用来自图8和图9的表现最佳的引物组组合的多重DETECTR反应的获得结果的时间。
图11示意性地示出了用于检测SARS-CoV-2的N-2基因的CDC-N2靶位点的序列。
图12示意性地示出了SARS-CoV-2 N-基因(“N-Sarbeco”)靶位点的区域的序列。
图13示出了用于确定针对SARS-CoV-2的N-基因(“R1763”)、SARS-CoV的N-基因(“R1766”)或Sarbeco冠状病毒的N-基因(“R1767”)的gRNA对于含有SARS-CoV-2的N-基因(“N–2019-nCoV”)、SARS-CoV的N-基因(“N-SARS-CoV”)或蝙蝠-SL-CoV45的N-基因(“N–蝙蝠-SL-CoV45”)的样品的灵敏度的DETECTR测定的结果。
图14示意性地示出了SARS-CoV-2 E-基因(“E-Sarbeco”)靶位点的区域的序列。
图15示出了用于确定针对冠状病毒N-基因的两种gRNA对于含有SARS-CoV-2的E-基因(“E-2019-nCoV”)、SARS-CoV的E-基因(“E–SARS-CoV”)、蝙蝠-SL-CoV45的E-基因(“E–蝙蝠-SL-CoV45”)或蝙蝠-SL-CoV21的E-基因(“E–蝙蝠-SL-CoV21”)的样品的灵敏度的DETECTR测定的结果。
图16示出了使用Cas12变体(SEQ ID NO:28)检测SARS-CoV-2N-基因靶RNA的存在或不存在的侧流DETECTR反应的结果。示出侧流测试条。对含有(“+”)或缺乏(“-”)体外转录的SARS-CoV-2 N-基因RNA(“N-基因IVT”)的样品进行了测试。顶部的一组水平线(表示为“测试”)指示DETECTR反应的结果。
图17示意性地示出了使用可编程核酸酶检测靶核酸。简言之，具有反式附带裂解活性的Cas蛋白在与引导核酸和与所述引导核酸的区域反向互补的靶序列结合后被激活。激活的可编程核酸酶裂解报告子核酸，从而产生可检测信号。
图18示意性地示出了样品中靶核酸的存在或不存在的检测。使用等温扩增来扩增样品中的选定核酸。使经扩增的样品与可编程核酸酶、引导核酸和报告子核酸接触，如图17中所示。如果样品含有靶核酸，则产生可检测信号。
图19示出了用于检测样品中SARS-CoV-2(“2019-nCoV”)RNA的存在或不存在的DETECTR侧流反应的结果。RNA酶P的检测用作样品质量控制。将样品进行体外转录和扩增(左)，并使用Cas12可编程核酸酶(右)进行检测。用Cas12可编程核酸酶和针对SARS-CoV-2的gRNA测定含有(“+”)或缺乏(“-”)体外转录的SARS-CoV-2 RNA(“2019-nCoV IVT”)的样品持续0分钟或5分钟。所述反应对含有SARS-CoV-2的样品灵敏。
图20示出了用于确定患者样品中SARS-CoV-2的存在或不存在的使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)的DETECTR反应的结果。
图21示出了用于检测患者样品中SARS-CoV-2的存在或不存在的侧流DETECTR反应的结果。使用针对SARS-CoV-2的gRNA或针对RNA酶P的gRNA检测样品。
图22示出了使用逆转录和环介导等温扩增(RT-LAMP)及Cas12检测进行的冠状病毒检测的技术规范和测定条件。
图23示出了使用LbCas12a评价用于检测SARS-CoV-2的多种gRNA的DETECTR测定的结果。使用引物组扩增靶核酸序列以扩增SARS-CoV-2 E-基因(“2019-nCoV-E-组13”至“2019-nCoV-E-组20”)或SARS-CoV-2 N-基因(“2019-nCoV-N-组21”至“2019-nCoV-N-族24”)。
图24示出了评价多种gRNA在区分三种不同的冠状病毒株SARS-CoV-2(“COVID-2019”)、SARS-CoV或蝙蝠-SL-CoV45方面的效用的DETECTR测定的结果。对含有SARS-CoV-2(“N–2019-nCoV”)、SARS-CoV(“N–SARS-CoV”)或蝙蝠-SL-CoV45(“N–蝙蝠-SL-CoV45”)的N-基因扩增子的样品进行了测试。
图25示出了评价多种gRNA在区分三种不同的冠状病毒株SARS-CoV-2(“COVID-2019”)、SARS-CoV或蝙蝠-SL-CoV45方面的效用的DETECTR测定的结果。对含有SARS-CoV-2(“N–2019-nCoV”)、SARS-CoV(“N–SARS-CoV”)或蝙蝠-SL-CoV45(“N–蝙蝠-SL-CoV45”)的E-基因扩增子的样品进行了测试。
图26示出了评价LAMP引物组在SARS-CoV-2靶标的多重扩增方面的效用的DETECTR测定的结果。使用针对SARS-CoV-2 N-基因(“组1”)或SARS-CoV-2 E-基因(“组14”)或RNA酶P(“RNA酶P”)的一个或多个引物组对样品进行扩增。
图27示出了评价RT-LAMP扩增反应对常见样品缓冲液的灵敏度的DETECTR测定的结果。在不同缓冲液稀释度(从左至右：1x、0.5x、0.25x、0.125x或无缓冲液)下在通用转运介质(UTM，顶部)或DNA/RNA Shield缓冲液(底部)中测量反应。
图28示出了用于确定针对SARS-CoV-2(归因于COVID-19感染的病毒)的DETECTR测定的检测限(LoD)的DETECTR测定的结果。
图29示出了使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)，评价针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(“R1763–N-基因”)在2重(2-plex)多重RT-LAMP反应中的靶标特异性的DETECTR测定的结果。
图30示出了使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)，评价针对SARS-CoV-2的N-基因(“R1763–N-基因”)或SARS-CoV-2的E-基因(“R1765–E-基因”)的gRNA在3重(3-plex)多重RT-LAMP反应中的靶标特异性的DETECTR测定的结果。
图31示出了与PCRD侧流装置相容的检测剂核酸的设计。提供了示例性的相容检测剂核酸rep072、rep076和rep100(左)。这些检测剂核酸可用于PCRD侧流装置(右)中以检测靶核酸的存在或不存在。右上示意图示出当与不含靶核酸的样品接触时产生的示例性条带构造。右下示意图示出当与含有靶核酸的样品接触时产生的示例性条带构造。
图32A示出了指示冠状病毒基因组内E(包膜)基因和N(核蛋白)基因区域的位置的基因组图。引物和探针相对于E和N基因区域的相应区域或退火区域显示在相应基因区域下方。RT-LAMP引物由黑色矩形表示，FIP引物(灰色)的F1c和B1c半部的结合位置由带虚线边框的条纹矩形表示。在世界卫生组织(World Health Organization，WHO)和疾病控制中心(Center for Disease Control，CDC)使用的测试中扩增的区域分别表示为“WHO E扩增子”和“CDC N2扩增子”。
图32B示出了使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)，评价针对各种冠状病毒株(SARS-CoV-2、SARS-CoV或蝙蝠-SL-CoVZC45)的N-基因或E-基因的gRNA的特异性或广泛检测效用的DETECTR测定的结果。所述测定中使用的N基因gRNA(左，“N-基因”)对SARS-CoV-2具有特异性，而E基因gRNA能够检测3种SARS样冠状病毒(右，“E-基因”)。靶向SARS-CoV和蝙蝠冠状病毒的单独N基因gRNA未能检测到SARS-CoV-2(中间，“N-基因相关物种变体”)。
图32C示出了用于冠状病毒DETECTR测定中的示例性实验室设备。除了适当的生物安全防护设备外，所使用的设备还包括样品收集装置、微量离心管、设定为37℃和62℃的加热块、移液管和尖端以及侧流条。
图32D示出了用于检测受试者中的冠状病毒的DETECTR测定的示例性工作流程。常规RNA提取或样品基质可用作DETECTR(NE基因、EN基因和RNA酶P的LAMP预扩增和基于Cas12的检测)的输入，其可通过荧光读取仪或侧流条进行可视化。
图32E示出了侧流测试条(左)，指示SARS-CoV-2 N-基因(左，上)的阳性测试结果和SARS-CoV-2 N-基因(左，下)的阴性测试结果。表(右)说明基于侧流条的冠状病毒诊断测定的可能测试指标和相关结果，所述测定测试RNA酶P(阳性对照)、SARS-CoV-2 N-基因和冠状病毒E-基因的存在或不存在。
图33A示出了在靶核酸存在下，Cas12可编程核酸酶对用FAM和生物素标记的检测剂核酸的裂解(上)。侧流测试条的示意图(下)示出指示所测试样品中靶核酸的存在(“阳性”)或不存在(“阴性”)的标记。完整FAM生物素化报告分子流向对照捕获线。在识别匹配靶标后，Cas-gRNA复合物裂解报告分子，所述报告分子流向靶标捕获线。
图33B示出了用于确定反应时间对含有0fM SARS-CoV-2 RNA或5fM SARS-CoV-2RNA的样品的影响的使用LbCas12a的DETECTR测定的结果。对SARS-CoV-2 N-基因的RT-LAMP扩增子进行的LbCas12a检测测定的荧光信号在10分钟内饱和。通过在62℃下扩增20分钟由2μL的5fM或0fM SARS-CoV-2 N-基因IVT RNA产生RT-LAMP扩增子。
图33C示出了对应于图33B中由DETECTR测定的样品的侧流测试条测定样品。示出随反应时间变化的含有0fM SARS-CoV-2 RNA(“-”)或5fM SARS-CoV-2 RNA(“+”)的样品的对应于对照(C)或测试(T)的条带。同一RT-LAMP扩增子上的LbCas12a在5分钟内通过侧流测定产生可见信号。
图33D示出了用于确定SARS-CoV-2的检测限的使用LbCas12a的DETECTR测定(中间)或CDC方案(左)的结果。示出随每个反应的病毒基因组拷贝数的变化的信号。示出0个拷贝/μL和10个拷贝/μL(右)的测定的代表性侧流结果。
图33E示出了患者样品DETECTR数据。来自6名患有COVID-19感染的患者(n＝11，5次重复)和12名感染流感或4种季节性冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43)中的一种的患者(n＝12)的临床样品使用SARS-CoV-2 DETECTR(阴影框)进行分析。使用ImageJ对来自侧流条的信号强度进行定量，并将其针对N基因、E基因或RNA酶P组内的最高值归一化，其中在高于背景五个标准偏差处具有阳性阈值。SARS-CoV-2测试的最终确定是基于图32E中的解释矩阵。FluA表示甲型流感，并且FluB表示乙型流感。HCoV表示人冠状病毒。
图33F示出了在患有COVID-19的患者(对SARS-CoV-2呈阳性，“患者1”)、缺乏靶核酸的无靶标对照样品(“NTC”)和含有靶核酸的阳性对照样品(“PC”)中测试SARS-CoV-2的侧流测试条。测试了所有三个样品中SARS-CoV-2 N-基因、SARS-CoV-2 E-基因和RNA酶P的存在。
图33G示出了SARS-CoV-2 DETECTR测定的性能特征。使用SARS-CoV-2 DETECTR测定的荧光型式评估了83个临床样品(41个COVID-19阳性，42个阴性)。由于失败测定质量控制，一个样品(COVID19-3)被省略。阳性和阴性调用是基于图32E中描述的标准。fM表示飞摩尔；NTC表示无模板对照；PPA表示阳性预测一致性；NPA表示阴性预测一致性。
图34示出了比较使用本公开的RT-LAMP的SARS-CoV-2DETECTR测定与使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测方法的SARS-CoV-2测定的表。DETECTR RT-LAMP测定中的N-基因靶标与qRT-PCR测定中检测到的N-基因N2扩增子相同。
图35A示出了在不同缓冲液条件下RT-LAMP扩增的获得结果的时间。获得结果的时间被计算为荧光值为实验最大值的三分之一的时间。未能扩增的反应以20分钟的值报告，并标记为“无扩增”。对于靶对照质粒在水、10％磷酸盐缓冲盐水(PBS)或10％通用转运培养基(UTM)中的不同起始浓度确定获得结果的时间。获得结果的时间越短表明扩增越快。
图35B示出了用于确定SARS-CoV-2的N-基因、SARS-CoV-2的E-基因和RNA酶P在5％UTM、5％ PBS或水中的扩增效率的RT-LAMP测定的结果。对含有0.5fM体外转录的N-基因、0.5fM体外转录的E-基因和0.8ng/μL HeLa总RNA(“N+E+总RNA”)或无靶标对照(“NTC”)的样品进行了测试
图35C示出了在PBS中直接从鼻拭子扩增RNA。随PBS浓度变化测量获得结果的时间。鼻拭子(“鼻拭子”)掺杂HeLa总RNA(左，“总RNA：0.08ng/uL”)或水(右，“总RNA：0ng/uL”)。比较没有鼻拭子(“无拭子”)的样品作为对照。
图36A示出了由SARS-CoV-2 N-基因(n＝6)的LbCas12a(SEQ ID NO:18)检测产生的原始荧光曲线。曲线在不到20分钟内显示饱和。
图36B示出了如从图36A所示的原始荧光迹线所确定，用LbCas12a检测的SARS-CoV-2 N-基因的DETECTR测定的检测限。随着SARS-CoV-2 N-基因的浓度(每mL拷贝数)降低，测量荧光强度。
图36C示出了如从图36A中所示的原始荧光迹线所确定，DETECTR测定检测限的获得结果的时间。获得结果的时间越短表明扩增和检测越快。
图37A示出了用于确定反应时间对含有0fM SARS-CoV-2 RNA或5fM SARS-CoV-2RNA的样品的影响的使用LbCas12a的DETECTR测定的结果。
图37B示出了对应于图37A中通过DETECTR测定的样品的侧流测试条测定样品。示出随反应时间变化含有0fM SARS-CoV-2RNA(“-”)或5fM SARS-CoV-2 RNA(“+”)的样品的对应于对照(C)或测试(T)的条带。
图38示出了用于确定gRNA对于不同人冠状病毒株的交叉反应性的DETECTR测定的结果。对含有SARS-CoV-2 N-基因、SARS-CoV N-基因、蝙蝠-SL-CoVZC45 N-基因、SARS-CoV-2 E-基因、SARS-CoV E-基因或蝙蝠-SL-CoVZC45 E-基因的体外转录RNA的样品或对CoV-HKU1、CoV-299E、CoV-OC43或CoV-NL63呈阳性的临床样品进行了测试。HeLa总RNA作为RNA酶P的阳性对照进行了测试，并且缺乏靶核酸的样品(“NTC”)作为阴性对照进行了测试。
图39A示出了三种冠状病毒株的N-基因gRNA所靶向的靶位点的序列比对。N基因gRNA#1与CDC-N2扩增子相容，N基因gRNA#2与WHO N-Sarbeco扩增子相容。
图39B示出了三种冠状病毒株的E-基因gRNA所靶向的靶位点的序列比对。所测试的两种E基因gRNA(E基因gRNA#1和E基因gRNA#2)与WHO E-Sarbeco扩增子相容。
图40A-图40C示出了COVID-19感染患者样品的DETECTR动力学曲线。使用两种不同的基因N2和E以及样品输入对照RNA酶P，测试了来自5名患者的10份鼻拭子样品(COVID19-1至COVID19-10)的SARS-CoV-2。图40A示出了使用标准扩增和检测条件，10名患者中的9名产生了指示SARS-CoV-2 E-基因的存在的稳健荧光曲线(20分钟扩增，10分钟内发出信号)。图40B示出了SARS-CoV-2 N-基因需要延长的扩增时间才来产生10名患者中的8名的强荧光曲线(30分钟扩增，10分钟内发出信号)。图40C示出了作为样品输入对照，RNA酶P对于所测试的22个总样品中的17个呈阳性(20分钟扩增，10分钟内发出信号)。
图41示出了SARS-CoV-2的DETECTR分析在大约30分钟内鉴定直至10个病毒基因组(20分钟扩增，10分钟DETECTR)。将一式两份LAMP反应物扩增20分钟，然后进行LbCas12aDETECTR分析。
图42示出了图41中提供的LbCas12a DETECTR分析在5分钟时的原始荧光。SARS-CoV-2 N-基因的检测限被确定为每个反应10个病毒基因组(n＝6)。
图43示出了10个COVID-19感染患者样品和12个其他病毒性呼吸道感染患者样品的侧流DETECTR结果。使用两种不同的基因N2和E以及样品输入对照RNA酶P，测试了来自6名患者的10个样品(COVID19-1至COVID19-5)以及一个鼻咽拭子(A)和一个口咽拭子(B)的SARS-CoV-2。根据图44中提供的指导分析结果。
图44示出了用于解释SARS-CoV-2 DETECTR侧流结果的说明。
图45A-C示出了对11个COVID-19感染患者样品和12个其他病毒性呼吸道感染患者样品进行的荧光DETECTR动力学曲线。使用两种不同的基因N2和E以及样品输入对照RNA酶P测试了来自6名患者的10份鼻咽/口咽拭子样品(COVID19-1至COVID19-6)的SARS-CoV-2。
图45A示出了使用标准扩增和检测条件测试的样品，12个COVID-19阳性患者样品中的10个产生了指示SARS-CoV-2 E基因的存在的稳健荧光曲线(20分钟扩增，10分钟内发出信号)。在12个其他病毒性呼吸道临床样品中均未检测到E基因信号。
图45B示出了对于12个COVID-19阳性患者样品中的10个，使用延长的扩增时间以产生强荧光曲线(30分钟扩增，10分钟内发出信号)，测试样品中SARS-CoV-2 N基因的存在。在12个其他病毒性呼吸道临床样品中均未检测到N基因信号。
图46A示出了临床样品的SARS-CoV-2 DETECTR测定结果的热图，其中指示了测试解释。对于24个临床样品(12个COVID-19阳性)的SARS-CoV-2 DETECTR，通过ImageJ GelAnalyzer工具定量的侧流SARS-CoV-2 DETECTR测定的结果(上)显示与测定的荧光型式的结果(下)的98.6％(71/72个条)一致性。两种测定均以30分钟扩增运行，Cas12反应信号在10分钟时获取。推定阳性用呈橙色的(+)(下，第4列)表示。
图46B示出了临床样品的SARS-CoV-2 DETECTR测定结果的热图，其中指示了测试解释。上图示出了对另外30个COVID-19阳性临床样品的荧光SARS-CoV-2 DETECTR测定的结果(27个阳性、1个推定阳性、2个阴性)。推定阳性用呈橙色的(+)表示(上，第9列)。下图示出了对另外30个COVID-19阴性临床样品的荧光SARS-CoV-2DETECTR测定的结果(0个阳性，30个阴性)。
图47示出了用不同引物组对RNA酶P POP7进行RT-LAMP扩增的获得结果的时间。确定用引物组1-10扩增的样品的获得结果的时间。引物组1对应于SEQ ID NO:206–SEQ IDNO:211，并且引物组9对应于SEQ ID NO:212–SEQ ID NO:217。
图48示出了对使用RT-LAMP用引物组1或引物组9扩增并用R779、R780或R1965gRNA检测的RNA酶P POP7进行的DETECTR反应随时间推移的原始荧光。DETECTR反应在37℃下进行90分钟。通过R779在无背景(虚线)情况下检测到由第1组引物产生的扩增子。
图49A示出了在含有使用RT-LAMP用引物组1或引物组9扩增的总RNA的10倍稀释液的样品中RNA酶P POP7检测的获得结果的时间。扩增在60℃下进行30分钟。
图49B示出了图49A中所示并使用gRNA 779(SEQ ID NO:178)或gRNA 1965(SEQ IDNO:218)检测的RNA酶P POP7扩增子的DETECTR反应。用gRNA 779检测使用引物组1扩增的样品，并且用gRNA 1965检测使用引物组9扩增的样品。DETECTR反应在37℃下进行90分钟。
图50示出了在不同裂解条件下使用LAMP扩增SeraCare靶核酸的结果。样品在含有缓冲液(上图)或病毒裂解缓冲液(“VLB”，下图)的低pH缓冲液中扩增。缓冲液不含还原剂(“对照”，第1和4列)、含有还原剂B(第2和5列)或含有还原剂A(第3和6列)。将样品在室温(左图)或95℃(右图)下孵育5分钟。样品含有每个反应无靶标(“NTC”)、2.5、25或250个拷贝。使用25μL反应中的5μL样品一式三份进行测定。
图51示出了在不同裂解条件下使用LAMP扩增SeraCare标准靶核酸的结果。样品在含有缓冲液(左图)或病毒裂解缓冲液(“VLB”，右图)的低pH缓冲液中扩增。缓冲液不含还原剂(“对照”)、含有还原剂B或含有还原剂A。将样品在室温(上图)或95℃(下图)下孵育5分钟。样品含有每个反应无靶标(“NTC”)、1.5、2.5、15、25、150或250个拷贝。使用15μL反应物中的3μL样品或25μL反应物中的5μL样品一式三份进行测定。
图52示出了在六种不同的病毒裂解缓冲液(“VLB”、“VLB-D”、“VLB-T”、“缓冲液”、“缓冲液-A”和“缓冲液-B”)存在下SARS-CoV-2N基因(“N”)和RNA酶P样品输入对照核酸(“RP”)的扩增。缓冲液-A含有含还原剂A的缓冲液，并且缓冲液-B含有含还原剂B的缓冲液。阴影方块表示扩增速率，阴影越深表示扩增越快。在95℃(“95C”)或室温(“RT”)下对高、中或低滴度COVID-19阳性患者样品(分别“16.9”、“30.5”和“33.6”)进行扩增。一式两份测量样品。
图53A和图53B示出了被设计用于DETECTR测定中的盒的照片。
图54A和图54B是图53A中所示的盒的示意图。
图55A-图55D示出了被设计用于DETECTR测定中的盒的示意图。图55A示出了具有圆形试剂储存孔和z方向高电阻蛇形路径的盒。图55B示出了具有细长试剂储存孔和z方向高电阻蛇形路径的盒。图55C示出了具有圆形试剂储存孔和xy方向高电阻蛇形路径的盒。图55D示出了具有细长试剂储存孔和xy方向高电阻蛇形路径的盒。
图56A-图56D示出了被设计用于DETECTR测定中的盒的示意图。图56A示出了具有用于样品计量的蛇形电阻通道的盒，所述蛇形电阻通道在与样品计量通道不同的平面或层上是蛇形的。图56B示出了具有用于样品计量的蛇形电阻通道的盒，所述蛇形电阻通道在与样品计量通道相同的平面或层上是蛇形的。图56C示出了具有用于样品计量的直角艰难路径电阻路径和在与样品计量通道不同的平面或层上的DETECTR样品计量入口的盒。图56D示出了具有用于样品计量的直角艰难路径电阻路径和在与样品计量通道相同的平面或层上的DETECTR样品计量入口的盒。
图57A示出了被设计用于DETECTR测定中的盒的特征。
图57B示出了用于制造本公开的盒的制造方案(左和中)和用于检测盒中的样品的读出装置(右)。
图58A示出了用于加热本公开的盒的区域的盒式歧管的示意图。盒式歧管具有集成加热区，所述集成加热区具有集成空气供应连接和用于空气供应接口的集成O形环槽。盒式歧管含有绝缘区以使扩增温度区与检测温度区热分离并保持盒的扩增室和检测室的适当温度。
图58B示出了用于生产本文所述的盒的两种生产方法。在第一制造方法(左)中，使用多个层的二维(2D)层压制造盒。在第二制造方法(右)中，将含有固结的复杂特征的零件注塑模制并通过层压密封。
图58C示出了具有用于将盒联接至注射器的鲁尔滑动适配器的盒的示意图。所述适配器可与滑动鲁尔尖端形成紧密配合的密封。所述适配器被配置为与本文公开的任何盒一起起作用。
图59A和图59B示出了用于与微流体盒一起使用的集成流动池的示意图。集成流动池含有三个区域，裂解区域、扩增区域和检测区域。裂解区域的长度足以容纳微流体芯片商店(microfluidic chip shop)样品裂解流动池。裂解流动池可与本文公开的盒上的扩增室和检测室组合。
图60示出了本公开的盒上的入口通道的细节。
图61示出了使用本公开的微流体盒进行DETECTR测定的工作流程。盒(“芯片”)负载有样品和反应溶液。将扩增室(“LAMP室”)加热至60℃，并将样品在扩增室中孵育30分钟。将经扩增的样品(“LAMP扩增子”)泵送至DETECTR反应室，并将DETECTR试剂泵送至DETECTR反应室。将DETECTR反应室加热至37℃，并将样品孵育30分钟。实时测量DETECTR反应室中的荧光以产生定量结果。
图62示出了与本文公开的盒相容的盒式歧管的***电子器件结构的示意图。所述电子器件被配置为将盒的第一区域加热至37℃并且将盒的第二区域加热至60℃。
图63A和图63B示出了用于加热和检测本公开的盒的盒式歧管的示意图。所述歧管被配置为接受盒，促进DETECTR反应，并读取DETECTR反应的所得荧光。
图64A示出了盒中并用盒式歧管照明的荧光样品的实例。在60℃下30分钟扩增步骤和37℃下30分钟检测步骤后，阳性对照孔含有试剂和扩增的样品。空孔充当假阴性样品。
图64B示出了本公开的检测歧管。
图65示出了用于加热和检测本公开的盒的盒式歧管。
图66A和图66B示出了由检测歧管促进的在微流体盒中进行的DETECTR反应产生的荧光信号的检测。
图67A、图67B、图68A和图68B示出了加热至60℃的扩增室(图67A和图68A)或加热至37℃的DETECTR室(图67B和图68B)的热测试总结。
图69A示出了使用来自微流体盒的LAMP产物作为输入，在读板仪上以100的增益运行的DETECTR结果。使用单个非模板对照(NTC)一式两份运行样品。
图69B示出了使用来自微流体芯片的样品在读板仪上运行的三种LAMP产物。LAMP反应按照芯片运行的顺序编号(LAMP_1首先运行，等等)。供体对于SNP A而言是纯合的，并且据此crRNA 570首先出现。ATTO 488用作荧光标准物。
图70A示出了负载的微流体芯片的图像。
图70B示出了在LAMP扩增30分钟后在读板仪上测量的DETECTR反应的结果。
图71A、图71B、图71C和图71D示出了冠状病毒DETECTR反应的结果。具有10个拷贝输入至LAMP的两个反应室导致快速递增的DETECTR信号。所有NTC均为阴性。将10个拷贝输入至LAMP中，DETECTR信号在反应过程中逐渐增加，如下面图71C中的光电二极管测量值所示。图71D中的阴性对照表明没有污染。
图72A、图72B、图72C和图72D示出了重复冠状病毒DETECTR反应的结果。
图73A、图73B、图74A、图74B和图74C示出了微流体盒中乙型流感DETECTR反应的光电二极管测量值。
图75提供用于含有样品输入室和多个腔室的注射模制盒的设计，其中样品的部分可进行扩增和检测剂反应。
图76提供用于包括检测器二极管阵列和加热板的装置的设计，所述装置能够利用图75中所示的注模模制盒。
图77和图78示出了来自对经受不同双重裂解扩增缓冲液的样品进行的一系列DETECTR反应的荧光数据。
图79图(a)提供用于对样品进行多重扩增和DETECTR反应的注塑模制盒的设计。图(b)提供被配置为利用注塑模制盒并测量来自在所述盒中进行的DETECTR反应的荧光的装置的设计。
图80提供使用图79中所示的注塑模制盒和装置用于对样品进行并行扩增和DETECTR反应的方法。
图81示出了来自图79中的注塑模制盒和装置的二极管阵列和负载染料的反应隔室。
图82示出了注塑模制盒的可能设计，所述注塑模制盒包括连接至5个扩增室的一个样品室以及连接至每个扩增室的2个检测室。因此，所述装置能够对单个样品进行10次并行DETECTR反应。
图83示出了注塑模制盒的可能设计，所述注塑模制盒包括连接至4个扩增室的一个样品室以及连接至每个扩增室的2个检测室。注塑模制盒包括泵歧管的一系列阀门和泵或端口，所述泵歧管控制整个盒内的流。
图84示出了注塑模制盒的可能设计，所述注塑模制盒包括连接至4个扩增室的一个样品室、连接至每个扩增室的2个检测室以及连接至所述样品室的试剂室。
图85提供注模模制盒设计的俯视图，其中试剂室位于通向扩增室和检测室的流动路径中。
图86示出了具有能够通过单个旋转阀连接至多个试剂室和扩增室的样品室的注塑模制盒设计的一部分。
图87示出了具有连接多个隔室的滑动阀的注塑模制盒设计的一部分。图A-C示出了滑动阀能够采用的不同位置。
图88图A示出了具有壳体的注塑模制盒的可能设计。图B提供图A中所示的设计的物理模型。
图89图A提供具有壳体的注射模制盒的设计的自底向上视图。图B提供注塑模制盒的顶部的视图。
图90提供具有滑动阀的注塑模制盒的多个视图。
图91提供具有通向透明反应室的多个试剂孔的注塑模制盒的一部分的两个视图。
图92图A-B提供注塑模制盒设计的自顶向下视图。图C示出了注塑模制盒的物理模型的图片。
图93示出了容纳在含有二极管阵列的装置中的注塑模制盒的图片。
图94示出了用于控制含有注塑模制盒和用于检测的二极管阵列的装置的图形用户界面。
图95示出了来自使用8二极管检测器阵列、8室注塑模制盒和染料的一系列荧光实验的结果。
图96示出了用8二极管检测器阵列测量的来自一系列HERC2靶向DETECTR反应和缓冲液对照的荧光结果。
图97示出了***装置中的注塑模制盒，具有含有DETECTR反应的8个腔室。
图98示出了针对检测效率评估的一组结合至来自甲型流感病毒的基质蛋白1 RNA的gRNA(IAV-MP gRNA)和结合至来自甲型流感病毒的聚合酶碱性蛋白2 RNA的gRNA(IAV-PB2 gRNA)。背景减去行中较暗的方块表示检测IAV靶核酸的效率更高。
图99示出了对于160fM的靶核酸的检测，DETECTR反应中gRNA池对比减去背景的荧光的图。合并的gRNA的数量沿x轴从1种gRNA增加至10种不同的gRNA。此图示出了从1种gRNA至10种合并gRNA的递增信号。
图100示出了用于病毒检测的PON 5重组的示例性测定设计，所述组包括离散区域中的合并的CRISPR-Cas复合物。所述离散区域用于检测：(1)SARS-CoV-2、(2)甲型流感、(3)乙型流感、(4)Pan-CoV和(5)内源性人对照。(1)SARS-CoV-2区域包括用于检测N-基因靶标和E-基因靶标的gRNA，(2)甲型流感区域包括用于检测H1N1靶标、H3N2靶标和H1N1 pdm2009靶标的gRNA，(3)乙型流感区域包括用于检测Yamagata靶标和Victoria靶标的gRNA，(4)Pan-CoV区域包括用于检测HCoV-OC43靶标、HCoV-NL63靶标、HCoV-229E靶标和HCoV-HKU1靶标的gRNA，以及(5)内源性人对照区域包括人rpp30靶标的gRNA。每个区域可包括合并的gRNA。例如，甲型流感区域的gRNA结合至在H1N1、H3N2和H1N1 pdm2009中98％保守的靶位点，如基质蛋白1(MP)、非结构蛋白1(NS)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、血凝素(HA)、PB1、聚合酶酸性蛋白(PA)和聚合酶碱性蛋白2(PB2)。来自每个区域的检测信号可指示在所述区域内检测到靶标。
图101描绘本文所述的SARS-COV-2刺突糖蛋白的氨基酸序列。
图102A和B描绘本文所述的SARS-COV-2S基因的核苷酸序列。
图103示出了来自缓冲液和聚合酶组合的测试的测定结果，所述组合适合于实现SARS-CoV-2的快速扩增。
图104示出了来自缓冲液和聚合酶组合的进一步优化的测定结果，所述组合适合于实现SARS-CoV-2的快速扩增。
图105示出了FASTR测定的检测限和在SARS-CoV-2的单拷贝处的检测结果。
图106示出了来自快速循环时间(包括FASTR测定中的变性和退火/延伸时间)的优化的结果。
图107示出了来自FASTR测定条件的优化以使逆转录时间(RT时间)最小化的结果。
图108示出了缓冲液pH条件对FASTR测定性能的影响。
图109示出了当与各种粗裂解缓冲液组合时FASTR测定的性能。
图110示出了在非优化条件下来自多重FASTR测定的结果。
图111示出了含有缓冲液、引物浓度、dNTP、DMSO的不同组合的多重FASTR测定反应条件的优化的结果，以及稳健测定条件的鉴定。
图112示出了优化的多重FASTR测定在不同人RNA和病毒RNA浓度下的性能。
图113示出了被设计用于筛选可检测SARS-CoV-2的刺突区域内的E484K SNP位置并且能够进一步区分突变体(E484K)和WT SARS-CoV-2的引导RNA的引导物筛选的结果。
图114示出了被设计用于筛选可检测SARS-CoV-2的刺突区域内的N501Y SNP位置并且能够进一步区分突变体(N501Y)和WT SARS-CoV-2的引导RNA的引导物筛选的结果。
具体实施方式
本公开提供了用于测定和检测样品中的冠状病毒的各种组合物及其使用方法。特别地，本文公开的各种方法、试剂和装置使用与引导核酸序列复合的可编程核酸酶来检测来自冠状病毒的核酸的存在或不存在和/或定量所述核酸的量。本文公开了用于在大约30分钟内检测患者样品中的冠状病毒(包括SARS-CoV-2)的基于CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复序列)-Cas12的测定。本文公开的检测测定可提供低成本、便携和准确的冠状病毒检测，并且可使用市售试剂进行。这种测定在本文中可以称为靶向冠状病毒DNA核酸内切酶的CRISPR反式报告子(DETECTR)测定。冠状病毒可以是SARS-CoV-2(也称为2019新型冠状病毒或2019-nCoV)、229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、MERS-CoV或SARS-CoV。冠状病毒可以是SARS-CoV-2的变体，特别是称为20B/501Y.V1、VOC202012/01或B.1.1.7谱系的英国(UK)变体，或者称为以下的南非变体：20C/501Y.V2或B.1.351谱系。这些变体的遗传特征在Leung等人,Early transmissibility assessmentof the N501Y mutant strains of SARS-CoV-2in the United Kingdom,2020年10月至11月,Euro Surveill.2021；26(1)和Tegally等人,Emergence and rapid spread of a newsevere acute respiratory syndrome-related coronavirus 2(SARS-CoV-2)lineagewith multiple spike mutations in South Africa,MedRxiv 2020.12.21中进行了论述。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法特异性地靶向和测定SARS-CoV-2冠状病毒。本文公开的组合物和方法可用于检测患者样品中SARS-CoV-2的存在或不存在。在一些实施方案中，如果在来自患者的样品中检测到SARS-CoV-2的存在，则所述患者可被诊断患有COVID-19。本文公开的测定可提供单核苷酸靶标特异性，从而能够特异性检测单一冠状病毒。术语“2019-nCoV”、“SARS-CoV-2”和“COVID-19”在本文中可互换使用。本文公开的DETECTR测定可使用RNA(例如，从患者样品中提取的RNA)的逆转录(RT)和/或等温扩增(例如，环介导的扩增(LAMP))，随后对预定义的冠状病毒序列进行Cas12检测，然后裂解报告分子以检测病毒的存在。DETECTR测定可靶向冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)的E(包膜)基因或N(核蛋白)基因。在一些情况下，DETECTR测定可靶向冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)或冠状病毒变体的S(刺突)基因。可进行等温扩增以扩增冠状病毒的N-基因、冠状病毒的E-基因或两者的一个或多个区域。本文还公开了被设计用于冠状病毒的N-基因、冠状病毒的E-基因或两者的一个或多个区域的LAMP扩增的引物组。本文还公开了被设计用于冠状病毒的S-基因的一个或多个区域的逆转录酶PCR扩增的引物组。可使用本文公开的组合物和方法测定SARS-CoV-2的任何核酸。在一些实施方案中，靶核酸包含冠状病毒的N基因或E基因，并且可使用本文公开的组合物和方法进行测定。本文公开了用于特异性检测冠状病毒株的N-基因的引导核酸(gRNA)。本文还公开了用于特异性检测包含在一种或多种冠状病毒株的S-基因中的突变的引导核酸(gRNA)。本文公开了用于广泛检测一种或多种冠状病毒株的E-基因的gRNA。
在一些实施方案中，可编程核酸酶可用于检测来自受试者的样品中的冠状病毒(例如，来自诸如SARS-CoV-2的冠状病毒)的靶核酸。例如，可编程核酸酶可与引导核酸复合，所述引导核酸与来自冠状病毒的靶核酸的靶序列杂交。可使复合物与来自受试者的样品接触。受试者可能感染或可能未感染冠状病毒。可将样品中的靶核酸逆转录(RT)并通过热扩增(例如PCR)或等温扩增(例如LAMP)进行扩增。在一些实施方案中，可同时进行逆转录和等温扩增。如果受试者感染了冠状病毒，则引导核酸与靶核酸杂交，从而导致可编程核酸酶的激活。在激活后，可编程核酸酶可裂解检测剂核酸，其中所述检测剂核酸包含与多核苷酸(例如，多脱氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸)连接的可检测标记。在测定的一些实施方案中，在多核苷酸裂解后，可检测标记发射可检测信号，然后捕获并定量所述可检测信号(例如，可检测标记是荧光团并且可检测信号是荧光)。在检测到可检测标记后，可确定来自受试者的样品含有来自冠状病毒的靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸包含冠状病毒的N基因或E基因，并且可使用本文公开的组合物和方法进行测定。在一些实施方案中，DETECTR测定可检测多种靶核酸或扩增子。例如，DETECTR测定可检测对SARS-CoV-2具有特异性的多种靶核酸，或者DETECTR测定可检测对SARS-CoV-2具有特异性的靶核酸和相关SARS样冠状病毒中存在的靶核酸的组合。
本文公开的组合物及其使用方法包括使用可编程核酸酶如Cas12蛋白、Cas14蛋白或Cas13蛋白来测定、检测和/或定量来自冠状病毒(例如，来自诸如SARS-CoV-2的冠状病毒)的核酸。在一些实施方案中，Cas12蛋白、Cas13蛋白或Cas14蛋白用于检测来自受试者的样品中的冠状病毒的靶核酸。例如，Cas12蛋白、Cas14蛋白或Cas13蛋白与引导核酸复合，所述引导核酸与来自冠状病毒的靶核酸的靶序列杂交。可使复合物与来自受试者的样品接触。受试者可能感染或可能未感染冠状病毒。为了在使用Cas12蛋白、Cas14蛋白或Cas13蛋白的测定中使用，可将样品中的靶核酸逆转录并通过热扩增(例如，PCR)或等温扩增(例如，LAMP)进行扩增。为了在使用Cas13蛋白的测定中使用，可将经扩增的靶核酸转录回成RNA。如果受试者感染了冠状病毒，则引导核酸与靶核酸或其扩增子杂交，从而导致Cas12蛋白、Cas14蛋白或Cas13蛋白的激活。在激活后，Cas12蛋白、Cas14蛋白或Cas13蛋白可裂解检测剂核酸，其中所述检测剂核酸包含与核酸连接的用于由Cas12蛋白、Cas13蛋白或Cas14蛋白裂解的可检测标记。在测定的一些实施方案中，在检测剂核酸裂解后，可检测标记发射可检测信号，然后可捕获并定量所述可检测信号(例如，可检测标记是荧光团并且可检测信号是荧光)。在检测到可检测标记后，可确定来自受试者的样品包含来自冠状病毒的靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸包含冠状病毒的N基因或E基因，并且可使用本文公开的组合物和方法进行测定。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:28具有至少60％序列同一性的可编程核酸酶可用于检测来自受试者的样品中的冠状病毒(例如，来自诸如SARS-CoV-2的冠状病毒)的靶核酸。例如，与SEQ ID NO:28具有至少60％序列同一性的可编程核酸酶可与引导核酸复合，所述引导核酸与来自冠状病毒的靶核酸的靶序列杂交。可使复合物与来自受试者的样品接触。受试者可能感染或可能未感染冠状病毒。可将样品的靶核酸逆转录并通过热扩增(例如PCR)或等温扩增(例如LAMP)进行扩增。如果受试者感染了冠状病毒，则引导核酸与靶核酸杂交，从而导致与SEQ ID NO:28具有至少60％序列同一性的可编程核酸酶的激活。在激活后，与SEQ ID NO:28具有至少60％序列同一性的可编程核酸酶可裂解检测剂核酸，其中所述检测剂核酸包含与核酸连接的可检测标记。在测定的一些实施方案中，在裂解后，可检测标记发射可检测信号，然后捕获并定量所述可检测信号(例如，可检测标记是荧光团并且可检测信号是荧光)。在检测到可检测标记后，可确定来自受试者的样品含有来自冠状病毒的靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸包含冠状病毒的N基因或E基因，并且可使用本文公开的组合物和方法进行测定。
本文公开的组合物及其使用方法可与用于治疗冠状病毒的药物一起用作伴随诊断，或者可用于试剂盒、即时(point-of-care)诊断或非处方诊断中。所述方法可用作即时诊断或用作用于检测靶核酸的实验室测试，且由此检测从其取得样品的受试者的疾患。所述方法可用于各种场所或地点，如实验室、医院、医师办公室/实验室(POL)、诊所、远程地点或家中。有时，本公开提供了用于消费者基因使用或非处方使用的各种方法、试剂和装置。
本文还描述了用于检测样品中靶核酸的存在的方法、试剂和装置。用于检测样品中靶核酸的存在的方法、试剂和装置可用于快速实验室测试以检测目标靶核酸(例如，来自靶群体的靶核酸)。特别地，本文提供了其中可在单个***中进行快速实验室测试的方法、试剂和装置。靶核酸可以是来自病毒(例如冠状病毒)或导致样品中的疾病的其他因子的核酸的一部分。靶核酸可以是样品中来自冠状病毒如SARS-CoV-2的RNA或DNA的一部分或其扩增子。
在一些实施方案中，本文公开的可编程核酸酶被RNA或DNA激活以起始检测剂核酸的反式裂解活性。如本文所公开的可编程核酸酶在一些情况下结合至靶RNA以起始检测剂核酸的反式裂解，并且这种可编程核酸酶可称为RNA激活的可编程RNA核酸酶。在一些情况下，如本文公开的可编程核酸酶结合至靶DNA以起始检测剂核酸的反式裂解，并且这种可编程核酸酶可称为DNA激活的可编程RNA核酸酶。在一些情况下，如本文所述的可编程核酸酶能够被靶RNA或靶DNA激活。例如，本文公开的Cas13蛋白如Cas13a被靶RNA核酸或靶DNA核酸激活以反式附带裂解RNA检测剂核酸。在一些实施方案中，Cas13结合至起始RNA检测剂核酸的反式裂解的靶ssDNA。
样品中检测到靶核酸可指示样品中存在疾病，并且可为采取行动以减少疾病传播给受疾病影响的环境中的个体或携带疾病的个体附近的个体提供信息。样品中检测到靶核酸可指示疾病突变如单核苷酸多态性(SNP)的存在，所述疾病突变提供对致病细菌的抗生素抗性。可编程核酸酶促进对靶核酸的检测。可编程核酸酶可在引导核酸与靶核酸结合后被激活，其中激活的可编程核酸酶可裂解靶核酸并且可具有反式裂解活性，其也可被称为“附带”或“反式附带”裂解。
反式裂解活性可以是激活的可编程核酸酶对附近单链核酸的非特异性裂解，如用检测部分反式裂解检测剂核酸。一旦检测剂核酸被激活的可编程核酸酶裂解，检测部分就从检测剂核酸中释放并产生固定至载体介质(support medium)的可检测信号。通常，检测部分是荧光团、染料、多肽或核酸中的至少一者。有时检测部分结合至待固定的载体介质上的捕获分子。可检测信号可在载体介质上可视化，以评估与病痛如疾病相关的靶核酸的存在或水平。可编程核酸酶可以是具有反式裂解活性的CRISPR-Cas(成簇规律间隔的短回文重复序列-CRISPR相关)核蛋白复合物，其可通过引导核酸与靶核酸的结合而激活。这些利用CRISPR-Cas酶的反式附带裂解性质的测定在本文中被称为靶向DNA核酸内切酶的CRISPR反式报告子(DETECTR)反应。DETECTR反应可在流体装置中进行。
在一些实施方案中，本公开提供来自冠状病毒的靶核酸的Cas12检测。在这种情况下，将来自样品的核酸(RNA)逆转录并扩增为DNA。本文公开的任何Cas12蛋白与被设计为与逆转录且扩增的DNA的核酸序列杂交的引导核酸复合。进行DETECTR反应。在指示冠状病毒的逆转录且扩增的DNA存在下，Cas12被激活以反式附带裂解检测剂核酸，从而发射可检测信号(例如，荧光)。在一些实施方案中，本公开提供来自冠状病毒的靶核酸的Cas13检测。在这种情况下，通过将Cas13酶与被设计为与来自冠状病毒的靶RNA序列杂交的引导核酸复合来直接检测样品中的RNA，或者在使RNA与同引导核酸复合的Cas13酶接触之前将所述RNA逆转录、扩增和体外转录，所述引导核酸被设计为与来自冠状病毒的这种扩增的靶RNA序列杂交。在RNA(未扩增的或扩增的)存在下，Cas13被激活以反式附带裂解检测剂核酸，从而发射可检测信号(例如，荧光)。
本文还描述了用于检测靶核酸(例如，来自冠状病毒如SARS-CoV-2)的试剂盒。所述试剂盒可包括载体介质；靶向靶核酸序列的引导核酸序列；当与引导核酸和靶核酸复合时能够被激活的可编程核酸酶；以及包含检测部分的单链检测剂核酸，其中所述检测剂核酸能够被所述激活的核酸酶裂解，从而产生第一可检测信号。
可测试来自个体的生物样品或环境样品以确定个体是否患有病毒性疾病(例如，感染了冠状病毒)。检测到来自靶核酸(例如，来自冠状病毒如SARS-CoV-2)的至少一种靶核酸也可表明一种或多种靶群体是野生型或包含赋予对治疗，如抗生素治疗的抗性的突变。将来自个体或来自环境的样品应用于本文所述的试剂。如果样品中存在靶核酸，则所述靶核酸结合至引导核酸以激活可编程核酸酶。激活的可编程核酸酶裂解检测剂核酸并产生可检测信号，所述可检测信号可例如在载体介质上可视化。如果靶核酸在样品中不存在或低于检测阈值，则引导核酸保持未结合，可编程核酸酶保持失活，并且检测剂核酸保持未裂解。
本文所述的此类方法、试剂和装置可允许在偏远地区或资源匮乏的环境中检测靶核酸且进而检测与所述靶核酸(例如，冠状病毒如SARS-CoV-2)相关的疾病而无需专用设备。此外，本文所述的此类方法、试剂和装置可允许在医疗保健诊所或医生办公室中检测靶核酸且进而检测与所述靶核酸相关的疾病而无需专用设备。在一些情况下，这为用户提供了即时测试，以便在家中或在医疗保健提供者的办公室以高灵敏度快速且容易地测试疾病或感染。出于多种原因，在一个小时内(例如，15至60分钟)内提供结果的测定对于在家测试来说是特别合乎需要的。例如，在疾病暴露后的最初48小时内施用时，抗病毒剂可能最有效。因此，本文公开的能够在一小时内提供结果的方法可允许在感染后的最初48小时内递送抗病毒疗法。此外，本文提供的能够提供快速诊断和结果的***和测定可帮助将患者留在家中或将其送到家中，改进全面疾病监测，并预防感染传播。在其他情况下，这提供了一种测试，所述测试可在实验室中用于检测来自受试者的样品中的一种或多种目标核酸群体或品种。特别地，本文提供了其中可在单个测定中进行高灵敏度实验室测试的方法、试剂和装置。在一些情况下，这对于在发展中国家检测疾病以及作为检测疾病传播或治疗功效或提供疾病的早期检测的全球医疗保健工具可具有价值。
如本文所述的一些方法使用编辑技术，如使用编辑酶或可编程核酸酶和引导核酸的技术，以检测靶核酸(例如来自冠状病毒如SARS-CoV-2)。编辑技术中的编辑酶或可编程核酸酶可被一种或多种靶核酸激活，之后激活的编辑酶或激活的可编程核酸酶可裂解附近的单链核酸，如具有检测部分的检测剂核酸。靶核酸群体(例如，来自冠状病毒如SARS-CoV-2的靶核酸)可通过等温扩增进行扩增，然后可使用编辑技术来检测标记物。在一些情况下，编辑技术可包括当被激活时裂解附近的RNA或DNA作为检测的读出的编辑酶或可编程核酸酶。在一些情况下，如本文所述的方法包括获得无细胞DNA样品，从所述样品中扩增DNA，使用编辑技术来裂解检测剂核酸，以及读取编辑技术的输出。在其他情况下，所述方法包括从患者获得流体样品，并且不扩增所述流体样品的核酸，使用编辑技术来裂解检测剂核酸，以及检测所述核酸。所述方法还可包括使用单链检测剂DNA，使用激活的编辑酶裂解单链检测剂DNA，其中如通过颜色的变化所测量，所述编辑酶裂解至少50％的单链检测剂DNA群体。许多样品、引导核酸、可编程核酸酶或编辑酶、载体介质、靶核酸、单链检测剂核酸和试剂与本文公开的装置、***、流体装置、试剂盒和方法一致。
本文还公开了检测剂核酸和使用所述检测剂核酸检测靶核酸的方法。通常，检测剂核酸是蛋白质-核酸。例如，测定样品中的靶核酸(例如来自冠状病毒如SARS-CoV-2)的方法包括使所述样品与多种复合物接触，所述多种复合物包含引导核酸，每个引导核酸序列包含与靶核酸群体内的靶核酸序列的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；以及测定指示蛋白质-核酸群体中的至少一些蛋白质-核酸的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在一种或多种靶核酸群体，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸群体。通常，蛋白质-核酸是酶-核酸或酶底物-核酸。核酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。本文所述的方法使用可编程核酸酶如CRISPR/Cas***来检测靶核酸(例如来自冠状病毒如SARS-CoV-2)。测定样品中的靶核酸(例如来自冠状病毒如SARS-CoV-2)的方法例如包括：a)使所述样品与多种复合物接触，所述多种复合物包含引导核酸，每个引导核酸序列包含与靶核酸群体内的核酸靶序列的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；b)使所述复合物与底物接触；c)使所述底物与同裂解底物差异反应的试剂接触；以及d)测定指示所述底物的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在一种或多种靶核酸群体，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸群体。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
蛋白质-核酸的裂解产生信号。例如，蛋白质-核酸的裂解产生量热信号、电位信号(potentiometric signal,)、电流信号(amperometric signal)、光学信号或压电信号。可使用各种设备来检测这些不同类型的信号，所述信号指示样品中是否存在靶核酸。
样品
许多样品与本文公开的方法、试剂和装置一致。
这些样品可包含用于检测病痛(如疾病)、病原体或病毒(如流感)的靶核酸。病原体也可以是细菌、真菌、原生动物或蠕虫。病原体可以是病毒，如冠状病毒。通常，可获得来自个体或动物的样品或环境样品以测试疾病或任何目标突变的存在。来自个体的生物样品可以是血液、血清、血浆、唾液、尿液、粘膜样品、腹膜样品、脑脊液、胃分泌物、鼻分泌物、痰、咽渗出物、尿道或***分泌物、渗出物、积液或组织。在施加至本公开的检测***之前，可将组织样品解离或液化。来自环境的样品可来自土壤、空气或水。在一些情况下，环境样品作为拭子从目标表面采集或直接从目标表面采集。在一些情况下，将原始样品施加至检测***。在一些情况下，将样品在施加至检测***之前用缓冲液或流体稀释或浓缩，或直接施加至检测***。有时，样品包含在不超过20μL中。在一些情况下，样品包含在不超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200、300、400、500μL或1μL至500μL的任何值中。有时，样品包含在超过500μL中。
在一些情况下，样品取自单细胞真核生物体；植物或植物细胞；藻细胞；真菌细胞；动物细胞、组织或器官；来自无脊椎动物的细胞、组织或器官；来自脊椎动物如鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物的细胞、组织、流体或器官；来自哺乳动物如人、非人灵长类动物、有蹄类动物、猫科动物、牛科动物、绵羊和山羊的细胞、组织、流体或器官。在一些情况下，样品取自线虫、原生动物、蠕虫或疟原虫。在一些情况下，样品包含来自真核细胞、哺乳动物细胞、人细胞、原核细胞或植物细胞的细胞裂解物的核酸。在一些情况下，样品包含从细胞表达的核酸。
用于疾病测试的样品可包含可结合至本文所述的试剂的引导核酸的至少一个靶序列。核酸的一部分可来自基因组基因座、转录mRNA或逆转录cDNA。核酸的一部分的长度可以是5至100、5至90、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、5至30、5至25、5至20、5至15或5至10个核苷酸。核酸的一部分的长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60、70、80、90或100个核苷酸。靶序列可与引导核酸反向互补。多个靶序列中的每个靶序列可与不同的引导核酸反向互补。
在一些情况下，靶序列是来自病毒或细菌或导致样品中的疾病的其他因子的核酸群体的一部分(例如，来自冠状病毒的核酸)。在一些情况下，靶序列是样品中来自性传播感染或接触传染病的核酸群体的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自上呼吸道感染、下呼吸道感染或接触传染病的核酸群体的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自医院获得性感染或接触传染病的核酸群体的一部分。在一些情况下，所述靶序列是ssRNA。这些靶序列可来自疾病，并且所述疾病可包括但不限于流感病毒，包括甲型流感病毒(IAV)或乙型流感病毒(IBV)、鼻病毒、感冒病毒、呼吸道病毒、上呼吸道病毒、下呼吸道病毒或呼吸道合胞体病毒。病原体包括病毒、真菌、蠕虫、原生动物和寄生虫。病毒的实例包括冠状病毒。可使用本文公开的组合物和方法测定所有冠状病毒株。例如，冠状病毒可以是SARS-CoV-2。此外，冠状病毒可以是229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、MERS-CoV或SARS-CoV。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法特异性地靶向和测定SARS-CoV-2冠状病毒。可使用本文公开的组合物和方法测定SARS-CoV-2的任何核酸。在一些实施方案中，可使用本文公开的组合物和方法测定冠状病毒的N基因或E基因。在一些实施方案中，本文公开的引导核酸特异性地靶向并结合SARS-CoV-2株的核酸序列。在一些实施方案中，本文公开的引导核酸特异性地靶向并结合N基因或E基因。其他病原体包括，例如，结核分枝杆菌、无乳链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎球菌、乙型流感嗜血杆菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体、中间链球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌。通常，靶核酸包含来自病毒或细菌或导致样品中可发现的疾病的其他因子的序列。致病性病毒包括但不限于流感病毒、RSV、ssRNA病毒、呼吸道病毒、上呼吸道病毒、下呼吸道病毒或鼻病毒。病原体包括例如结核分枝杆菌、无乳链球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、乙型流感嗜血杆菌流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)或结核分枝杆菌。
样品可用于鉴定疾病状态。例如，样品是本文所述的任何样品，并且从受试者获得以用于鉴定受试者的疾病状态(例如，感染冠状病毒或未感染)。有时，一种方法包括从受试者获得血清样品；以及鉴定所述受试者的疾病状态。
在一些情况下，靶核酸是单链核酸。可替代地或组合地，靶核酸是双链核酸并且在接触试剂之前或之后制备成单链核酸。靶核酸可以是在生物或环境样品中发现的RNA、DNA、合成核酸或核酸。靶核酸包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA、非编码RNA、长链非编码RNA和微小RNA(miRNA)。在一些情况下，靶核酸是mRNA。在一些情况下，靶核酸来自本文所述的病毒、寄生虫或细菌。在一些情况下，靶核酸从如本文所述的基因转录。
许多靶核酸(例如，来自冠状病毒)与本文公开的方法和组合物一致。本文所述的一些方法可检测作为靶核酸以各种浓度或量存在于样品中的靶核酸。在一些情况下，样品具有至少2种靶核酸。在一些情况下，样品具有至少3、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种靶核酸。在一些情况下，所述方法检测至少在每101种非靶核酸、102种非靶核酸、103种非靶核酸、104种非靶核酸、105种非靶核酸、106种非靶核酸、107种非靶核酸、108种非靶核酸、109种非靶核酸或1010种非靶核酸一个拷贝处存在的靶核酸。
许多靶核酸(例如，来自冠状病毒)与本文公开的方法和组合物一致。本文所述的一些方法可检测以各种浓度或量存在于样品中的两个或更多个靶核酸序列。在一些情况下，样品具有至少2个靶核酸序列。在一些情况下，样品具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个靶核酸序列。在一些情况下，所述方法检测至少在每101种非靶核酸、102种非靶核酸、103种非靶核酸、104种非靶核酸、105种非靶核酸、106种非靶核酸、107种非靶核酸、108种非靶核酸、109种非靶核酸或1010种非靶核酸一个拷贝处存在的靶核酸序列。靶核酸序列可以不同浓度或量存在于样品中。
任何上文公开的样品与本文公开的***、测定和可编程核酸酶一致，并且可用作本文公开的任何疾病(例如冠状病毒感染)的伴随诊断，或者可用于试剂盒、即时诊断或非处方诊断中。
试剂
许多试剂与本文公开的方法、试剂和装置一致。
这些试剂与如本文所述的用于检测病痛(如疾病)的样品、方法和装置相容。本文所述的用于检测疾病(如冠状病毒)的试剂包含多种引导核酸，每种引导核酸靶向指示所述疾病的靶核酸区段。每种引导核酸结合至包含如本文所述的核酸序列(例如，来自冠状病毒的核酸)的区段的靶核酸。每种引导核酸可结合至靶核酸，所述靶核酸包含如本文所述的核酸(例如，来自冠状病毒的靶核酸)的一部分并且还包含可赋予对治疗(如抗生素治疗)的抗性的突变，如单核苷酸多态性(SNP)。每种引导核酸结合至包含核酸的一部分的靶核酸。每种引导核酸与靶核酸互补。通常，引导核酸特异性地结合至靶核酸。靶核酸可以是RNA、DNA或合成核酸。
本文公开了如本文所述的测定多种靶核酸(例如，来自冠状病毒的多种核酸)的方法。例如，测定样品中的多种靶核酸的方法包括使所述样品与复合物接触，所述复合物包含多个引导核酸序列，每个引导核酸序列包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；以及测定指示蛋白质-核酸群体的至少一些蛋白质-核酸的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在多种靶核酸中的一种或多种靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。作为另一个实例，测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使所述样品与多种复合物接触，每种复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；b)使所述多种复合物与底物接触；c)使所述底物与同裂解底物差异反应的试剂接触；以及d)测定指示所述底物的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
可编程核酸酶可包括当与引导核酸和靶核酸复合时能够被激活的可编程核酸酶。可编程核酸酶可在引导核酸与靶核酸结合后被激活，其中激活的可编程核酸酶可裂解靶核酸并且可具有反式裂解活性。反式裂解活性可以是激活的可编程核酸酶对附近单链核酸的非特异性裂解，如用检测部分反式裂解检测剂核酸。一旦检测剂核酸被激活的可编程核酸酶裂解，检测部分就可从检测剂核酸中释放并且可产生信号。信号可以是量热信号、电位信号、电流信号、光学(例如，荧光、比色等)信号或压电信号。通常，信号在检测剂核酸裂解之前存在并且在检测剂核酸裂解后改变。有时，信号在检测剂核酸裂解之前不存在，并且在检测剂核酸裂解后存在。可检测信号可固定在载体介质上用于检测。可编程核酸酶可以是具有反式裂解活性的CRISPR-Cas(成簇规律间隔的短回文重复序列-CRISPR相关)核蛋白复合物，其可通过引导核酸与靶核酸的结合而激活。CRISPR-Cas核蛋白复合物可包含与引导核酸复合的Cas蛋白(也称为Cas核酸酶)，其也可被称为CRISPR酶。引导核酸可以是CRISPRRNA(crRNA)。有时，引导核酸包含crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)。
用于检测经修饰的靶核酸的CRISPR/Cas***可包含CRISPR RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)、Cas蛋白和检测剂核酸。
引导核酸可包含与靶核酸的序列反向互补的序列。引导核酸可以是crRNA。有时，引导核酸包含crRNA和tracrRNA。引导核酸可特异性地结合至靶核酸。在一些情况下，引导核酸不是天然存在的，而是通过人工组合其他分离的序列区段来制成的。通常，所述人工组合通过化学合成、通过遗传工程化技术或通过人工操作核酸的分离区段来进行。可设计和制造靶核酸以提供所需的功能。在一些情况下，引导核酸的靶向区域的长度是20个核苷酸。引导核酸的靶向区域可具有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。在一些情况下，引导核酸的靶向区域的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，引导核酸的靶向区域具有正好或约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt的长度。应理解，多核苷酸的序列不需要与其待特异性地杂交或特异性地结合的靶核酸的序列100％互补。引导核酸可具有在核酸残基5至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的修饰可变区反向互补。在一些情况下，引导核酸具有在核酸残基5至9、10至14或15至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的修饰可变区反向互补。引导核酸可具有在核酸残基5至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的甲基化可变区反向互补。在一些情况下，引导核酸具有在核酸残基5至9、10至14或15至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的甲基化可变区反向互补。
引导核酸可选自已针对感染株或目标基因组基因座的核酸序列平铺的一组引导核酸。引导核酸可选自已针对冠状病毒株的核酸序列平铺的一组引导核酸。通常，针对感染株或目标基因组基因座的核酸平铺的引导核酸可合并用于本文所述的方法中。通常，这些引导核酸被合并以用于在单一测定中检测靶核酸。针对单一靶核酸平铺的引导核酸的合并可增强使用本文描述的方法对靶核酸的检测。针对单一靶核酸平铺的引导核酸的合并可确保使用本文所述方法在单个反应中广泛覆盖靶核酸。例如，平铺是沿靶核酸连续的。有时，平铺沿靶核酸重叠。在一些情况下，平铺在沿靶核酸的平铺引导核酸之间包括间隙。在一些情况下，引导核酸的平铺是不连续的。通常，用于检测靶核酸的方法包括使靶核酸与引导核酸池和可编程核酸酶接触，其中所述引导核酸池的引导核酸具有选自对应于靶核酸的核酸的平铺引导核酸组的序列；以及测定由检测剂核酸群体中的至少一些检测剂核酸的裂解产生的信号。引导核酸的合并可确保在单个反应中对靶标物种的广谱鉴定或广泛覆盖。这在可能由多种生物体引起的疾病或适应症(如败血症)中特别有用。在一些实施方案中，引导物合并包含在DETECTR反应中产生最佳信号的引导核酸(例如，前10种gRNA)。在一些实施方案中，随着合并的gRNA的数量增加，信噪比增加(例如，1个gRNA的信号比<2个合并gRNA<3个合并gRNA<4个合并gRNA<5个合并gRNA<6个合并gRNA<7个合并gRNA<8个合并gRNA<9个合并gRNA<10个合并gRNA)。
本文描述了包含可编程核酸酶的试剂，所述可编程核酸酶在与引导核酸和靶核酸区段复合时能够被激活。当与引导核酸和靶序列复合时，可编程核酸酶可能能够被激活。可编程核酸酶可在引导核酸与其靶核酸结合后被激活并在其环境中非特异性地降解核酸。可编程核酸酶一旦被激活就具有反式裂解活性。可编程核酸酶可以是Cas蛋白(也可互换地称为Cas核酸酶)。crRNA和Cas蛋白可形成CRISPR酶。
“同一性百分比”和“同一性％”可指两个序列(核苷酸或氨基酸)在比对中在相同位置具有相同残基的程度。例如，“氨基酸序列与SEQ ID NO:Y X％同一”可指氨基酸序列与SEQ ID NO:Y的同一性％，并详细说明为所述氨基酸序列中X％的残基与SEQ ID NO:Y中公开的序列的残基同一。通常，计算机程序可用于此类计算。比较和比对序列对的说明性程序包括ALIGN(Myers和Miller,Comput Appl Biosci.1988年3月；4(1):11-7)、FASTA(Pearson和Lipman,Proc Natl Acad Sci U S A.1988年4月；85(8):2444-8；Pearson,MethodsEnzymol.1990；183:63-98)和空位BLAST(Altschul等人,Nucleic Acids Res.1997年9月1日；25(17):3389-40)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux等人,Nucleic Acids Res.1984年1月11日；12(1Pt 1):387-95)。
几种可编程核酸酶与本公开的方法和装置一致。例如，CRISPR/Cas酶是用于本文公开的方法和***中的可编程核酸酶。CRISPR/Cas酶可包括任何已知类别和类型的CRISPR/Cas酶。本文公开的可编程核酸酶包括1类CRISPR/Cas酶，如I型、IV型或III型CRISPR/Cas酶。本文公开的可编程核酸酶还包括2类CRISPR/Cas酶，如II型、V型或VI型CRISPR/Cas酶。包括在本文公开的若干测定(例如，用于测定装置如微流体装置或侧流测定中的冠状病毒)中及其使用方法中的优选可编程核酸酶包括V型或VI型CRISPR/Cas酶。
本公开的可编程核酸酶可被配置为形成具有靶核酸结合亲和力的多聚体复合物。本公开的可编程核酸酶可形成同源二聚体复合物(例如，包含相同序列的两种蛋白质非共价缔合以形成任选催化活性的复合物)或异二聚体复合物(例如，包含不同序列的两种蛋白质非共价缔合以形成任选催化活性的复合物)。
在一些实施方案中，V型CRISPR/Cas酶是可编程Cas12核酸酶。V型CRISPR/Cas酶(例如，Cas12或Cas14)缺乏HNH结构域。本公开的Cas12核酸酶通过单个催化RuvC结构域裂解核酸。RuvC结构域位于核酸酶或蛋白质的“NUC”叶内，并且Cas12核酸酶还包含识别或“REC”叶。REC叶和NUC叶通过桥螺旋连接，并且Cas12蛋白另外包含用于PAM识别的两个结构域，称为PAM相互作用(PI)结构域和楔形(WED)结构域。(Murugan等人,Mol Cell.2017年10月5日；68(1):15–25)。可编程Cas12核酸酶可以是Cas12a(也称为Cpf1)蛋白、Cas12b蛋白、Cas12c蛋白、Cas12d蛋白或Cas12e蛋白。在一些情况下，合适的Cas12蛋白包含与SEQ IDNO:18–SEQ ID NO:60中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
表1–Cas12蛋白序列
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可替代地，V型CRISPR/Cas酶是可编程Cas14核酸酶。本公开的Cas14蛋白(此术语与术语“CasZ蛋白”、“Cas14”、“Cas14多肽”或“Cas14蛋白”可互换使用)包含相对于Cas14蛋白的一级氨基酸序列不连续、但一旦所述蛋白产生并折叠就形成RuvC结构域的3个部分RuvC结构域(RuvC-I、RuvC-II和RuvC-III，在本文中也称为亚结构域)。天然存在的Cas14蛋白充当催化靶核酸中的特定序列处的裂解的核酸内切酶。当根据SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列编号时，Cas14的催化残基包括D405、E586和D684。因此，在一些情况下，Cas14蛋白具有降低的活性并且一个或多个上述氨基酸(或任何Cas14蛋白的一个或多个相应氨基酸)被突变(例如，被丙氨酸取代)。
与之前鉴定的CRISPR-Cas核酸内切酶相比，Cas14较短，并且因此使用这种蛋白质作为替代方案提供了编码所述蛋白质的核苷酸序列相对较短的优势。例如，在编码Cas14蛋白的核酸为合乎需要的情况下，例如在采用病毒载体(例如，AAV载体)以用于递送至细胞，如真核细胞(例如，哺乳动物细胞、人细胞、小鼠细胞、体外、离体、体内)用于研究和/或临床应用的情况下，这是有用的。此外，在其自然环境中，编码Cas14的DNA序列存在于也具有Cas1蛋白的基因座中。
在一些情况下，主题Cas14蛋白具有900个氨基酸或更少(例如，850个氨基酸或更少、800个氨基酸或更少、750个氨基酸或更少、或700个氨基酸或更少)的长度。在一些情况下，主题Cas14蛋白具有850个氨基酸或更少(例如，850个氨基酸或更少)的长度。在一些情况下，主题Cas14蛋白具有800个氨基酸或更少(例如，750个氨基酸或更少)的长度。在一些情况下，主题Cas14蛋白具有700个氨基酸或更少的长度。在一些情况下，主题Cas14蛋白具有650个氨基酸或更少的长度。在一些情况下，主题Cas14蛋白具有350-900个氨基酸(例如，350-850、350-800、350-750、350-700、400-900、400-850、400-800、400-750或400-700个氨基酸)范围内的长度。
可编程Cas14核酸酶可以是Cas14a蛋白、Cas14b蛋白、Cas14c蛋白、Cas14d蛋白、Cas14e蛋白、Cas14f蛋白、Cas14g蛋白、Cas14h蛋白或Cas14u蛋白。在一些情况下，合适的Cas14蛋白包含与SEQ ID NO:61–SEQ ID NO:152中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
表2–Cas14蛋白序列
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在一些实施方案中，V型CRISPR/Cas酶是CasФ核酸酶。CasФ多肽可充当催化靶核酸中的特定序列处的裂解的核酸内切酶。本公开的可编程CasФ核酸酶可在RuvC结构域中具有单个活性位点，所述单个活性位点能够催化前体-crRNA加工和核酸的切口或裂解。这种紧凑的催化位点可使可编程CasФ核酸酶特别有利于基因组工程化和基因组操作的新功能。
在一些实施方案中，RuvC结构域是RuvC样结构域。各种RuvC样结构域在本领域中是已知的，并且使用诸如InterPro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)的在线工具容易地鉴定。例如，RuvC样结构域可以是与IS605和其他相关转座子家族的TnpB蛋白区域具有同源性的结构域，如综述文章如Shmakov等人(Nature Reviews Microbiology第15卷,第169–182页(2017))以及Koonin E.V.和Makarova K.S.(2019,Phil.Trans.R.Soc.,B 374:20180087)中所描述。在一些实施方案中，RuvC样结构域与C-末端转座酶IS605、OrfB具有同源性。C末端转座酶IS605、OrfB容易地由技术人员使用生物信息学工具如PFAM(Finn等人(Nucleic Acids Res.2014年1月1日；42(数据库问题):D222–D230)；El-Gebali等人(2019)Nucleic Acids Res.doi:10.1093/nar/gky995)鉴定。PFAM是蛋白质家族数据库，其中每个条目由种子比对组成，所述种子比对构成了使用HMMER软件(hmmer.org)构建剖面隐马尔可夫模型(HMM)的基础。它可通过由EMBL-EBI维护的pfam.xfam.org容易地访问，其容易地允许针对PFAM的当前版本(例如来自2020年5月的33.1版)分析氨基酸序列，但也可使用公开和自由可用的数据库文件和工具来实现本地构建。技术人员使用HMM PF07282容易地鉴定C末端转座酶IS605、OrfB。PF07282在图11中重现以供参考(登录号PF07282.12)。本领域技术人员还将能够使用PFAM工具鉴定RuvC结构域，例如使用HMM PF18516。PF18516在图12中重现以供参考(登录号PF18516.2)。在一些实施方案中，可编程CasФ核酸酶包含与PFAM家族PF07282匹配、但不匹配PFAM家族PF18516的RuvC样结构域，如使用PFAM工具所评估(例如使用PFAM版本33.1和HMM登录号PF07282.12和PF18516.2)。PFAM搜索应理想地使用设置为1.0的E值截断值执行。
表3提供可用于本公开的组合物和方法中的说明性CasФ多肽的氨基酸序列。
表3–CasФ氨基酸序列
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在一些实施方案中，本公开的任何可编程CasФ核酸酶(例如，SEQ ID NO:221–SEQID NO:268中的任一项或其片段或变体)可包含核定位信号(NLS)。在一些情况下，所述NLS可具有KRPAA TKKAGQAKKKKEF(SEQ ID NO:269)的序列。
CasФ多肽或其变体可包含与SEQ ID NO:221–SEQ ID NO:268中的任一项的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，VI型CRISPR/Cas酶是可编程Cas13核酸酶。Cas13蛋白的总体架构包含N末端结构域和由两个螺旋结构域分隔的两个HEPN(高等真核生物和原核生物核苷酸结合)结构域(Liu等人,Cell 2017年1月12日；168(l-2):121-134.el2)。HEPN结构域各自包含aR-X4-H基序。Cas13蛋白的共同特征包括，在引导核酸crRNA与靶核酸结合后，所述蛋白质经历构象变化以将HEPN结构域聚集在一起并形成催化活性RNA酶。(Tambe等人,CellRep.2018年7月24日；24(4):1025–1036.)。因此，两个可激活HEPN结构域是本公开的可编程Cas13核酸酶特有的。然而，也与本公开一致的可编程Cas13核酸酶包括在HEPN结构域中包含增强Cas13蛋白裂解效率的突变或使HEPN结构域催化失活的突变的Cas13核酸酶。与本公开一致的可编程Cas13核酸酶还包括Cas13核酸酶，所述Cas13核酸酶包含催化性
可编程Cas13核酸酶可以是Cas13a蛋白(也称为“c2c2”)、Cas13b蛋白、Cas13c蛋白、Cas13d蛋白或Cas13e蛋白。示例性C2c2蛋白如SEQ ID NO:153-SEQ ID NO:160中所示。在一些情况下，主题C2c2蛋白包含与SEQ ID NO:153-SEQ ID NO:160中的任一项中所示的氨基酸序列具有80％或更高(例如，85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的C2c2多肽包含与SEQ ID NO:153中所示的斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)C2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的C2c2多肽包含与SEQ ID NO:154中所示的口腔纤毛菌(Leptotrichia buccalis)C2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的C2c2多肽包含与SEQ ID NO:156中所示的荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)C2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的C2c2多肽包含与SEQ ID NO:157中所示的鸡肉食杆菌(Carnobacterium gallinarum)C2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的C2c2多肽包含与SEQ ID NO:158中所示的解半纤植雪菌(Herbinix hemicellulosilytica)C2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，C2c2蛋白包含与SEQ ID NO:154中所示的口腔纤毛菌(Lbu)C2c2氨基酸序列具有80％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，C2c2蛋白是口腔纤毛菌(Lbu)C2c2蛋白(例如，参见SEQ ID NO:154)。在一些情况下，C2c2蛋白包含SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:156–SEQ ID NO:160中的任一项中所示的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的方法中使用的C2c2蛋白不是沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)(Lsh)C2c2蛋白。在一些情况下，本公开的方法中使用的C2c2蛋白不是与SEQ ID NO:155中所示的Lsh C2c2多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的C2c2多肽。其他Cas13蛋白序列在SEQ ID NO:153–SEQ ID NO:170中所示。
表4–Cas13蛋白序列
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可编程核酸酶可以是Cas13。有时Cas13可以是Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d或Cas13e。在一些情况下，可编程核酸酶可以是Mad7或Mad2。在一些情况下，可编程核酸酶可以是Cas12。有时Cas12可以是Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d或Cas12e。在一些情况下，可编程核酸酶可以是Csm1、Cas9、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9或CasZ。有时，Csm1也可称为smCms1、miCms1、obCms1或suCms1。有时Cas13a也可称为C2c2。有时CasZ也可称为Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、Cas14h、Cas14i、Cas14j或Cas14k。有时，可编程核酸酶可以是V型CRISPR-Cas***。在一些情况下，可编程核酸酶可以是VI型CRISPR-Cas***。有时，可编程核酸酶可以是III型CRISPR-Cas***。在一些情况下，可编程核酸酶可来自以下中的至少一者：沙氏纤毛菌(Lsh)、斯氏李斯特氏菌(Lse)、口腔纤毛菌(Lbu)、韦德纤毛菌(Lwa)、荚膜红细菌(Rca)、解半纤植雪菌(Hhe)、产丙酸栖沼泽杆菌(Ppr)、毛螺菌科细菌(Lba)、直肠[真杆菌](Ere)、纽约李斯特氏菌(Listerianewyorkensis)(Lny)、嗜氨基酸梭菌(Clostridium aminophilum)(Cam)、普雷沃氏菌属(Psm)、犬咬二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga canimorsus)(Cca，毛螺菌科细菌(Lba)、动物溃疡伯杰氏菌(Bzo)、中间普雷沃氏菌(Pin)、颊普雷沃氏菌(Pbu)、另枝菌属某种(Alistipes sp.)(Asp)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)(Ran)、桔红色普雷沃氏菌(Prevotella aurantiaca)(Pau)、解糖普雷沃氏菌(Prevotella saccharolytica)(Psa)、中间普雷沃氏菌(Pin2)、犬咬二氧化碳嗜纤维菌(Cca)、齿周卟啉单胞菌(Porphyromonas gulae)(Pgu)普雷沃氏菌属(Psp)、牙龈卟啉单胞菌(Pig)、中间普雷沃氏菌(Pin3)、意大利肠球菌(Ei)、唾液乳杆菌(Ls)、或嗜热栖热菌(Tt)。有时，Cas13是LbuCas13a、LwaCas13a、LbaCas13a、HheCas13a、PprCas13a、EreCas13a、CamCas13a或LshCas13a中的至少一者。当crRNA与靶核酸复合时，可激活CRISPR酶的反式裂解活性。当包含tracrRNA和crRNA的引导核酸与靶核酸复合时，可激活CRISPR酶的反式裂解活性。靶核酸可以是RNA或DNA。
在一些实施方案中，如本文公开的可编程核酸酶是RNA激活的可编程RNA核酸酶。在一些实施方案中，如本文公开的可编程核酸酶是DNA激活的可编程RNA核酸酶。在一些实施方案中，可编程核酸酶能够被靶RNA激活以起始RNA检测剂核酸的反式裂解并且能够被靶DNA激活以起始RNA检测剂核酸的反式裂解，如VI型CRISPR/Cas酶(例如，Cas13)。例如，本公开的Cas13a可被靶RNA激活以起始Cas13a的反式裂解活性以用于裂解RNA检测剂核酸，并且可被靶DNA激活以起始Cas13a的反式裂解活性以用于反式裂解RNA检测剂核酸。RNA检测剂核酸可以是基于RNA的检测剂核酸分子。在一些实施方案中，Cas13a识别并检测ssDNA以起始RNA检测剂核酸的反式裂解。在引导核酸与靶DNA杂交后，多种Cas13a分离物可识别靶DNA、被靶DNA激活并检测靶DNA，包括ssDNA。例如，Lbu-Cas13a和Lwa-Cas13a两者均可被激活以通过靶DNA反式附带裂解RNA检测剂核酸。因此，VI型CRISPR/Cas酶(例如，Cas13，如Cas13a)可以是DNA激活的可编程RNA核酸酶，并且因此可用于使用如本文所述的方法检测靶DNA。ssDNA的DNA激活的可编程RNA核酸酶检测可在多个pH值下稳健。例如，通过Cas13检测靶ssDNA可在广泛范围的pH条件(如6.8的pH至8.2的pH)下表现出一致的裂解。相比之下，通过Cas13检测靶RNA可在7.9至8.2的pH值下表现出高裂解活性。在一些实施方案中，也能够是RNA激活的可编程RNA核酸酶的DNA激活的可编程RNA核酸酶可具有与其RNA靶向偏好不同的DNA靶向偏好。例如，Cas13a的最佳ssDNA靶标与Cas13a的最佳RNA靶标具有不同的性质。作为一个实例，ssDNA上的gRNA表现可能不一定与相同gRNA在RNA上的表现相关。作为另一个实例，gRNA可以高水平进行，而不管靶RNA序列上3'位置处的靶核苷酸身份如何。在一些实施方案中，gRNA可在靶ssDNA序列的3'位置处不存在G的情况下以高水平发挥进行。此外，通过本文公开的Cas13检测的靶DNA可直接来自生物体，或者可通过核酸扩增方法如PCR和LAMP或本文描述的任何扩增方法间接产生。通过DNA激活的可编程RNA核酸酶(如Cas13a)灵敏检测靶DNA(如靶ssDNA)的关键步骤可包括：(1)产生或分离DNA至每个反应高于约0.1nM的浓度以用于体外诊断，(2)选择具有适当序列特征的目标序列以实现DNA检测，因为这些特征不同于RNA检测所需的特征，以及(3)增强DNA检测的缓冲液组成。通过DNA激活的可编程RNA核酸酶检测靶DNA可连接至多种读数，包括荧光、侧流、电化学或本文所述的任何其他读出。可编程DNA核酸酶(如V型CRISPR-Cas蛋白)与DNA激活的可编程RNA核酸酶(如VI型蛋白)与DNA检测剂核酸和RNA检测剂核酸的复用可分别实现靶ssDNA或靶dsDNA与靶ssDNA的组合的多重检测。具有不同RNA检测剂核酸裂解偏好的不同RNA激活的可编程RNA核酸酶的复用可实现额外的复用。用于产生用于基于DNA激活的可编程RNA核酸酶的诊断的ssDNA的方法可包括(1)不对称PCR，(2)不对称等温扩增，如RPA、LAMP、SDA等，(3)用于产生短ssDNA分子的NEAR，以及(4)通过逆转录酶将RNA靶标转化为ssDNA，然后进行RNA酶H消化。因此，靶DNA的DNA激活的可编程RNA核酸酶检测与本文公开的各种***、试剂盒、组合物、试剂和方法相容。
本文描述了包含含有检测部分的单链检测剂核酸的试剂，其中所述检测剂核酸能够被激活的核酸酶裂解，从而产生第一可检测信号。如本文所用，检测剂核酸可与报告子或报告分子互换使用。在一些情况下，检测剂核酸是包含脱氧核糖核苷酸的单链核酸。在其他情况下，检测剂核酸是包含核糖核苷酸的单链核酸。检测剂核酸可以是包含至少一种脱氧核糖核苷酸和至少一种核糖核苷酸的单链核酸。在一些情况下，检测剂核酸是在充当裂解位点的内部位置包含至少一个核糖核苷酸残基的单链核酸。在一些情况下，检测剂核酸在内部位置包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核糖核苷酸残基。有时核糖核苷酸残基是连续的。可替代地，核糖核苷酸残基散布在非核糖核苷酸残基之间。在一些情况下，检测剂核酸仅具有核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测剂核酸仅具有脱氧核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测剂核酸包含对由本文所述的可编程核酸酶裂解具有抗性的核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含合成核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少一个核糖核苷酸残基和至少一个非核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测剂核酸的长度是5-20、5-15、5-10、7-20、7-15或7-10个核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少一个尿嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少两个尿嘧啶核糖核苷酸。有时检测剂核酸仅具有尿嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少一个腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少两个腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸仅具有腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少一个胞嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少两个胞嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少一个鸟嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸包含至少两个鸟嘌呤核糖核苷酸。检测剂核酸可仅包含未修饰的核糖核苷酸、仅包含未修饰的脱氧核糖核苷酸或它们的组合。在一些情况下，检测剂核酸的长度是5至12个核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸的长度是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，检测剂核酸的长度是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。对于由包含Cas13的可编程核酸酶裂解，检测剂核酸的长度可以是5、8或10个核苷酸。对于由包含Cas12的可编程核酸酶裂解，检测剂核酸的长度可以是10个核苷酸。
单链检测剂核酸包含能够产生第一可检测信号的检测部分。有时检测剂核酸包含能够产生信号的蛋白质。信号可以是量热信号、电位信号、电流信号、光学(例如，荧光、比色等)信号或压电信号。在一些情况下，检测部分位于裂解位点的一侧上。任选地，淬灭部分位于裂解位点的另一侧上。有时淬灭部分是荧光淬灭部分。在一些情况下，淬灭部分位于裂解位点的5'，并且检测部分位于裂解位点的3'。在一些情况下，检测部分位于裂解位点的5'，并且淬灭部分位于裂解位点的3'。有时淬灭部分位于检测剂核酸的5'末端。有时检测部分位于检测剂核酸的3'末端。在一些情况下，检测部分位于检测剂核酸的5'末端。在一些情况下，淬灭部分位于检测剂核酸的3'末端。在一些情况下，单链检测剂核酸是能够产生第一可检测信号的至少一个单链核酸群体。在一些情况下，单链检测剂核酸是能够产生第一可检测信号的单链核酸群体。任选地，存在多于一个单链检测剂核酸群体。在一些情况下，存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50或大于50或此列表的范围所跨越的任何数量的能够产生可检测信号的不同单链检测剂核酸群体。
表5–示例性单链检测剂核酸
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/56-FAM/：5′6-荧光素(Integrated DNA Technologies)
/3IABkFQ/：3′Iowa Black FQ(Integrated DNA Technologies)
/5IRD700/：5′IRDye 700(Integrated DNA Technologies)
/5TYE665/：5′TYE 665(Integrated DNA Technologies)
/5Alex594N/：5′Alexa Fluor 594(NHS酯)(Integrated DNA Technologies)
/5Alex488N/：5′Alexa Fluor 488(NHS酯)(Integrated DNA Technologies)
/5ATTO633N/：5′ATTO TM 633(NHS酯)(Integrated DNA Technologies)
/3IRQC1N/：3′IRDye QC-1淬灭剂(Li-Cor)
/3IAbRQSp/：3′Iowa Black RQ(Integrated DNA Technologies)
rU：尿嘧啶核糖核苷酸
rG：鸟嘌呤核糖核苷酸
*此表以检测部分和淬灭剂部分的商品名提及检测部分和淬灭剂部分，并标识它们的来源。然而，也可使用来自其他来源的具有相似功能的替代物、无商标消费品或非商品名部分。
检测部分可以是红外荧光团。检测部分可以是发射500nm至720nm范围内的荧光的荧光团。检测部分可以是发射500nm至720nm范围内的荧光的荧光团。在一些情况下，检测部分发射波长为700nm或更高的荧光。在其他情况下，检测部分发射约660nm或约670nm的荧光。在一些情况下，检测部分发射在500至520、500至540、500至590、590至600、600至610、610至620、620至630、630至640、640至650、650至660、660至670、670至680、6890至690、690至700、700至710、710至720或720至730nm范围内的荧光。检测部分可以是发射与6-荧光素、IRDye 700、TYE 665、Alex Fluor或ATTO TM 633(NHS酯)相同范围内的荧光的荧光团。检测部分可以是荧光素亚磷酰胺、6-荧光素、IRDye 700、TYE 665、Alex Fluor594或ATTO TM633(NHS酯)。检测部分可以是发射与6-荧光素(Integrated DNA Technologies)、IRDye700(Integrated DNA Technologies)、TYE 665(Integrated DNA Technologies)、AlexFluor 594(Integrated DNA Technologies)或ATTO TM 633(NHS酯)(Integrated DNATechnologies)相同范围内的荧光的荧光团。检测部分可以是荧光素亚磷酰胺、6-荧光素(Integrated DNA Technologies)、IRDye 700(Integrated DNA Technologies)、TYE 665(Integrated DNA Technologies)、Alex Fluor 594(Integrated DNA Technologies)或ATTO TM 633(NHS酯)(Integrated DNA Technologies)。本文所述的任何检测部分可来自任何可商购的来源，可以是所列检测部分的具有相似功能的替代物、无商标消费品或非商品名。
可选择检测部分用于基于待测样品的类型使用。例如，作为红外荧光团的检测部分与尿样一起使用。作为另一个实例，具有发射约520nm的荧光团的SEQ ID NO:1用于在非尿液样品中进行测试，并且具有发射约700nm的荧光的荧光团的SEQ ID NO:8用于在尿液样品中进行测试。
可基于其淬灭检测部分的能力来选择淬灭部分。淬灭部分可以是非荧光的荧光淬灭剂。淬灭部分可淬灭发射500nm和720nm范围内的荧光的检测部分。淬灭部分可淬灭发射500nm和720nm范围内的荧光的检测部分。在一些情况下，淬灭部分淬灭发射波长为700nm或更高的荧光的检测部分。在其他情况下，淬灭部分淬灭发射约660nm或约670nm的荧光的检测部分。在一些情况下，淬灭部分淬灭发射在500至520、500至540、500至590、590至600、600至610、610至620、620至630、630至640、640至650、650至660、660至670、670至680、6890至690、690至700、700至710、710至720或720至730nm范围内的荧光的检测部分。淬灭部分可淬灭荧光素亚磷酰胺、6-荧光素、IRDye 700、TYE 665、Alex Fluor 594或ATTO TM 633(NHS酯)。淬灭部分可以是Iowa Black RQ、Iowa Black FQ或IRDye QC-1淬灭剂。淬灭部分可淬灭荧光素亚磷酰胺、6-荧光素(Integrated DNA Technologies)、IRDye 700(IntegratedDNA Technologies)、TYE 665(Integrated DNA Technologies)、Alex Fluor 594(Integrated DNA Technologies)或ATTO TM 633(NHS酯)(Integrated DNATechnologies)。淬灭部分可以是Iowa Black RQ(Integrated DNA Technologies)、IowaBlack FQ(Integrated DNA Technologies)或IRDye QC-1淬灭剂(LiCor)。本文所述的任何淬灭部分可来自任何可商购的来源，可以是所列淬灭部分的具有相似功能的替代物、无商标消费品或非商品名。
从检测部分的释放产生可检测信号表明通过可编程核酸酶裂解已经发生并且样品含有靶核酸。在一些情况下，检测部分包含荧光染料。有时检测部分包含荧光共振能量转移(FRET)对。在一些情况下，检测部分包含红外(IR)染料。在一些情况下，检测部分包含紫外(UV)染料。可替代地或组合地，检测部分包含多肽。有时检测部分包含生物素。有时检测部分包含抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白中的至少一者。在一些情况下，检测部分包含多糖、聚合物或纳米颗粒。在一些情况下，检测部分包含金纳米颗粒或胶乳纳米颗粒。
检测部分可以是能够产生量热信号、电位信号、电流信号、光学(例如，荧光、比色等)信号或压电信号的任何部分。有时，检测剂核酸是能够在核酸裂解后产生量热信号、电位信号、电流信号、光学(例如，荧光、比色等)信号或压电信号的蛋白质-核酸。通常量热信号是检测剂核酸裂解后产生的热量。有时，量热信号是检测剂核酸裂解后吸收的热量。例如，电位信号是检测剂核酸裂解后产生的电位。电流信号可以是检测器核酸裂解后产生的电子的运动。通常，信号是光学信号，如比色信号或荧光信号。光学信号是例如检测剂核酸裂解后产生的光输出。有时，光学信号是检测剂核酸裂解之前和之后之间的吸光度变化。通常，压电信号是检测剂核酸裂解之前和之后之间的质量变化。
通常，蛋白质-核酸是酶-核酸。当存在于酶-核酸中时，酶可能会受到空间位阻，但然后在从核酸裂解之后具有功能性。通常，酶是与底物产生反应的酶。酶可以是转化酶。通常，转化酶的底物是蔗糖和DNS试剂。
有时蛋白质-核酸是底物-核酸。通常底物是与酶产生反应的底物。
蛋白质-核酸可连接至固体载体。例如，固体载体是表面。表面可以是电极。有时，固体载体是珠粒。通常珠粒是磁珠。裂解后，蛋白质从固体释放并与其他混合物相互作用。例如，蛋白质是酶，并且在酶-核酸的核酸裂解后，酶流过腔室进入包含底物的混合物中。当酶遇到酶底物时，发生反应，如比色反应，然后对其进行检测。作为另一个实例，蛋白质是酶底物，并且在酶底物-核酸的核酸裂解后，酶流过腔室进入包含酶的混合物中。当酶底物遇到酶时，发生反应，如量热反应，然后对其进行检测。
在一些实施方案中，检测剂核酸包含与亲和分子缀合的核酸和与荧光团缀合的亲和分子(例如，核酸-亲和分子-荧光团)或与荧光团缀合的核酸和与亲和分子缀合的荧光团(例如，核酸-荧光团-亲和分子)。在一些实施方案中，接头将核酸缀合至亲和分子。在一些实施方案中，接头将亲和分子缀合至荧光团。在一些实施方案中，接头将核酸缀合至荧光团。接头可以是本领域已知的任何合适的接头。在一些实施方案中，检测剂核酸的核酸可直接缀合至亲和分子并且所述亲和分子可直接缀合至荧光团，或者所述核酸可直接缀合至荧光团并且所述荧光团可直接缀合至亲和分子。在本文中，“直接缀合”表示在彼此直接缀合的两个部分之间不存在***分子、多肽、蛋白质或其他部分。例如，如果检测剂核酸包含直接缀合至亲和分子的核酸和直接缀合至荧光团的亲和分子——在所述核酸与所述亲和分子之间不存在***部分，并且在所述亲与所述荧光团之间不存在***部分。亲和分子可以是生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或任何类似分子。
在一些情况下，报告子包含底物-核酸。当存在于底物-核酸中时，底物可与其同源酶隔离，但随后在裂解后从核酸中释放，其中释放的底物可接触同源酶以产生可检测信号。通常，底物是蔗糖，并且同源酶是转化酶，并且DNS试剂可用于监测转化酶活性。
本文公开的装置和方法的主要优点是设计针对未扩增或扩增样品中的总核酸的过量报告子，不包括报告子的核酸。总核酸可包括靶核酸和非靶核酸，不包括报告子的核酸。非靶核酸可来自裂解的或未裂解的原始样品。非靶核酸也可以是扩增的副产物。因此，非靶核酸可包括来自裂解的或未裂解的原始样品和来自扩增样品的非靶核酸。大量非靶核酸的存在可抑制激活的可编程核酸酶结合和裂解报告子序列的能力。这是因为激活的可编程核酸酶附带裂解任何核酸。如果总核酸大量存在，它们可能在对可编程核酸酶的竞争中胜过报告子。本文公开的装置和方法被设计成具有相对于总核酸过量的报告子，使得来自裂解反应(例如，DETECTR反应)的可检测信号特别优越。在一些实施方案中，报告子可以总核酸的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、1.5倍至100倍、2倍至10倍、10倍至20倍、20倍至30倍、30倍至40倍、40倍至50倍、50倍至60倍、60倍至70倍、70倍至80倍、80倍至90倍、90倍至100倍、1.5倍至10倍、1.5倍至20倍、10倍至40倍、20倍至60倍或10倍至80倍过量存在。
本文公开的装置和方法的第二显著优点是设计包含引导核酸、可编程核酸酶和报告子的过量体积，所述过量体积接触包含具有目标靶核酸的样品的较小体积。包含样品的较小体积可以是未裂解的样品、裂解的样品或已经历逆转录、扩增和体外转录的任何组合的裂解样品。粗未裂解的样品、裂解的样品或裂解且扩增的样品中各种试剂(如缓冲液、硫酸镁、盐、pH、还原剂、引物、dNTP、NTP、细胞裂解物、非靶核酸、引物或其他组分)的存在可抑制可编程核酸酶发现和裂解报告子的核酸的能力。这可能是由于不是报告子的核酸在对可编程核酸酶的竞争中胜过报告子的核酸。可替代地，样品中的各种试剂可简单地抑制可编程核酸酶的活性。因此，本文提供的用于使包含引导核酸、可编程核酸酶和报告子的过量体积与包含具有目标靶核酸的样品的较小体积接触的装置和方法通过确保所述可编程核酸酶能够发现并裂解所述报告子的核酸而提供了对所述靶核酸的优异检测。在一些实施方案中，包含引导核酸、可编程核酸酶和报告子的体积(可称为“第二体积”)是包含样品的体积(可称为“第一体积”)的4倍大。在一些实施方案中，包含引导核酸、可编程核酸酶和报告子的体积(可称为“第二体积”)是包含样品的体积(可称为“第一体积”)的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、1.5倍至100倍、2倍至10倍、10倍至20倍、20倍至30倍、30倍至40倍、40倍至50倍、50倍至60倍、60倍至70倍、70倍至80倍、80倍至90倍、90倍至100倍、1.5倍至10倍、1.5倍至20倍、10倍至40倍、20倍至60倍或10倍至80倍大。在一些实施方案中，包含样品的体积是至少0.5ul、至少1ul、至少1μL、至少2μL、至少3μL、至少4μL、至少5μL、至少6μL、至少7μL、至少8μL、至少9μL、至少10μL、至少11μL、至少12μL、至少13μL、至少14μL、至少15μL、至少16μL、至少17μL、至少18μL、至少19μL、至少20μL、至少25μL、至少30μL、至少35μL、至少40μL、至少45μL、至少50μL、至少55μL、至少60μL、至少65μL、至少70μL、至少75μL、至少80μL、至少85μL、至少90μL、至少95μL、至少100μL、0.5μL至5ulμL、5μL至10μL、10μL至15μL、15μL至20μL、20μL至25μL、25μL至30μL、30μL至35μL、35μL至40μL、40μL至45μL、45μL至50μL、10μL至20μL、5μL至20μL、1μL至40μL、2μL至10μL或1μL至10μL。在一些实施方案中，包含可编程核酸酶、引导核酸和报告子的体积是至少10μL、至少11μL、至少12μL、至少13μL、至少14μL、至少15μL、至少16μL、至少17μL、至少18μL、至少19μL、至少20μL、至少21μL、至少22μL、至少23μL、至少24μL、至少25μL、至少26μL、至少27μL、至少28μL、至少29μL、至少30μL、至少40μL、至少50μL、至少60μL、至少70μL、至少80μL、至少90μL、至少100μL、至少150μL、至少200μL、至少250μL、至少300μL、至少350μL、至少400μL、至少450μL、至少500μL、10μL至15ulμL、15μL至20μL、20μL至25μL、25μL至30μL、30μL至35μL、35μL至40μL、40μL至45μL、45μL至50μL、50μL至55μL、55μL至60μL、60μL至65μL、65μL至70μL、70μL至75μL、75μL至80μL、80μL至85μL、85μL至90μL、90μL至95μL、95μL至100μL、100μL至150μL、150μL至200μL、200μL至250μL、250μL至300μL、300μL至350μL、350μL至400μL、400μL至450μL、450μL至500μL、10μL至20μL、10μL至30μL、25μL至35μL、10μL至40μL、20μL至50μL、18μL至28μL或17μL至22μL。
报告子可以是杂合核酸报告子。杂合核酸报告子包含具有至少一种脱氧核糖核苷酸和至少一种核糖核苷酸的核酸。在一些实施方案中，杂合核酸报告子的核酸可具有任何长度并且可具有DNA和RNA的任何混合物。例如，在一些情况下，较长的DNA链段可被一些核糖核苷酸中断。可替代地，较长的RNA链段可被一些脱氧核糖核苷酸中断。可替代地，核酸中每隔一个碱基可在核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸之间交替。与纯RNA核酸报告子相比，杂合核酸报告子的主要优点是稳定性增加。例如，与纯DNA或纯RNA报告子相比，杂合核酸报告子在溶液、冻干或玻璃化中可能更稳定。
此外，靶核酸可在与CRISPR酶的crRNA结合之前进行扩增。这种扩增可以是PCR扩增或等温扩增。样品的这种核酸扩增可提高靶RNA的检测的灵敏度、特异性或准确性中的至少一者。用于核酸扩增的试剂可包含重组酶、寡核苷酸引物、单链DNA结合(SSB)蛋白和聚合酶。核酸扩增可以是转录介导的扩增(TMA)。核酸扩增可以是解旋酶依赖性扩增(HDA)或环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)。在另外的情况下，核酸扩增是链置换扩增(SDA)。核酸扩增可以是重组酶聚合酶扩增(RPA)。核酸扩增可以是环介导的扩增(LAMP)或指数扩增反应(EXPAR)中的至少一者。在一些情况下，核酸扩增是通过滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、简单方法扩增RNA靶标(SMART)、单引物等温扩增(SPIA)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、铰链起始的引物依赖性核酸扩增(HIP)、切口酶扩增反应(NEAR)或改进的多重置换扩增(IMDA)进行。核酸扩增可进行不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或60分钟。有时，核酸扩增反应在约20℃-45℃的温度下进行。核酸扩增反应可在不高于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃的温度下进行。核酸扩增反应可在至少20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃或45℃的温度下进行。
本文公开了如本文所述的测定靶核酸的方法，其中检测到信号。例如，测定样品中的靶核酸的方法包括使所述样品与复合物接触，所述复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；以及测定指示蛋白质-核酸群体的至少一些蛋白质-核酸的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。作为另一个实例，测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使所述样品与复合物接触，所述复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸(例如，来自冠状病毒如SARS-CoV-2的核酸)的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物时表现出序列独立性裂解；b)使所述复合物与底物接触；c)使所述底物与同裂解底物差异反应的试剂接触；以及d)测定指示所述底物的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
可编程核酸酶可包括当与引导核酸和靶核酸(例如，来自冠状病毒如SARS-CoV-2的核酸)复合时能够被激活的可编程核酸酶。可编程核酸酶可在引导核酸与靶核酸结合后被激活，其中激活的可编程核酸酶可裂解靶核酸并且可具有反式裂解活性。反式裂解活性可以是激活的可编程核酸酶对附近核酸的非特异性裂解，如用检测部分反式裂解检测剂核酸。一旦检测剂核酸被激活的可编程核酸酶裂解，检测部分就可从检测剂核酸中释放并且可产生信号。信号可固定在载体介质上用于检测。可使信号可视化以评估靶核酸是否包含修饰。
通常，信号是比色信号或肉眼可见的信号。在一些情况下，信号是荧光信号、电信号、化学信号、电化学信号或磁信号。信号可以是量热信号、电位信号、电流信号、光学(例如，荧光、比色等)信号或压电信号。在一些情况下，可检测信号是比色信号或肉眼可见的信号。在一些情况下，可检测信号是荧光信号、电信号、化学信号、电化学信号或磁信号。在一些情况下，第一检测信号通过检测部分与检测区域中的捕获分子的结合产生，其中所述第一检测信号表明样品含有靶核酸。有时所述***能够检测多于一种类型的靶核酸，其中所述***包括多于一种类型的引导核酸和多于一种类型的检测剂核酸。在一些情况下，可检测信号由裂解事件直接产生。可替代地或组合地，可检测信号由信号事件间接产生。有时可检测信号不是荧光信号。在一些情况下，可检测信号是比色或基于颜色的信号。在一些情况下，所检测到的靶核酸是基于其在载体介质的检测区域上的空间位置来鉴定的。在一些情况下，第二可检测信号在与第一产生信号空间上不同的位置中产生。
在一些情况下，对于检测样品中的单链靶核酸的主题方法，检测阈值小于或等于10nM。术语“检测阈值”在本文中用于描述为了进行检测而必须存在于样品中的靶核酸的最小量。例如，当检测阈值为10nM时，当靶核酸以10nM或更高的浓度存在于样品中时，中可检测到信号。在一些情况下，检测阈值小于或等于5nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、0.005nM、0.001nM、0.0005nM、0.0001nM、0.00005nM、0.00001nM、10pM、1pM、500fM、250fM、100fM、50fM、10fM、5fM、1fM、500阿托摩尔(attomole)(aM)、100aM、50aM、10aM或1aM。在一些情况下，检测阈值在1aM至1nM、1aM至500pM、1aM至200pM、1aM至100pM、1aM至10pM、1aM至1pM、1aM至500fM、1aM至100fM、1aM至1fM、1aM至500aM、1aM至100aM、1aM至50aM、1aM至10aM、10aM至1nM、10aM至500pM、10aM至200pM、10aM至100pM、10aM至10pM、10aM至1pM、10aM至500fM、10aM至100fM、10aM至1fM、10aM至500aM、10aM至100aM、10aM至50aM、100aM至1nM、100aM至500pM、100aM至200pM、100aM至100pM、100aM至10pM、100aM至1pM、100aM至500fM、100aM至100fM、100aM至1fM、100aM至500aM、500aM至1nM、500aM至500pM、500aM至200pM、500aM至100pM、500aM至10pM、500aM至1pM、500aM至500fM、500aM至100fM、500aM至1fM、1fM至1nM、1fM至500pM、1fM至200pM、1fM至100pM、1fM至10pM、1fM至1pM、10fM至1nM、10fM至500pM、10fM至200pM、10fM至100pM、10fM至10pM、10fM至1pM、500fM至1nM、500fM至500pM、500fM至200pM、500fM至100pM、500fM至10pM、500fM至1pM、800fM至1nM、800fM至500pM、800fM至200pM、800fM至100pM、800fM至10pM、800fM至1pM、1pM至1nM、1pM至500pM、1pM至200pM、1pM至100pM、或1pM至10pM的范围内。在一些情况下，检测阈值在800fM至100pM、1pM至10pM、10fM至500fM、10fM至50fM、50fM至100fM、100fM至250fM或250fM至500fM的范围内。在一些情况下，在样品中检测到单链靶核酸的最低浓度在1aM至1nM、10aM至1nM、100aM至1nM、500aM至1nM、1fM至1nM、1fM至500pM、1fM至200pM、1fM至100pM、1fM至10pM、1fM至1pM、10fM至1nM、10fM至500pM、10fM至200pM、10fM至100pM、10fM至10pM、10fM至1pM、500fM至1nM、500fM至500pM、500fM至200pM、500fM至100pM、500fM至10pM、500fM至1pM、800fM至1nM、800fM至500pM、800fM至200pM、800fM至100pM、800fM至10pM、800fM至1pM、1pM至1nM、1pM至500pM、1pM至200pM、1pM至100pM、或1pM至10pM的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最低浓度在1aM至100pM的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最低浓度在1fM至100pM的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最低浓度在10fM至100pM的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最低浓度在800fM至100pM的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最低浓度在1pM至10pM的范围内。在一些情况下，本文所述的装置、***、流体装置、试剂盒和方法检测样品中的靶单链核酸，所述样品包含多种核酸，如多种非靶核酸，其中所述靶单链核酸以低至1aM、10aM、100aM、500aM、1fM、10fM、500fM、800fM、1pM、10pM、100pM或1pM的浓度存在。
在一些情况下，本文所述的装置、***、流体装置、试剂盒和方法检测样品中的靶单链核酸(例如，来自冠状病毒如SARS-CoV-2的核酸)，其中使所述样品与试剂接触足以使反式裂解发生或裂解反应达到完成的预定时间长度。在一些情况下，本文所述的装置、***、流体装置、试剂盒和方法检测样品中的靶单链核酸，其中使所述样品与试剂接触不超过60分钟。有时使样品与试剂接触不超过120分钟、110分钟、100分钟、90分钟、80分钟、70分钟、60分钟、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟。有时使样品与试剂接触至少120分钟、110分钟、100分钟、90分钟、80分钟、70分钟、60分钟、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟。在一些情况下，本文所述的装置、***、流体装置、试剂盒和方法可在少于10小时、少于9小时、少于8小时、少于7小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于1小时、少于50分钟、少于45分钟、少于40分钟、少于35分钟、少于30分钟、少于25分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟或少于5内检测样品中的靶核酸。
当引导核酸结合至靶核酸(例如，来自冠状病毒如SARS-CoV-2的核酸)时，可起始可编程核酸酶的反式裂解活性，并且可裂解检测剂核酸，从而导致荧光的检测。如本文所述的一些方法可以是测定样品中的靶核酸的方法，所述方法包括使所述样品与复合物接触，所述复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；以及测定指示蛋白质-核酸群体的至少一些蛋白质-核酸的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。作为非限制性实例，如通过量热、电位、电流、光学(例如，荧光、比色等)或压电信号的变化所测量，使用可编程核酸酶裂解检测剂核酸可以50％的效率进行裂解。如本文所述的一些方法可以是检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括使包含所述靶核酸的样品与靶向靶核酸区段的引导核酸、在与所述引导核酸和所述靶核酸区段复合时能够被激活的可编程核酸酶、包含检测部分的单链检测剂核酸接触，其中所述检测剂核酸能够被激活的可编程核酸酶裂解，从而产生第一可检测信号，使用如通过颜色变化所测量裂解的可编程核酸酶裂解单链检测剂核酸，并且测量载体介质上的所述第一可检测信号。如通过颜色变化所测量，使用可编程核酸酶裂解单链检测剂核酸可以50％的效率进行裂解。在一些情况下，如通过颜色变化所测量，裂解效率示至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。颜色的变化可以是可检测的比色信号或肉眼可见的信号。颜色的变化可作为第一可检测信号来测量。所述第一可检测信号可在使包含靶核酸的样品与靶向靶核酸区段的引导核酸、在与所述引导核酸和所述靶核酸区段复合时能够被激活的可编程核酸酶以及包含检测部分的单链检测剂核酸接触的5分钟内检测到，其中所述检测剂核酸能够被激活的核酸酶裂解。第一可检测信号可在接触样品的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110或120分钟内可检测到。
在一些情况下，本文所述的方法、试剂和装置用可编程核酸酶和单链检测剂核酸检测样品中的靶核酸，其中使所述样品与所述试剂接触足以进行所述单链检测剂核酸的反式裂解的预定时间长度。例如，可编程核酸酶是检测靶核酸的LbuCas13a，并且单链检测剂核酸包含两个相邻的尿嘧啶核苷酸与在裂解后检测到的绿色可检测部分。作为另一个实例，可编程核酸酶是检测靶核酸的LbaCas13a，并且单链检测剂核酸包含两个相邻的腺嘌呤核苷酸与在裂解后检测到的红色可检测部分。靶核酸可以是单链核酸(例如，单链DNA(ssDNA)或单链RNA)，或者靶核酸可以是双链核酸(例如，双链DNA(dsDNA)或双链RNA)。
本文所述的试剂还可包括与本文公开的装置、***、流体装置、试剂盒和方法相容的缓冲液。这些缓冲液与如本文所述的用于检测病痛(如疾病，包括由病毒引起的那些，如流感)的其他试剂、样品和载体介质相容。本文所述的方法还可包括使用与本文公开的方法相容的缓冲液。例如，缓冲液包含20mM HEPES(pH 6.8)、50mM KCl、5mM MgCl2和5％甘油。在一些情况下，缓冲液包含0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、至30、5至40、5至50、5至75、5至100、10至20、10至30、10至40、10至50、15至20、15至25、15至30、15至4、15至50、20至25、20至30、20至40、或20至50mM HEPES(pH6.8)。缓冲液可包含0至500、0至400、0至300、0至250、0至200、0至150、0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150、5至200、5至250、5至300、5至400、5至500、25至50、25至75、25至100、50至100、50 150、50至200、50至250、50至300、100至200、100至250、100至300、或150至250mM KCl。在其他情况下，缓冲液包含0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、至30、5至40、5至50、5至75、5至100、10至20、10至30、10至40、10至50、15至20、15至25、15至30、15至4、15至50、20至25、20至30、20至40、或20至50mM MgCl2。缓冲液可包含0％至25％、0％至20％、0％至10％、0％至5％、5％至10％、5％至15％、5％至20％、5％至25％、5％至30％甘油。
作为另一个实例，缓冲液包含100mM咪唑(pH 7.5)、250mM KCl、25mM MgCl2、50ug/mL BSA、0.05％ Igepal Ca-630和25％甘油。在一些情况下，缓冲液包含0至500、0至400、0至300、0至250、0至200、0至150、0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150、5至200、5至250、5至300、5至400、5至500、25至50、25至75、25至100、50至100、50 150、50至200、50至250、50至300、100至200、100至250、100至300、或150至250mM咪唑(pH 7.5)。缓冲液可包含0至500、0至400、0至300、0至250、0至200、0至150、0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150、5至200、5至250、5至300、5至400、5至500、25至50、25至75、25至100、50至100、50 150、50至200、50至250、50至300、100至200、100至250、100至300、或150至250mM KCl。在其他情况下，缓冲液包含0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、至30、5至40、5至50、5至75、5至100、10至20、10至30、10至40、10至50、15至20、15至25、15至30、15至4、15至50、20至25、20至30、20至40、或20至50mM MgCl2。在一些情况下，缓冲液包含0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至50、5至75、5至100、10至20、10至50、10至75、10至100、25至50、25至75、25至100、50至75、或50至100ug/mL BSA。在一些情况下，缓冲液包含0％至1％、0％至0.5％、0％至0.25％、0％至0.01％、0％至0.05％、0％至0.025％、0％至0.01％、0.01％至0.025％、0.01％至0.05％、0.01％至0.1％、0.01％至0.25％、0.01％至0.5％、0.01％至1％、0.025％至0.05％、0.025％至0.1％、0.025％至0.5％、0.025％至1％、0.05％至0.1％、0.05％至0.25％、0.05％至0.5％、0.05％至0.75％、0.05％至1％、0.1％至0.25％、0.1％至0.5％、或0.1％至1％ Igepal Ca-630。缓冲液可包含0％至25％、0％至20％、0％至10％、0％至5％、5％至10％、5％至15％、5％至20％、5％至25％、5％至30％甘油。
本公开的缓冲液可包括病毒裂解缓冲液。病毒裂解缓冲液可裂解病毒样品(例如，从疑似患有冠状病毒感染的个体收集的样品)中的冠状病毒衣壳，从而释放病毒基因组。病毒裂解缓冲液可与病毒基因组的靶区域的扩增(例如，RT-LAMP扩增)相容。病毒裂解缓冲液可与检测(例如，本文公开的DETECTR反应)相容。样品可在一步样品制备方法中制备，所述方法包括将所述样品悬浮在与扩增、检测(例如，DETECTR反应)或两者相容的病毒裂解缓冲液中。与扩增(例如，RT-LAMP扩增)、检测(例如，DETECTR)或两者相容的病毒裂解缓冲液可包含缓冲剂(例如，Tris-HCl、磷酸盐或HEPES)、还原剂(例如，N-乙酰基半胱氨酸(NAC)、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(BME)或三(2-羧乙基)膦(TCEP))、螯合剂(例如，EDTA或EGTA)、洗涤剂(例如，脱氧胆酸盐、NP-40(Ipgal)、Triton X-100或Tween 20)、盐(例如，乙酸铵、乙酸镁、乙酸锰、乙酸钾、乙酸钠、氯化铵、氯化钾、氯化镁、氯化锰、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锰、硫酸钾或硫酸钠)或它们的组合。例如，病毒裂解缓冲液可包含缓冲剂和还原剂，或者病毒裂解缓冲液可包含缓冲剂和螯合剂。病毒裂解缓冲液可在低pH下配制。例如，病毒裂解缓冲液可在约pH 4至约pH 5的pH下配制。在一些实施方案中，病毒裂解缓冲液可在约pH 4至约pH 9的pH下配制。病毒裂解缓冲液还可包含防腐剂(例如，ProClin 150)。在一些实施方案中，病毒裂解缓冲液可包含扩增反应的激活剂。例如，缓冲液可包含引物、dNTP或镁(例如，MgSO4、MgCl2或MgOAc)或它们的组合，以激活扩增反应。在一些实施方案中，可在冠状病毒裂解后将激活剂(例如，引物、dNTP或镁)添加至缓冲液中以起始扩增反应。
病毒裂解缓冲液可包含约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5或约9的pH。在一些实施方案中，病毒裂解缓冲液可包含3.5至4.5、4至5、4.5至5.5、3.5至4、4至4.5、4.5至5、5至5.5、5至6、6至7、7至8或8至9的pH。
病毒裂解缓冲液可包含约0mM、约2mM、约4mM、约5mM、约6mM、约8mM、约10mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM或约60mM镁(例如，MgSO4、MgCl2或MgOAc)的镁浓度。病毒裂解缓冲液可包含0mM至5mM、5mM至10mM、10mM至15mM、15mM至20mM、20mM至25mM、25mM至30mM、30mM至40mM、40mM至50mM或50mM至60mM镁(例如，MgSO4、MgCl2或MgOAc)的镁浓度。在一些实施方案中，可在病毒裂解后添加镁以激活扩增反应。
病毒裂解缓冲液可包含浓度为约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约10mM、约12mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约7mM、约80mM、约90mM、约100mM或约120mM的还原剂(例如，NAC、DTT、BME或TCEP)。病毒裂解缓冲液可包含浓度为1mM至5mM、5mM至10mM、10mM至15mM、15mM至20mM、20mM至25mM、25mM至30mM、30mM至40mM、40mM至50mM、50mM至60mM、60mM至70mM、70mM至80mM或80mM至90mM、90mM至100mM、或100mM至120mM的还原剂(例如，NAC、DTT、BME或TCEP)。病毒裂解缓冲液可包含浓度为约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约10mM、约12mM、约15mM、约20mM、约25mM或约30mM的螯合剂(例如，EDTA或EGTA)。病毒裂解缓冲液可包含浓度为0.1mM至0.5mM、0.25mM至0.5mM、0.4mM至0.6mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、5mM至10mM、10mM至15mM、15mM至20mM、20mM至25mM或25mM至30mM的螯合剂(例如，EDTA或EGTA)。
病毒裂解缓冲液可包含浓度为约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM的盐(例如，乙酸铵((NH4)2OAc)、乙酸镁(MgOAc)、乙酸锰(MnOAc)、乙酸钾(K2OAc)、乙酸钠(Na2OAc)、氯化铵(NH4Cl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、氯化锰(MnCl2)、氯化钠(NaCl)、硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸锰(MnSO4)、硫酸钾(K2SO4)或硫酸钠(Na2SO4))。病毒裂解缓冲液可包含浓度为1mM至5mM、1mM至10mM、5mM至10mM、10mM至15mM、15mM至20mM、20mM至25mM、25mM至30mM、30mM至35mM、35mM至40mM、40mM至45mM、45mM至50mM、50mM至55mM、55mM至60mM、60mM至70mM、70mM至80mM、80mM至90mM或90mM至100mM的盐(例如，(NH4)2OAc、MgOAc、MnOAc、K2OAc、Na2OAc、NH4Cl、KCl、MgCl2、MnCl2、NaCl、(NH4)2SO4、MgSO4、MnSO4、K2SO4或Na2SO4)。
病毒裂解缓冲液可包含浓度为约0.01％、约0.05％、约0.10％、约0.15％、约0.20％、约0.25％、约0.30％、约0.35％、约0.40％、约0.45％、约0.50％、约0.55％、约0.60％、约0.65％、约0.70％、约0.75％、约0.80％、约0.85％、约0.90％、约0.95％、约1.00％、约1.10％、约1.20％、约1.30％、约1.40％、约1.50％、约2.00％、约2.50％、约3.00％、约3.50％、约4.00％、约4.50％或约5.00％的洗涤剂(例如，脱氧胆酸盐、NP-40(Ipgal)、Triton X-100或Tween 20)。病毒裂解缓冲液可包含浓度为0.01％至0.10％、0.05％至0.15％、0.10％至0.20％、0.15％至0.25％、0.20％至0.30％、0.25％至0.35％、0.30％至0.40％、0.35％至0.45％、0.40％至0.50％、0.45％至0.55％、0.50％至0.60％、0.55％至0.65％、0.60％至0.70％、0.65％至0.75％、0.70％至0.80％、0.75％至0.85％、0.80％至0.90％、0.85％至0.95％、0.90％至1.00％、0.95％至1.10％、1.00％至1.20％、1.10％至1.30％、1.20％至1.40％、1.30％至1.50％、1.40％至1.60％、1.50％至2.00％、2.00％至2.50％、2.50％至3.00％、3.00％至3.50％、3.50％至4.00％、4.00％至4.50％或4.50％至5.00％的洗涤剂(例如，脱氧胆酸盐、NP-40(Ipgal)、Triton X-100或Tween 20)。
裂解反应可在一定温度范围内进行。在一些实施方案中，裂解反应可在约室温下进行。在一些实施方案中，裂解反应可在约95℃下进行。在一些实施方案中，裂解反应可在1℃至10℃、4℃至8℃、10℃至20℃、15℃至25℃、15℃至20℃、18℃至25℃、18℃至95℃、20℃至37℃、25℃至40℃、35℃至45℃、40℃至60℃、50℃至70℃、60℃至80℃、70℃至90℃、80℃至95℃或90℃至99℃下进行。在一些实施方案中，裂解反应可进行约5分钟、约15分钟或约30分钟。在一些实施方案中，裂解反应可进行2分钟至5分钟、3分钟至8分钟、5分钟至15分钟、10分钟至20分钟、15分钟至25分钟、20分钟至30分钟、25分钟至35分钟、30分钟至40分钟、35分钟至45分钟、40分钟至50分钟、45分钟至55分钟、50分钟至60分钟、55分钟至65分钟、60分钟至70分钟、65分钟至75分钟、70分钟至80分钟、75分钟至85分钟或80分钟至90分钟。
许多检测装置和方法与本文公开的方法一致。例如，可测量或检测量热信号、电位信号、电流信号、光学(例如，荧光、比色等)信号或压电信号的任何装置。通常量热信号是检测剂核酸裂解后产生的热量。有时，量热信号是检测剂核酸裂解后吸收的热量。例如，电位信号是检测剂核酸裂解后产生的电位。电流信号可以是检测器核酸裂解后产生的电子的运动。通常，信号是光学信号，如比色信号或荧光信号。光学信号是例如检测剂核酸裂解后产生的光输出。有时，光学信号是检测剂核酸裂解之前和之后之间的吸光度变化。通常，压电信号是检测剂核酸裂解之前和之后之间的质量变化。有时，检测剂核酸是蛋白质-核酸。通常，蛋白质-核酸是酶-核酸。
来自已完成测定的检测区域的结果可以多种方式，例如通过血糖仪进行检测和分析。在一些情况下，检测区域中的阳性对照斑点和检测斑点是肉眼可见的，并且用户可读取结果。在一些情况下，检测区域中的阳性对照斑点和检测斑点根据信号的类型通过成像装置或其他装置可视化。通常，成像装置是数码相机，如移动装置上的数码相机。移动装置可具有软件程序或移动应用程序，其可捕获载体介质的图像、鉴定正在进行的测定、检测检测区域和检测斑点、提供检测斑点的图像性质、分析检测斑点的图像性质并提供结果。可替代地或组合地，成像装置可捕获荧光、紫外(UV)、红外(IR)或可见波长信号。成像装置可具有激发源以提供激发能量并捕获发射的信号。在一些情况下，激发源可以是相机闪光灯和任选的滤光片。在一些情况下，成像装置与放置在载体介质上的成像盒一起使用，以创建暗室来改善成像。成像盒可以是成像装置可在成像之前装入其中的纸板盒。在一些情况下，成像盒具有光学透镜、反射镜、滤光片或其他光学元件，以帮助产生更聚焦的激发信号或捕获更聚焦的发射信号。通常，成像盒和成像装置是小型的、手持的和便携式的，以有助于在远程或资源匮乏的环境中运输和使用测定。
本文所述的测定可通过移动应用程序(app)或软件程序进行可视化和分析。使用app或程序的图形用户界面(GUI)，个体可使用移动装置上的相机拍摄载体介质的图像，包括检测区域、条形码、参考色标和外壳上的基准标记物。所述程序或app读取测试类型的条形码或可标识标记，定位所述基准标记物以定向样品，并且读取可检测信号，与参考颜色栅格进行比较，并确定靶核酸的存在或不存在，其指示导致疾病的基因、病毒或因子的存在。移动应用程序可将测试结果呈现给个体。移动应用程序可将测试结果存储在移动应用程序中。移动应用程序可与远程装置通信并传输测试结果的数据。另一个体(包括医疗保健专业人员)可从远程装置远程查看测试结果。远程用户可访问结果并使用所述信息来推荐治疗、干预、环境清理的行动。
疾病检测
本文公开了可用于疾病检测的如本文所述的测定靶核酸的方法。疾病可以是冠状病毒。冠状病毒可以是SARS-CoV-2、229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、MERS-CoV或SARS-CoV。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法特异性地靶向和测定SARS-CoV-2冠状病毒。例如，测定样品中的靶核酸(例如，来自冠状病毒)的方法包括使所述样品与复合物接触，所述复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；以及测定指示蛋白质-核酸群体的至少一些蛋白质-核酸的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。检测到信号可指示靶核酸的存在。有时，靶核酸包含突变。通常，突变是单核苷酸突变。作为另一个实例，测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使所述样品与复合物接触，所述复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；b)使所述复合物与底物接触；c)使所述底物与同裂解底物差异反应的试剂接触；以及d)测定指示所述底物的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。可使用本文公开的组合物和方法测定SARS-CoV-2的任何核酸。在一些实施方案中，靶核酸包含冠状病毒的N基因或E基因，并且可使用本文公开的组合物和方法进行测定。
所述方法可用于鉴定影响基因表达的靶核酸的突变。影响基因表达的突变可以是所述基因内的靶核酸的突变、包含与基因表达相关的RNA的靶核酸的突变、或包含与基因表达的调控相关的核酸(如RNA或基因的启动子、增强子或阻遏子)的突变的靶核酸。有时，使用靶核酸突变的状态来确定细菌、病毒或微生物的致病性或治疗抗性，如对抗生素治疗的抗性。通常，突变的状态用于诊断或鉴定与细菌、病毒或微生物中的靶核酸的突变相关的疾病。通常，突变是单核苷酸突变。
检测作为研究工具，即时或非处方
本文公开了如本文所述的测定多种靶核酸(例如，来自冠状病毒的核酸)的方法，其可用作研究工具并且可作为试剂盒提供。冠状病毒可以是SARS-CoV-2、229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、MERS-CoV或SARS-CoV。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法特异性地靶向和测定SARS-CoV-2冠状病毒。冠状病毒可以是SARS-CoV-2的变体，特别是称为20B/501Y.V1、VOC 202012/01或B.1.1.7谱系的英国(UK)变体，或者称为以下的南非变体：20C/501Y.V2或B.1.351谱系。可使用本文公开的组合物和方法测定SARS-CoV-2的任何核酸。在一些实施方案中，靶核酸包含冠状病毒的N基因或E基因，并且可使用本文公开的组合物和方法进行测定。
例如，测定样品中的多种靶核酸的方法包括使所述样品与多种复合物接触，所述多种复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述多种靶核酸的靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；以及测定指示蛋白质-核酸群体的至少一些蛋白质-核酸的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。多种复合物可包含具有针对不同靶核酸的引导核酸的可编程核酸酶复合物。检测到信号可指示靶核酸的存在。有时，多种靶核酸的靶核酸包含突变。通常，突变是单核苷酸突变。作为另一个实例，测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使所述样品与复合物接触，所述复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；b)使所述复合物与底物接触；c)使所述底物与同裂解底物差异反应的试剂接触；以及d)测定指示所述底物的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
如本文所述的方法可用于鉴定多种靶核酸。所述方法可用于鉴定影响基因表达的靶核酸的突变。影响基因表达的突变可以是所述基因内的靶核酸的单核苷酸突变、包含与基因表达相关的RNA的靶核酸的突变、或包含与基因表达的调控相关的核酸(如RNA或基因的启动子、增强子或阻遏子)的突变的靶核酸。通常，突变是单核苷酸突变。
试剂盒或研究工具可用于在实验室环境中检测任何数量的靶核酸、突变或本文公开的其他适应症。试剂盒可作为开箱仪器的试剂包提供。
在其他实施方案中，所述***、测定形式、Cas报告子、可编程核酸酶或其他试剂中的任一者都可用于即时(POC)测试中，所述测试可在分散位置如医院、POL或诊所进行。这些即时测试可用于诊断本文公开的任何适应症，如流感或链球菌感染，或者可用于测量靶核酸中特定突变(例如，EGFR)的存在或不存在。POC测试可作为具有消耗性测试卡的小型仪器提供，其中测试卡是本文公开的任何测定形式(例如，侧流测定)。
在其他实施方案中，所述***、测定形式、Cas报告子、可编程核酸酶或其他试剂中的任一者都可以非处方(OTC)、无读取仪形式使用，其可在远程站点或在家中使用以诊断一系列适应症，如流感。这些适应症可包括甲型流感、乙型流感、链球菌感染或CT/NG感染。OTC产品可包括消耗性测试卡，其中所述测试卡是本文公开的任何测定形式(例如，侧流测定)。在OTC产品中，可视觉地或使用手机对测试卡进行解读。
复用(Multiplexing)
本文所述的装置、***、流体装置、试剂盒和方法可多种方式复用。这些复用方法例如与本文公开的用于检测样品中的靶核酸的方法、试剂和装置一致。流体装置可包括多个泵、阀、储库和腔室，以用于样品制备、扩增样品中的靶核酸的一个或多于一个序列、与可编程核酸酶混合以及检测由流体***本身内的可编程核酸酶裂解检测剂核酸产生的可检测信号。
与本公开一致的方法包括测定样品中的靶核酸的复用方法。复用方法包括使所述样品与复合物接触，所述复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；以及测定指示蛋白质-核酸群体的至少一些蛋白质-核酸的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。作为另一个实例，测定样品中的靶核酸的复用方法例如包括：a)使所述样品与复合物接触，所述复合物包含引导核酸，所述引导核酸包含与所述靶核酸的区段反向互补的区段；和可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与所述靶核酸的所述区段结合的所述引导核酸的所述区段的复合物后表现出序列独立性裂解；b)使所述复合物与底物接触；c)使所述底物与同裂解底物差异反应的试剂接触；以及d)测定指示所述底物的裂解的信号，其中所述信号指示所述样品中存在所述靶核酸，并且其中不存在所述信号指示所述样品中不存在所述靶核酸。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
复用可以是空间复用，其中同时检测多种不同的靶核酸，但反应在空间上是分开的。通常，使用相同的可编程核酸酶、但使用不同的引导核酸来检测多种靶核酸。有时使用不同的可编程核酸酶来检测多种靶核酸。有时，复用可以是单一反应复用，其中在单个反应体积中检测多种不同的靶核酸。通常，单一可编程核酸酶群体用于单一反应复用中。有时，在单一反应复用中使用至少两种不同的可编程核酸酶。例如，可通过将多个类别的检测剂核酸固定在流体***内来实现复用，从而能够检测单个样品中的多种靶核酸。
此外，可定量来自复用的信号。例如，定量疾病群组的方法包括测定来自样品的多个等分试样中的多种独特靶核酸，测定所述样品的第二等分试样中的对照核酸对照，以及通过测量与所述第二等分试样中产生的信号相比由检测剂核酸的裂解产生的信号来定量所述多种独特靶核酸的多个信号。通常，多种独特靶核酸来自样品中的多种病毒。有时，多个信号的定量与产生多个信号的多种独特靶核酸的多种独特靶核酸的浓度相关。
本文所述的方法、试剂和装置可通过试剂和载体介质的各种配置来复用。在一些情况下，试剂盒或***被设计成将多个载体介质封装在单个外壳中。有时，容纳在单个外壳中的多个载体介质共享单个样品垫。单个样品垫可以诸如分支或径向形式的各种设计连接至载体介质。可替代地，多种载体介质中的每一者都具有其自己的样品垫。在一些情况下，试剂盒或***被设计成具有封装在外壳中的单一载体介质，其中所述载体介质包含用于检测多种靶核酸的多个检测斑点。有时，用于多重测定的试剂包含多种引导核酸、多种可编程核酸酶和多种单链检测剂核酸，其中所述引导核酸中的一者、所述可编程核酸酶中的一者和所述单链检测剂核酸中的一者的组合检测一种靶核酸并且可在检测区域上提供检测斑点。在一些情况下，被配置为检测一种靶核酸的引导核酸、可编程核酸酶和单链检测剂核酸的组合在单个试剂室中与至少一种其他组合混合。在一些情况下，被配置为检测一种靶核酸的引导核酸、可编程核酸酶和单链检测剂核酸的组合在单个载体介质上与至少一种其他组合混合。当使这些试剂组合与样品接触时，多种靶核酸的反应在同一介质或试剂室中同时发生。有时，将此反应样品施加至本文所述的多重载体介质。在一些情况下，本文所述的方法、试剂和装置可在缺乏载体介质的配置中复用。
在一些情况下，被配置为检测一种靶核酸的引导核酸、可编程核酸酶和单链检测剂核酸的组合被提供在其自己的试剂室或其自己的载体介质中。在这种情况下，在装置、试剂盒或***中提供多个试剂室或载体介质，其中一个试剂室被设计用于检测一种靶核酸。在这种情况下，使用多种载体介质来检测病毒感染组或其他目标疾病。
流体装置中靶核酸的检测
本文公开了用于检测生物样品中的目标靶核酸的各种流体装置。目标靶核酸可来自包含冠状病毒的样品，所述冠状病毒如SARS-CoV-2、229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、MERS-CoV或SARS-CoV。在一些实施方案中，目标靶核酸来自SARS-CoV-2冠状病毒。SARS-CoV-2的任何核酸都可以是目标靶核酸。在一些实施方案中，目标靶核酸包含冠状病毒的N基因或E基因。流体装置可用于监测样品中的靶核酸与可编程核酸酶的反应，从而允许检测所述靶核酸。本文公开的所有样品和试剂对于与流体装置一起使用而言是相容的。任何可编程核酸酶(如本文所述的任何Cas核酸酶)对于与流体装置一起使用而言是相容的。本文公开的载体介质和外壳对于与流体装置结合使用而言也是相容的。如在本公开全文中所描述的，多重检测可在流体装置内进行。本文公开的用于检测和可视化的组合物和方法对于在流体***中使用而言也是相容的。
在以下描述的流体***中，可监测任何可编程核酸酶(例如，CRISPR-Cas)反应。例如，本文公开的任何可编程核酸酶可用于裂解报告分子以产生检测信号。在一些情况下，可编程核酸酶是Cas13。有时Cas13是Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d或Cas13e。在一些情况下，可编程核酸酶是Mad7或Mad2。在一些情况下，可编程核酸酶是Cas12。有时Cas12是Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d或Cas12e。在一些情况下，可编程核酸酶是Csm1、Cas9、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9或CasZ。有时，Csm1也称为smCms1、miCms1、obCms1或suCms1。有时Cas13a也称为C2c2。有时CasZ也称为Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、Cas14h、Cas14i、Cas14j或Cas14k。有时，可编程核酸酶是V型CRISPR-Cas***。在一些情况下，可编程核酸酶是VI型CRISPR-Cas***。有时，可编程核酸酶是III型CRISPR-Cas***。在一些情况下，可编程核酸酶来自以下中的至少一者：沙氏纤毛菌(Lsh)、斯氏李斯特氏菌(Lse)、口腔纤毛菌(Lbu)、韦德纤毛菌(Lwa)、荚膜红细菌(Rca)、解半纤植雪菌(Hhe)、产丙酸栖沼泽杆菌(Ppr)、毛螺菌科细菌(Lba)、直肠[真杆菌](Ere)、纽约李斯特氏菌(Listeria newyorkensis)(Lny)、嗜氨基酸梭菌(Clostridium aminophilum)(Cam)、普雷沃氏菌属(Psm)、犬咬二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga canimorsus)(Cca，毛螺菌科细菌(Lba)、动物溃疡伯杰氏菌(Bzo)、中间普雷沃氏菌(Pin)、颊普雷沃氏菌(Pbu)、另枝菌属某种(Alistipes sp.)(Asp)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)(Ran)、桔红色普雷沃氏菌(Prevotella aurantiaca)(Pau)、解糖普雷沃氏菌(Prevotellasaccharolytica)(Psa)、中间普雷沃氏菌(Pin2)、犬咬二氧化碳嗜纤维菌(Cca)、齿周卟啉单胞菌(Porphyromonas gulae)(Pgu)普雷沃氏菌属某种(Psp)、牙龈卟啉单胞菌(Pig)、中间普雷沃氏菌(Pin3)、意大利肠球菌(Ei)、唾液乳杆菌(Ls)、或嗜热栖热菌(Tt)。有时，Cas13是LbuCas13a、LwaCas13a、LbaCas13a、HheCas13a、PprCas13a、EreCas13a、CamCas13a或LshCas13a中的至少一者。
可修改任何微流体***或侧流测定以适应本文公开的用于测定和检测来自冠状病毒的靶核酸的CRISPR-Cas反应。在一些实施方案中，信号本身可例如通过使用诸如辣根过氧化物酶(HRP)的酶而扩增。在一些实施方案中，以4:1的比例结合的生物素和抗生物素蛋白反应可用于将多种酶或次级信号分子(例如，次级信号分子的4种酶，各自在生物素上)固定至单一蛋白质(例如，抗生物素蛋白)。在一些实施方案中，电化学信号可由电化学分子(例如，生物素、二茂铁、地高辛或转化酶)产生。在一些实施方案中，上述装置可与额外的浓缩步骤相结合。例如，二氧化硅膜可用于从柱中捕获核酸并将Cas反应混合物直接施加在所述过滤器的顶部。在一些实施方案中，本文公开的装置中的任一者的样品室可容纳20ul至1000ul的体积。在一些实施方案中，样品室容纳20至500、40至400、30至300、20至200或10至100ul的体积。在优选实施方案中，样品室容纳200ul的体积。扩增室和检测室可容纳比样品室更低的体积。例如，扩增室和检测室可容纳1至50、10至40、20至30、10至40、5至35、40至50或1至30ul的体积。优选地，扩增室和检测室可容纳约200ul的体积。在一些实施方案中，核酸外切酶存在于扩增室中或者可添加至扩增室中。核酸外切酶可清除不是靶标的单链核酸。在一些实施方案中，可使用于靶核酸的引物硫代磷酸化以防止靶核酸在核酸外切酶存在下降解。在一些实施方案中，本文公开的任何装置可具有用于平衡样品的pH的pH平衡孔。在一些实施方案中，在上述装置的每一个中，报告子以总核酸(靶核酸+非靶核酸)的至少四倍过量存在。优选地，报告子以总核酸的至少10倍过量存在。在一些实施方案中，报告子以总核酸的至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、1.5至100倍、4至80倍、4至10倍、5至20倍或4至15倍过量存在。在一些实施方案中，本文公开的任何装置可以至少0.1aM、至少0.1nM、至少1nM或0.1aM至1nM的检测限进行DETECTR反应(例如，用于测定来自冠状病毒的靶核酸的DETECTR反应)。在一些实施方案中，本文公开的装置可以至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％或100％的阳性预测值进行DETECTR反应。在一些实施方案中，本文公开的装置可以至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％或100％的阴性预测值进行DETECTR反应。在一些实施方案中，上述装置中的空间复用通过使装置中的至少一个、多于一个或每个检测室包含独特引导核酸来进行。
流体装置可包括多个腔室和多种类型的腔室。流体装置可包括多个腔室，所述多个腔室被配置为容纳具有试剂的样品并且处于有助于特定类型反应的条件下。这种腔室可被设计成有助于检测反应或反应物质(例如，通过具有透明表面以便可通过外部荧光计监测腔室的内容物，或者通过具有能够进行电位分析的电极)。流体装置可包括扩增室，所述扩增室可被设计成在适合扩增反应的条件(例如温度)下容纳样品和试剂。流体装置可包括检测室，所述检测室可被设计成在适合检测反应(例如，比色反应或DETECTR反应)的条件下容纳具有试剂的样品。流体装置还可包括被设计用于储存或转移试剂的腔室。例如，流体装置可包括被设计用于容纳用于扩增反应(例如，LAMP)的试剂的扩增试剂室或被设计用于容纳能够检测物种的存在或不存在的反应(例如，DETECTR反应)的试剂。流体装置可包括被配置用于多种目的的腔室(例如，腔室可被配置用于储存试剂、含有用于两种不同类型的反应的两种类型的样品以及促进荧光检测)。
流体装置可包括通向流体装置内的内部空间的样品入口(术语“样品入口”在本文中可与样品入口端口和样品收集端口互换使用)，如腔室或流体通道。样品入口可通向流体装置内的腔室。样品入口可能能够密封。在一些情况下，样品入口密封在被设计用于递送样品的第二设备周围，从而将样品入口与周围环境密封。例如，样品入口可能能够围绕拭子或注射器密封。样品入口还可被配置为容纳盖或覆盖或密封所述样品入口的其他机构，其可包括可弯曲或可断裂部件。例如，样品入口可包括在样品***后断裂的密封件。在一些情况下，样品入口内的密封件在断裂后释放试剂。样品入口可包括多个腔室或隔室。例如，样品入口可包括由可断裂塑料密封件隔开的上部隔室和下部隔室。密封件可在样品***后断裂，从而将内容物(例如，裂解缓冲液或扩增缓冲液)从上部容器释放到下部容器中，在下部容器中它可与样品混合并洗脱到流体装置内的单独隔室(例如，样品隔室)中。
在一些实施方案中，流体装置可包括滑动阀。滑动阀可能能够采用多个位置，所述多个位置连接装置中的不同通道或隔室。在一些情况下，滑动装置包括可同时连接多个不同通道或隔室的多组通道。例如，包括10个扩增室、10个试剂室和1个样品室的装置可包括滑动阀，所述滑动阀可采用通过10个单独通道将样品室连接至10个扩增室的第一位置，以及可单独将10个扩增室连接至10个试剂室的第二位置。滑动阀可能能够通过装置或计算机进行自动控制。滑动阀可包括输送流体通道，所述输送流体通道可具有在滑动阀处于第一位置时对第一腔室或流体通道开放的第一端和被阻塞的第二端，并且可具有在滑动阀处于第二位置时被阻塞的第一端和对第二腔室或流体通道开放的第二端。滑动阀可被设计成将来自两个或更多个腔室或通道的流组合到单个腔室或通道中。滑动阀可被设计成将来自单个腔室或通道的流分到两个或更多个单独腔室或流体通道中。
装置可包括多个腔室、流体通道和阀。装置可包括多种类型的腔室、流体通道、阀或它们的任何组合。装置可包括不同数量的腔室、流体通道和阀。例如，装置可包括一个样品室、将样品室连接至10个单独扩增反应室的旋转阀以及将来自10个扩增反应室的流控制到30个单独检测室中的两个滑动阀。旋转阀可连接2个或更多个腔室或流体通道。旋转阀可连接3个或更多个腔室或流体通道。旋转阀可连接4个或更多个腔室或流体通道。旋转阀可连接5个或更多个腔室或流体通道。旋转阀可连接8个或更多个腔室或流体通道。旋转阀可连接10个或更多个腔室或流体通道。旋转阀可连接15个或更多个腔室或流体通道。旋转阀可连接20个或更多个腔室或流体通道。
流体装置可包括多个通道。流体装置可包括多个通道，所述多个通道包括多个尺寸和性质。流体装置可包括具有相同长度的两个通道。流体装置可包括提供相同阻力的两个通道。流体装置可包括两个相同通道。
流体装置可包括多个毫通道。毫通道可具有介于100与200mm之间的宽度。毫通道可具有介于50与100nm之间的宽度。毫通道可具有介于20与50nm之间的宽度。毫通道可具有介于10与20nm之间的宽度。毫通道可具有介于1与10nm之间的宽度。流体装置可包括微通道。微通道可具有介于800与990μm之间的宽度。微通道可具有介于600与800μm之间的宽度。微通道可具有介于400与600μm之间的宽度。微通道可具有介于200与400μm之间的宽度。微通道可具有介于100与200μm之间的宽度。微通道可具有介于50与100μm之间的宽度。微通道可具有介于30与50μm之间的宽度。微通道可具有介于20与30μm之间的宽度。微通道可具有介于10与20μm之间的宽度。微通道可具有介于5与10μm之间的宽度。微通道可具有介于1与5μm之间的宽度。流体装置可包括纳米通道。纳米通道可具有介于800与990nm之间的宽度。纳米通道可具有介于600与800nm之间的宽度。纳米通道可具有介于400与600nm之间的宽度。纳米通道可具有介于200与400nm之间的宽度。纳米通道可具有介于1与200nm之间的宽度。通道可具有相当的高度和宽度。通道可具有比高度更大的宽度，或比高度更窄的宽度。通道可具有为其高度的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、500、1000倍或更多倍的宽度。通道可具有为其高度的0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001倍或更多倍的宽度。通道可具有小于其高度的0.001倍的宽度。通道可具有不均匀的尺寸。通道可在沿其长度的不同点处具有不同尺寸。通道可分成2个或更多个单独的通道。通道可以是直的，或者可具有弯曲、曲线、转弯、角度或非线性形状的其他特征。通道可包括一个回路或多个回路。
流体装置可包括阻力通道。阻力通道可以是相对于流体装置内的其他通道具有慢流速的通道。阻力通道可以是相对于流体装置内的其他通道具有低体积流率的通道。阻力通道可相对于流体装置中的其他通道向样品流动提供更大阻力。阻力通道可防止或限制样品回流。阻力通道可通过限制湍流来防止或限制装置内的多个样品之间的交叉污染。阻力通道可有助于流体装置内的流动稳定性。阻力通道可限制流体装置的多个部分之间的流速差异。阻力通道可使装置内的流速稳定，并使随时间推移的流量变化最小化。
阻力通道装置。在一些实施方案中，本公开的装置可具有阻力通道、样品计量通道、用于流体流动的阀或它们的任何组合。图53A、图53B、图54A、图54B、图55A、图55B、图55C、图55D、图56A、图56B、图56C和图56D示出了用于DETECTR反应中的所述微流体盒的实例。在一些实施方案中，盒可包括扩增室、流体连接至所述扩增室的阀、流体连接至所述阀的检测反应室以及流体连接至所述检测室的检测试剂储库，如图57A所示。在一些实施方案中，装置还可包括鲁尔滑动适配器，如图58C所示。鲁尔滑动适配器可用于适配用于将样品或试剂递送至装置中的鲁尔锁注射器。微流体装置的一个或多个元件(例如，腔室、通道、阀或泵)可流体连接至微流体装置的一个或多个其他元件。第一元件可流体连接至第二元件，使得流体可在所述第一元件与所述第二元件之间流动。第一元件可通过第三元件流体连接至第二元件，使得流体可通过穿过第三元件从所述第一元件流动至所述第二元件。例如，检测试剂室可通过阻力通道流体连接至检测室，如图57A所示。
装置的腔室(例如，扩增室、检测室或检测试剂储库)可通过一个或多个通道流体连接至一个或多个另外的腔室。在一些实施方案中，通道可以是被配置为调控第一腔室与第二腔室之间的流体流动的阻力通道。阻力通道可在所述第一腔室与所述第二腔室之间形成非线性路径。它可包括限制或混淆流动的特征，如弯曲、转弯、翅片、V形(chevron)、人字形(herringbone)或其他微结构。与具有相当长度和宽度的线性通道相比，阻力通道可能减少了回流。与具有相当长度和宽度的线性通道相比，阻力通道可通过需要增加的压力来使流体穿过通道而起作用。在一些实施方案中，与通过具有相当长度和宽度的线性通道连接的两个腔室之间的交叉污染相比，阻力通道可使得通过阻力通道连接的两个腔室之间的交叉污染减少。阻力通道可具有角度路径，例如如图55A、图55B、图56C和图56D所示。角度路径可包括在穿过通道的流体的流动方向上的一个或多个角度。在一些实施方案中，角度路径可包括直角。在一些实施方案中，角度路径可包括约90°的角。在一些实施方案中，角度路径可包括介于约45°与约135°之间的至少一个角。在一些实施方案中，角度路径可包括介于约80°与约100°之间的至少一个角。在一些实施方案中，角度路径可包括介于约85°与约95°之间的至少一个角。阻力通道可具有迂回或蜿蜒路径，例如如图55C、图55D、图56A和图56B所示。迂回或蜿蜒路径可包括在穿过通道的流体的流动方向上的一个或多个弯曲。在一些实施方案中，迂回或蜿蜒路径可包括约90°的弯曲。在一些实施方案中，迂回或蜿蜒路径可包括介与约45°与约135°之间的至少一个弯曲。在一些实施方案中，迂回或蜿蜒路径可包括介与约80°与约100°之间的至少一个弯曲。在一些实施方案中，迂回或蜿蜒路径可包括介与约85°与约95°之间的至少一个弯曲。在一些实施方案中，阻力通道可基本上包含在平面内(例如，阻力通道在二维中可以是有角度的、迂回的或蜿蜒的)。二维阻力通道可基本上定位在本公开的微流体装置的单层内。在一些实施方案中，阻力通道可以是三维阻力通道(例如，阻力通道在微流体装置的x、y和z维度上可以是有角度的、迂回的或蜿蜒的)。在一些实施方案中，阻力通道的样品输入可在与阻力通道、连接至阻力通道的腔室或两者相同的平面中(例如，在z方向上的同一水平面)。在一些实施方案中，阻力通道的样品输入可在与阻力通道、连接至阻力通道的腔室或两者不同的平面中(例如，在z方向上的不同水平面)。阻力通道的实例示于图60中。在一些实施方案中，阻力通道可具有约300μm的宽度。在一些实施方案中，阻力通道可具有约10μm至约100μm、约50μm至约100μm、约100μm至约200μm、约100μm至约300μm、约100μm至约400μm、约100μm至约500μm、约200μm至约300μm、约200μm至约400μm、约200μm至约500μm、约200μm至约600μm、约200μm至约700μm、约200μm至约800μm、约200μm至约900μm或约200μm至约1000μm的宽度。
在一些实施方案中，通道可以是样品计量通道。样品计量通道可在第一腔室与第二腔室之间形成路径并且具有被配置为容纳设定体积的流体以计量从第一腔室转移至第二腔室的流体的容积的通道容积。样品计量路径可在第一腔室与第二腔室之间形成路径并且具有被配置为允许以所需的速率从第一通道流动至第二通道的通道容积。计量也可能受到施加至充当液体试剂储存储库的辅助腔室的正压或负压的影响。这也可通过将空气储存在用于低成本应用的泡罩包装中来实现。样品计量通道的实例示于图60中。在一些实施方案中，样品计量通道的样品输入可在与样品计量通道、连接至样品计量通道的腔室或两者相同的平面中(例如，在z方向上的同一水平面)。在一些实施方案中，样品计量通道的样品输入可在与样品计量通道、连接至样品计量通道的腔室或两者不同的平面中(例如，在z方向上的不同水平面)。样品计量通道的长度、宽度、体积或它们的组合可被设计成将所需体积的流体从第一腔室传递至第二腔室。样品计量通道的长度、宽度、体积或它们的组合可被设计成以所需速率将来自第一腔室的流体传递至第二腔室。在一些实施方案中，样品计量通道可具有约300μm的宽度。在一些实施方案中，样品计量通道可具有约10μm至约100μm、约50μm至约100μm、约100μm至约200μm、约100μm至约300μm、约100μm至约400μm、约100μm至约500μm、约200μm至约300μm、约200μm至约400μm、约200μm至约500μm、约200μm至约600μm、约200μm至约700μm、约200μm至约800μm、约200μm至约900μm或约200μm至约1000μm的宽度。在一些实施方案中，第一腔室可通过包括阻力通道和样品计量通道的通道连接至第二腔室。
阻力通道的示意性实例示于图133中。阀座可具有约142μm的减小高度并且阀具有约2μL的死体积。阀可定位在与样品计量通道不同的平面上，以使阀座高度和死体积最小化并改善密封。DETECTR样品计量入口可位于与样品计量通道不同的水平面上，使得样品以不同的高度进入通道，以防止扩增的样品进入或回流。与高度为142μm且占用面积为约0.142mm x 0.75mm x 46mm的通道相比，样品计量通道可具有约784μm的增加高度以容纳5μL的占用面积为约0.784mm x 0.75mm x 8.25mm的计量样品。DETECTR样品检测孔入口可位于与混合孔不同的水平面上，使得DETECTR样品在不同水平面进入检测孔，以减少横截面积并减少回流。
微流体装置可包括被配置为将试剂接收到装置中(例如，到装置的腔室中)的一个或多个试剂端口。试剂端口可包括腔室的壁中的开口。试剂端口可包括通道的壁或通道的末端中的开口。被配置为接收样品的试剂端口可以是样品入口端口。可通过试剂端口将试剂(例如，缓冲液、溶液或样品)引入微流体装置中。试剂可由用户(例如，人用户)手动引入，或者试剂可由机器(例如，通过检测歧管)自动引入。
在本公开的盒中可使用多种腔室形状。腔室可以是圆形的，例如图55A和图55C中所示的扩增室、检测室和检测试剂储库。腔室可以是细长的，例如图55B、图55D、图56A、图56B、图56C和图56D中所示的扩增室和检测试剂储库。
阀可被配置成防止、调控或允许流体从第一腔室流动至一个或多个另外的腔室。在一些实施方案中，阀可从第一位置旋转至第二位置以防止、允许或改变流体流动路径。在一些实施方案中，阀可从第一位置滑动至第二位置以防止、允许或改变流体流动路径。在一些实施方案中，阀可基于施加至阀的压力而打开或关闭。在一些实施方案中，阀可以是弹性体阀。阀可以是主动阀(机械、非机械或外部致动)或被动阀(机械或非机械)。可以电子方式控制阀。例如，可使用螺线管来控制阀。在一些实施方案中，可手动控制阀。其他控制机制可以是：磁、电、压电、热、双稳态、电化学、相变、流变、气动、止回阀调或毛细作用。在一些实施方案中，阀可以是一次性的。例如，可从微流体装置中移除阀并用新的阀更换以防止在重复使用微流体装置时的污染。
盒可被配置为连接至第一泵以将流体从扩增室泵送至检测室，并连接至第二泵以将流体从检测试剂储库泵送至检测室。本领域已知的多种泵用于将流体从第一腔室移动至第二腔室并且可与本公开的盒一起使用。在一些实施方案中，盒可与蠕动泵、气动泵、液压泵或注射泵一起使用。
微流体盒的实例在图54A和图54B中示出。如图54A所示，盒可含有扩增室和能够储存约45μL的水性反应混合物的样品入口孔，用户向所述样品入口孔添加约5μL的样品。扩增室可被密封。泵进气口将盒接口连接至外部小容量低功率泵，以用于溶液控制。板上(on-board)盒阀可被配置为在加热步骤期间和压力增大期间含有扩增混合物。盒可含有扩增混合分离器以分离进入的扩增反应混合物，并允许泵将约5μL直接分配至检测室。双检测室可通过疏水性PTFE排气口进行排气，以允许溶液进入，具有用于成像和检测的透明顶部，并且可在反应期间加热至37℃持续10分钟。在一些实施方案中，检测室的大小可被设定为使得扩增的样品混合物在与来自检测试剂储存室的检测试剂组合时填充检测室。DETECTR反应混合物储存孔(也称为检测试剂储存室)可在所述盒板上储存约100μL的水性DETECTR混合物。泵进气口将盒接口连接至外部小容量低功率泵，以用于溶液控制。如图54B所示，盒可含有盒供气阀，并且入口位于水性试剂上方以防止溢出。被动试剂填充阻挡件形成曲折路径，并具有静水压头以在填充后被动防止水溶液流入盒中。板上弹性体阀防止加热至65℃的反应混合物在压力积聚下向前流动，并由低成本、占用面积小的线性致动器致动。
在一些实施方案中，装置可包括用激光压印图案化的多层层压盒，以及具有集成电子器件、光学器件和机械部件的硬件，如图57B所示。多层装置可通过二维层压来制造，如图58B(左)所示。在一些实施方案中，装置可以是注塑模制的。可将注塑模制装置层压以密封装置，如图58B(右)所示。注塑模制可用于本公开的微流体装置的大批量生产。
检测歧管。检测歧管可用于在本公开的装置中执行和检测本公开的DETECTR测定。检测歧管在本文中也可称为盒歧管或加热歧管。检测歧管可被配置为促进或检测在本公开的微流体装置中进行的DETECTR反应。在一些实施方案中，检测歧管可包括一个或多个加热区以加热微流体装置的一个或多个区域。在一些实施方案中，检测歧管可包括第一加热区以加热其中进行扩增反应的微流体装置的第一区域。例如，第一加热器可将微流体装置的第一区域加热至约60℃。在一些实施方案中，检测歧管可包括第二加热区以加热其中进行扩增反应的微流体装置的第二区域。例如，第二加热器可将微流体装置的第二区域加热至约37℃。在一些实施方案中，检测歧管可包括第三加热区以加热其中进行裂解反应的微流体装置的第三区域。例如，第三加热器可将微流体装置的第三区域加热至约95℃。包括用于与微流体盒一起使用的两个绝缘加热区的检测歧管的实例在图58A中示出。在一些实施方案中，检测歧管可包括被配置为加热本公开的微流体装置的裂解区域的加热区。包括裂解加热区、扩增加热区和检测加热区的检测歧管的实例在图59A和图59B中示出。检测歧管可被配置为与包括裂解室、扩增室和检测室的微流体装置相容。
在一些实施方案中，检测歧管可包括被配置为照明微流体装置的检测室的照明源。照明源可被配置为发射窄谱照明(例如，LED)，或者照明可被配置为发射广谱照明(例如，弧光灯)。检测歧管还可包括一个或多个滤波器或光栅以过滤所需的照明波长。在一些实施方案中，照明源可被配置为通过微流体装置的顶面照明检测室(例如，包括DETECTR反应的室)。在一些实施方案中，照明源可被配置为通过微流体装置的侧表面照明检测室。在一些实施方案中，照明源可被配置为通过微流体装置的底表面照明检测室。在一些实施方案中，检测歧管可包括用于检测由DETECTR反应产生的信号的传感器。信号可以是荧光信号。例如，检测歧管可包括照相机(例如，电荷耦合装置(CCD)、互补金属氧化物-半导体(CMOS))或光电二极管。检测歧管的示意性实例在图63A和图63B中示出。在检测歧管中照明的检测室的实例在图64A中示出。
检测歧管可包括被配置为控制温度、泵、阀、照明源或传感器中的一者或多者的电子器件。在一些实施方案中，可使用程序自主控制电子器件。例如，可自主控制电子器件以实现本公开的工作流程(例如，图61中提供的工作流程。电子器件布局的示意性实例提供于图62中。电子器件可使用功率控制、温度反馈或PID回路中的一者或多者来控制一个或多个加热器。泵、阀(例如，电磁控制阀)或LED(例如，蓝色LED)中的一者或多者可由功率变换器(例如，3V、12V或9V功率变换器)或功率继电器板中的一者或多者控制。逻辑板可用于控制检测歧管的一个或多个元件。检测歧管可包括一个或多个指示器灯以指示一个或多个元件(例如，LED、加热器、泵或阀)的状态。本章节中描述的装置可与本文公开的任何其他特征(例如，气动阀、通过使用滑动阀操作的部件或本文公开的装置的任何其他一般特征)组合。
在一些情况下，检测或可视化可包括由二极管产生光。在一些情况下，二极管可产生可见光。在一些情况下，二极管可产生红外光。在一些情况下，二极管可产生紫外光。在一些情况下，二极管可能能够产生不同波长或光谱的光。二极管可产生广谱或窄谱的光。二极管可产生覆盖大部分可见光谱的白光。二极管可产生特定波长的光(例如，大约高斯或洛伦兹波长对比以约特定波长为中心的强度分布)。在一些情况下，由二极管产生的光的带宽可定义为类高斯或类洛伦兹带的半峰强度处的全宽度。一些二极管产生具有窄发射带宽的光。二极管可产生具有小于1nm带宽的光。二极管可产生具有小于5nm带宽的光。二极管可产生具有小于10nm带宽的光。二极管可产生具有小于20nm带宽的光。二极管可产生具有小于30nm带宽的光。二极管可产生具有小于50nm带宽的光。二极管可产生具有小于100nm带宽的光。
在一些情况下，检测或可视化可包括通过二极管进行的光检测。由二极管产生的电流可用于确定吸收的光的特性，包括偏振、波长、强度、行进方向、原点或它们的任何组合。
在一些情况下，二极管阵列可用于激发和检测来自样品的荧光。在一些情况下，装置可包括被定位成照明和检测来自样品的特定部分的光的发光二极管和检测器二极管。在一些情况下，装置可包括被定位成照明和检测来自特定样品隔室或腔室的光的发光二极管和检测器二极管。
工作流程。可使用许多不同的工作流程在微流体装置中进行DETECTR反应。在一些实施方案中，用于测量口腔拭子样品的工作流程可包括擦拭脸颊、将拭子添加至裂解溶液、孵育所述拭子以裂解样品、将经裂解的样品与用于扩增靶核酸的试剂混合、将经扩增的样品与DETCTR试剂合并以及孵育所述样品以检测靶核酸。在一些实施方案中，裂解、扩增和检测中的一者或多者可在微流体装置(例如，图53A-B、图54A-B、图55A-D、图56A-D、图57A、图60、图75、图76或图82–图92中所示的微流体盒)中进行。在一些实施方案中，工作流程可包括使用检测歧管(例如，图136A-B、图64B、图65、图81、图93或图97中所示的检测歧管)测量指示靶核酸的存在或不存在的可检测信号。
用于检测靶核酸的工作流程的实例提供于图61中。盒可负载有样品和反应溶液。可将扩增室加热至60℃，并且可将样品在扩增室中孵育30分钟。可将经扩增的样品泵送至DETECTR反应室，并且可将DETECTR试剂泵送至DETECTR反应室。可将DETECTR反应室加热至37℃，并且可将样品孵育30分钟。可实时测量DETECTR反应室中的荧光以产生定量结果。
用于检测靶核酸(例如，病毒靶核酸)的工作流程的实例可包括擦拭受试者的脸颊。可将拭子添加至约200μL的低pH溶液中。在一些实施方案中，拭子可置换溶液，使得总体积为约220μL。可将拭子在低pH溶液中孵育约一分钟。在一些实施方案中，可使存在于拭子上的细胞或病毒衣壳在低pH溶液中裂解。可将样品的一部分(5μL)在扩增室中与约45μL的扩增溶液合并。所述室内的总体积可以是约50μL。可将样品在扩增室中在约50℃至约65℃的温度下孵育至多约30分钟以扩增所述样品中的靶核酸。在一些实施方案中，各自约5μL的经扩增样品的两个等分试样可被引导至两个检测室，在所述检测室中它们与各自约95μL的DETECTR反应混合物合并。可将经扩增的样品可在两个检测室中的每一个中在约37℃下与DETECTR反应混合物孵育至多约10分钟，以检测靶核酸的存在或不存在。
在一些实施方案中，用于在微流体装置中进行的DETECTR反应的工作流程可由用户实施。用户可从受试者收集样品(例如，口腔拭子或鼻拭子)，将所述样品置于裂解缓冲液中，将经裂解的样品添加至本公开的微流体盒中，并将所述盒***本公开的检测歧管中。在一些实施方案中，用户可将未裂解的样品添加至微流体盒中。在一些实施方案中，用于DETECTR反应的工作流程可在本公开的微流体盒中实施。微流体盒可在一个或多个腔室中包括一种或多种试剂以促进样品中的靶核酸的裂解、扩增或检测中的一者或多者。在一些实施方案中，检测歧管可促进在微流体装置中进行的DETECTR反应的工作流程。检测歧管可提供扩增反应、检测反应或两者的加热控制、溶液移动控制(例如，泵控制或阀控制)、照明或检测中的一者或多者。
在一些实施方案中，在微流体盒中进行并由用户和检测歧管促进的DETECTR的工作流程可包括以下步骤：1)用户将样品负载到包括一种或多种试剂的盒中，2)用户将盒***检测歧管中并按下启动按钮，3)歧管使螺线管通电以关闭扩增室与检测室之间的阀，4)歧管指示器LED打开，5)歧管打开第一加热器以将第一加热区加热至60℃和第二加热器以将第二加热区加热至37℃，5)在第一加热区中将样品在扩增室中孵育30分钟以使样品扩增，6)歧管关闭第一加热器，7)歧管使螺线管断电以打开阀，8)歧管打开第一泵15秒以将经扩增的样品泵送至检测室，9)歧管关闭第一泵，10)歧管打开第二泵15秒以将来自检测试剂储存室的检测试剂泵送至所述检测室，11)歧管关闭第二泵，12)在第二加热区中将经扩增的样品和检测试剂在检测室中孵育30分钟以进行检测反应，13)歧管指示器LED关闭，14)歧管打开照明源并测量由检测反应产生的可检测信号。
可在微流体装置(例如图84中所示的微流体装置)中进行并通过检测歧管(例如图93中所示的检测歧管)促进的工作流程的实例可包括以下步骤：1)在阀V1-V18关闭、加热器1关闭并且加热器2关闭的情况下，将含有样品的拭子添加至腔室C2；2)折断拭子的末端并关闭装置的盖子；3)通过打开阀V1将拭子悬浮在裂解溶液中，以促进裂解溶液从腔室C1流动至腔室C2；4)通过打开阀V2计量从腔室C2到腔室C7-C10中的每个的约20μL裂解物，并通过打开阀V3-V6与来自腔室C3-C6的内容物混合；5)关闭所有阀并打开加热器1以在腔室C7-C10中在60℃下孵育样品以进行扩增；6)关闭加热器1，将约10μL扩增子从腔室C7-C10(来自每个腔室2x10μL)计量到腔室C19-C26中的每一个中，并通过打开阀V7-V18与来自腔室C11-C18中的每个的内容物合并；7)关闭所有阀并打开加热器2以将样品在腔室C19-C26中在37℃下孵育来进行CRISPR检测反应；8)在步骤7的孵育过程中，通过在470nm下照明和在520nm下检测来检测腔室C19-C26中的样品。
在一些实施方案中，在微流体装置中进行的工作流程可包括将样品分配到两个或更多个腔室中。装置可被配置为将样品分配成多个部分。装置可被配置为将分配的样品的两个部分转移至单独的流体通道或腔室中。装置可被配置为将样品的多个部分转移至多个不同的流体通道或腔室中。装置可被配置为对分配的样品的各个部分进行反应。装置可被配置为将样品分配成2个部分。装置可被配置为将样品分配成3个部分。装置可被配置为将样品分配成4个部分。装置可被配置为将样品分配成5个部分。装置可被配置为将样品分配成6个部分。装置可被配置为将样品分配成7个部分。装置可被配置为将样品分配成8个部分。装置可被配置为将样品分配成9个部分。装置可被配置为将样品分配成10个部分。装置可被配置为将样品分配成12个部分。装置可被配置为将样品分配成15个部分。装置可被配置为将样品分成至少20个部分。装置可被配置为将样品分配成至少50个部分。装置可被配置为将样品分配成100个部分。装置可被配置为将样品分配成500个部分。
装置可被配置为对样品的第一部分进行第一反应并且对分配的样品的第二部分进行第二反应。装置可被配置为对分配的样品的每个部分进行不同的反应。装置可被配置为对样品或样品的一部分进行顺序反应。装置可被配置为对样品或样品的一部分在第一腔室中进行第一反应和在第二腔室中进行第二反应。
装置可被配置为将样品与试剂混合。在一些情况下，装置通过使样品和试剂在多个隔室之间来回流动而使样品与试剂混合。在一些情况下，装置通过将样品和试剂级联至单个隔室中来使样品与试剂混合(例如，通过使样品和试剂两者从上方流动到隔室中)。在一些情况下，由装置进行的混合方法使气泡的形成最小化。在一些情况下，由装置进行的混合方法使样品损失或损坏(例如，蛋白质沉淀)最小化。
装置可被配置为对样品的多个部分进行多个反应。在一些情况下，装置包括多个腔室，每个腔室均包含试剂。在一些情况下，多个包含试剂的腔室中的两个腔室包含不同的试剂。在一些情况下，可使样品的第一部分和第二部分经受不同反应。在一些情况下，可在不同报告分子存在下使样品的第一部分和第二部分经受相同反应。在一些情况下，可使样品的第一部分和第二部分经受相同的检测方法。在一些情况下，可使样品的第一部分和第二部分经受不同的检测方法。在一些情况下，可单独检测样品的多个部分(例如，通过单独激发和检测来自样品的每个部分的荧光的二极管阵列)。在一些情况下，可同时检测样品的多个部分。例如，装置可将单个样品分配成4个部分，对每个部分进行不同的扩增反应，将每个扩增反应的产物分配成两个部分，对每个部分进行不同的DETECTR反应，并单独地测量每个DETECTR反应的进度。
装置可被配置成为大量不同反应或反应序列分配少量样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于1ml的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于800μl的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于600μl的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于400μl的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于200μl的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于100μl的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于50μl的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于1mg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于800μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于600μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于400μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于200μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于100μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于50μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于20μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于10μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于1μg的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于800ng的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于600ng的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于400ng的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于200ng的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于100ng的样品。在一些情况下，装置可为多个不同的反应或反应序列分配少于50ng的样品。在一些情况下，样品可包含核酸。在一些情况下，样品可包含细胞。在一些情况下，样品可包含蛋白质。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括2个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括3个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括4个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括5个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括10个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括20个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括50个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括100个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括500个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，多个不同的反应或反应序列可包括1000个或更多个不同的反应或反应序列。在一些情况下，第一反应或反应序列和第二反应或反应序列检测两个不同的核酸序列。在一些情况下，多个不同反应或反应序列中的每个反应或反应序列检测不同的核酸序列。例如，装置可被配置为进行40种不同的反应序列，所述反应序列被设计成检测来自包含200ng DNA(例如，来自口腔拭子的200ng DNA)的单个样品的40个不同的核酸序列。在这种情况下，40个不同的核酸序列中的每一个都可用于确定样品中特定病毒的存在。
在一些情况下，装置被配置为使步骤自动化。在一些情况下，装置使样品分配步骤自动化。在一些情况下，装置使反应步骤自动化(例如，通过将样品与试剂混合并加热至一定温度持续限定时间长度)。在一些情况下，装置在样品输入后使每个步骤自动化。在一些情况下，装置可使对单个输入样品的多个反应自动化。在一些情况下，装置可使对单个输入样品的多个反应自动化，检测并提供所述多个反应的结果。在一些情况下，装置可在不到2小时内使对单个样品的多个反应自动化，检测并提供所述多个反应的结果。例如，装置可在不到2小时内使对包含400ng DNA的样品的100个单独扩增和DETECTR反应自动化，检测且然后提供所述反应的结果。在一些情况下，装置可在不到1小时内使对单个样品的多个反应自动化，检测并提供所述多个反应的结果。在一些情况下，装置可在不到40分钟内使对单个样品的多个反应自动化，检测并提供所述多个反应的结果。在一些情况下，装置可在不到20分钟内使对单个样品的多个反应自动化，检测并提供所述多个反应的结果。在一些情况下，装置可在不到10分钟内使对单个样品的多个反应自动化，检测并提供所述多个反应的结果。在一些情况下，装置可在不到5分钟内使对单个样品的多个反应自动化，检测并提供所述多个反应的结果。在一些情况下，装置可在不到2分钟内使对单个样品的多个反应自动化，检测并提供所述多个反应的结果。
用于检测病毒感染的微流体装置和检测歧管。本公开的微流体装置(例如，图53A-B、图54A-B、图55A-D、图56A-D、图57A、图60、图76、图79或图82–图92中所示的微流体装置)可用于检测生物样品中冠状病毒(例如，SARS-CoV-2病毒、SARS-CoV病毒、MERS-CoV病毒或它们的组合，或任何冠状病毒株与一种或多种其他病毒或细菌的组合)的存在或不存在。可通过检测歧管(例如，图63A-B、图64B、图65、图81、图93或图97中所示的检测歧管)促进对冠状病毒的检测。可例如通过鼻拭子或口腔拭子从受试者收集生物样品，并将所述生物样品引入微流体装置的扩增室中。所述腔室可包括裂解缓冲液、扩增试剂或两者。在一些实施方案中，可使生物样品在引入扩增室之前与裂解缓冲液接触。在一些实施方案中，可将扩增试剂从扩增试剂储存室引入扩增室中。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者来控制扩增试剂的引入。扩增试剂可包含用于扩增存在于冠状病毒基因组中的靶核酸的引物。如果样品中存在靶核酸，则可扩增靶核酸(例如，通过TMA、HDA、cHDA、SDA、LAMP、EXPAR、RCA、LCR、SMART、SPIA、MDA、NASBA、HIP、NEAR或IMDA)。可通过检测歧管加热第一腔室。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者来将经扩增的样品引入检测室中。经扩增的样品可穿过样品计量通道。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者将检测试剂从检测试剂储存室引入检测通道中。检测试剂可穿过样品计量通道、阻力通道或两者。检测试剂可包含可编程核酸酶、针对靶核酸的引导核酸和标记的检测剂核酸。可通过经由检测歧管加热检测通道而在检测通道中进行检测反应。可使用检测歧管在检测通道中检测与冠状病毒相关的靶核酸的存在或不存在。可通过测量由可编程核酸酶在与靶核酸结合后对检测剂核酸的裂解产生的可检测信号来确定冠状病毒的存在或不存在。
本公开的微流体装置(例如，图53A-B、图54A-B、图55A-D、图56A-D、图57A、图60、图76、图79或图82-图92中所示的微流体装置)可用于检测生物样品中的流感病毒(例如甲型流感病毒或乙型流感病毒)的存在或不存在。可通过检测歧管(例如，图63A-B、图64B、图65、图81、图93或图97中所示的检测歧管)促进对冠状病毒的检测。可例如通过鼻拭子或口腔拭子从受试者收集生物样品，并将所述生物样品引入微流体装置的扩增室中。所述腔室可包括裂解缓冲液、扩增试剂或两者。在一些实施方案中，可使生物样品在引入扩增室之前与裂解缓冲液接触。在一些实施方案中，可将扩增试剂从扩增试剂储存室引入扩增室中。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者来控制扩增试剂的引入。扩增试剂可包含用于扩增存在于流感病毒基因组中的靶核酸的引物。如果样品中存在靶核酸，则可扩增靶核酸(例如，通过TMA、HDA、cHDA、SDA、LAMP、EXPAR、RCA、LCR、SMART、SPIA、MDA、NASBA、HIP、NEAR或IMDA)。可通过检测歧管加热第一腔室。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者来将经扩增的样品引入检测室中。经扩增的样品可穿过样品计量通道。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者将检测试剂从检测试剂储存室引入检测通道中。检测试剂可穿过样品计量通道、阻力通道或两者。检测试剂可包含可编程核酸酶、针对靶核酸的引导核酸和标记的检测剂核酸。可通过经由检测歧管加热检测通道而在检测通道中进行检测反应。可使用检测歧管在检测通道中检测与流感病毒相关的靶核酸的存在或不存在。可通过测量由可编程核酸酶在与靶核酸结合时对检测剂核酸的裂解产生的可检测信号来确定流感病毒的存在或不存在。
本公开的微流体装置(例如，图53A-B、图54A-B、图55A-D、图56A-D、图57A、图60、图76、图79或图82–图92中所示的微流体装置)可用于检测生物样品中的呼吸道合胞病毒的存在或不存在。可通过检测歧管(例如，图63A-B、图64B、图65、图81、图93或图97中所示的检测歧管)促进对呼吸道合胞病毒的检测。可例如通过鼻拭子或口腔拭子从受试者收集生物样品，并将所述生物样品引入微流体装置的扩增室中。所述腔室可包括裂解缓冲液、扩增试剂或两者。在一些实施方案中，可使生物样品在引入扩增室之前与裂解缓冲液接触。在一些实施方案中，可将扩增试剂从扩增试剂储存室引入扩增室中。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者来控制扩增试剂的引入。扩增试剂可包含用于扩增存在于呼吸道合胞病毒基因组中的靶核酸的引物。如果样品中存在靶核酸，则可扩增靶核酸(例如，通过TMA、HDA、cHDA、SDA、LAMP、EXPAR、RCA、LCR、SMART、SPIA、MDA、NASBA、HIP、NEAR或IMDA)。可通过检测歧管加热第一腔室。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者来将经扩增的样品引入检测室中。经扩增的样品可穿过样品计量通道。可通过经由检测歧管致动泵、阀或两者将检测试剂从检测试剂储存室引入检测通道中。检测试剂可穿过样品计量通道、阻力通道或两者。检测试剂可包含可编程核酸酶、针对靶核酸的引导核酸和标记的检测剂核酸。可通过经由检测歧管加热检测通道而在检测通道中进行检测反应。可使用检测歧管在检测通道中检测与呼吸道合胞病毒相关的靶核酸的存在或不存在。可通过测量由可编程核酸酶在与靶核酸结合后对检测剂核酸的裂解产生的可检测信号来确定呼吸道合胞病毒的存在或不存在。
试剂盒
本文公开了用于检测靶核酸的试剂盒、试剂、方法和***。靶核酸可来自冠状病毒，如SARS-CoV-2、229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、MERS-CoV或SARS-CoV。在一些实施方案中，靶核酸来自SARS-CoV-2冠状病毒。可使用本文公开和如本文所述的试剂盒中使用的组合物和方法测定SARS-CoV-2的任何核酸。在一些实施方案中，靶核酸包含冠状病毒的N基因或E基因，并且可使用本文公开和如本文所述的试剂盒中使用的组合物和方法进行测定。在一些实施方案中，试剂盒包括试剂和载体介质。试剂可提供在试剂室中或提供在载体介质上。可替代地，试剂可由使用试剂盒的个体放入试剂室或载体介质中。任选地，试剂盒还包括缓冲液和滴管。试剂室是测试孔或容器。试剂室的开口可大到足以容纳载体介质。缓冲液可提供在滴瓶中，以便于分配。滴管可以是一次性的并转移固定体积。滴管可用于将样品放入试剂室中或载体介质上。
在一些实施方案中，用于检测靶核酸的试剂盒包括载体介质；靶向靶核酸区段的引导核酸；当与所述引导核酸和所述靶核酸区段复合时能够被激活的可编程核酸酶；以及包含检测部分的单链检测剂核酸，其中所述检测剂核酸能够被激活的核酸酶裂解，从而产生第一可检测信号。
在一些实施方案中，用于检测靶核酸的试剂盒包括PCR板；靶向靶核酸区段的引导核酸；当与所述引导核酸和所述靶核酸区段复合时能够被激活的可编程核酸酶；以及包含检测部分的单链检测剂核酸，其中所述检测剂核酸能够被激活的核酸酶裂解，从而产生第一可检测信号。PCR板的孔可预先等分有靶向靶核酸区段的引导核酸、当与所述引导核酸和靶序列复合时能够被激活的可编程核酸酶以及至少一个包含检测部分的单链检测剂核酸群体。因此，用户可将目标生物样品添加至预先等分的PCR板的孔中，并使用荧光读取仪或可见光读取仪测量可检测信号。
在一些情况下，此类试剂盒可包括包装、载体或容器，所述包装、载体或容器被划分以接收一个或多个容器，如小瓶、管等，每个容器包括待用于本文所述的方法中的单独元件之一。合适的容器包括例如测试孔、瓶、小瓶和试管。在一个实施方案中，容器由诸如玻璃、塑料或聚合物的多种材料形成。
本文所述的试剂盒或***含有包装材料。包装材料的实例包括但不限于，小袋(pouch)、泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶和适用于预期使用模式的任何包装材料。
试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明的标签，以及带有使用说明的包装插页。通常还将包括一组说明。在一个实施方案中，标签在容器上或与容器相关联。在一些情况下，当形成标签的字母、数字或其他字符被附接、模制或蚀刻至容器本身内时，标签在容器上；当标签例如作为包装插页存在于也容纳有容器的贮器或载体内时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用于指示内容物将用于特定治疗应用。标签还指示内容物(如在本文所述的方法中)的使用说明。
在将成型产品包装并包裹或装箱以保持无菌屏障后，可通过热灭菌、气体灭菌、伽马辐射或电子束灭菌对产品进行最终灭菌。可替代地，可通过无菌加工制备和包装产品。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本说明书以及随附权利要求中所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数提及形式。除非另有说明，否则本文对“或(or)”的任何提及意图涵盖“和/或(and/or)”。
当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于所述系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等效于大于或等于1、大于或等于2或大于或等于3。
当术语“不大于”、“小于”、“小于或等于”或“至多”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”或“至多”适用于所述系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等效于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。
在将值描述为范围的情况下，应理解，这种公开内容包括在此类范围内的所有可能的子范围的公开内容，以及落入此类范围内的特定数值，而不管特定数值或特定子范围是否明确说明。
实施例
以下实施例是说明性的并且不限制本文所述的装置、方法、试剂、***和试剂盒的范围。
实施例1
用于检测冠状病毒的RT-LAMP DETECTR反应
此实施例描述用于检测冠状病毒的RT-LAMP DETECTR反应。使用从GISAID获得的所有可用基因组设计SARS-CoV-2靶序列。简言之，使用Clustal Omega比对病毒基因组。接下来，将SARS-CoV-2基因组上的LbCas12a靶位点针对SARS-CoV、两种蝙蝠-SARS样-CoV基因组和常见人冠状病毒基因组进行过滤。最后将相容的靶位点与来自CDC和WHO的当前方案中使用的那些进行比较。使用PrimerExplorer v5(https://primerexplorer.jp/e/)针对N-基因和E-基因区域设计了用于SARS-CoV-2的LAMP引物。图39A示出了三种冠状病毒株的N-基因gRNA所靶向的靶位点的序列比对。N基因gRNA#1与CDC-N2扩增子相容，N基因gRNA#2与WHO N-Sarbeco扩增子相容。图39B示出了三种冠状病毒株的E-基因gRNA所靶向的靶位点的序列比对。所测试的两种E基因gRNA(E基因gRNA#1和E基因gRNA#2)与WHO E-Sarbeco扩增子相容。RNA酶P POP7引物最初由Curtis等人(2018)公开，并且设计了相容的gRNA以与这些引物组一起起作用。
靶RNA是由目标病毒基因的合成基因片段产生的。首先，使用含有T7启动子的正向引物对合成基因片段进行PCR步骤。接下来，将PCR产物用作在37℃下持续2小时的体外转录(IVT)反应的模板。然后在37℃下用TURBO DNA酶(Thermo)处理IVT反应30分钟，然后是75℃下的热变性步骤15分钟。使用RNA Clean and Concentrator 5柱(Zymo Research)纯化RNA。通过Nanodrop和Qubit对RNA进行定量，并在无核酸酶水中稀释至工作浓度。
使用RT-LAMP用于预扩增病毒或对照RNA靶标和用于反式裂解测定的LbCas12a进行DETECTR测定。RT-LAMP被制备为具有6.5mM的MgSO4浓度和10μL的最终体积。以对于F3和B3为0.2μM、对于FIP和BIP为1.6μM且对于LF和LB为0.8μM的最终浓度添加LAMP引物。在62℃下使用2μL输入RNA对N-基因、E-基因和RNA酶P独立进行反应持续20分钟。
对于LbCas12a(SEQ ID NO:18)反式裂解，在37℃下将50nM LbCas12a(可从NEB获得)与62.5nM gRNA在1X NEBuffer 2.1中预孵育30分钟。在形成RNA-蛋白质复合物后，将侧流裂解报告子(/56-FAM/TTATTATT/3Bio/，IDT)以500nM最终浓度添加至反应中。RNA-蛋白质复合物立即使用或在使用前在4℃下储存至多24小时。
完成预扩增步骤后，将2μL的扩增子与18μL的LbCas12a-gRNA复合物和80μL的1XNEBuffer 2.1合并。允许100μL LbCas12a反式裂解测定在37℃下进行10分钟。
然后将侧流条(Milenia HybriDetect 1，TwistDx)添加至反应管中，并在大约2-3分钟后可视化结果。靠近样品施加垫的单一条带指示阴性结果，而靠近条顶部的单一条带或两个条带指示阳性结果。
使用如上所述的RT-LAMP方法进行患者优化的DETECTR测定，进行了以下修改：在反应中包括DNA结合染料SYTO9(Thermo Fisher Scientific)以监测扩增反应，并将孵育时间延长至30分钟以从低滴度样品中捕获数据。
如上所述进行基于荧光的患者优化的LbCas12a反式裂解测定，进行了修改；将40nM LbCas12a与40nM gRNA预孵育，然后将100nM的与在SYTO9染料(/5Alex594N/TTATTATT/3IAbRQSp/)存在下的检测相容的荧光报告分子添加至复合物中。将2μL的扩增子与18μL的LbCas12a-gRNA复合物在黑色384孔测定板中合并，并使用Tecan读板仪监测荧光。
实施例2
用于扩增SARS-CoV-2靶位点的引物组的筛选
此实施例描述用于扩增SARS-CoV-2靶位点的引物组的筛选。使用不同的LAMP引物组(组1至组11)扩增对应于病毒N-基因的冠状病毒RNA基因组区域。用每个引物组扩增含有1.5pM、5fM或0fM SARS-CoV-2 RNA的样品。使用热启动逆转录酶(“Warmstart RTx”)对每个样品中的SARS-CoV-2 RNA进行逆转录，并使用Bst 2.0DNA聚合酶扩增LAMP。所述测定在60摄氏度下进行60分钟。图1示意性地示出使用RT-LAMP和Cas12 DETECTR反应制备和检测样品的步骤。图22示出了使用逆转录和环介导等温扩增(RT-LAMP)及Cas12检测进行的冠状病毒检测的技术规范和测定条件。
对每个经扩增的样品进行DETECTR测定，并确定获得结果的时间。使用对应于针对SARS-CoV-2的N-基因的R1763的gRNA序列和对应于LbCas12a的Cas12可编程核酸酶检测序列。对于所有测试的引物组，DETECTR测定对经扩增的SARS-CoV-2靶序列均灵敏。此实施例中使用的gRNA的序列提供于表6中。图2示出了用不同引物组(“2019-nCoV-组1”至“2019-nCoV-组12”)扩增并使用LbCas12a和针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(“R1763，”SEQ IDNO:171)检测的SARS-CoV-2 N-基因的DETECTR测定结果。较短时间来获得结果指示阳性结果。对于所有引物组，对于具有更多靶序列的样品获得结果的时间较短，从而表明所述测定对靶序列灵敏。图3示出了对于0fM和5fM样品，图2中绘制的DETECTR反应的单独迹线。在每个图中，0fM迹线在基线上方不可见，从而表明几乎没有至没有非特异性检测。用于R1763(SEQ ID NO:171)的表现最佳的引物组是SARS-CoV-2-N-组1。在所测试的浓度下检测时间少于10分钟。
在第二测定中，引物组针对Sarbeco的E-基因(用gRNA R1764和R1765检测)和Sarbeco的N-基因(用R1767检测)。图4示出了对含有N-基因、E-基因或无靶标(“NTC”)的样品的DETECTR反应的获得结果的时间。使用针对SARS-CoV-2的E-基因的引物组(“2019-nCoV-E-组13”至“2019-nCoV-E-组20”)或针对SARS-CoV-2的N-基因的引物组(“2019-nCoV-N-组21”至“2019-nCoV-N-组24”)对样品进行扩增。靶位点序列提供于表7中。表现最佳的引物组是SARS-CoV-2-E-组14。使用R1767 N-基因gRNA(SEQ ID NO:175)检测SARS-CoV-2 N-基因的存在，并且使用R1764 E-基因gRNA(SEQ ID NO:172)或R1765 E-基因gRNA(SEQ IDNO:173)检测SARS-CoV-2 E-基因的存在。
还测试了用于扩增RNA酶P的对照引物组。图7示出了使用POP7样品引物组扩增RNA酶P。使用LAMP扩增样品。使用针对RNA酶P的gRNA(“R779，”SEQ ID NO:178)和Cas12变体(SEQ ID NO:28)进行DETECTR反应。样品含有HeLa总RNA或HeLa基因组DNA。
实施例3
SARS-CoV-2靶核酸的检测的特异性
此实施例描述了SARS-CoV-2靶核酸的检测的特异性。如实施例2所述，使用引物组1扩增含有对应于SARS-CoV-2的靶RNA的样品。筛选gRNA与被设计用于扩增SARS-CoV-2的N-基因或E-基因的不同引物组的相容性。图23示出了使用LbCas12a评价用于检测SARS-CoV-2的多种gRNA的DETECTR测定的结果。使用引物组扩增靶核酸序列以扩增SARS-CoV-2 E-基因(“2019-nCoV-E-组13”至“2019-nCoV-E-组20”)或SARS-CoV-2 N-基因(“2019-nCoV-N-组21”至“2019-nCoV-N-族24”)。对应于SEQ ID NO:172(“R1764–E-Sarbeco-1)的gRNA和对应于SEQ ID NO:173(“R1765–E-Sarbeco-2”)的gRNA能够检测使用针对SARS-CoV-2的E-基因的LAMP引物组扩增的靶序列。对应于SEQ ID NO:175(“R1767–N-Sarbeco”)的gRNA足以检测使用针对SARS-CoV-2的N-基因的大多数LAMP引物组扩增的靶序列。
使用DETECTR测定检测含有5fM或0fM SARS-CoV-2 RNA的样品。使用LbCas12a和针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA R1763或针对SARS-CoV的N-基因的gRNA R1766检测样品。此实施例中使用的gRNA的序列提供于表6中。图5示出用引物组1(“2019-nCoV-组1”)扩增并使用LbCas12a(SEQ ID NO:18)和针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(“R1763–CDC-N2-SARS-CoV-2，”SEQ ID NO:171)或针对SARS-CoV的N-基因的gRNA(“R1766–CDC-N2-SARS，”SEQ IDNO:174)检测的SARS-CoV-2 N-基因的DETECTR测定结果。
图11示意性地示出了在此测定中用于检测SARS-CoV-2的N-2基因的CDC-N2靶位点的序列。靶位点序列提供于表7中。
表6–用于检测冠状病毒的示例性gRNA序列
Figure BDA0003869671450002241
Figure BDA0003869671450002251
实施例4
SARS-CoV-2的检测限
此实施例描述了SARS-CoV-2的检测限。使用DETECTR反应检测含有减少的SARS-CoV-2靶核酸拷贝数的样品。图6示出了用于确定DETECTR反应中使用针对SARS-CoV-2的N-基因的引物组(“2019-nCoV-N-组1”)扩增的SARS-CoV-2的检测限的DETECTR反应的结果。对含有15,000、4,000、1,000、500、200、100、50、20或0个SARS-CoV-2 N-基因靶核酸拷贝的样品进行了检测。N-基因RNA的凝胶在下文示出。使用针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(SEQID NO:171)检测样品。
图41示出了SARS-CoV-2的DETECTR分析在大约30分钟内鉴定直至10个病毒基因组(20分钟扩增，10分钟DETECTR)。将一式两份LAMP反应物扩增20分钟，然后进行LbCas12aDETECTR分析。
图42示出了图41中提供的LbCas12a DETECTR分析在5分钟时的原始荧光。SARS-CoV-2 N-基因的检测限被确定为每个反应10个病毒基因组(n＝6)。
实施例5
用于检测SARS-CoV-2的多重SARS-CoV-2引物组
此实施例描述了用于检测SARS-CoV-2的多重SARS-CoV-2引物组。使用针对SARS-CoV-2或RNA酶P中的一者或多者的引物组的组合扩增含有靶核酸的样品。针对SARS-CoV-2的引物组用带有数字的“组”表示。图8示出了多重DETECTR反应的获得结果的时间。样品含有体外转录的SARS-CoV-2的N-基因(“N-基因IVT”)、体外转录的SARS-CoV-2的E-基因(“E-基因IVT”)、HeLa总RNA或无靶标(“NTC”)。使用针对SARS-CoV-2 N-基因(“组1”)、SARS-CoV-2 E-基因(“组14”)或RNA酶”(“RNA酶P”)的一个或多个引物组对样品进行扩增。图9示出了使用针对SARS-CoV-2 N-基因(“组1”)、SARS-CoV-2E-基因(“组14”)或RNA酶P的引物组的不同组合的多重DETECTR反应的获得结果的时间。对含有体外转录的SARS-CoV-2的N-基因(左，“N-基因IVT”)或体外转录的SARS-CoV-2的E-基因(右，“E-基因IVT”)的样品进行了测试。图10示出了使用来自图8和图9的表现最佳的引物组组合进行的多重DETECTR反应的获得结果的时间。
图26示出了评价LAMP引物组在SARS-CoV-2靶标的多重扩增方面的效用的DETECTR测定的结果。使用针对SARS-CoV-2 N-基因(“组1”)或SARS-CoV-2 E-基因(“组14”)或RNA酶P(“RNA酶P”)的一个或多个引物组对样品进行扩增。用针对SARS-CoV-2的N-基因(SEQ IDNO:171，“N-基因”)、SARS-CoV-2的E-基因(SEQ ID NO:173，“E-基因”)或RNA酶P(SEQ IDNO:178)的gRNA检测样品。
实施例6
DETECTR测定用于区分三种冠状病毒的灵敏度
此实施例描述了DETECTR测定用于区分三种冠状病毒的灵敏度。样品含有250pM的对应于SARS-CoV-2的N-基因、SARS-CoV的N-基因或蝙蝠-SL-CoV45的N-基因的任一RNA。如实施例2中所述在检测时扩增样品。使用针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(“R1763”)、针对SARS-CoV的N-基因的gRNA(“R1766”)或针对Sarbeco冠状病毒的N-基因的gRNA(“R1767”)检测样品。此实施例中使用的gRNA的序列提供于表6中。图12示意性地示出了SARS-CoV-2 N-基因(“N-Sarbeco”)靶位点的区域的序列。靶位点序列提供于表7中。图13示出用于确定针对SARS-CoV-2的N-基因(“R1763，”SEQ ID NO:171)、SARS-CoV的N-基因(“R1766，”SEQ IDNO:174)或Sarbeco冠状病毒的N-基因(“R1767，”SEQ ID NO:175)的gRNA对于含有SARS-CoV-2的N-基因(“N–2019-nCoV”)、SARS-CoV的N-基因(“N-SARS-CoV”)或蝙蝠-SL-CoV45的N-基因(“N–蝙蝠-SL-CoV45”)的样品的灵敏度的DETECTR测定的结果。SARS-CoV-2、SARS-CoV和蝙蝠-SL-CoV45是sarbeco冠状病毒株。使用LbCas12a(SEQ ID NO:18)检测样品。
图24示出了评价多种gRNA在区分三种不同的冠状病毒株SARS-CoV-2(“COVID-2019”)、SARS-CoV或蝙蝠-SL-CoV45方面的效用的DETECTR测定的结果。对含有SARS-CoV-2(“N–2019-nCoV”)、SARS-CoV(“N–SARS-CoV”)或蝙蝠-SL-CoV45(“N–蝙蝠-SL-CoV45”)的N-基因扩增子的样品进行了测试。使用针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(SEQ ID NO:171，“COVID-2019gRNA”)、针对SARS-CoV的N-基因的gRNA(SEQ ID NO:174，“SARS-CoV gRNA”)或针对多种冠状病毒物种的N-基因的gRNA(SEQ ID NO:175，“多-CoV gRNA”)检测样品。
表7–示例性冠状病毒N基因和E基因基因片段
Figure BDA0003869671450002271
Figure BDA0003869671450002281
Figure BDA0003869671450002291
Figure BDA0003869671450002301
Figure BDA0003869671450002311
实施例7
四种冠状病毒的E-基因的检测的灵敏度
此实施例描述了三种冠状病毒的E-基因的检测的灵敏度。样品含有250pM的对应于SARS-CoV-2的E-基因、SARS-CoV的E-基因、蝙蝠-SL-CoV45的E-基因或蝙蝠-SL-CoV21的E-基因的RNA。如实施例2中所述在检测时扩增样品。使用针对E-基因的第一gRNA(R1764)或针对E-基因的第二gRNA(R1765)中的每一者检测样品。此实施例中使用的gRNA的序列提供于表6中。图14示意性地示出SARS-CoV-2 E-基因(“E-Sarbeco”)靶位点的区域的序列。靶位点序列提供于表7中。图15示出了用于确定针对冠状病毒N-基因的两种gRNA对于含有SARS-CoV-2的E-基因(“E-2019-nCoV”)、SARS-CoV的E-基因(“E–SARS-CoV”)、蝙蝠-SL-CoV45的E-基因(“E–蝙蝠-SL-CoV45”)或蝙蝠-SL-CoV21的E-基因(“E–蝙蝠-SL-CoV21”)的样品的灵敏度的DETECTR测定的结果。用LbCas12a(SEQ ID NO:18)和对应于SEQ ID NO:172(“R1764–E基因1”)的gRNA或对应于SEQ ID NO:173(“R1765–E基因2”)的gRNA检测样品。测量随时间推移的荧光强度。
图25示出了评价多种gRNA在区分三种不同的冠状病毒株SARS-CoV-2(“COVID-2019”)、SARS-CoV或蝙蝠-SL-CoV45方面的效用的DETECTR测定的结果。对含有SARS-CoV-2(“N–2019-nCoV”)、SARS-CoV(“N–SARS-CoV”)或蝙蝠-SL-CoV45(“N–蝙蝠-SL-CoV45”)的E-基因扩增子的样品进行了测试。使用对应于SEQ ID NO:172(“E-基因gRNA#1”)或SEQ IDNO:173(“E-基因gRNA#2”)的针对多种冠状病毒的E-基因的gRNA检测样品。用针对E-基因的gRNA检测样品实现了对相关冠状病毒株的广谱靶向。
实施例8
使用Cas12变体使用侧流DETECTR反应检测冠状病毒
此实施例描述了使用侧流DETECTR反应检测冠状病毒。图31示出了与PCRD侧流装置相容的检测剂核酸的设计。提供了示例性的相容检测剂核酸rep072、rep076和rep100(左)。这些检测剂核酸可用于PCRD侧流装置(右)中以检测靶核酸的存在或不存在。右上示意图示出当与不含靶核酸的样品接触时产生的示例性条带构造。右下示意图示出当与含有靶核酸的样品接触时产生的示例性条带构造。与PCRD侧流装置相容的示例性报告子提供于表8中。侧流裂解报告子Rep100能够通过应用信号线检测侧流条上的样品。Rep072报告子仅在报告子被可编程核酸酶裂解后在IgG线上发出信号。与附着至磁珠的rep076报告子类似，rep100报告子在被裂解时在PCRD条上的FAM-生物素线处产生信号。然而，与rep076不同，rep100报告子在DIG-生物素线处被捕获，从而消除了对磁珠的需要。
使用等温扩增对包含来自冠状病毒的RNA靶序列的样品进行扩增。使用逆转录LAMP(RT-LAMP)扩增测定将含有0fM(“-”)或5fM(“+”)体外转录的冠状病毒N-基因的样品扩增60分钟。使用Cas12变体(SEQ ID NO:28)进行DETECTR反应持续0分钟、2.5分钟、5分钟或10分钟。图16示出了使用Cas12变体(SEQ ID NO:28)检测SARS-CoV-2 N-基因靶RNA的存在或不存在的侧流DETECTR反应的结果。示出侧流测试条。对含有(“+”)或缺乏(“-”)体外转录的SARS-CoV-2 N-基因RNA(“N-基因IVT”)的样品进行了测试。顶部的一组水平线(表示为“测试”)指示DETECTR反应的结果。DETECTR反应对含有体外转录的冠状病毒靶序列的样品灵敏。
表8–用于检测冠状病毒的示例性报告子序列
Figure BDA0003869671450002331
实施例9
使用侧流DETECTR反应检测SARS-CoV-2
此实施例描述了使用侧流DETECTR反应检测SARS-CoV-2。图17示意性地示出了使用可编程核酸酶检测靶核酸。简言之，具有反式附带裂解活性的Cas蛋白在与引导核酸和与所述引导核酸的区域反向互补的靶序列结合后被激活。激活的可编程核酸酶裂解报告子核酸，从而产生可检测信号。图18示意性地示出了样品中靶核酸的存在或不存在的检测。使用等温扩增来扩增样品中的选定核酸。使经扩增的样品与可编程核酸酶、引导核酸和报告子核酸接触，如图17中所示。如果样品含有靶核酸，则产生可检测信号。在靶核酸的体外转录和等温预扩增后，使用DETECTR反应检测对应于SARS-CoV-2的靶核酸的存在或不存在。使用Cas12可编程核酸酶检测样品。样品含有SARS-CoV-2病毒RNA或对应于RNA酶P的序列(阴性对照)。使用图17和图18中描述的DETECTR反应，使用针对SARS-CoV-2的gRNA检测样品。图19示出了用于检测样品中SARS-CoV-2(“2019-nCoV”)RNA的存在或不存在的DETECTR侧流反应的结果。RNA酶P的检测用作样品质量控制。将样品进行体外转录和扩增(左)，并使用Cas12可编程核酸酶(右)进行检测。用Cas12可编程核酸酶和针对SARS-CoV-2的gRNA测定含有(“+”)或缺乏(“-”)体外转录的SARS-CoV-2 RNA(“2019-nCoV IVT”)的样品持续0分钟或5分钟。所述反应对含有SARS-CoV-2的样品灵敏。
实施例10
使用DETECTR反应测试临床样品的SARS-CoV-2
此实施例描述了使用DETECTR反应测试临床样品的SARS-CoV-2。使用RT-PCR扩增临床样品并使用LbCas12a检测。使用针对SARS-CoV-2的N-基因或E-基因或RNA酶P(阴性对照)的gRNA(“crRNA”)检测样品。图20示出了用于确定患者样品中SARS-CoV-2的存在或不存在的使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)的DETECTR反应的结果。
使用侧流DETECTR反应对SARS-CoV-2呈阳性或阴性的患者的临床样品进行测定。使用RT-PCR对样品进行扩增和逆转录，并使用Cas12可编程核酸酶进行检测。还对阴性对照样品(“NTC”)进行了测定。进行DETECTR反应持续5分钟。图21示出了用于检测患者样品中SARS-CoV-2的存在或不存在的侧流DETECTR反应的结果。使用针对SARS-CoV-2的gRNA或针对RNA酶P的gRNA检测样品。针对E-基因区域的引物用于使用RT-PCR扩增靶区域。
实施例11
用于改进的RT-LAMP扩增和检测的缓冲液筛选
此实施例描述了用于改进的RT-LAMP扩增和检测的缓冲液筛选。在不同缓冲液条件下使用RT-LAMP扩增含有HeLa总RNA(“总RNA”)、SARS-CoV-2 N-基因RNA和HeLa总RNA(“N-基因+总RNA”)或无靶标(“NTC”)的样品。
图27示出了评价RT-LAMP扩增反应对常见样品缓冲液的灵敏度的DETECTR测定的结果。在不同缓冲液稀释度(从左至右：1x、0.5x、0.25x、0.125x或无缓冲液)下在通用转运介质(UTM，顶部)或DNA/RNA Shield缓冲液(底部)中测量反应。
实施例12
DETECTR测定中SARS-CoV-2的检测限
此实施例描述了DETECTR测定中SARS-CoV-2的检测限。使用不同拷贝数的SARS-CoV-2病毒基因组进行DETECTR反应。图28示出了用于确定针对SARS-CoV-2(归因于COVID-19感染的病毒)的DETECTR测定的检测限(LoD)的DETECTR测定的结果。使用针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(SEQ ID NO:171，“R1763–N-基因”)或针对RNA酶P的gRNA(SEQ ID NO:178，“R779–RNA酶P”)检测样品。每个条件重复7次。DETECTR测定能够下至每个反应约625与约150个拷贝之间重复性地且特异性地检测SARS-CoV-2 RNA的存在。
实施例13
使用DETECTR进行的多重RT-LAMP扩增的靶标特异性
此实施例描述了使用DETECTR反应的多重RT-LAMP扩增的靶标特异性。图29示出了使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)，评价针对SARS-CoV-2的N-基因的gRNA(“R1763–N-基因”)在2重(2-plex)多重RT-LAMP反应中的靶标特异性的DETECTR测定的结果。将来自SARS-CoV-2(“2019-nCoV N-基因IVT)、SARS-CoV(“SARS-CoV N-基因IVT”)或蝙蝠-SL-CoV45(“蝙蝠-SL-CoV45 N-基因IVT”)的体外转录的冠状病毒N-基因序列或来自具有不同冠状病毒株(CoV-HKU1、CoV-299E、CoV-OC43或CoV-NL63)的患者的临床残余样品使用2重多重RT-LAMP扩增进行扩增。HeLa总RNA用作RNA酶P的阳性对照。无靶标对照(“NTC”)作为阴性对照进行了测试。2重多重RT-LAMP扩增使用两个引物组扩增样品，一个引物组针对SARS-CoV-2 N-基因并且一个引物组针对RNA酶P。使用针对RNA酶P(SEQ ID NO:178，“R779–RNA酶P”)或SARS-CoV-2的N-基因(SEQ ID NO:171，“R1763–N-基因”)的gRNA检测经扩增的样品。两种gRNA均能够检测在2重多重RT-LAMP扩增测定中扩增的样品。
图30示出了使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)，评价针对SARS-CoV-2的N-基因(“R1763–N-基因”)或SARS-CoV-2的E-基因(“R1765–E-基因”)的gRNA在3重(3-plex)多重RT-LAMP反应中的靶标特异性的DETECTR测定的结果。将来自SARS-CoV-2(“2019-nCoVN-基因IVT)、SARS-CoV(“SARS-CoV N-基因IVT”)或蝙蝠-SL-CoV45(“蝙蝠-SL-CoV45 N-基因IVT”)的体外转录的冠状病毒N-基因序列、来自SARS-CoV-2(“2019-nCoV E-基因IVT)或SARS-CoV(“SARS-CoV E-基因IVT”)的体外转录的冠状病毒E-基因序列或来自具有不同冠状病毒株(CoV-HKU1、CoV-299E、CoV-OC43或CoV-NL63)的患者的临床残余样品使用3重多重RT-LAMP扩增进行扩增。HeLa总RNA用作RNA酶P的阳性对照。无靶标对照(“NTC”)作为阴性对照进行了测试。3重多重RT-LAMP扩增使用三个引物组扩增样品，一个引物组针对SARS-CoV-2 N-基因，一个引物组针对SARS-CoV-2 E-基因，并且一个引物组针对RNA酶P。使用针对RNA酶P(SEQ ID NO:178,“R779–RNA酶P”)、SARS-CoV-2的N-基因(SEQ ID NO:171，“R1763–N-基因”)或SARS-CoV-2的E-基因(SEQ ID NO:173，“R1765–E-基因”)的gRNA检测经扩增的样品。所有三种gRNA均能够检测在3重多重RT-LAMP扩增测定中扩增的样品。
实施例14
N-基因和E-基因gRNA的冠状病毒株特异性
此实施例描述了N-基因和E-基因gRNA的冠状病毒株特异性。引导RNA被设计为特异性地检测SARS-CoV-2的N-基因。引导RNA还被设计为检测三种SARS样冠状病毒株(SARS-CoV、蝙蝠SARS样冠状病毒(蝙蝠-SL-CoVZC45)和SARS-CoV-2)中的E-基因。将合成的体外转录(IVT)的SARS-CoV-2 RNA基因靶标掺杂到无核酸酶水中。通过使用LbCas12a(SEQ ID NO:18)的基于CRISPR-Cas12的检测测定来检测样品。DETECTR测定包括在62℃下20分钟的RT-LAMP反应和在37℃下10分钟的Cas12检测反应。用于靶标产生、qPCR和LAMP扩增的引物提供于表9中。图32A示出了指示冠状病毒基因组内E(包膜)基因和N(核蛋白)基因区域的位置的基因组图。引物和探针相对于E和N基因区域的相应区域或退火区域显示在相应基因区域下方。RT-LAMP引物由黑色矩形表示，FIP引物(灰色)的F1c和B1c半部的结合位置由带虚线边框的条纹矩形表示。在世界卫生组织(World Health Organization，WHO)和疾病控制中心(Center for Disease Control，CDC)使用的测试中扩增的区域分别表示为“WHO E扩增子”和“CDC N2扩增子”。
引导RNA能够使用N基因gRNA区分SARS-CoV-2而没有与相关冠状病毒株的交叉反应性，并且对于E基因gRNA具有预期交叉反应性。图32B示出了使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)评价针对各种冠状病毒株(SARS-CoV-2、SARS-CoV或蝙蝠-SL-CoVZC45)的N-基因或E-基因的gRNA的特异性或广泛检测效用的DETECTR测定的结果。所述测定中使用的N基因gRNA(左，“N-基因”)对SARS-CoV-2具有特异性，而E基因gRNA能够检测3种SARS样冠状病毒(右，“E-基因”)。靶向SARS-CoV和蝙蝠冠状病毒的单独N基因gRNA未能检测到SARS-CoV-2(中间，“N-基因相关物种变体”)。引导RNA被设计为特异性地靶向SARS-CoV-2或广泛检测相关冠状病毒株。含有SARS-CoV-2 N-基因(“N-基因：SARS-CoV-2”)、SARS-CoV N-基因(“N-基因：SARS-CoV”)、蝙蝠-SL-CoVZC45 N-基因(“N-基因：蝙蝠-SL-CoVZC45”)、SARS-CoV-2 E-基因(“E-基因：SARS-CoV-2”)、SARS-CoV E-基因(“E-基因：SARS-CoV”)或蝙蝠-SL-CoVZC45 E-基因(“E-基因：蝙蝠-SL-CoVZC45”)的样品使用被设计为特异性地检测SARS-CoV N-基因的gRNA(SEQ ID NO:171，“N-基因”)、被设计为检测冠状病毒变体的N-基因的gRNA(SEQ ID NO:174，“N-基因(相关物种变体)”)或被设计为广泛检测冠状病毒E-基因的gRNA(SEQ ID NO:172，“E-基因”)进行检测。
表9–靶标产生和扩增引物
Figure BDA0003869671450002381
Figure BDA0003869671450002391
Figure BDA0003869671450002401
实施例15
使用侧流DETECTR测定对冠状病毒的特异性和广泛检测
此实施例描述了使用侧流DETECTR测定对冠状病毒的特异性和广泛检测。可在适当的生物安全实验室要求范围内，使用最少的设备进行侧流DETECTR测定。图32C示出了用于冠状病毒侧流DETECTR测定中的示例性实验室设备。除了适当的生物安全防护设备外，所使用的设备还包括样品收集装置、微量离心管、设定为37℃和62℃的加热块、移液管和尖端以及侧流条。
DETECTR测定可在30至40分钟内运行，并在侧流条上可视化。常规RNA提取或样品基质可用作DETECTR(N基因、E基因和RNA酶P的LAMP预扩增和基于Cas12的检测)的输入，其可通过荧光读取仪或侧流条进行可视化。如果检测到E基因和N基因两者，则认为SARS-CoV-2 DETECTR测定呈阳性，或者如果检测到E基因或N基因，则推定阳性。这种解释与当前FDA紧急使用授权(Emergency Use Authorization，EUA)指南和根据EUA的最近批准的即时诊断一致。图32D示出了用于检测受试者中的冠状病毒的DETECTR测定的示例性工作流程。使用鼻咽拭子收集患者样品。常规RNA提取或样品基质可用作DETECTR(NE基因、EN基因和RNA酶P的LAMP预扩增和基于Cas12的检测)的输入，其可通过荧光读取仪或侧流条进行可视化。可直接从原始样品基质检测样品，或者可提取病毒RNA、然后进行检测。使用诸如RT-LAMP的等温扩增方法扩增编码SARS-CoV-2 E-基因和SARS-CoV N-基因的病毒RNA以及编码人RNA酶P的RNA。使用与针对SARS-CoV-2 N-基因和E-基因序列的gRNA复合的Cas12可编程核酸酶检测经扩增的样品。Cas12可编程核酸酶在与靶核酸形成复合物后裂解ssDNA报告子核酸。然后使用侧流读出检测样品。样品收集可在约0分钟至约10分钟内进行，扩增和检测可在约20分钟至约30分钟内进行，并且样品读出可在约2分钟内进行。
图32E示出了侧流测试条(左)，指示SARS-CoV-2 N-基因(左，上)的阳性测试结果和SARS-CoV-2 N-基因(左，下)的阴性测试结果。样品中的SARS-CoV-2阳性鉴定需要检测E-基因和N-基因两者以确认阳性测试。如图32D所示和所描述进行侧流测定。表(右)说明基于侧流条的冠状病毒诊断测定的可能测试指标和相关结果，所述测定测试RNA酶P(阳性对照)、SARS-CoV-2 N-基因和冠状病毒E-基因的存在或不存在。检测到两种SARS-CoV-2病毒基因靶标和内部掺杂的人RNA酶P对照指示阳性结果。
实施例16
直接从原始样品基质扩增和检测患者样品
此实施例描述了直接从原始样品基质扩增和检测患者样品。评估了RT-LAMP测定直接从原始样品基质扩增SARS-CoV-2核酸的能力。使用RT-LAMP DETECTR反应测定由来自无症状供体的鼻拭子组成的样品，所述样品置于通用转运介质(UTM)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并掺杂有SARS-CoV-2IVT靶RNA。由于与在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中相比，在通用转运介质(UTM)中更频繁地收集鼻拭子，因此评价了从由UTM缓冲液组成的鼻拭子样品基质运行所述测定的效果。将来自无症状供体的鼻拭子收集在UTM或PBS中。
图35A示出了在不同缓冲液条件下RT-LAMP扩增的获得结果的时间。获得结果的时间被计算为荧光值为实验最大值的三分之一的时间。未能扩增的反应以20分钟的值报告，并标记为“无扩增”。对于靶对照质粒在水、10％磷酸盐缓冲盐水(PBS)或10％通用转运培养基(UTM)中的不同起始浓度确定获得结果的时间。获得结果的时间越短表明扩增越快。结果表明与10％ UTM相比，10％ PBS对测定的抑制较低。图35B示出了用于确定SARS-CoV-2的N-基因、SARS-CoV-2的E-基因和RNA酶P在5％ UTM、5％ PBS或水中的扩增效率的RT-LAMP测定的结果。对含有0.5fM体外转录的N-基因、0.5fM体外转录的E-基因和0.8ng/μL HeLa总RNA(“N+E+总RNA”)或无靶标对照(“NTC”)的样品进行了测试对N-基因、E-基因和RNA酶P在5％样品缓冲液最终体积中的RT-LAMP扩增效率的评价表明，在5％样品缓冲液浓度下，RT-LAMP对于所有靶基因均具有功能。最终靶标浓度为0.5fM N-基因IVT、0.5fM E-基因IVT和0.08ng/μL HeLa总RNA。图35C示出了直接从PBS中的鼻拭子扩增RNA。随PBS浓度变化测量获得结果的时间。鼻拭子(“鼻拭子”)掺杂HeLa总RNA(左，“总RNA：0.08ng/uL”)或水(右，“总RNA：0ng/uL”)。比较没有鼻拭子(“无拭子”)的样品作为对照。使用RT-LAMP，在反应浓度≥10％UTM(按体积计)或≥20％ PBS(按体积计)时，测定性能下降。估计的检测限在≥10％UTM中降至500个拷贝/μL，并且在≥20％ PBS中降至1,00个拷贝/μL。RT-LAMP能够直接从PBS中的鼻拭子扩增RNA，在每个RT-LAMP预扩增反应5％或10％PBS最终体积时表现最佳。鼻拭子在PBS中制备并且掺杂有HeLa总RNA或水，并在针对RNA酶P的RT-LAMP反应中以不同浓度运行。
实施例17
SARS-CoV-2的DETECTR测定的检测限
此实施例描述了SARS-CoV-2的DETECTR测定的检测限。使用掺杂到PBS中的供体鼻拭子样品基质中的IVT SARS-CoV-2靶RNA，将DETECTR测定的分析检测限(LoD)相对于美国FDA紧急使用授权(EUA)批准的用于检测SARS-CoV-2的CDC测定(对于3个靶标中的2个，N2和N3运行测试)进行比较。将体外转录的病毒RNA的5种10倍连续稀释液以101-105个拷贝/mL范围内的浓度掺杂到样品基质中，其中对于DETECTR测定在每个稀释度下6次重复，并且对于CDC测定在每个稀释度下3次重复。图36A示出了由SARS-CoV-2 N-基因(n＝6)的LbCas12a(SEQ ID NO:18)检测产生的原始荧光曲线。曲线在不到20分钟内显示饱和。图36B示出了如从图36A所示的原始荧光迹线所确定，用LbCas12a检测的SARS-CoV-2 N-基因的DETECTR测定的检测限。随着SARS-CoV-2 N-基因的浓度(每mL拷贝数)降低，测量荧光强度。图36C示出了如从图36A中所示的原始荧光迹线所确定，DETECTR测定检测限的获得结果的时间。获得结果的时间越短表明扩增和检测越快。SARS-CoV-2 DETECTR的估计LoD是大约10个拷贝/μl，其与CDC N2和N3测定的LoD相当。SARS-CoV-2的DETECTR分析在不到30分钟内鉴定下至10个病毒基因组。将一式两份LAMP反应物扩增20分钟，然后进行LbCas12aDETECTR分析。进一步分析揭示SARS-CoV-2 N-基因的检测限为每个反应10个病毒基因组(n＝6，图36B)。评价这些反应的获得结果的时间突出显示了在5分钟内检测到10个SARS-CoV-2病毒基因组(n＝6，图36C)。
将RT-LAMP DETECTR反应的分析检测限相对于美国FDA紧急使用授权批准的用于检测SARS-CoV-2的CDC测定所使用的qRT-PCR检测测定进行了比较。定量标准曲线使用对照IVT病毒核蛋白RNA(“CDC VTC nCoV转录物”)的7种稀释液构建，每个稀释度3次重复，并使用CDC方案进行检测(图33D，左)。然后使用相同对照核蛋白RNA的10种两倍连续稀释液来运行DETECTR测定，每个稀释度6次重复(图33D，中间)。加州公共***(CaliforniaDepartment of Public Health)所测试的CDC测定的估计稀释限是1个拷贝/μL反应，与FDA包装插页中的分析性能一致，相比之下对于DETECTR测定为10个拷贝/μL反应。图33D示出了用于确定SARS-CoV-2的检测限的使用LbCas12a的DETECTR测定(中间)或CDC方案(左)的结果。示出随每个反应的病毒基因组拷贝数的变化的信号。示出0个拷贝/μL和10个拷贝/μL(右)的测定的代表性侧流结果。
使用侧流装置测量用于检测SARS-CoV-2的检测限(LoD)。图33A示出了在靶核酸存在下，Cas12可编程核酸酶对用FAM和生物素标记的检测剂核酸的裂解(上)。侧流测试条的示意图(下)示出指示所测试样品中靶核酸的存在(“阳性”)或不存在(“阴性”)的标记。完整FAM生物素化报告分子流向对照捕获线。在识别匹配靶标后，Cas-gRNA复合物裂解报告分子，所述报告分子流向靶标捕获线。
实施例18
用于SARS-CoV-2的DETECTR测定中孵育时间的影响
此实施例描述了用于SARS-CoV-2的DETECTR测定中孵育时间的影响。使用RT-LAMP扩增样品并使用LbCas12a(SEQ ID NO:18)进行检测。测试了Cas12反应孵育时间对信号的影响。
图33B示出了用于确定反应时间对含有0fM SARS-CoV-2 RNA或5fM SARS-CoV-2RNA的样品的影响的使用LbCas12a的DETECTR测定的结果。对SARS-CoV-2 N-基因的RT-LAMP扩增子进行的LbCas12a检测测定的荧光信号在10分钟内饱和。通过在62℃下扩增20分钟由2μL的5fM或0fM SARS-CoV-2 N-基因IVT RNA产生RT-LAMP扩增子。Cas12检测反应的可视化是使用FAM-生物素报告分子和被设计为捕获经标记的核酸的侧流条实现的，如图33A所示。未裂解的报告分子在第一检测线(对照线)处被捕获，而不加选择的Cas12裂解活性在第二检测线(测试线)处产生信号。为了比较使用荧光或侧流时由Cas12产生的信号，使用N基因引物使用5fM或0fM IVT模板进行RT-LAMP，并使用荧光读板仪和通过在0、2.5、5和10分钟时的侧流监测相同扩增子上Cas12读出的性能。Cas12荧光学信号在<1分钟内可检测到，而通过侧流获得的视觉信号可在5分钟内实现。图37A示出了用于确定反应时间对含有0fMSARS-CoV-2 RNA或5fM SARS-CoV-2 RNA的样品的影响的使用LbCas12a的DETECTR测定的结果。对SARS-CoV-2 N-基因的RT-LAMP扩增子进行的LbCas12a(SEQ ID NO:18)检测测定的荧光信号在10分钟内饱和。通过在62℃下扩增20分钟由2μL的5fM或0fM SARS-CoV-2 N-基因IVT RNA产生RT-LAMP扩增子。
图33C示出了对应于图33B中由DETECTR测定的样品的侧流测试条测定样品。示出随反应时间变化的含有0fM SARS-CoV-2RNA(“-”)或5fM SARS-CoV-2 RNA(“+”)的样品的对应于对照(C)或测试(T)的条带。同一RT-LAMP扩增子上的LbCas12a在5分钟内通过侧流测定产生可见信号。图37B示出了对应于图37A中通过DETECTR测定的样品的侧流测试条测定样品。示出随反应时间变化的含有0fM SARS-CoV-2 RNA(“-”)或5fM SARS-CoV-2 RNA(“+”)的样品的对应于对照(C)或测试(T)的条带。如图37A所示的同一RT-LAMP扩增子上的LbCas12a(SEQ ID NO:18)在5分钟内通过侧流测定产生可见信号。
实施例19
使用DETECTR测定检测患者样品中的SARS-CoV-2
此实施例描述使用DETECTR测定检测患者样品中的SARS-CoV-2。对来自从6名确诊感染SARS-CoV-2的患者收集的鼻拭子样品、来自15名患有其他流感或冠状病毒感染的患者的鼻拭子样品以及来自5名健康供体的鼻拭子样品的提取RNA进行了测试。将来自患有流感(n＝4)和其他人冠状病毒感染(常见的人季节性冠状病毒感染(OC34、HKU1、229E和NL63，n＝7))的患者的RNA提取物与掺杂到UTM中的鼻拭子基质中的体外转录的SARS-CoV-2靶RNA和从来自2名SARS-CoV-2感染患者的鼻拭子中提取的RNA进行了比较。使用具有基于荧光的和侧流条读出的SARS-CoV-2 DETECTR测定来检测样品。图34示出了比较使用本公开的RT-LAMP的SARS-CoV-2 DETECTR测定与使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测方法的SARS-CoV-2测定的表。DETECTR RT-LAMP测定中的N-基因靶标与qRT-PCR测定中检测到的N-基因N2扩增子相同。图33E示出了患者样品DETECTR数据。来自6名患有COVID-19感染的患者(n＝11，5次重复)和12名感染流感或4种季节性冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43)中的一种的患者(n＝12)的临床样品使用SARS-CoV-2 DETECTR(阴影框)进行分析。使用ImageJ对来自侧流条的信号强度进行定量，并将其针对N基因、E基因或RNA酶P组内的最高值归一化，其中在高于背景五个标准偏差处具有阳性阈值。SARS-CoV-2测试的最终确定是基于图32E中的解释矩阵。FluA表示甲型流感，并且FluB表示乙型流感。HCoV表示人冠状病毒。图33F示出了在患有COVID-19的患者(对SARS-CoV-2呈阳性，“患者11”)、缺乏靶核酸的无靶标对照样品(“NTC”)和含有靶核酸的阳性对照样品(“PC”)中测试SARS-CoV-2的侧流测试条。使用对应于SEQ ID NO:173的gRNA检测E-基因。使用对应于SEQ IDNO:171的gRNA检测N-基因。测试了所有三个样品中SARS-CoV-2 N-基因、SARS-CoV-2 E-基因和RNA酶P的存在。基于Cas12的测定与CDC N2/N3 qRT-PCR测定的结果存在100％一致性，从而证明了使用基于DETECTR Cas12的测定诊断患有SARS-CoV-2感染的患者的可行性。
在11份患者拭子中的9份中检测到SARS-CoV-2，并且未与其他呼吸道病毒发生交叉反应。确认来自COVID-19患者的两个阴性拭子低于所确立的检测限。图43示出了10个COVID-19感染患者样品和12个其他病毒性呼吸道感染患者样品的侧流DETECTR结果。使用两种不同的基因N2和E以及样品输入对照RNA酶P，测试了来自6名患者的10个样品(COVID19-1至COVID19-5)以及一个鼻咽拭子(A)和一个口咽拭子(B)的SARS-CoV-2。根据图44中提供的指导分析结果。图44示出了用于解释SARS-CoV-2 DETECTR侧流结果的说明。图45A-C示出了对11个COVID-19感染患者样品和12个其他病毒性呼吸道感染患者样品进行的荧光DETECTR动力学曲线。使用两种不同的基因N2和E以及样品输入对照RNA酶P测试了来自6名患者的10份鼻咽/口咽拭子样品(COVID19-1至COVID19-6)的SARS-CoV-2。
图45A示出了使用标准扩增和检测条件测试的样品，12个COVID-19阳性患者样品中的10个产生了指示SARS-CoV-2 E基因的存在的稳健荧光曲线(20分钟扩增，10分钟内发出信号)。在12个其他病毒性呼吸道临床样品中均未检测到E基因信号。
图45B示出了对于12个COVID-19阳性患者样品中的10个，使用延长的扩增时间以产生强荧光曲线(30分钟扩增，10分钟内发出信号)，测试样品中SARS-CoV-2 N基因的存在。在12个其他病毒性呼吸道临床样品中均未检测到N基因信号。
鉴于图45和图46中所示的侧流读出与基于荧光的读出之间的100％一致性，使用我们的DETECTR测定，使用基于荧光的读出对来自患有SARS-CoV2急性呼吸道感染的患者的另外60个鼻咽拭子样品进行盲法测试。在60个样品中，30个通过qRT-PCR测试对COVID-19感染呈阳性，并且30个对COVID-19感染呈阴性，但通过呼吸道病毒组(RVP)多重PCR检测对另一种病毒性呼吸道感染呈阳性或通过所有测试呈阴性。对于83个总呼吸道拭子样品中的冠状病毒的检测，SARS-CoV-2 DETECTR相对于CDC qRT-PCR测定的阳性预测一致性(PPA)和阴性预测一致性(NPA)分别是95％和100％。
图46A示出了临床样品的SARS-CoV-2 DETECTR测定结果的热图，其中指示了测试解释。对于24个临床样品(12个COVID-19阳性)的SARS-CoV-2 DETECTR，通过ImageJ GelAnalyzer工具定量的侧流SARS-CoV-2 DETECTR测定的结果(上)显示与测定的荧光型式的结果(下)的98.6％(71/72个条)一致性。两种测定均以30分钟扩增运行，Cas12反应信号在10分钟时获取。推定阳性用呈橙色的(+)(下，第4列)表示。
图46B示出了临床样品的SARS-CoV-2 DETECTR测定结果的热图，其中指示了测试解释。上图示出对另外30个COVID-19阳性临床样品的荧光SARS-CoV-2 DETECTR测定的结果(27个阳性、1个推定阳性、2个阴性)。推定阳性用呈橙色的(+)表示(上，第9列)。下图示出对另外30个COVID-19阴性临床样品的荧光SARS-CoV-2DETECTR测定的结果(0个阳性，30个阴性)。
相对于CDC qRT-PCR方案，SARS-CoV-2 DETECTR测定对检测鼻拭子样品中的冠状病毒具有90％灵敏度和100％特异性，分别对应于100％和91.7％的阳性预测值和阴性预测值。图33G示出了SARS-CoV-2 DETECTR测定的性能特征。使用SARS-CoV-2DETECTR测定的荧光型式评价了83个临床样品(41个COVID-19阳性，42个阴性)。由于失败测定质量控制，一个样品(COVID19-3)被省略。阳性和阴性调用是基于图32E中描述的标准。fM表示飞摩尔；NTC表示无模板对照；PPA表示阳性预测一致性；NPA表示阴性预测一致性。
关于来自SARS-CoV-2、SARS-CoV、蝙蝠-SL-CoVZC45的IVT RNA产物和来自常见人冠状病毒的临床样品对SARS-CoV-2DETECTR测定(RT-LAMP+Cas12a)进行了评价。图38示出了用于确定gRNA对于不同人冠状病毒株的交叉反应性的DETECTR测定的结果。对含有SARS-CoV-2 N-基因、SARS-CoV N-基因、蝙蝠-SL-CoVZC45 N-基因、SARS-CoV-2 E-基因、SARS-CoV E-基因或蝙蝠-SL-CoVZC45 E-基因的体外转录RNA的样品或对CoV-HKU1、CoV-299E、CoV-OC43或CoV-NL63呈阳性的临床样品进行了测试。HeLa总RNA作为RNA酶P的阳性对照进行了测试，并且缺乏靶核酸的样品(“NTC”)作为阴性对照进行了测试。使用对应于SEQ IDNO:171的gRNA检测N-基因。使用对应于SEQ ID NO:173的gRNA检测E-基因。使用对应于SEQID NO:178的gRNA检测RNA酶P。SARS-CoV-2 DETECTR测定仅在体外转录的SARS-CoV-2掺杂样品和来自SARS-CoV-2感染患者的鼻拭子样品中呈阳性，从而表明DETECTR测定对SARS-CoV-2具有特异性。N-基因仅在SARS-CoV-2中检测到，而E-基因仅在SARS-CoV-2和蝙蝠-SL-CoVZC45中检测到。未检测到SARS-CoV E-基因，因为RT-LAMP引物组不能扩增SARS-CoV E-基因，即使E-基因gRNA能够检测SARS-CoV E-基因靶位点。在常见人冠状病毒中检测到RNA酶P，因为这些样品是从临床样品中提取的RNA。结果在荧光板读取仪上在LbCas12a(SEQ IDNO:18)检测测定信号的15分钟时显示。
图40A-图40B示出了COVID-19感染患者样品的DETECTR动力学曲线。使用两种不同的基因N2和E以及样品输入对照RNA酶P，测试了来自5名患者的10份鼻拭子样品(COVID19-1至COVID19-10)的SARS-CoV-2。图40A示出了使用标准扩增和检测条件，10名患者中的9名产生了指示SARS-CoV-2 E-基因的存在的稳健荧光曲线(20分钟扩增，10分钟内发出信号)。图40B示出了SARS-CoV-2 N-基因需要延长的扩增时间才来产生10名患者中的8名的强荧光曲线(30分钟扩增，10分钟内发出信号)。图40C示出了作为样品输入对照，RNA酶P对于所测试的22个总样品中的17个呈阳性(20分钟扩增，10分钟内发出信号)。
实施例20
用经修饰的LAMP引物和gRNA对RNA酶P POP7对照基因的改进的检测
此实施例描述了用经修饰的LAMP引物和gRNA对RNA酶PPOP7对照基因的改进的检测。使用RT-LAMP和DETECTR反应对含有RNA酶P POP7 RNA的样品进行测定，以评估针对RNA酶PPOP7的引物组和gRNA的扩增和检测效率。用不同引物组将含有0.16ng/μL总RNA或0ng/μL总RNA的样品通过RT-LAMP在60℃下扩增60分钟。图47示出了用不同引物组对RNA酶P POP7进行RT-LAMP扩增的获得结果的时间。确定用引物组1-10扩增的样品的获得结果的时间。引物组1对应于SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:211，并且引物组9对应于SEQ ID NO:212–SEQ IDNO:217。对于含有0.16ng/μL总RNA的样品，引物组9显示出与引物组1以及引物组2-8和10相比改进的获得结果的时间。此外，与引物组1以及引物组2、3、7、8和10相比，引物组9显示出对不含总RNA(0ng/μL总RNA)的样品的更少非特异性扩增。
对通过RT-LAMP产生的扩增子进行DETECTR反应。使用对应于R779(SEQ ID NO:178)、R780(SEQ ID NO:219.)或R1965(SEQ ID NO:218)的gRNA检测样品。图48示出了对使用RT-LAMP用引物组1或引物组9扩增并用R779、R780或R1965 gRNA检测的RNA酶P POP7进行的DETECTR反应随时间推移的原始荧光。DETECTR反应在37℃下进行90分钟。通过R779在无背景(虚线)情况下检测到由第1组引物产生的扩增子。在通过组9产生的扩增子上通过R1965和R780也观察到干净检测。结果表明，与R779或R780相比，R1965更快地检测。
然后测试使用RT-LAMP用引物组1(SEQ ID NO:206–SEQ ID NO:211)或引物组9(SEQ ID NO:212–SEQ ID NO:217)扩增并用R779 gRNA(SEQ ID NO:178)或R1965 gRNA(SEQID NO:218)检测的RNA酶P POP7的检测限。图49A示出了在含有使用RT-LAMP用引物组1或引物组9扩增的总RNA的10倍稀释液的样品中RNA酶P POP7检测的获得结果的时间。扩增在60℃下进行30分钟。图49B示出了图49A中所示并使用gRNA 779(SEQ ID NO:178)或gRNA 1965(SEQ ID NO:218)检测的RNA酶P POP7扩增子的DETECTR反应。用gRNA 779检测使用引物组1扩增的样品，并且用gRNA 1965检测使用引物组9扩增的样品。DETECTR反应在37℃下进行90分钟。与引物组1相比，引物组9显示出改进的达到检测限的时间，如通过在低RNA浓度下更快获得结果的时间所示。此外，与用引物组1扩增并用gRNA 779检测的样品相比，当用gRNA1965检测时，引物组9在DETECTR反应中显示出改进的速度和灵敏度。
实施例21
用于冠状病毒的裂解和扩增的病毒裂解缓冲液
此实施例描述了用于冠状病毒的裂解和扩增的病毒裂解缓冲液。鼻拭子或唾液样品是从疑似患有冠状病毒感染的个体收集的。将鼻拭子和唾液样品悬浮在病毒裂解缓冲液中，所述病毒裂解缓冲液被配制用于裂解病毒衣壳并释放病毒基因组。病毒裂解缓冲液与病毒基因组的RT-LAMP扩增和靶核酸的DETECTR检测相容，从而为冠状病毒DETECTR反应提供一步样品制备溶液。
实施例22
靶核酸在病毒裂解缓冲液中的扩增
此实施例描述了靶核酸在病毒裂解缓冲液中的扩增。测试了各种缓冲液组成、还原剂和孵育温度对靶核酸的扩增的影响。使用LAMP扩增对不同缓冲液中的样品进行扩增，并测量所产生的荧光。更高的荧光指示更多的扩增。
图50示出了在不同裂解条件下使用LAMP扩增SeraCare靶核酸的结果。使样品在各种缓冲液中扩增。将样品在室温(左图)或95℃(右图)下孵育5分钟。样品含有每个反应无靶标(“NTC”)、2.5、25或250个拷贝。使用25μL反应物中的5μL样品一式三份进行测定。
图51示出了在不同裂解条件下使用LAMP扩增SeraCare标准靶核酸的结果。使样品在各种缓冲液中扩增。将样品在室温(上图)或95℃(下图)下孵育5分钟。样品含有每个反应无靶标(“NTC”)、1.5、2.5、15、25、150或250个拷贝。使用15μL反应物中的3μL样品或25μL反应物中的5μL样品一式三份进行测定。
这一实验的结果证明，某些缓冲液更有利于LAMP扩增。
实施例23
来自COVID-19患者样品的靶核酸在病毒裂解缓冲液中的扩增
此实施例描述了来自COVID-19患者样品的靶核酸在病毒裂解缓冲液中的扩增。将从对COVID-19呈阳性的患者收集的样品在具有不同组分的病毒裂解缓冲液中裂解并扩增。如实施例22中所述，使用LAMP扩增对应于SARS-CoV-2 N基因和RNA酶P的靶核酸。对各种缓冲液配方进行了测试。
图52示出了在六种不同的病毒裂解缓冲液(“VLB”、“VLB-D”、“VLB-T”、“缓冲液”、“缓冲液-A”和“缓冲液-B”)存在下SARS-CoV-2N基因(“N”)和RNA酶P样品输入对照核酸(“RP”)的扩增。缓冲液-A含有含还原剂A的缓冲液，并且缓冲液-B含有含还原剂B的缓冲液。阴影方块表示扩增速率，阴影越深表示扩增越快。在95℃(“95C”)或室温(“RT”)下对高、中或低滴度COVID-19阳性患者样品(分别“16.9”、“30.5”和“33.6”)进行扩增。一式两份测量样品。在所测试的缓冲液中，在95℃下在VLB-T中观察到最快的扩增。
实施例24
在微流体盒上使用DETECTR测定检测SNP
此实施例描述了在微流体盒上使用DETECTR测定检测SNP。此测定在图53B中所示的微流体盒上进行。打开被配置为加热所述盒的盒歧管。将5μL来自蓝眼睛个体的样品与45μL含有用于样品的LAMP扩增的组分的LAMP主混合溶液合并。样品在添加至盒之前进行了预混合。将预混合的样品负载到扩增室中的盒中，并用透明胶带密封所述室。将95μL的蓝眼睛RNP(G SNP)负载到DETECTR室中。将负载的芯片转移至预先加热的歧管上并用透明胶带密封。
将歧管的第一加热器设置为60℃，并且将第二加热器设置为37℃。将样品在60℃下孵育30分钟。30分钟后，启动歧管中的第一泵以将含有样品的LAMP缓冲液泵送通过所述盒。启动歧管中的第二泵以将95μL的DETECTR溶液推入检测室中。将样品在37℃下孵育30分钟。使用黑盒荧光检测器可视化荧光。
使用加热块在微量离心管中进行对照测定。在第一管中，将5μL来自蓝眼睛个体的样品与45μL的LAMP主混合溶液合并。在第二管中，将5μL来自棕色眼睛个体的样品与45μL的LAMP主混合溶液合并。将样品在小型干浴中在60℃下孵育30分钟。将5μL的每个扩增样品转移至95μL的1 x RNP溶液中，以用于检测A和G SNP。将反应物转移至37℃加热块。
实施例25
微流体盒中SNP的扩增和检测
此实施例描述了微流体盒中SNP的扩增和检测。这些测定在图55B中所示的微流体盒中进行。制备了以下溶液：LAMP主混合物(1x IsoAmp缓冲液(NEB)、4.5mM MgSO4、1.4mMdNTP、1:5Bst 2.0(NEB)、1x引物主混合物和1:10靶DNA)和CRISPR复合物(1x MBuffer3、40nM crRNA和40nM Cas12变体(SEQ ID NO:28)；在37℃下孵育后添加1μM报告子底物)。
通过在RNAse Zap中浸泡20分钟并通过在无核酸酶水中洗涤两次来洗涤清洁溶液的残余物来清洁盒的PMMA层。使用氮气流干燥盒。组装了盒的各层。将CRISPR反应工作流程的上半部分用高溶胶环氧树脂封闭并干燥20分钟直至澄清。将80μL的LAMP主混合物与10μL的引物混合物和10μL的纯DNA提取物在微量离心管中预混合。通过上下移液混合溶液。使用移液管将70μL的此溶液负载到盒的扩增室中。使用一小片矩形PCR粘合剂(Biorad，MSB-1001)密封所述室。
将盒放入加热歧管中，并将铝块加热至60℃的芯片上温度。将样品在60℃下孵育30分钟以使用LAMP扩增样品。将100μL含有蓝眼睛gRNA的CRISPR试剂添加至下部DETECTR室中。将顶部和底部腔室用小片矩形PCR粘合剂密封。通过致动盒中的阀，将CRISPR试剂与5μL的经扩增样品混合。将歧管用3D打印的APS护罩覆盖以阻挡光。将铝块加热至37℃的芯片上温度。将CRISPR反应物在37℃下孵育30分钟。通过肉眼观察所产生的荧光。
使用图55C中所示的盒，如上所述重复测定，除了上半部分没有用环氧树脂密封。在两种测定中，对应于阳性结果的荧光可通过肉眼观察到。从盒顶部对歧管中的盒进行照明导致检测室的不均匀照明。
实施例26
经修改的微流体盒中SNP的扩增和检测
此实施例描述了经修改的微流体盒中SNP的扩增和检测。此测定在图56A中所示的微流体盒上进行。如实施例25中所述制备LAMP主混合物和CRISPR复合物溶液。通过在RNAseZap中浸泡20分钟并通过在无核酸酶水中洗涤两次来洗涤清洁溶液的残余物来清洁盒的PMMA层。使用氮气流干燥盒。组装了盒的各层。
将40μL的LAMP主混合物与5μL的引物混合物和5μL的纯DNA提取物在微量离心管中预混合。通过上下移液混合溶液。使用移液管将50μL的此溶液负载到盒的扩增室中。使用一小片矩形PCR粘合剂(Biorad，MSB-1001)密封腔室。将95μL含有Cas12变体(SEQ ID NO:28)和针对棕色眼睛SNP的gRNA的CRISPR试剂溶液添加至下部DETECTR室中，并将95μL的阴性试剂溶液(5x MBuffer3)添加至上部DETECTR室。使用一小片矩形PCR粘合剂(Biorad，MSB-1001)密封所述室。
将盒组装在加热歧管上，并将铝块在扩增室中加热至60℃的芯片上温度。在开始测定前2分钟开始加热。扩增在60℃下进行30分钟。致动盒的阀以将CRISPR试剂与5μL的经扩增样品混合。将检测室的歧管加热器在没有预加热的情况下加热至37℃。DETECTR反应在37℃下进行30分钟，并且通过肉眼观察所产生的荧光。通过用来自微型PCR试剂盒的LED或来自ThorLabs的LED照明对腔室进行成像。
在具有相同设计的新盒上重复所述测定，具有以下修改：未将CRISPR试剂预负载到装置中，因为从之前运行，加热器仍然是温热的，并且扩增和检测步骤运行15分钟而不是30分钟。
第三测定在图56B中所示的微流体盒上进行。扩增室负载有50μL无核酸酶水，并用一小片PCR粘合剂密封所述腔室。将50μL的1μM ATTO-488染料和45μL的无核酸酶水负载到下部CRISPR室中，并将95μL的无核酸酶水负载到上部CRISPR室中。两个腔室均用一小片PCR粘合剂密封。如图64B中所示，将盒组装在加热歧管上。将样品在扩增室中孵育10秒。将第一泵运行3秒以将5μL的流体从扩增室驱出并进入CRISPR室(也称为检测室)中。将第二泵运行5秒以驱动检测试剂进入CRISPER室中。将样品在CRISPR室中孵育10秒，然后用LED照明。使用以下参数重复测定：在扩增室中孵育30分钟，泵1运行1秒，泵2运行20秒，然后在CRISPR室中孵育15分钟，然后用LED照明。较长的泵送时间改进了腔室之间的流体输送。
实施例27
使用微流体装置进行DETECTR反应
此实施例描述了使用微流体装置进行DETECTR反应。如图53A、图53B、图54A、图54B、图55A、图55B、图55C、图55D、图56A、图56B、图56C或图56D中任一个所示的微流体盒负载有扩增试剂和DETECTR试剂。将50μL的扩增试剂添加至扩增室，并且将95μL的DETECTR试剂添加至DETECTR室。将盒的孔密封。如图63A、图63B、图64B或图65中任一个所示，将盒负载到加热歧管中。以特定取向***盒。拧紧螺丝以将盒固持在适当位置。将开口用切割成一定大小的透明qPCR密封，以形成气密密封。将热电偶***扩增室中以记录温度。将图57A中所示的螺线管通电以关闭阀。指示器LED灯打开。打开设置为60℃和37℃的两个加热器。将样品在扩增室中在60℃下孵育30分钟。将螺线管断电以打开阀。将泵1致动15秒以将流体从扩增室移动至DETECTR反应室。15秒后，将泵2致动15秒以将流体从DETECTR试剂储库移动至DETECTR反应室。将样品在DETECTR反应室中在37℃下孵育30分钟。指示器灯关闭。打开LED并通过图像、视觉评估或光电二极管检测来测量荧光。
在30分钟60℃LAMP孵育结束时，螺线管阀打开，并且蠕动泵#1以100％ PWM运行10秒。将LAMP缓冲液通过阀泵送至通向DETECTR反应室的蛇形通道与通向DETECTR试剂储库的直通道的交叉点。与通向DETECTR试剂储库的通道相比，通向DETECTR反应室的蛇形通道具有更大的横截面积。这是为了减少蛇形通道中的流体阻力，并将所有缓冲液引向DETECTR反应室。然而，在整个研究过程中(测试23+芯片)，缓冲液几乎每次都会双向分离，大约一半的缓冲液体积走错方向。在下一流体步骤中，螺线管阀关闭，并且将DETECTR试剂朝向DETECTR反应室泵送，从而沿途收集LAMP产物。这提供了一些混合，因为两种缓冲液同时行进通过蛇形通道，但这个过程也产生可被带到DETECTR室的气泡。
为防止气泡在DETECTR期间干扰荧光测量，将与反应室可容纳相比更大体积的缓冲液负载到储库中，并使用比必要更长的泵送时间。这确保腔室完全充满试剂并且所有气泡均已爆裂。DETECTR反应室具有70μL的体积，并且将25μL LAMP加95μL DETECTR试剂递送至每个腔室中。第二流体步骤(DETECTR试剂至DETECTR反应室)需要约20-30秒来递送所有缓冲液，但此步骤运行45秒。这导致完全充满DETECTR反应室，其中过量的试剂留在蛇形通道中。除气泡外，如果DETECTR反应室未完全充满，则在37℃孵育期间在室顶部上形成冷凝，这也会干扰从上方进行的荧光测量。
实施例28
用于DETECTR反应的微流体装置的热测试
此实施例描述了用于DETECTR反应的微流体装置的热测试。通过测量达到温度的时间和加热至设定点的准确度来测试加热歧管的热性能，其中热电偶浸没在缓冲液中。在标准测定温度设定点(60℃LAMP/37℃DETECTR)下，LAMP缓冲液在8.5分钟内加热至60℃，但DETECTR缓冲液在大约21分钟时达到34℃的最高温度。这在某种程度上违反直觉，因为达到较低温度需要更长的时间(并且DETECTR缓冲液没有达到设定点温度)。为了达到特定温度，加热器控制器改变它在开启状态下花费的时间量。这种状态切换由脉冲宽度调制(PWM)值定量，即它在开启状态中花费的给定时间单位的百分比。加热器控制器还对加热器的温度进行采样，以反馈当前温度与设定点温度之间的差异。那两个值之间的差异越大，所得的PWM值就越高。随着加热器温度接近设定点，PWM值下降以减缓变化速率并避免超出设定点温度。室温加热器与LAMP设定点之间的差是约35℃，而DETECTR加热器与其设定点之间的差是约12℃。LAMP孵育以20％左右的最大PWM值加热，而DETECTR孵育以12％左右的最大PWM值加热。我们当前的设置被设计为更加强调准确性并且不会超出设定点温度，而不是快速加热缓冲液至测定温度。
特定PWM值可用于更快地加热至我们的设定点温度。然而，这是手动过程并且可能导致超出目标温度并损坏试验电路板(breadboard)原型并熔化微流体芯片。将LAMP加热器PWM值设置为100％时，LAMP缓冲液(通过热电偶测量)在90秒内加热至60℃，但加热器温度达到100℃。将DETECTR加热器PWM设置为100％时，DETECTR缓冲液在60秒内加热至37℃，并且加热器达到80℃。当DETECTR缓冲液达到37℃时关闭加热器导致约60℃的最高缓冲液温度。在30分钟60℃LAMP孵育期间，芯片的DETECTR侧的温度升高，从而使其高于室温。它不时变化，但通常在DETECTR侧开始时介于25℃-29℃之间。
图67A、图67B、图68A和图68B示出加热至60℃的扩增室(图67A和图68A)或加热至37℃的DETECTR室(图67B和图68B)的热测试总结。图68A示出标题为BOBv2 LAMP温度对时间(61℃设定点)的图表。x轴显示从0至1800的时间(秒)，增量为200。y轴显示在20至65范围内的温度(℃)，增量为5。所述图包括代表加热器和缓冲液的两条线。虽然加热器和缓冲液线最终都达到相同的温度，但加热器线更快地达到最高温度。图68B示出标题为BOBv2 LAMP温度对时间(40℃设定点)的图。x轴显示从0至1800的时间(秒)，增量为200。y轴显示在25至43范围内的温度(℃)，增量为2。所述图包括代表加热器和缓冲液的两条线。加热器线更快地达到更高的温度。
实施例29
使用微流体盒检测HERC2 SNP
此实施例描述了使用微流体盒检测HERC2 SNP。制备在无核酸酶水中含有2μM F3引物、2μM B3引物、16μM FIP引物、16μM BIP引物、8μM LF引物和8μM LB引物的引物混合物。制备了含有1xMBuffer3、40nM crRNA和50nM Cas12变体(SEQ ID NO:28)的复合反应。在37℃下孵育30分钟后添加40nM报告子底物。制备了含有1x IsoAmp缓冲液、4.5mM MgSO4、dNTP和1x引物混合物的LAMP混合物。将DETECTR试剂负载到微流体盒中，并用PCR胶带密封孔。将LAMP混合物与引物混合并负载到盒中。将Chip Shop罐的窄端用封口膜覆盖并***LAMP反应室上方的鲁尔连接器中。Chip Shop罐负载有200μL的20mM NaOH。将盒***加热歧管中并拧紧螺丝。将口腔拭子添加至罐中，轻轻搅拌，并孵育2分钟。使用Drummond微量移液管通过封口膜将10μL裂解样品递送至LAMP反应室中。移除罐并用切割成一定大小的qPCR胶带密封腔室。
图69A示出了使用来自微流体盒的LAMP产物作为输入，在读板仪上以100的增益运行的DETECTR结果。使用单个非模板对照(NTC)一式两份运行样品。将19μL的DETECTR主混合物(装置上使用的相同混合物)吸移到384孔板的孔中，并添加1μL的LAMP扩增子。对于一个样品，不慎添加了10μL的扩增子；所述样品由“10μL靶标”表示。由于供体对于A-SNP而言是纯合的，因此预期引导R570产生比R571更快的信号。在两个样品之间观察到轻微差异。图69A示出线图，其中x轴显示在0至30范围内的时间(分钟)，增量为10；并且y轴显示在0至60000范围内的原始荧光(任意单位(AU))，增量为20000。底部两条平整线是R570 NTC和R571 NTC。快速实现高信号的线从左到右包括R570 10ul、R 570 1ul和R571 1ul。
图69B示出了使用来自微流体芯片的样品在读板仪上运行的三种LAMP产物。LAMP反应按照芯片运行的顺序编号(LAMP_1首先运行，等等)。供体对于SNP A而言是纯合的，并且因此crRNA 570首先出现。ATTO 488用作荧光标准物。这些测量是在读板仪上进行的，增益为60。将三个LAMP反应的结果紧密地聚集在一起，其表明微流体盒和加热歧管上的扩增具有良好运行-至-运行重现性。每个LAMP反应使用每种crRNA一式三份运行，产生图中可见的误差范围。图69B示出了线图，其中x轴显示在0至30范围内的时间(分钟)，增量为10；并且y轴显示在0至8000范围内的原始荧光(任意单位(AU))，增量为2000。图底部附近的平整线是10nM ATTO488无和NTC。6000AU附近的平整虚线是100nM ATTO488无。快速实现高信号的线从左到右大致包括LAMP_1 R570和LAMP_3 R570、LAMP_2 R570、LAMP_3 R571、LAMP_1R571和LAMP_2 R571。
进行了另一个测定。如上所述制备溶液，并且使样品在图56A所示的微流体盒上运行，其在扩增室顶部添加了鲁尔连接器。如上所述制备口腔拭子样品。将盒负载，并使用以下设置运行测定：30分钟扩增，10秒泵1，40秒泵2，30分钟DETECTR。在读板仪上测量样品。图70A是测定后微流体盒的图像。与左侧孔的绿色外观相比，右侧孔的蓝色外观可能是由于右侧孔中的气泡使输入蓝光漫射导致的。图70B示出了在LAMP扩增30分钟后在读板仪上测量的DETECTR反应的结果。一个反应室中的气泡干扰了来自ESE日志的信号，因此不应该信任定量测量。然而，10分钟和20分钟时间点具有相似的信号。此外，当LED在30分钟DETECTR后打开时，两个孔在视觉上看起来均较亮。读板仪上的DETECTR结果显示，30分钟后，两个SNP的信号均较高。图70B示出了从左到右标题为R570、R571和无的线图。每个图上的x轴显示在0至80范围内的时间(秒)，增量为20；并且每个图上的y轴显示在0至60000范围内的原始荧光(任意单位(AU))，增量为20000。在最左边的图中，NTC线在底部是平坦的，而提取的DNA线快速实现高荧光信号。在中间图中，NTC线在底部是平坦的，而提取的DNA线快速实现高荧光信号。在右图中，10nM ATTO线在底部平坦，10nM ATTO线靠近中间平坦，并且100nM ATTO线在顶部平坦。
实施例30
使用微流体盒检测冠状病毒
此实施例描述了使用微流体盒检测冠状病毒。制备了含有1xMBuffer3、40nMcrRNA和50nM Cas12变体(SEQ ID NO:28)的复合反应物。在37℃下孵育30分钟后添加40nM报告子底物。将95μL DETECTR试剂负载到每个DETECTR试剂孔中并用qPCR胶带密封。将一管N基因LAMP主混合物(537μL)与32μL的100mM MgSO4混合，并将40μL的混合物负载到盒中。将10μL的Twist SARS-Cov-2标准物以不同拷贝数/μL或1X TE作为阴性对照添加至LAMP反应室。将盒***歧管中并拧紧。将LAMP反应室用qPCR胶带密封。设定温度(62℃LAMP，40℃DETECTR(考虑热偏移))并启动自动化工作流程。将3D打印的光学罩置于盒上，以使光学噪声最小化。DETECTR测量在0分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟和30分钟进行。改变LAMP反应中RNA的拷贝数以估计装置中的检测下限。
图71A、图71B、图71C和图71D示出冠状病毒DETECTR反应的结果。具有10个拷贝输入至LAMP的两个反应室导致快速递增的DETECTR信号。所有NTC均为阴性。将10个拷贝输入至LAMP中，DETECTR信号在反应过程中逐渐增加，如下面图71C中的光电二极管测量值所示。图71D中的阴性对照表明没有污染。
重复所述测定。图72A、图72B、图72C和图72D示出重复冠状病毒DETECTR反应的结果。
实施例31
微流体盒中乙型流感DETECTR测定的周转时间
此实施例描述了微流体盒中乙型流感DETECTR测定的周转时间。制备在无核酸酶水中含有2μM F3引物、2μM B3引物、16μM FIP引物、16μM BIP引物、8μM LF引物和8μM LB引物的引物混合物。制备了含有1x MBuffer3、40nM crRNA和50nM Cas12变体(SEQ ID NO:28)的复合反应物。在37℃下孵育30分钟后添加40nM报告子底物。将95μL DETECTR试剂负载到每个DETECTR试剂孔中并用qPCR胶带密封。将40μL的LAMP混合物添加至盒中。将2μL的1pMIBV靶标添加至198μL病毒裂解缓冲液中，并负载到Chip Shop罐中。使用Drummond微量移液管通过封口膜将10μL裂解样品递送至LAMP反应室中。移除罐并密封腔室。
图73A、图73B、图74A、图74B和图74C示出微流体盒中乙型流感DETECTR反应的光电二极管测量值。10分钟的扩增时间导致高于背景的信号的增加(这也可通过肉眼观察到)。5分钟的扩增时间没有导致信号的明显增加。图73A示出标题为聚合DETECTR信号：对BOB的IBV LAMPrey时间点测试的线图。x轴显示在0至25范围内的时间(分钟)，增量为5。y轴显示在0至0.5范围内的原始荧光，增量为0.1。靠近中间的3条线是15分钟LAMP、5分钟LAMP和NTC，3条线中最上面的线是15分钟lamp。图中最上面的线是10分钟LAMP。图73B示出标题为DETECTR信号：15min IBV LAMP的线图。x轴显示在0至30范围内的时间(分钟)，增量为10。y轴显示在0至0.5范围内的原始荧光，增量为0.1。靠近中间的两条线是通道1和通道2，其中通道1的线更高。
实施例32
用于自动化序列扩增和CRISPR反应的装置
此实施例描述了能够对样品进行多重扩增和CRISPR反应的装置。所述装置能够划分样品，以对单个输入样品的不同等分试样进行多个不同顺序的扩增和CRISPR反应。所述装置装有微流体芯片，所述芯片含有用于储存试剂和使样品反应的多个隔室。所述装置被配置为检测由CRISPR反应产生的信号(例如，光学信号)，并因此促进来自单个样品输入的多个测量。所述装置的可能应用是进行单独系列的扩增和CRISPR反应，以测定单个生物样品中的大量病毒。
微流体芯片的示意图描绘于图75中。在***装置中后，生物样品将被运送至第一隔室(V1)，其中可根据样品的类型和待进行的测定的数量和类型将样品与各种溶液(例如，裂解缓冲液)合并。在一些测定中，V1将在负载样品之前预负载稀释缓冲液。所述装置可将受控量的样品(例如，5μl)从第一隔室移动(例如，通过泵)至第二隔室(V2)，其中其可与来自P1的扩增试剂混合。所述装置控制V2的温度以促进扩增反应。所述装置将部分扩增产物从V2运送至V3或V4，在所述V3或V4中样品与用于CRISPR反应的试剂混合。来自V3和V4的样品可被运送至废物隔室(分别为V5和V6)。
所述装置的描述提供于图76中。所述装置被配置为将微流体芯片101保持在样品入口端口102下方。所述入口端***有可将样品拉入微流体芯片104中的第一隔室中的突出物103(例如，气动针)。微流体芯片可被移除和更换，并且被保持在温度控制元件105上方，所述温度控制元件调节微流体芯片中的隔室内的温度。所述装置含有被配置为测量来自多个微流体芯片隔室的吸光度和荧光的二极管阵列106。所述装置使用电池107作为电源。
实施例33
具有双重扩增、病毒裂解缓冲液***的流感DETECTR反应
此实施例描述了用于检测流感病毒核酸的测定。所述测定是环境温度RT-LAMP扩增和基于引导核酸驱动的可编程核酸酶的检测的组合。LAMP方案通常需要严格的操作温度，这对于在进行多种类型的反应的装置中实施是不可行的。例如，一些扩增反应所需的高温可能损坏用于CRISPR反应的试剂。此实施例公开了用于LAMP扩增的激活剂，所述激活剂可在更适合在装置内实施的温度范围内操作，包括环境温度。此实施例还提供了含有LAMP激活剂的病毒裂解缓冲液，从而可在输入样品(如含有与流感相关的核酸的拭子)后同时进行裂解和扩增。
测试了多种潜在LAMP激活剂的LAMP激活能力和病毒裂解缓冲液相容性。LAMP激活能力通过在没有单独LAMP激活剂的情况下进行双重LAMP-DETECTR测定来评价。在这些测定中，LAMP是用缓冲液、激活剂、dNTP和引物四者中的三者进行的。对具有SEQ ID NO:28和下表10中给出的引导核酸(靶向HERC2)的口腔拭子样品进行DETECTR反应。在90分钟内通过荧光监测DETECTR反应。使用在LAMP扩增过程中存在的所有四种试剂进行单独的对照测定。如图77所示，LAMP反应因不存在四种试剂中的任一者而受到抑制。不同的提取条件显示在两列中。左列显示粗裂解，并且右列显示标准商业提取方法。
表10
Figure BDA0003869671450002641
Figure BDA0003869671450002651
图78示出了靶向流感核酸的双重LAMP-DETECTR测定的结果。第一列和第三列中的图示出缺乏激活剂的LAMP反应的阴性结果。用对应于SEQ ID NO:377(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCUGCUCGAAUUGGCUUUG R1463)的gRNA检测样品，所述gRNA靶向对应于SEQ ID NO:378(AGCAGAAGCAGAGGATTTGTTTAGTCACTGGCAAACAGGAAAAAAAAATGGCGGACAACAACATGACCACAACACAAATTGAGGTGGGTCCGGGAGCAACCAATGCCACCATAAACTTTGAAGCAGGAATTCTGGAGTGCTATGAAAGGCTTTCATGGCAAAGGGCCCTTGACTACCCTGGTCAAGACCGCCTAAACAGACTAAAGAGAAAATTAGAGTCAAGAATAAAGACTCACAACAAAAGTGAGCCTGAAAGTAAAAGGATGTCTCTTGAAGAGAGAAAAGCAATTGGAGTAAAAATGATGAAAGTACTCCTATTTATGAATCCGTCTGCTGGAATTGAAGGGTTTGAGCCATACT)的靶序列。第二列和第四列中的图示出在存在激活剂的情况下，在缓冲液(第二列中的图)和病毒裂解缓冲液(第四列中的图)中进行的LAMP反应的结果。
实施例34
用于并行扩增和CRISPR反应的多腔室注塑模制盒此实施例描述了能够对一个输入样品进行多重扩增和DETECTR反应的完全集成的装置。所述装置含有用于***样品的入口端口、含有用于扩增和DETECTR反应的试剂的注塑模制盒、用于为多个反应分配样品的流体***、用于分析反应的检测组件以及用于处理反应的硬件。将样品***入口端口中使样品密封在装置内，从而防止样品和周围环境受到污染。
图79图(a)示出注塑模制盒。注塑模制盒含有用于***样品的入口端口101。入口端口的底部较窄，从而允许拭子在***后折断并密封到位。入口端口的顶部连接至被配置为气密地密封入口端口的盖102。注塑模制盒含有流体通道103(例如，微流体通道)，样品和试剂可流动通过所述流体通道，包括分配具有限定体积的样品部分的计量通道103a。所述通道通过可容纳泵(例如，蠕动泵、液压泵、连接至气动泵歧管的端口等)以及引导和计量流体流的可切换阀104的位置相互连接。一些通道含有或终止于反应隔室105。盒含有与端口107耦合的试剂储存隔室106阵列，以用于将试剂输送通过整个流体通道和反应隔室。注塑模制盒由两个部件108和109构成，所述两个部件连接至储存在盒内的气密密封试剂。注塑模制盒腔室还包括激光粘合的密封层。
图79图(b)示出能够容纳注塑模制盒的装置。所述装置含有顶部110和底部111平台，所述平台被设计为将注塑模制盒牢固地固持到位。所述装置含有控制注塑模制盒内的液压***的泵和可切换阀112阵列，以及调节注塑模制盒内的温度的加热元件113。容纳在装置内的荧光计114能够测量来自注塑模制盒中的检测室的荧光。计算装置115控制装置内的荧光计、电机和加热元件。
图80示出了利用使用户输入最小化的装置的测定方法。所述方法包括需要用户输入的芯片外制备步骤和由所述装置控制的芯片上自动化过程。注塑模制盒含有多个试剂隔室。在用于测定中之前，隔室需要填充有裂解缓冲液、扩增试剂和DETECTR试剂，包括基于荧光的报告子、可编程核酸酶和引导核酸。注塑模制盒具有能够储存多组不同的扩增试剂和DETECTR试剂(例如，具有不同靶序列的扩增试剂和DETECTR试剂)的多个隔室。在负载之前，可编程核酸酶和引导核酸需要在37℃下孵育30分钟。一旦负载了试剂，就可将注塑模制盒气密密封，然后负载到装置中。注塑模制盒可重新负载，或者可预先负载试剂。在这种情况下，所述装置可在进行DETECTR反应之前混合和预加热引导核酸和可编程核酸酶。
注塑模制盒含有用于样品***的入口端口。一旦注塑模制盒已准备好试剂并密封，就可在拭子上收集样品并将所述拭子***入口端口中。入口端口被配置为使得拭子可在入口端口内的断裂点处被折断以将样品固定在注塑模制盒内。一旦样品被固定在注塑模制盒中，就可用密封盖密封入口端口。
可将密封的注塑模制盒(负载有试剂和样品)***装置中，从而使样品制备和分析自动化。所述装置首先将样品与200μl裂解缓冲液一起孵育2分钟。所述装置将样品的20μl等分试样计量到80或180μlLAMP主混合物中，用于在60℃下等温扩增10-60分钟。将所得扩增子的10μl等分试样计量到含有DETECTR试剂的90或190μl溶液中，并在37℃下孵育，同时在470nm和520nm处进行实时激发和检测。所述装置收集并传输此数据(例如，作为无线电信号)至计算装置以供分析。所述装置可针对单个样品上的不同核酸序列进行和检测大量顺序和并行扩增和检测反应。
图81示出了用于装置的光学组件。图81图(a)示出了二极管116的阵列，其可产生470nm的光并检测520nm或594nm的光以分别激发和检测报告分子。图81图(b)示出了照明琥珀色和蓝色LED的二极管阵列。图81图(c)示出了由二极管阵列照明的注塑模制盒。
图82示出了用于注塑模制盒的可能设计。注塑模制盒含有样品室117以用于收集样品，然后将样品与多达400μl的缓冲液混合。样品室含有泵，并通过旋转阀连接至一系列流体通道118(例如，微流体通道)，所述流体通道将样品分配到多个扩增室119中。样品室出口处的旋转阀内的计量阀每次旋转将20μl等分试样从样品室过孔(sample chamber via)分配到流体通道中。扩增室通过阻力通道118b与扩增试剂室(其含有用于扩增反应的试剂)120耦合，所述阻力通道各自被配置为具有泵和阀，所述泵和阀控制进入扩增室中的储存试剂的流量。每个扩增室的后端连接至阀，所述阀计量通过第二系列流体通道121进入一系列检测室122的流量。检测室通过阻力通道118b与检测试剂室(其储存用于检测反应的试剂)123耦合，所述阻力通道各自被配置为具有泵和阀，所述泵和阀控制进入检测室中的储存试剂的流量。此注塑模制盒含有一个样品室、5个扩增室和10个检测室。
实施例35
用于对单个样品进行多重扩增和DETECTR反应的注塑模制盒设计
此实施例提供了能够为单独扩增和DETECTR反应分配样品的注塑模制盒的设计。注塑模制盒被设计用于从拭子(例如，口腔拭子)收集样品。不同扩增和DETECTR反应的组合允许测定样品的多个序列。例如，8DETECTR反应可用于查询8种单独病毒或7种病毒和内部对照。注射模制盒被设计用于安装在使样品和试剂移动、加热和检测自动化的装置内。
图83示出了具有1个样品室124、4个扩增室125和8个检测室126的注塑模制盒设计。每个扩增室和检测室分别通过阻力通道129b连接至一个扩增试剂室127或一个检测试剂室128。每个系列的腔室通过流体通道129连接，如图83所示。将样品室连接至扩增室的流体通道宽度介于300μm与1mm之间。
图84示出了用于图83中的注塑模制盒的替代设计，其中裂解试剂室130连接至样品室124。阀(v1)介导裂解试剂室与样品室之间的流动。V1-V18对应于控制腔室之间的流动的阀。
图85示出了与图84中所描绘的类似的注塑模制盒的顶部的设计。注塑模制盒可连接至用于压力驱动流的歧管。标记的腔室C1和C2对应于图84中的裂解试剂室和样品室。标记的腔室C3-C6对应于图84中的扩增试剂室。标记的腔室C7-C10对应于图84中的扩增室。标记的腔室C11-C18对应于图84中的检测试剂室。标记的腔室C19-C26对应于图84中的检测室。在这种设计中，样品室和裂解试剂室位于注塑模制盒的中心附近。控制来自C3-C6和C11-C18的流量的阀可从注塑模制盒的顶部进行控制131。检测试剂室和检测室也与扩增室进一步隔开，以进一步使检测试剂(例如，用于CRISPR反应的试剂)与扩增反应的温度隔离开，如在一些情况下，检测试剂(例如，CRISPR反应试剂)在扩增反应所需的温度下不稳定。
图86示出了含有通过旋转阀134连接的样品室132和裂解试剂室133的注塑模制盒的一部分的设计，所述旋转阀用激光粘合透明聚碳酸酯密封。可将含有样品的拭子***样品室中。可通过旋转阀134的部分旋转将裂解缓冲液从裂解试剂室泵送至样品室。旋转阀含有计量通道135a，所述计量通道可将限定体积的液体从样品隔室转移至通向扩增室136的通道135b中。因此，所述装置能够将等分试样从样品室顺序转移至每个单独扩增室。每个扩增室的出流量由阀137控制，所述阀与排出口相连。图A示出了连接裂解试剂室与样品室的旋转阀。图B示出了旋转阀部分旋转后的注塑模制盒(相对于图A)。
图87示出了含有通过滑动器阀140连接的扩增试剂室138和扩增室139的注射模制盒的一部分的设计。滑动器阀具有四个位置，第一位置用于通过第一计量通道141将流体递送至扩增室中(图A所示)，两个位置用于计量扩增室的流出量并进入计量通道142和143的流入量(这两个位置中的一个在图B中进行了描绘)，和第四位置，其中计量通道连接至通向单独的检测室的流体通道144和145(在图C中示出)。当滑动器阀处于四个位置中的第一位置时(图A所示)，扩增试剂室与扩增室之间的阀146控制两个腔室之间的流量。
图88示出了具有塑料外壳的注塑模制盒的设计。所述设计包括通向样品室的样品入口端口147，带有气密密封盖148。样品入口端口被设计为容纳拭子149。在***拭子之前，可将裂解缓冲液负载到样品入口端口的顶部。***拭子破坏密封，从而允许裂解缓冲液流动通过样品入口端口的底部并进入样品室中。一旦***，拭子就抵靠一组塑料突起150锁定在适当位置，从而使样品污染最小化。关闭样品入口端口上的盖进一步防止污染。所述设计是矩形的，使得检测室151具有平面，用于激发光在荧光检测期间通过。可在注塑模制盒的背面附近观察到滑动器阀152，所述滑动器阀计量通过扩增室的流量。注塑模制盒的顶部含有多个端口153，终止于O形环154，从而使所述盒连接至可向单独盒腔室施加压力的气动泵送歧管。图A描绘注塑模制盒的设计。图B是与图A中所示类似的注塑模制盒的功能模型的图片。图C中的注塑模制盒与图A中的注塑模制盒的不同之处在于其样品入口端口，所述样品入口端口缺乏易碎密封件和用于固持拭子的突起。
图89图A示出了注塑模制盒设计的底视图。这种设计的特征是宽而平坦的试剂室(例如，扩增试剂室)，以通过将流体来回泵入和泵出试剂室来实现快速加热和快速流体混合，而不是使不同的溶液顺序地流入单个腔室。短的盒高度允许加热器环绕反应隔室。通道155的长度连接相同类型的腔室以在用于混合时提供相等的流体阻力。从盒的底部可观察到滑动阀156、扩增试剂室157和检测室158的底部。图B示出了注塑模制芯片的俯视图。顶部159和底部160塑料壳体件在注模模制芯片周围形成气密密封。塑料壳体件上的互锁夹161有助于容易组装成单个单元。一系列O形环顶部端口162允许注塑模制盒连接至可控制在整个注塑模制盒中流动的气动泵送歧管。样品入口端口163含有由易碎密封件164塞住的顶部腔室。
实施例36
能够对单个样品进行并行扩增和CRISPR反应的注塑模制盒
此实施例描述了被设计为对单个样品进行多重扩增和CRISPR反应的注塑模制盒。此盒具有4个扩增室和8个检测室。单个样品将首先在样品室中稀释，然后在四个扩增室之间分配。来自每个扩增室的扩增产物将被分配到两个单独的检测室。每个扩增室是透明的，以便允许对CRISPR(例如，DETECTR)反应进行光学(例如，荧光)监测。每个扩增和检测室连接至独特的试剂储存室(例如，扩增试剂室)。一些腔室可负载相同的试剂，或者每个腔室可负载不同的试剂(例如，靶向不同序列的扩增试剂和DETECTR试剂)。因此，注塑模制盒能够对单个输入样品进行多达8个独特顺序的扩增和CRISPR反应。
注射模制盒被配置为***能够控制所述盒内的样品分配、试剂负载、加热和检测的装置中。所述盒含有多个阀以及气动递送歧管，它们共同允许装置控制装置内的腔室和流体通道中的流量、压力和温度。所述装置还可配备有能够测量检测室的组件的光学检测器(例如，荧光计)。
图90示出了含有样品室101和扩增室102的注塑模制盒的一部分的设计。图A和B提供自上而下的视图，而图C至E从底部示出了注塑模制盒。如图A所示，含有待分析样品的拭子103可***样品入口端口104中。所述样品入口端口具有气密密封盖105，所述气密密封盖将注塑模制盒的内容物与周围环境阻隔。一旦样品被***样品室中，旋转阀106就可将裂解缓冲液从裂解缓冲液储存室107递送至样品室。图A示出了连接裂解缓冲液储存室和样品室的旋转阀。一旦样品裂解完成，旋转阀就可将20μl样品等分试样转移至计量通道108中，所述计量通道可旋转以将样品递送至通向四个扩增试剂室110的微流体通道109中。图B示出了被定位成连接计量通道与样品室的旋转阀。
如图C所描绘的自底而上视图所示，扩增试剂室的内容物可流入扩增室101中。通过使内容物在两个腔室之间来回移动来进行混合。一旦混合完成，就将样品完全转移至扩增室中并孵育一段受控的时间。如图D中所示，注塑模制盒可位于控制装置内的加热元件上方，从而允许在扩增期间进行温度控制。
流入和流出扩增室的方向由滑动器阀111介导。图C描绘了处于将每个扩增试剂室连接至扩增室的第一位置的滑动器阀。一旦扩增反应完成，图可滑动至第二和第三位置(所述位置之一在图E中描绘)，从而允许样品从扩增室移动到计量通道112中。滑动器然后能够采用第四位置，其中计量通道与通向检测试剂室的通道113重叠。因此，样品在扩增后被分到8个独立的组件中。
图91图A提供了含有检测试剂室和检测室的注塑模制盒的部分的设计。在扩增之后，样品从扩增室流动并进入检测试剂室114。样品然后从检测试剂室流动并向下级联进入检测室115。注塑模制盒连接至塑料盖片，所述塑料盖片安装在所述盒顶部并密封其腔室。图B示出了带有塑料盖片116的注塑模制盒。如图B的侧视图所示，检测室具有平坦、透明的表面，从而实现荧光激发和检测。检测室位于控制装置中能够升高检测室温度的第二加热器上方。检测室之间的黑色凸台使腔室之间的光污染最小化，从而提高光学实验(例如，发光检测、荧光等)的精确度和灵敏度。
图92图A和B提供注塑模制盒的全视图。扩增室102、裂解缓冲液储存室107、扩增试剂室110和检测试剂室114是打开的，并且可负载有溶液和试剂。一旦将所需的试剂负载到装置中，就可将塑料盖片连接至注塑模制盒上，从而密封所述装置内的腔室和流体通道。图C示出了连接有塑料盖片116的注塑模制盒的工作物理模型的图片。塑料盖片含有顶部为O形环的入口端口118阵列，所述入口端口可连接至气动歧管，所述气动歧管能够引导注塑模制盒内的整个腔室和流体通道中的流动。盒的总尺寸是92mm x 80mm x 52.5mm(包括样品入口端口的高度)和92mm x 80mm x 19.5mm(不包括样品入口端口)。保持环在注塑模制盒与入口端口之间形成密封，否则它们是不同的和可分离的。
实施例37
用于激发和检测来自注塑模制盒的荧光检测的二极管阵列
此实施例涵盖多腔室盒中荧光读出DETECTR反应的检测方案。所述盒被设计为对经历了扩增的样品的不同部分进行单独DETECTR反应。图93示出了容纳在装置102中的注塑模制盒101，所述装置含有能够检测来自每个腔室的光的二极管阵列和被定位成照明腔室的白光发光二极管103。注塑模制盒具有8个检测室104。最左边的四个(橙色)检测室含有染料ATTO 594，并且最右边的四个室含有染料ATTO 488。含有594染料的检测室的正面(之初装置开口)涂有橙色凝胶滤光片。含有488染料的检测室的正面涂有黄色滤光片。白光从侧面照明检测室，从而激发检测室内的荧光染料。检测室面向白光的侧面可涂有滤光片或颜色吸收凝胶。所述装置含有检测从检测室发出的光的二极管，因此允许所述装置使用荧光报告子监测DETECTR反应。
图94图A和B示出了用于控制白光、检测二极管和用于监测在检测二极管上收集的数据的图形用户界面。图形用户界面允许用户设置温度关闭点(例如，配置检测器二极管以在其温度超过50℃时关闭)、通过二极管的偏置电压或电流以及每个检测器二极管上的采样率(例如，100Hz)。所述图形可展示来自每个检测器二极管的荧光读出数据。
图95示出了二极管阵列的校准测试的结果。每组8个数据点对应于8个检测器二极管在单个测试中收集的数据。数据集A是在装置中没有注塑模制盒的情况下收集的。数据集B-H是在装置中具有空注塑模制盒的情况下收集的。数据集B是在空盒上收集的。数据集C和D是在盒含有缓冲液但不含染料的情况下收集的。数据集E、F和G是在盒含有1nM、10nM和100nM染料的情况下收集的，其中二极管1-4在含有ATTO 488的孔和含有ATTO 594的孔5-8上收集。数据集H是在孔1-3中100nM ATTO 488、孔4中1μM ATTO 488、孔5-7中100nM ATTO594和孔8中1μM ATTO 594的情况下收集的。图95示出了指定为A、B、C、D、E、F、G和H的8个部分中的条形图。部分1是LED打开、没有芯片，部分B是LEDS打开、空芯片，部分C是LEDS打开、具有100ul 1x TE的芯片，部分D是LEDS打开、具有90ul 1x TE的芯片，部分E是90ul的1nM染料，部分F是90ul的10nM染料，部分G是90ul的100nM染料，并且部分H是100nM和1uM。每个部分中有7个条形，从左到右是二极管1、二极管2、二极管3、二极管4、二极管5、二极管6、二极管7和二极管8。y轴显示2.4至3.0范围内的荧光(任意单位(a.u.))，增量为0.1。
实施例38
使用二极管阵列测量进行的HERC2 DETECTR测定
此实施例描述了使用实施例37的二极管阵列在实施例36的注塑模制盒上进行的DETECTR测定。用于DETECTR测定的试剂直接负载到检测室中。所述测定利用具有SEQ IDNO:28的可编程核酸酶、具有SEQ ID NO:270的靶向HERC2 G SNP等位基因的引导核酸以及在裂解后增加荧光响应的报告子核酸。四个孔含有5μM报告子、150nM可编程核酸酶、600nM引导核酸和500pM靶核酸。两个孔含有5μM报告子、150nM可编程核酸、600nM引导核酸，并且没有靶标。两个孔仅含有缓冲液。报告子含有ATTO 488或ATTO 594。
图96示出了通过8个二极管的检测器阵列测量的来自8个检测室的荧光迹线。含有报告子、可编程核酸酶、引导核酸和靶核酸的检测室提供随时间推移线性增加的荧光响应。含有DETECTR试剂但缺乏靶核酸的检测室和仅含有缓冲液的检测室均未显示荧光增加。因此，具有活性反式附带报告子裂解的检测室可通过荧光区分。图96示出了线图，其中x轴显示在0至35范围内的DETECTR时间点(分钟)，增量为5；并且y轴显示在-0.02至0.12范围内的净荧光(任意单位(a.u.))，增量为0.02。线性增加的四条线从左/最高到右/最低是G-SNP–488nm、G-SNP–594nm、G-SNP–488nm和G-SNP–488nm。先前列表中的最后两个几乎重叠。靠近底部的较高平线对应于DETECTR MM–488nm。底部的较低平线对应于DETECTR MM–594nm和1XTE–594nm。
图97示出了DETECTR试剂添加后30分钟检测室的图像。检测室1、4、5和8含有靶核酸，并且明显比其余检测室更亮。
实施例39
使用逆转录酶PCR DETECTR测定检测冠状病毒变体
逆转录酶PCR DETECTR反应可用于检测SARS-CoV-2变体，特别是称为20B/501Y.V1、VOC 202012/01或B.1.1.7谱系的英国(UK)变体，或者称为以下的南非变体：20C/501Y.V2或B.1.351谱系。参见www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/more/science-and-research/sci entific-brief-emerging-variants.html。这些变体的遗传特征在Leung等人,Early transmissibility assessment of the N501Y mutant strains of SARS-CoV-2in the United Kingdom,2020年10月至11月,Euro Surveill.2021；26(1)和Tegally等人,Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2(SAR S-CoV-2)lineage with multiple spike mutations inSouth Africa,Me dRxiv 2020.12.21中进行了论述。可使用表12中列出的一种或多种引物对含有对应于英国或南非变体的靶核酸的样品进行扩增，并且可使用利用Cas12M08(Cas12家族内的变体，具有SEQ ID NO:28)和表14中描述的gRNA之一的荧光测定检测变体所特有的核酸中的突变。在本文的实施例中描述的RT-LAMP可以可替代地用于扩增。本领域技术人员将认识到RT-LAMP方法可以可替代地用于扩增方法反应，对引物的进行适当的修改。
表11列出了表征英国和南非变体的Spike基因中的某些突变，所述突变中的一个或多个可被选择作为RT-PCR DETECTR反应的靶标。由Spike(“S”)基因(GenBank RefMN908947.3:21563..25384)编码的表面糖蛋白(GenBank Ref QHD43416.1)的氨基酸序列提供于图101中。Spike基因的核苷酸序列提供于图102A和102B中。可用于区分目标株的其他突变位于SARS-CoV-2基因组的其他区域中。关于表11-14，氨基酸突变相对于图101中描绘的序列按以下形式描述：[野生型氨基酸][氨基酸数量][突变型氨基酸]。括号中的小写核苷酸对应于野生型核苷酸，并且括号中的大写核苷酸对应于包含突变的突变型核苷酸(即，编码所述突变型氨基酸)。此外，“xxx”是指未知的SNP。已经使用从GISAID获得的所有可用基因组获得了SARS-CoV-2靶序列。
表11–表征英国和南非变体的遗传变化。
Figure BDA0003869671450002761
可选择包含表12中详述的突变组的任何Spike基因区域作为扩增子。表12列出Spike基因(参考名称MN908947.3)中存在的突变。Spike区域是病毒基因组中变异最大的区域，并且是当前SARS-CoV-2疫苗设计的主要区域。可选择包含分别在表12的第2列和第3列中给出的起始和终止核苷酸(nt)的扩增子。右侧的三个列详细说明了突变是否存在于英国变体、南非变体和/或两种变体中。此外，表13详细说明了包含表11中详述的各种突变的南非变体和英国变体的基因片段。表13的第2列详细说明基因片段中包含的突变。
表12-Spike基因(参考名称MN908947.3)的组合株的示例性突变。
Figure BDA0003869671450002762
Figure BDA0003869671450002771
表13–南非和英国株的基因片段
Figure BDA0003869671450002772
Figure BDA0003869671450002781
Figure BDA0003869671450002791
DETECTR测定使用逆转录酶-PCR以进行预扩增。特别地，使用了一种极端PCR技术，其中通过反应温度的近乎瞬时的变化将PCR反应的速度降低到少于5分钟。这种快速温度变化可通过在薄壁容器中移动各种温度的加热区(水浴、加热块等)之间的反应来实现，而不是在每个循环中冷却或加热整个仪器。可替代地，反应体积可在两个或三个加热区之间泵送，以实现这种快速热变化并驱动PCR反应。通过增加反应的引物、聚合酶和Mg2+浓度，可实现PCR反应的额外速度增加。使用表14中描述的一种或多种引物。引物是使用Panel Plex(https://www.dnasoftware.com/)设计的。表14提供每个引物的序列，以及靶序列中包含的与它们相容的突变。
表14：针对逆转录酶-PCR-DETECTR测定设计的引物
Figure BDA0003869671450002792
Figure BDA0003869671450002801
Figure BDA0003869671450002811
Figure BDA0003869671450002821
在完成扩增步骤后，可将扩增子与Cas12M08-gRNA复合物合并，并允许进行基于荧光的反式裂解测定，如例如本文先前实施例中所述。使用表15中公开的任何gRNA序列来检测序列。表15提供了crRNA类型的英国变体和南非变体并与Cas12M08蛋白相容的示例性引导物。关于表15，在引导物的名称中，“d6-7”是指缺失60至70。“wt”是指原始野生型SARS-CoV-2，“m”是指突变型变体的引导物并且“mp”是指突变体毒物。突变体毒物引导物被设计为进一步破坏引导物识别野生型序列的稳定性，因为被设计为识别突变体的一些引导物也可识别野生型，但速率较低。换言之，相对于野生型，突变体毒物引导物促进对突变体的更强识别。“名称”列中的编号提供突变的氨基酸位置。Cas12M08蛋白可识别以下PAM中的任一者：ttcc、tcca、tttg、tta、cttg、cctt、tta、tttc、ttcc、tcca、ttg、tttg、ttg、tca、ctca、ttct、cttg、tttc、tcta、ctct或ttg。
表15英国和南非变体的示例性引导物
Figure BDA0003869671450002822
Figure BDA0003869671450002831
Figure BDA0003869671450002841
Figure BDA0003869671450002851
Figure BDA0003869671450002861
实施例40：
通过快速热循环检测SARS-CoV-2
此实施例描述了为了优化测定反应条件以通过快速热循环快速检测SARS-CoV-2(本文称为FASTR测定)所采取的步骤。FASTR使用一种极端PCR技术，其中通过反应温度的近乎瞬时的变化将PCR反应的速度降低到少于5分钟。这种快速温度变化可通过在薄壁容器中移动不同温度的加热区(水浴、加热块等)之间的反应来实现，而不是在每个循环中冷却或加热整个仪器。可替代地，反应体积可在两个或三个加热区之间泵送，以实现这种快速热变化并驱动PCR反应。通过增加反应的引物、聚合酶和Mg2+浓度，可实现PCR反应的额外速度增加。
图103描绘了来自聚合酶和缓冲液组合的结果，所述组合能够使用来自CDC测定的N2引物(引物序列呈现在表16中)快速扩增SARS-CoV-2。所述测定在两个目标浓度下进行：2个拷贝/反应(rxn)和10个拷贝/反应(rxn)。反应(rxn)条件如下：在98℃下初始变性30秒，然后是包括98℃下1秒和65℃下3秒的45个循环。在热循环之后，将扩增子转移至Cas12M08检测反应，在37℃下持续30分钟。图103中呈现的数据是来自CRISPR反应的信号。表现最佳的酶/缓冲液对是在两种测试浓度下给出强信号的那些。
图103中鉴定的靠前的酶和缓冲液以各种浓度和多次重复进行测试，如图104所示，以进一步优化FASTR的反应条件。反应条件如下：在98℃下初始变性30秒，然后是包括98℃下1秒和65℃下3秒的45个循环。所使用的引物来自针对SARS-CoV-2的CDC N2测定(引物序列呈现于表16中)。在热循环之后，将扩增子转移至Cas12M08检测反应，在37℃下持续30分钟。图104中呈现的数据是来自CRISPR反应的信号。表现最佳的酶/缓冲液对是在最低测试浓度下并在重复检测中给出强信号的酶/缓冲液对。
为了进一步评价FASTR测定的性能，从1000个拷贝/反应至1个拷贝/反应评价了所述测定的检测限。反应条件如下：在55℃下逆转录60秒，在98℃下初始变性30秒，然后是包括98℃下1秒和65℃下3秒的45个循环。所使用的引物来自针对SARS-CoV-2的CDC N2测定(序列呈现于表16中)。在热循环之后，将扩增子转移至Cas12M08检测反应，在37℃下持续30分钟。图105中呈现的数据是来自CRISPR反应的信号。所述测定在1个拷贝/反应下表现良好，并且能够在单拷贝水平下检测SARS-CoV-2。
接下来，评价了快速循环时间的变化对FASTR测定中的变性和退火/延伸的影响。为了确定FASTR测定的最佳循环条件，在变化的循环条件下评价了所述测定的性能。对于所有反应，逆转录在55℃下进行60秒，并且初始变性在98℃下进行30秒。所测试的循环条件是：98℃持续1秒，65℃持续3秒；98℃持续2秒，65℃持续2秒；或98℃持续1.5秒，65℃持续1.5秒。所使用的引物来自针对SARS-CoV-2的CDC N2测定(序列呈现于表16中)。在热循环之后，将扩增子转移至Cas12M08检测反应，在37℃下持续30分钟。图106中的结果表明在65℃下>2秒的退火/延伸时间对于稳健灵敏度是必要的。
接下来，为了使FASTR的逆转录(RT)时间最小化，在55℃下使用各种逆转录孵育时间评价了FASTR测定的性能，以确定FASTR测定的最小逆转录条件。图107中这种测定优化的结果指示所述测定在30秒逆转录以上最稳健。
为了测试反应缓冲液的pH对FASTR测定性能的影响，使用pH 9.2或pH 7.8的缓冲液对FASTR测定的性能进行了评价。如图108所示的结果表明更高的pH缓冲液在扩增子产率和灵敏度方面产生了优异结果。
为了测试FASTR测定与粗裂解缓冲液的相容性，评价了当与各种粗裂解缓冲液(包括粗裂解缓冲液VTE5、A3和来自ChargeSwitch试剂盒(Thermo)的洗脱缓冲液)组合时FASTR测定的性能。如图109所示，FASTR测定在VTE5裂解缓冲液中表现最好，但在A3缓冲液中表现稍微不那么稳健。来自ChargeSwitch试剂盒的洗脱缓冲液的性能与对照反应(水)相似。
如图110所示，针对SARS-CoV-2和RNA酶P POP7(内源性对照)的多重FASTR的初始非优化测试表明，虽然单重测定在DETECTR中产生了稳健信号，但双重测定倾向于对于SARS-CoV-2(R1763)产生微弱信号，并且对于RNA酶P(R1965)几乎没有产生信号。反应条件如下：在55℃下逆转录60秒，在98℃下初始变性30秒，然后是包括98℃下1秒和65℃下3秒的45个循环。所使用的引物来自针对SARS-CoV-2的CDC N2测定，以及如表16中所示的M3637/M3638。
接下来，考虑到图110中未优化多重FASTR测定的结果，为了优化SARS-CoV-2和RNA酶P的多重FASTR，设计了一组新的SARS-CoV-2引物(M3257/M3258)(序列呈现于表16中)。然后进行了一系列具有变化的反应条件的实验，所述反应条件含有缓冲液、引物浓度、dNTP和DMSO的不同组合。如图111所示的此实验的结果鉴定了对于多重反应稳健进行的两种反应条件(由反应4和反应9处的箭头描绘)。在反应4中，使用了以下条件：1X FastBuffer 2、1μMRNA酶P引物、0.5μM CoV引物、0.2mM dNTP、2％ DMSO。在反应9中，使用了以下条件：1XKlentaq1缓冲液、1μM RNA酶P引物、0.5μM CoV引物、0.4mM dNTP、0％ DMSO。在正常反应条件下，逆转录在55℃下进行60秒，初始变性在98℃下进行30秒，然后是包括98℃下1秒和65℃下3秒的45个循环。在许可反应条件下，逆转录在55℃下进行60秒，初始变性在98℃下进行30秒，然后是包括98℃下3秒和65℃下5秒的45个循环。
一旦优化了这些条件，就在不同浓度的人RNA和病毒RNA下评价经优化的多重FASTR测定，以评价多重FASTR反应的检测限。如图111所示的结果表明所述测定在人类RNA浓度范围下进行，同时保持约5个拷贝/反应的灵敏度。如图112所示的结果来自DETECTR反应，使用引物R1965来检测人RNA酶P，或使用引物R3185(标记为M3309)来检测SARS-CoV-2。R1965和R3185的引物序列呈现于表16中。所测试的反应条件如下：在55℃下逆转录60秒，在98℃下初始变性30秒，然后是包括98℃下1秒和65℃下3秒的45个循环。所使用的引物是M3257/M3258(SARS-CoV-2)和M3637/M3638(RNA酶P)(呈现于表16中)。
表16：用于优化使用快速热循环测试SARS-CoV2的反应(rxn)条件的引物和gRNA
Figure BDA0003869671450002901
实施例41：
用于检测SARS-CoV-2的SNP变体的引导物筛选的设计
此实施例描述了能够鉴定引导RNA的引导筛选，所述引导RNA能够实现对SARS-CoV-2的刺突区域内的不同SNP位置的检测。设计了一系列引导物来区分E484K和N501Y处的野生型和突变体序列。E484K SNP代表在南非发现的SARS-CoV-2的B.1.351变体。N501Y SNP是在英国发现的SARS-CoV-2的B.1.1.7变体所特有的。N501Y也在B.1.351变体中发现。鉴定用于SNP检测的合适的cfRNA引导物的第一步是针对野生型序列和突变体序列的基因片段筛选所有引导物。将由野生型或突变体序列组成的基因片段扩增并用作DETECTR反应中的模板，如图113所示。筛选由野生型或突变体序列(E484K)组成的基因片段中可区分它们的引导序列。在第二种类似测定中，如图114所示，筛选由野生型或突变体序列(N501Y)组成的基因片段中可区分它们的引导序列。
图113和图114中所示的数据是被设计用于鉴定两个不同SNP位置(分别E484K和N501Y)的引导物筛选的实例。如图114如所示，理想的引导物识别它们的特异性靶标下至核苷酸序列(例如R4550)。如图113所示，不太“严格”的引导物可能无法区分野生型和突变体序列之间的单核苷酸变化(例如4541)。如图113所示，与其他序列相比，引导物通常对一个序列表现出更强的偏好，这取决于“严格性”将提供足够的SNP区分。这方面的实例是R4542或R4545，它们两者均应鉴定突变体SNP E484K，但显示出低水平的野生型检测(图113)。野生型反应中引导物的定时和强度使得这些引导物仍然提供突变体序列的较强区分。

Claims (75)

1.一种测定样品中的冠状病毒靶核酸的区段的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与以下物质接触：
i)检测剂核酸；和
ii)组合物，所述组合物包含可编程核酸酶和与所述靶核酸的区段杂交的非天然存在的引导核酸，其中在所述非天然存在的引导核酸与所述冠状病毒靶核酸的区段杂交后，所述可编程核酸酶裂解所述检测剂核酸；以及
b)测定信号的变化，其中所述信号的变化由所述检测剂核酸的裂解产生。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述冠状病毒靶核酸来自SARS-CoV-2。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述冠状病毒靶核酸来自E基因、N基因或它们的组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述冠状病毒靶核酸具有SEQ ID NO:179–SEQ IDNO:184中的任一项的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述引导核酸是引导RNA。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述引导核酸与SEQ ID NO:171–SEQ IDNO:178、SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:219中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述引导核酸选自SEQ ID NO:171–SEQID NO:178、SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:219中的任一项。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，所述方法还包括扩增所述冠状病毒靶核酸。
9.如权利要求8所述的方法，其中扩增所述冠状病毒靶核酸包括使所述样品与用于扩增的试剂接触。
10.如权利要求9所述的方法，其中使所述样品与用于所述扩增的试剂接触在使所述样品与所述检测剂核酸与所述检测剂核酸和所述组合物接触之前发生。
11.如权利要求9所述的方法，其中使所述样品与用于所述扩增的试剂接触与使所述样品与所述检测剂核酸与所述检测剂核酸和所述组合物接触同时发生。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述扩增包括热循环扩增。
13.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述扩增包括等温扩增。
14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中所述扩增包括转录介导的扩增(TMA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)、链置换扩增(SDA)、环介导的扩增(LAMP)、指数扩增反应(EXPAR)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、简单方法扩增RNA靶标(SMART)、单引物等温扩增(SPIA)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、铰链起始的引物依赖性核酸扩增(HIP)、切口酶扩增反应(NEAR)或改进的多重置换扩增(IMDA)。
15.如权利要求8-11或13-14中任一项所述的方法，其中所述扩增包括环介导的扩增(LAMP)。
16.如权利要求9-14中任一项所述的方法，其中所述用于扩增的试剂包括扩增引物、聚合酶和dNTP。
17.如权利要求9-16中任一项所述的方法，其中所述用于扩增的试剂包括FIP引物、BIP引物、LF引物和LB引物。
18.如权利要求16-17中任一项所述的方法，其中所述扩增引物选自SEQ ID NO:194–SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:202–SEQ ID NO:205。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述冠状病毒靶核酸逆转录。
20.如19所述的方法，其中所述逆转录包括使所述样品与用于逆转录的试剂接触。
21.如20所述的方法，其中所述用于逆转录的试剂包括逆转录酶、寡核苷酸引物和dNTP。
22.如权利要求20-21中任一项所述的方法，其中使所述样品与用于逆转录的试剂接触在使所述样品与所述检测剂核酸与所述检测剂核酸和所述组合物接触之前发生，在使所述样品与所述用于扩增的试剂接触之前发生，或在两者之前发生。
23.如权利要求20-21中任一项所述的方法，其中使所述样品与用于逆转录的试剂接触与使所述样品与所述检测剂核酸和所述组合物接触同时发生，与使所述样品与所述用于扩增的试剂接触同时发生，或与两者同时发生。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过使对照核酸与第二检测剂核酸和组合物接触来测定对照序列，所述组合物包含所述可编程核酸酶和与所述对照核酸的区段杂交的非天然存在的引导核酸，其中在所述非天然存在的引导核酸与所述对照核酸的区段杂交后，所述可编程核酸酶裂解所述检测剂核酸。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述对照核酸是RNA酶P。
26.如权利要求24-25中任一项所述的方法，其中所述对照核酸具有SEQ ID NO:220的序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述引导核酸与SEQ ID NO:178、SEQID NO:218或SEQ ID NO:219具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述引导核酸是SEQ ID NO:178、SEQID NO:218或SEQ ID NO:219。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述方法在侧流条上进行。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述侧流条包括样品垫区域、对照线和测试线。
31.如权利要求30所述的方法，所述方法还包括将所述样品添加至所述样品垫区域。
32.如权利要求30-31中任一项所述的方法，其中在所述对照线处检测未裂解的报告分子的存在或不存在，并且在测试线处呈现裂解的报告分子的存在或不存在。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述方法在微流体盒中进行。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，所述方法还包括裂解所述样品。
35.如权利要求34所述的方法，其中裂解所述样品包括使所述样品与裂解缓冲液接触。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述可编程核酸酶包含RuvC催化结构域。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述可编程核酸酶是V型CRISPR/Cas效应蛋白。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效应蛋白是Cas12蛋白。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述Cas12蛋白包含Cas12a多肽、Cas12b多肽、Cas12c多肽、Cas12d多肽、Cas12e多肽、C2c4多肽、C2c8多肽、C2c5多肽、C2c10多肽和C2c9多肽。
40.如权利要求38-39中任一项所述的方法，其中所述Cas12蛋白与SEQ ID NO:18–SEQID NO:60中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述Cas12蛋白选自SEQ ID NO:18–SEQ ID NO:60。
42.如权利要求37所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效应蛋白是Cas14蛋白。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述Cas14蛋白包含Cas14a多肽、Cas14b多肽、Cas14c多肽、Cas14d多肽、Cas14e多肽、Cas14f多肽、Cas14g多肽、Cas14h多肽、Cas14i多肽、Cas14j多肽或Cas14k多肽。
44.如权利要求42-43中任一项所述的方法，其中所述Cas14蛋白与SEQ ID NO:61–SEQID NO:152中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述Cas14蛋白选自SEQ ID NO:61–SEQ ID NO:152。
46.如权利要求37所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效应蛋白是CasФ蛋白。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述CasФ蛋白与SEQ ID NO:221–SEQ ID NO:268中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
48.如权利要求46-47中任一项所述的方法，其中所述CasФ蛋白选自SEQ ID NO:221–SEQ ID NO:268。
49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，所述方法还包括体外转录经扩增的冠状病毒靶核酸。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述体外转录包括使所述经扩增的冠状病毒靶核酸与用于体外转录的试剂接触。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述用于体外转录的试剂包括RNA聚合酶、引物和NTP。
52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述可编程核酸酶包含HEPN裂解结构域。
53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述可编程核酸酶是VI型CRISPR/Cas效应蛋白。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述VI型CRISPR/Cas效应蛋白是Cas13蛋白。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述Cas13蛋白包含Cas13a多肽、Cas13b多肽、Cas13c多肽、Cas13c多肽、Cas13d多肽或Cas13e多肽。
56.如权利要求54-55中任一项所述的方法，其中所述Cas13蛋白与SEQ ID NO:153–SEQID NO:170中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
57.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述Cas13蛋白选自SEQ ID NO:153–SEQ ID NO:170。
58.如权利要求1-57中任一项所述的方法，所述方法还包括多于一种冠状病毒靶核酸的多重检测。
59.如权利要求1-58中任一项所述的方法，所述方法还包括多于一种冠状病毒靶核酸和对照核酸的多重检测。
60.如权利要求58-59中任一项所述的方法，其中所述多重检测在试管、孔板、侧流条或微流体盒中进行。
61.如权利要求1-60中任一项所述的方法，其中样品裂解、逆转录、扩增、体外转录、检测或它们的任何组合在单个体积中进行。
62.如权利要求1-60中任一项所述的方法，其中样品裂解、逆转录、扩增、体外转录、检测或它们的任何组合在单独体积中进行。
63.一种包含非天然存在的引导核酸的组合物，所述非天然存在的引导核酸与SEQ IDNO:171–SEQ ID NO:177中的任一项具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述引导核酸选自SEQ ID NO:171–SEQ ID NO:177中的任一项。
65.如权利要求63-64中任一项所述的组合物，所述组合物还包含如权利要求1-64中任一项所述的检测剂核酸。
66.如权利要求63-65中任一项所述的组合物，所述组合物还包含如权利要求1-64中任一项所述的可编程核酸酶。
67.如权利要求63-66中任一项所述的组合物，所述组合物还包含如权利要求9-64中任一项所述的用于扩增的试剂。
68.如权利要求63-67中任一项所述的组合物，所述组合物还包含如权利要求20-64中任一项所述的用于逆转录的试剂。
69.如权利要求63-68中任一项所述的组合物，所述组合物还包含如权利要求57-64中任一项所述的用于体外转录的试剂。
70.如权利要求63-69中任一项所述的组合物，所述组合物还包含如权利要求35-69中任一项所述的裂解缓冲液。
71.如权利要求63-70中任一项所述的组合物，所述组合物还包含如权利要求24-69中任一项所述的对照核酸。
72.如权利要求63-71中任一项所述的组合物，所述组合物还包含如权利要求24-62中任一项所述的引导核酸。
73.如权利要求70-72中任一项所述的组合物，其中所述组合物存在于如权利要求29-62中任一项所述的侧流条中。
74.如权利要求63-73中任一项所述的组合物，其中所述组合物存在于微流体盒中。
75.一种装置，所述装置包括：
样品接口，所述样品接口被配置为接收包含目标冠状病毒序列的样品；
与所述样品接口和检测室流体连通的通道，所述通道包括一个或多个可移动机构以将所述样品分离成多个液滴，其中所述检测室被配置为接收所述多个液滴并使所述多个液滴与设置在所述检测室表面上的至少一个可编程核酸酶探针接触，其中所述至少一个可编程核酸酶探针包含与可编程核酸酶复合的引导核酸；以及
多个传感器，所述多个传感器通过检测由所述至少一个可编程核酸酶探针裂解所述至少一个目标序列的靶核酸区域后产生的信号来确定所述目标冠状病毒序列的存在。
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