CN115515430A - 用于宠物食品产品的抗微生物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗微生物组合物用于向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物的抗微生物活性的方法和用途，所述抗微生物组合物由以下组成：(i)至少30％的乳酸，和(ii)至少两种选自乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的羧酸。

Description

用于宠物食品产品的抗微生物组合物
技术领域
本发明涉及组合物的用途及用于制备其的方法，所述组合物向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物的抗微生物活性。
背景技术
宠物食品产品容易受到微生物(特别是细菌)的微生物污染，所述微生物如沙门氏菌属(Salmonella)、李斯特菌属(Listeria)、大肠埃希菌(Escherichia coli)和梭菌属(Clostridium)。尽管宠物食品工业通过使用长蒸煮时间和高温来积极提高质量和安全性，但仍可能发生不希望的，尤其是致病或腐败微生物的交叉污染，例如在后加工期间。
脂肪和油是宠物食品的主要组成，有助于它们的质地、气味和/或风味、营养价值和适口性。大多数情况下，高比例的脂肪在蒸煮-挤出步骤后被涂在粗粒(kibble)上。因此，即使宠物食品制造商遵循良好的生产规范，使用受沙门氏菌属污染的脂肪也可能导致宠物或人患病。
已经证明，为此目的寻找有效的抗微生物剂是宠物食品工业的一项挑战，因为这些抗微生物剂必须是适口的、安全的、具有成本效益的、稳定的，并且即使在少量(如低于1％)也有效。
到目前为止，磷酸是宠物食品工业中使用最多的抗微生物剂之一，特别是因为它不仅有效和便宜，而且不会对宠物食品的适口性产生负面影响。然而，为了提供微生物控制，需要以相对高的水平添加磷酸。由于添加磷酸而添加的水可能会损害脂肪的氧化稳定性，并降低宠物食品产品的质量。此外，不能将磷酸视为天然溶液。最后但并非最不重要的一点是，磷的摄入有时需要被限制，例如当肾功能下降时，如在肾病的情况下。
已经研究了天然的替代化合物，如乳酸。专利申请号WO2012/018913公开了乳酸特别是0.1％至3％的量的乳酸赋予干燥宠物食品抗沙门氏菌属的抗微生物活性的用途。然而，进一步观察到，单独使用乳酸有时会降低适口性，尤其是对狗的适口性。
因此，本发明的一个目的在于提供一种抗微生物剂的组合，其可以有效地保护宠物食品产品，并且至少与单独的乳酸一样有效，同时确保至少维持对猫和狗的适口性。
本发明的另一个目的在于提供一种抗微生物组合物，其在掺入宠物食品产品时在低量特别是在小于1％时是有效的。
本发明的另一个目的在于提供一种抗微生物组合物，其具有保护脂肪免受微生物污染的特殊能力。
本发明的另一个目的在于提供一种由天然抗微生物剂制成的组合物。
发明内容
本发明涉及一种用于向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物的抗微生物活性的方法，以及用于向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物的抗微生物活性的组合物的用途。
附图说明
通过参考以下附图来阐明本发明：
图1：肠沙门氏菌肠亚种婴儿血清型(Salmonella enteric subsp.entericaser.Infantis)、姆班达卡沙门氏菌血清型(Salmonella ser.Mbandaka)和山夫顿堡沙门氏菌血清型(Salmonella ser.Senftenberg)的等份混合物在脂肪中孵育20小时后，组合物15的抗微生物活性(“测量的”)对比组合物2、3、4的累积抗微生物活性(“计算的”)。
图2：在肠沙门氏菌肠亚种纽波特血清型(Salmonella enteric subsp.entericaser.Newport)、山夫顿堡沙门氏菌血清型和鼠伤寒沙门氏菌血清型(Salmonellaser.Typhimurium)的等份混合物中，组合物16(500或1000ppm)对比组合物1(1000ppm)、5(500ppm)、6(500ppm)、7(500ppm)、8(500ppm)的随时间变化的抗微生物活性。T+代表不含任何抗微生物剂的对照。
图3：在肠沙门氏菌肠亚种婴儿血清型、姆班达卡沙门氏菌血清型和山夫顿堡沙门氏菌血清型的等份混合物中，组合物18(1000ppm)对比组合物1(1000ppm)和14(1000ppm)的随时间变化的抗微生物活性。T+代表不含任何抗微生物剂的对照。
图4：在肠沙门氏菌肠亚种纽波特血清型、山夫顿堡沙门氏菌血清型和鼠伤寒沙门氏菌血清型的等份混合物中，组合物17(1000ppm)的随时间变化的抗微生物活性。T+代表不含任何抗微生物剂的对照。
图5：在肠沙门氏菌肠亚种纽波特血清型、山夫顿堡沙门氏菌血清型和鼠伤寒沙门氏菌血清型的等份混合物中，组合物19(1000ppm)对比组合物9、10、11、12(1000ppm)的随时间变化的抗微生物活性。
具体实施方式
定义
除非另有特别说明，量或百分比在本文中以产品参考的重量表示。
在本公开中，范围以简写形式表述，从而避免必须详细说明并描述该范围内的每个值和每种值。在适当的情况下，可以选择范围内的任何适当值作为范围的上限值、下限值或终点值。例如，0.1-1.0(从0.1到1)的范围表示终点值0.1和1.0，以及中间值0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，和涵盖在0.1至1.0内的所有中间范围，如0.2至0.5、0.2至0.8、0.7至1.0等。此外，术语“至少”和“小于(less than)”涵盖其后引用的值。例如，“至少5％”必须被理解为也涵盖“5％”，“小于5％”被理解为也涵盖“5％”。
如本文所使用的术语“约”在指代可测量的值(如量、持续时间等)时，意在涵盖可以由参考技术领域的技术人员容易地确定的标准变化。优选地，除非另有明确说明，这些值旨在涵盖±5％的变化。
如全文所使用，除非上下文另有明确规定，词语的单数形式包括复数，反之亦然。因此，引述“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”通常包括各个术语的复数。例如，引述“一种方法”或“一种食品”包括多种这样的“方法”或“食品”。类似地，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被非排他性地解释。同样，术语“包括(include)”、“包括(including)”和“或(or)”都应被解释为非排他性的。然而，所有这些术语必须被理解为涵盖排他性的实施方案，其也可以使用如“由……组成”的词语来引述。
本文列举的方法和组合物以及其他实施方案不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂，因为如本领域技术人员将理解，它们可以变化。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语、本领域术语和首字母缩写词具有本发明领域或使用该术语的领域的技术人员通常理解的含义。尽管在本发明的实践中可以使用与本文所描述的那些类似或等同的任何产品、方法或其他手段或材料，但本文描述了优选的组合、组合物、方法或其他手段或材料。
术语“宠物”和“动物”为同义词，是指任何动物，包括但不限于猫、狗、虾、鱼、兔子、家禽、豚鼠、雪貂、仓鼠、小鼠、沙鼠、鸟、马、牛、山羊、绵羊、驴、猪等。在本发明的情况下，优选宠物，如狗、猫和鱼。更特别地，优选狗和猫。
如本文所使用，术语“抗微生物”是指能够在一段时间内减少和/或防止许多不期望的微生物生长的任何分子、成分、产品、组合物。例如，它可以指任何分子、成分、产品、组合物，这些分子、成分、产品、组合物能够通过延长产品的保质期来保存产品，而避免产品因微生物生长而变得不适合使用或消费，并且与AAFCO颁布的定义一致。
术语“不期望的微生物”是指病原菌和/或腐败微生物，包括酵母和霉菌。病原菌可以为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，如沙门氏菌属、李斯特菌属、大肠埃希菌或梭菌属，或其混合物。
术语“种群对数减少”或“数量对数减少”或“对数减少”(其中“对数”应理解为“log10”)为数学术语，表示被抗微生物组合物杀死的不期望的微生物的活细胞的数量。“4对数减少”意味着定义的采样点的活细胞数量比原始采样点的活细胞数量小10000倍。“5对数减少”意味着活细胞数量比原始采样点的活细胞数量小105倍。“6对数减少”意味着活细胞数量比原始采样点的活细胞数量小106倍。
本文所有对“乳酸”或任何种类的“短链脂肪酸”或任何种类的“羧酸”的引述旨在指代这些化合物或其盐。此外，这些化合物可以以任何合适的形式使用。在一个特别的实施方案中，可以使用含有不可忽略量的根据本发明的乳酸或短链脂肪酸或羧酸的材料，如植物材料，或提取物，或材料的部分或部分提取物，包括浓缩物或汁液。在另一个特别的实施方案中，可以使用纯化合物，其涵盖纯度为至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％的化合物。
术语“宠物食品产品”可以指“宠物食品”或“宠物食品成分”或两者兼有。在阅读本公开内容后，“宠物食品产品”的确切含义对于技术人员来说将是清楚明白的。重要的是，本文对任何种类的宠物食品产品的所有引述旨在仅指为宠物制造和销售的宠物食品产品，其可能受益于本文公开的抗微生物组合物，特别是在其功效和适口性方面。
术语“宠物食品”是指供宠物消耗的食品。例如，“狗食品”或“狗食品产品”是指旨在供狗消耗的组合物。作为另一个示例，“猫食品”或“猫食品产品”是指旨在供猫消耗的组合物。“宠物食品”涵盖宠物饲料，如鱼饲料，以下也称为“鱼食品”。因此“鱼食品”是指旨在供鱼消耗的组合物。术语“宠物食品”包括营养均衡的宠物食品、宠物食品补充剂、奖励品(treats)、零食、玩具(可咀嚼玩具和/或可食用玩具)、饮品(drinks)和饮料(beverages)。
“营养全面的”、“营养均衡的”或“全面且营养均衡的食品”为一种食品，其含有对于食品的预期接受者或消耗者合适的量和比例的所有已知必须的营养物，所述合适的量和比例是基于例如伴侣动物营养领域中认可的或主管的当局的推荐。因此，这样的食品能够用作膳食摄取的唯一来源以维持生命，而无需添加补充营养源。因此，这些宠物食品不包括宠物食品补充剂、奖励品、零食、玩具、饮品和饮料。营养全面的宠物食品通常为干燥的宠物食品(具有小于约14％的水分和/或小于0.65的水分活度)、罐装的或湿的或高含水的宠物食品(具有大于约50％的水分和/或大于0.85的水分活度)或半湿润的宠物食品(具有约14％至约50％的水分和/或0.65至0.85的水分活度)。营养全面的宠物食品的示例为挤出宠物食品，如粗粒；“X”块状产品(chunk-in-“X”product)，如胶冻块状产品、肉汁块状产品；和肉糕(loaf)，如肉冻(terrines)、肉酱
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慕斯(mousses)。
术语“宠物食品补充剂”是指旨在除了正常膳食之外还被摄取的产品。补充剂可以为任何形式，例如固体、液体、凝胶、片剂、胶囊、粉末等。优选地，它们以方便的剂型提供。在一些实施方案中，它们以散装销售包装(如散装粉末、液体、凝胶或油)提供。在其他实施方案中，补充剂以批量提供以包含于其他食品(例如零食、奖励品、补充剂棒、饮料等)中。
术语“奖励品”意指设计为由所有者优选在非用餐时间喂给宠物，以协助、促进或维持宠物与其所有者之间的联系过程的任何食品。奖励品的示例为骨头、生皮(rawhide)、棍、枕头、饼干等。奖励品可以为营养的或非营养的，完全或部分可消耗的(例如可消耗的玩具)。奖励品通常以可比得上营养均衡的食品的方式含有适口性增强剂。奖励品典型地含有被包合到奖励品中或涂布到奖励品上的脂肪，如动物脂肪和/或植物油和/或海洋油。
“挤出”宠物食品是指已通过挤出或成丸加工被转化的任何产品。优选地，挤出产品为干燥的挤出产品。在一个特别的实施方案中，挤出产品为粗粒。在另一个特别的实施方案中，挤出产品为鱼丸。
术语“鱼丸”是指鱼食品，特别是能够通过挤出或成丸加工(优选成丸加工)获得的干燥挤出产品(含有小于约14％的水分，优选小于约9％的水分)。鱼丸典型地由一种或多种蛋白质源组成，所述蛋白质源例如但不限于海洋蛋白质(尤其包括鱼粉和磷虾粉)、植物蛋白质和屠宰场副产物。
在本文中使用的术语“粗粒”是指通过成丸或挤出加工(优选挤出加工)形成的干燥宠物食品块。取决于加工方法或设备，块的尺寸和形状可以变化。例如，粗粒可以具有球形、圆柱形、椭圆形或类似的形状。例如，它们可以具有小于约2cm的最大尺寸。
“宠物食品成分”为适合宠物消耗并且可以加入到宠物食品中的任何化合物、组合物或材料。宠物食品成分的非限制性实例为动物粉(animal meal)、新鲜肉类、动物消化物、脂肪、植物粉、酵母、谷物、适口性增强剂、营养素、添加剂等。
如本文所使用，“含脂肪的宠物食品产品”是指含有至少一种可以被不期望的微生物破坏的脂肪的“宠物食品产品”。“含脂肪的宠物食品产品”的脂肪含量不是“痕量的脂肪”。在本文中使用的术语“痕量的脂肪”意指可以忽略的脂肪量，或微不足道的脂肪量，或无法检测到的脂肪量(低于通过标准方法(如在欧洲法规EC n°152/2009原油和脂肪的确定-程序B中所描述的，可在线获得)确定的阈值水平)。典型地，营养均衡的宠物食品、脂肪、适口性增强剂、动物粉或植物粉为含脂肪的宠物食品产品。
脂肪的示例包括来自任何来源的脂肪或油，如动物脂肪、植物油或海洋油。可大量得到的植物油典型地为芥花籽油(canola oil)、大豆油、玉米油、橄榄油、葵花油、亚麻籽油、棕榈油、油菜籽油、芝麻油、椰子油、红花油等，以及它们的副产品。典型的动物脂肪为猪脂肪、鸡脂肪、家禽脂肪、羔羊脂或牛脂等，以及它们的副产品。海洋油典型地为金枪鱼油、沙丁鱼油、鲑鱼油、鲱鱼油(herring oil)、鲭鱼油、玉筋鱼油(sand eel oil)、鳟鱼油、罗非鱼油、鲶鱼油、鳀鱼油、鱼油(fish oil)、油鲱油(menhaden oil)等，以及它们的副产品。本文也涵盖来源于动物、植物、海洋来源的脂肪。
脂肪为例如饱和或不饱和的脂肪酸酯或游离脂肪酸，并且它们可以是内源性的(如动物消化物、动物粉或植物粉等中含有的脂肪)或外源性的。
如在本文中所使用，术语“适口性”是指受试者食用某种食品组合物的总体意愿。每当受试者例如对两种或更多种食品中的一种显示出偏好时，偏爱的食品是更“适口的”，并具有“增强的适口性”。存在不同的方法来评价适口性，如宠物的适口性。这样的方法的示例涉及同时(例如，在并排式、自由选择比较中，例如，通过测量至少两种不同的宠物食品的相对消耗)或顺序地(例如，使用单碗测试方法学)将宠物暴露于宠物食品。有利地，可以使用至少两种不同的方法，以巩固由此获得的有关给定宠物食品的适口性的结果。
术语“适口性增强剂”和任何其他类似术语(例如，“适口性增强成分”)是指增强宠物食品对动物的适口性的任何材料。典型地，适口性增强剂为液体或干燥的可食用组合物，其提供吸引或取悦受试者的香气、味道、余味、气味、口感、质地和/或感官感觉。适口性增强成分的非限制性示例为动物消化物、无机磷酸盐化合物(如多磷酸盐、焦磷酸盐和单磷酸盐)、美拉德成分、酵母产品(如酵母提取物、酵母水解物、酵母自溶物、酵母膏、干酵母)等。
术语“动物消化物”在本文中是指由清洁的、未分解的动物组织(如来自家禽、猪肉、牛肉、绵羊、羊肉、鱼等)的化学和/或酶水解产生的材料。在一些实施方案中，如本文所使用的动物消化物与美国饲料管制协会股份有限公司(Association Of American FeedControl Officials,Inc.)(AAFCO)所发布的定义完全一致。
术语“动物粉”或“肉粉”为已经干燥和研磨以形成基本均匀尺寸的颗粒的肉。例如，美国饲料管制协会(AAFCO)将“肉粉”定义为来自哺乳动物组织的提炼产品，所述哺乳动物组织不包括任何加入的血液、毛发、蹄、角、皮屑、粪便、胃和瘤胃内容物，但在良好加工实践中可能不可避免地出现的量除外，并且不得包含本定义未规定的外来材料。适用于本文公开的组合物的肉粉的非限制性示例包括牛肉粉、家禽粉、猪肉粉、火鸡粉、鱼粉及其组合。牛肉粉为来自牛肉组织的提炼产品，所述牛肉组织不包括任何加入的血液、毛发、蹄、角、皮屑、粪便、胃和瘤胃内容物，但在良好加工实践中可能不可避免地出现的量除外。家禽粉为来源于干净的肉和皮肤(有或没有伴随的骨头)的组合的干燥提炼产品，来自家禽的整个屠体或其组合的部分，不包括羽毛、头、脚和内脏。猪肉粉为来源于干净的肉和皮肤(有或没有伴随的骨头)的组合的干燥提炼产品，来自猪的整个屠体或其组合的部分，不包括头、脚或内脏。火鸡粉为来源于干净的肉和皮肤(有或没有伴随的骨头)的组合的干燥提炼产品，来自火鸡的整个屠体的部分，不包括羽毛、头、脚或内脏。鱼粉为未分解的整条鱼和/或鱼片中的干净、干燥、磨碎的组织，无论是否提取了部分油。
术语“植物粉(vegetable flour)”(或植物粉(vegetable meal))涵盖谷物粉，如小麦、小麦面筋、大麦、大米、燕麦、玉米和玉米面筋粉；豆类粉，如大豆粉和豌豆粉；和蔬菜粉，如土豆和木薯粉。其他此类粉是技术人员已知的。
术语“天然来源”或“天然的”旨在表示在自然界中存在或产生的化合物。可以通过任何合适的手段从其自然环境中提取或分离此类化合物。当然，也可以通过人工合成产生这些化合物，因此被称为“合成的”。
如在本文中所使用，“涂布(coating)”或“涂布(coated)”是指例如通过喷雾、撒粉等将成分或组合物局部沉积到宠物食品的表面上。
如在本文中所使用，“包合(inclusion)”或“包合(included)”是指在宠物食品的核心中添加成分或组合物。如有必要，可以进行进一步的加工步骤(包括热处理和/或挤出和/或蒸馏等)以获得最终的宠物食品产品。
“容器”包括但不限于袋、盒子、纸箱、瓶、任何类型或设计或材料的包装、透明带、收缩胶膜、装订的或另外附着的组件、或它们的组合。
术语“单独包装”意指试剂盒的组件在一个或多个容器中物理组合或与一个或多个容器物理组合，并被认为是用于制造、配送、销售或使用的一个单元。容器包括但不限于袋、盒子、纸箱、瓶、任何类型或设计或材料的包装、透明带、收缩胶膜、装订的或另外附着的组件、或它们的组合。单独包装可以为物理组合的单独组件的容器，使得它们被认为是用于制造、配送、销售或使用的一个单元。
如在本文所使用，“用于传递信息或指令的手段”为适用于提供信息、指示、推荐和/或保证等的任意形式的试剂盒组件。这样的手段可以包括含有信息的文件、数字储存媒体、光储存媒体、音频展示、视觉展示。传递手段可以为显示的网址、手册、产品标签、包装说明书、广告、视觉展示等。
本发明一些实施方案的说明
本发明人在本文中首次表明，与其他组合和与单独的乳酸或其他酸相比，包含乳酸和至少两种特定羧酸的组合令人惊讶地有利。特别地，当掺入宠物食品产品中时，这种组合能够随时间抑制所述宠物食品产品中的微生物活性而不损害其适口性(与其中没有掺入任何抗微生物组合物的相同宠物食品产品相比)。
宠物食品产品
本公开涉及一种宠物食品产品，其包含小于约1％的抗微生物组合物，所述抗微生物组合物由以下组成：
(i)至少30％的乳酸，和
(ii)至少两种选自乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的羧酸。
因此，这种抗微生物组合除了含有至少30％的乳酸以外，还含有至少两种特定的羧酸。宠物食品工业目前关注天然抗微生物剂如乳酸的使用，因为它们可能对宠物食品的适口性产生负面影响。然而，本发明人在本文中表明，包含小于约1％的根据本发明的抗微生物组合物的宠物食品产品对猫和狗的适口性没有受到负面影响。本发明人甚至表明，与单独使用乳酸时的适口性相比，它可以表现出增强的适口性，特别是对狗而言。
本发明人证明，所要求保护的乳酸与至少两种特定羧酸的组合提供显著的抗微生物活性，甚至可以提供协同抗微生物活性。
抗微生物组合物具有针对病原菌和/或腐败微生物(包括酵母和霉菌)的抗微生物活性。病原菌可以为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，如沙门氏菌属、李斯特菌属、大肠埃希菌或梭菌属，或其混合物。典型地，抗微生物组合物具有针对沙门氏菌属，特别是肠沙门氏菌肠亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)的抗微生物活性。
本公开的一个目的涉及一种如上所述的抗微生物组合物，其由以下组成：
(i)至少30％的乳酸，和
(ii)至少两种选自乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的羧酸。
组合物优选提供至少约2，在一些实施方案中至少约3，在一些实施方案中至少约4和在一些实施方案中至少约5的不期望的微生物种群对数减少。根据本发明，仅在相对短的暴露时间之后就可以实现这种对数减少。例如，在约30至40℃的温度(适合微生物如沙门氏菌属生长的温度)，在暴露仅48小时，在一些实施方案中24小时，在一些实施方案中10小时，在一些实施方案中5小时，在一些实施方案中2小时，在一些实施方案中1小时后，可以实现期望的对数减少。
在一个特别的实施方案中，抗微生物组合物包含小于95％、优选小于90％、更优选小于85％、更优选小于80％的乳酸。
在一个实施方案中，所述乳酸为乳酸盐，如乳酸钠、乳酸钙或乳酸钾。
重要的是，这种抗微生物剂的组合即使在少量时也是有效的。在一个特别的实施方案中，宠物食品产品包含小于1％、优选小于0.9％、更优选小于0.8％、更优选小于0.7％、更优选小于0.6％、更优选小于0.5％、更优选小于0.4％、更优选小于0.3％、更优选小于0.25％、更优选小于0.2％、更优选小于0.15％、更优选小于0.1％的抗微生物组合物。在一个特别的实施方案中，宠物食品产品包含大于0.01％、优选大于0.02％、更优选大于0.03％的抗微生物组合物。
除了乳酸之外，本发明的抗微生物组合物中还包含至少两种特定的羧酸。所述羧酸选自乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸，优选选自乙酸、丁酸、戊酸和异戊酸。
除了乳酸之外的至少两种羧酸的必要性存在已在如下实施例中证明。在一个特别的实施方案中，抗微生物组合物包含两种或三种羧酸。在一个特别的实施方案中，抗微生物组合物包含两种羧酸。在另一个特别的实施方案中，抗微生物组合物包含三种羧酸。
在一个特别的实施方案中，抗微生物组合物包含大于5％、优选大于10％、更优选大于15％、更优选大于20％、更优选大于25％的羧酸。在一个特别的实施方案中，抗微生物组合物包含小于70％的羧酸。
在一个特别有利的实施方案中，抗微生物组合物的乳酸和羧酸是天然来源的。在一个可选的实施方案中，抗微生物组合物的乳酸和羧酸是合成的。
有利地，本发明的抗微生物组合物为粉末形式或液体形式。
因此，一个特别的实施方案涉及一种本发明的宠物食品产品，其进一步包含与抗微生物组合物组合的适当载体。技术人员能够根据宠物食品产品的用途，特别是根据组合物的形式(即液体或粉末)，和/或根据组合物的亲水或疏水形式，来确定合适的载体。
如上面所解释，术语“宠物食品产品”是指受益于本文公开的抗微生物组合物的宠物食品产品。根据本发明的宠物食品产品可以是宠物食品或宠物食品成分(其可以继而掺入宠物食品中)。优选地，所述宠物食品产品为含脂肪的宠物食品产品。
在一个特别的实施方案中，宠物食品产品为宠物食品成分，优选选自脂肪、动物粉、植物粉和适口性增强剂。该特别的实施方案涉及一种包含本发明的抗微生物组合物的受保护的宠物食品成分，然后可以将所述宠物食品成分加入到宠物食品中。换言之，在该特别的实施方案中，抗微生物组合物旨在保护宠物食品成分(但不是可以加入宠物食品成分的宠物食品)。
在第一可选方案中，宠物食品成分为脂肪，优选选自动物脂肪、植物油或海洋油，更优选动物脂肪或海洋油。
更特别地，所述动物脂肪选自猪肉脂肪、鸡肉脂肪、家禽脂肪、羔羊脂或牛脂等，以及它们的副产物。在一个实施方案中，所述动物脂肪为家禽脂肪。
更特别地，所述植物油选自芥花籽油、大豆油、玉米油、橄榄油、葵花油、亚麻籽油、棕榈油、油菜籽油、芝麻油、椰子油、红花油等，以及它们的副产品。更优选地，所述植物油为葵花油或芥花籽油。
更特别地，所述海洋油选自金枪鱼油、沙丁鱼油、鲑鱼油、鲱鱼油、鲭鱼油、玉筋鱼油、鳟鱼油、罗非鱼油、鲶鱼油、鳀鱼油、鱼油、油鲱油等，以及它们的副产品。更优选地，所述海洋油为鱼油、鲑鱼油或金枪鱼油。
在第二可选方案中，宠物食品成分为动物粉或植物粉，优选包含脂肪。
在第三可选方案中，宠物食品成分为适口性增强剂，优选包含脂肪。
在一个特别的实施方案中，宠物食品产品为宠物食品，优选狗食品或猫食品。该特别的实施方案涉及一种包含本发明的抗微生物组合物的受保护的宠物食品。换言之，在该特别的实施方案中，抗微生物组合物旨在保护宠物食品。对于该实施方案，可以通过将抗微生物组合物直接加入到宠物食品中，或通过将抗微生物组合物加入到宠物食品成分中，然后再将宠物食品成分加入到宠物食品中来提供抗微生物活性。对于后一种可选方案，宠物食品成分和宠物食品都可以受益于组合物的抗微生物活性。
优选地，宠物食品为营养均衡的宠物食品，更优选地选自挤出宠物食品(如粗粒、鱼丸)、“X”块状产品(如胶冻块状产品、肉汁块状产品)和肉糕(如肉冻、肉酱、慕斯)。在一个特别的实施方案中，宠物食品产品为粗粒。
用于制备宠物食品产品的方法/用于向宠物食品提供针对一种或多种不期望的微 生物的抗微生物活性的方法
本公开的另一个目的涉及一种用于制备宠物食品产品的方法，其包括：
a)提供宠物食品产品，
b)将小于1％的上述抗微生物组合物掺入所述宠物食品产品中。
本发明涉及一种用于向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物(优选针对沙门氏菌属)的抗微生物活性的方法，其包括：
a)提供宠物食品产品，
b)将小于1％的上述抗微生物组合物掺入所述宠物食品产品中。
根据本发明的抗微生物组合物通过在一段时间内减少和/或防止不期望的微生物的数量来提供针对一种或多种不期望的微生物的抗微生物活性。在一个实施方案中，抗微生物组合物具有针对沙门氏菌属、李斯特菌属、大肠埃希菌、梭菌属、酵母和/或霉菌的抗微生物活性，优选针对沙门氏菌属和/或霉菌的抗微生物活性，优选针对沙门氏菌属的抗微生物活性。
非常有利地，这种抗微生物功效不损害宠物食品产品的适口性。事实上，包含小于1％的根据本发明的抗微生物组合物的宠物食品产品对猫和狗的适口性没有受到负面影响。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明为一种用于向宠物食品提供针对一种或多种不期望的微生物的抗微生物活性同时不会不利地影响其对宠物(优选猫和/或狗，更优选猫和狗)的适口性的方法，所述宠物食品包含宠物食品产品或由宠物食品产品组成。
如上所述，可以将本发明的组合物掺入任何宠物食品产品，优选含脂肪的宠物食品产品中。在特别的宠物食品技术领域中，如前面所解释，上述方法的步骤a)的宠物食品产品可以是宠物食品或宠物食品成分。
在第一可选方案中，步骤a)的宠物食品产品为宠物食品，特别是挤出的宠物食品，如粗粒。
对于该第一可选方案，上述方法的步骤b)可以包括以下步骤：
i)通过在高温下混合湿成分和干成分来预处理以形成粗粒面团；
ii)在高温高压下挤出粗粒面团；
iii)干燥挤出的粗粒；和
iv)用一种或多种脂肪和/或一种或多种适口性增强剂涂布干燥的粗粒；
其中将抗微生物组合物在步骤i)和/或iv)中掺入到粗粒中。
例如，在步骤iv)中，通过用至少一种包含抗微生物组合物的脂肪涂布干燥的粗粒，来将抗微生物组合物掺入到粗粒中。优选地，用1％至10％的所述脂肪，更优选2％至6％的所述脂肪涂布干燥的粗粒。
在第二可选方案中，步骤a)的宠物食品产品为宠物食品成分，优选选自脂肪、动物粉、植物粉和适口性增强剂。
对于该特别的实施方案，上述方法的步骤b)可以通过将抗微生物组合物与宠物食品成分混合来进行。
针对宠物食品产品和抗微生物组合物所述的上述技术特征也适用于本文。
用途
本发明的一个目的涉及抗微生物组合物用于向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物，优选针对沙门氏菌属和/或霉菌，更优选针对沙门氏菌属的抗微生物活性的用途，所述抗微生物组合物由以下组成：
(i)至少30％的乳酸，和
(ii)至少两种选自乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的羧酸。
更特别地，本发明的抗微生物组合物可以用于向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物的抗微生物活性，同时不会不利地影响宠物食品对宠物，优选猫和/或狗，更优选猫和狗的适口性，所述宠物食品包含所述宠物食品产品或由所述宠物食品产品组成。
在一个特别的实施方案中，组合物的量为小于1％(以宠物食品产品的重量计)。
针对宠物食品产品和抗微生物组合物所述的上述技术特征也适用于本文。
试剂盒
本公开的另一个方面涉及一种试剂盒，其在单个包装中的一个或多个容器中包含：
-一种或多种如上面所定义的宠物食品产品；和
-如上所述的抗微生物组合物。
根据本公开的特别的试剂盒进一步包含用于传达信息或说明的手段，以帮助使用试剂盒的元件。
实施例
1.材料和方法
1.1.抗微生物组合物的制备
通过混合一种或多种以下天然化合物(磷酸除外)来制备表1中列出的液体抗微生物组合物：磷酸(Brenntag-80％纯度)、丁酸(Penta->95％纯度/Naturamole->95％纯度)、戊酸(Penta->95％纯度)、异戊酸(Naturamole->95％纯度)、乳酸(Jungbunzlauer-80％纯度/Naturamole->95％纯度)、辛酸(Penta->95％纯度)、牛至油(Kalsec)、己酸(SigmaAldrich->95％)、月桂酸(Sigma Aldrich->95％)、乙酸(Naturamole->95％)。
表1
Figure BDA0003924485870000121
Figure BDA0003924485870000131
组合物1至14不属于本发明，组合物15至20是根据本发明的。
1.2.适口性测试
1.2.1.包含抗微生物组合物的宠物食品的制备
用6％的脂肪涂布适合宠物消耗并在挤出和干燥加工后获得的营养均衡的干粗粒(饮食“X”)，所述脂肪包含如实施例1.1中制备的抗微生物组合物(组合物“X”)和适口性增强剂。这些营养均衡的干粗粒不含任何不期望的微生物。
然后，用适口性增强组合物涂布用于狗和猫的干粗粒。
1.2.2.用双碗测试确定适口性
双碗测试的原理：
测试基于此假设：食物消耗得越多，则其越适口。
基于两种食品之间的比较，进行单独对比(双碗)适口性测试(individual versus(two bowls)palatability tests)。根据测试的目的，在36只狗的组中或在40只猫的组中进行测试。
测试的操作方法：
-称量相同量的食品A和食品B，并置于相同的碗中。存在于每份口粮(ration)中的量能够满足每日的需求。
-碗的分配：
狗测试：将碗放置于狗可接近的单独饲喂槽中。
猫测试：将碗同时呈现给在单独散放箱(loose box)中的每只猫，在每一餐时交换它们的位置，以避免偏手倾向(handedness)导致的选择。
-测试的持续时间：
*猫测试：约15分钟至约20小时(如果在测试结束之前两个碗之一被完全吃净，则将两个碗移出，并停止测试)；
*狗测试：约15分钟至约30分钟(如果在测试结束之前两个碗之一被完全吃净，则将两个碗移出，并停止测试)。
研究的参数
-测量的参数：测试结束时消耗的每种食品的量；
-计算的参数：以％计的单独消耗比例(CR)
CRA＝A的消耗(g)×100/(A+B的消耗)(g)
CRB＝B的消耗(g)×100/(A+B的消耗)(g)；
Figure BDA0003924485870000142
平均消耗比例(ACR)＝所有单独比例的平均值(给予每个动物相等的重要性，无论其大小或其相应的消耗如何)。
如果相比于预定值(其随例如动物重量和/或新陈代谢而变化)动物具有更高或更低的消耗，则不将它们考虑在统计处理中。
统计分析：
使用统计分析来确定在2个比例之间是否存在显著差异。
进行具有3个误差阈值(即，5％、1％和0.1％)的学生t检验。
使用卡方检验来确定在以食品A作为第一食用食品的宠物数量和以食品B作为第一食用食品的宠物数量之间是否存在显著差异。
显著性水平如下所示：
Figure BDA0003924485870000141
1.3.沙门氏菌属抑制
细菌菌株和培养介质
在这些研究中使用肠沙门氏菌肠亚种的六种血清型：对于实施例1、实施例3和实施例6为肠沙门氏菌肠亚种婴儿血清型(CIP103549)、姆班达卡沙门氏菌血清型(CIP105859)和山夫顿堡沙门氏菌血清型(从ANSES收集的猪肉/家禽中分离)，或者对于实施例2、实施例4和实施例5为肠沙门氏菌肠亚种纽波特血清型、山夫顿堡沙门氏菌血清型和鼠伤寒沙门氏菌血清型(均从宠物食品中分离)。所有菌株都集体保存在-80℃的甘油肉汤中。将细菌菌株在脑心浸液琼脂(Brain Heart Infusion agar)中培养，并在脑心浸液肉汤(Brain Heart Infusion broth)中在37℃传代培养20±2小时(BHI，VWR，美国)。对于实施例1、实施例3和实施例6，使用木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(Xylose Lysine Deoxycholateagar)(XLD,VWR,美国)进行家禽脂肪中的沙门氏菌计数，或者对于实施例2、实施例4和实施例5，使用紫红胆汁葡萄糖琼脂(Violet Red Bile Glucose agar)(VRBG,BioRad,美国)进行家禽脂肪中的沙门氏菌计数。按照修改后的EN ISO 6579-1在125g家禽脂肪中进行沙门氏菌检测。
接种物制备
使用两种类型的基质接种物。(i)湿接种物制备：传代培养后，通过在早期稳定期从BHI肉汤中离心(3750x g，10分钟)收获沙门氏菌属菌株，然后将其洗涤并重悬于0.1％蛋白胨(VWR，美国)中。最后，将每个单独的菌株以等份混合在一起以获得标准接种物。(ii)干接种物制备：传代培养后，将处于早期稳定期的BHI肉汤铺展到BHI琼脂板中。孵育后，通过用无菌铺展器松开菌苔，将所得的细菌菌苔收集在0.1％蛋白胨中。然后，将菌株洗涤，重悬在0.1％蛋白胨中，等份混合在一起，最后与作为载体的肉粉混合。将该混合物在室温干燥至低且稳定的水分含量。
家禽脂肪的接种
为了达到约5-6log10 CFU/g的浓度，将湿接种物(实施例1至5)或干接种物(实施例6)以0.1％(w/w)加入家禽脂肪中，然后彻底混合，然后进行对基质的24小时的生理适应。在所有实验中，将家禽脂肪储存在35℃(湿接种物)或40℃(干接种物)。然后，将抗微生物溶液加入到基质(T0)中，并与不含任何抗微生物剂的对照(T+)进行比较。根据实施例，沙门氏菌计数和检测的采样点随时间分布。
1.4.真菌抑制
真菌菌株和培养介质
在研究中使用从宠物食品产品中分离的三种真菌菌株：阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)、黑曲霉(Aspergillus niger)和产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)。将产黄青霉在马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)中于25℃培养和传代培养72小时。将阿姆斯特丹散囊菌和黑曲霉在马铃薯葡萄糖琼脂+40％蔗糖中于28℃培养和传代培养72小时。
接种物制备
传代培养后，通过用无菌铺展器松开培养物，将每个菌株收集在0.1％蛋白胨中。然后，将菌株洗涤，重悬于0.1％蛋白胨中，使用Malassez细胞计数标准化，以约3log UFC/g加入到Deepwell 2ml 96孔板(Axygen，AM-2ML-RD)中，所述板预先填充有1ml补充有期望的抗微生物组合物的液体未酸化适口性增强剂。qPCR分析包括对照(不含抗微生物剂)。在25℃孵育72小时后，通过移液器将150μl移到适合DNA提取的新96孔板(Axygen，AM-2ML-RD)中来收获培养物。
DNA提取
根据Ladirat等人(2013)描述的方法并进行一些细微调整，来从每个样品中提取总基因组DNA：首先将样品与300μl裂解缓冲液(Agowa，Berlin，德国)、500μl锆珠(0.5mm)和500μl苯酚混合，然后引入BeadBeater(BioSpec Products,Bartlesville,OK,美国)中持续3分钟。
定量PCR(qPCR)
为了量化抗微生物组合物的效果，利用定量PCR(qPCR)分析每个样品中总基因组DNA的量。将提取的基因组DNA稀释10至50倍，并用作定量PCR分析的模板，作为生长或生长抑制的读数。反应混合物包含12.5μl 2x Mastermix(Diagenode)、10μM正向引物、10μM反向引物、5μM探针(用FAM和MGB淬灭剂标记)，plus模板(染色体DNA)和mQ，总体积为25μl。在ABI7500Fast System(Taqman-MGB)上进行qPCR。循环条件为50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。
使用qPCR数据作为抑制的测量
qPCR分析的结果分析如下。循环阈值(Ct)被用作评价抗菌功效的基础。将Ct值定义为当PCR产物的荧光可以在背景信号之上检测到时的循环数。比较了起始点(接种物)和没有抗微生物组合物的对照的收获时间的Ct值。不含任何抗微生物组合物的生长对照在收获时的Ct值应低于起始点的Ct值(由生长引起，因此DNA更多，从而Ct值较低)，并且其差值(Ctt＝0减去Ctt＝收获)得到ΔCt值，其代表孵化期间的最大生长。同时，该值也可以认为是最大抑制：如果收获时的Ct值等于开始时的Ct值，则没有生长，因此出现了最大抑制。因此，该ΔCt值也被用作最大抑制。
为了对抗微生物组合物的效果进行评分，在收获时将样品的Ct值与没有抗微生物组合物的对照(生长对照)的Ct值进行比较。如果测试化合物完全抑制生长，则测试样品的Ct值类似于起始点的Ct值，使得ΔCt值等于最大抑制。另一方面，如果测试样品的Ct值等于没有抑制剂的对照的Ct值，则ΔCt值等于0，表明没有任何抑制。
2.结果
2.1.实施例1
评价了表2的组合物。
表2
Figure BDA0003924485870000171
抗微生物功效
评估了组合物15中乳酸、戊酸和丁酸的抗微生物协同作用。
当加入到脂肪中时，单独测试了每个成分(如1.2中所述)：分别测试了7.25ppm的丁酸(组合物2)、7.25ppm的戊酸(组合物3)和43.5ppm的乳酸(组合物4)针对沙门氏菌属的抗微生物功效。计算各个组分(组合物2至4)的抗微生物作用的总和(“计算”)。
58ppm的组合物15(7.25ppm丁酸+7.25ppm戊酸+43.5ppm乳酸)也被加入到脂肪中，并测试其针对沙门氏菌属的抗微生物功效(“测量”)。
如图1所示，组合物15的抗微生物作用大于单个组分(组合物2至4)的抗微生物作用的总和，证明组合物15中组分的协同功效。
适口性
将不同量的组合物2、3、4、15加入到脂肪中(如1.2中所述)，并涂布在干粗粒上(如1.3中所述)。
狗和猫的适口性结果示于表3。
表3
Figure BDA0003924485870000172
Figure BDA0003924485870000181
1统计显著性
如表3所示，虽然丁酸、戊酸和乳酸在饮食中单独添加时显著降低了狗的适口性，但它们的组合却令人惊讶地增加了饮食消耗。
此外，组合物15有利地不会降低猫的适口性。
2.2.实施例2
评价了表4的组合物。
表4
Figure BDA0003924485870000182
抗微生物功效
测试当以500ppm加入到脂肪中时的组合物5、6、7、8、16的抗微生物功效，并与以1000ppm加入到脂肪中时的磷酸(组合物1)的抗微生物功效进行比较。还评价了脂肪中1000ppm的组合物16的抗微生物功效。
如图2所示，组合物16在接种后2天完全抑制了接种细菌的生长，无论掺入量如何(500ppm或1000ppm)。这种抑制在接种后71天保持不变。
组合物7在接种后2天也完全抑制了接种细菌的生长。然而，沙门氏菌在接种后7天再次超出计数阈值(1log10 UFC/g)。
相反，当在脂肪中加入磷酸(组合物1)时，接种后1个月仍检测到沙门氏菌。组合物5、6和8也不是抑制微生物活性的良好候选物。
适口性
狗和猫的适口性结果示于表5。
表5
Figure BDA0003924485870000191
1统计显著性
如表5所示，组合物16的丁酸、戊酸和乳酸的组合显著增加了狗的饮食消耗。此外，组合物16有利地不会降低猫的适口性。
组合物6和7以1000ppm应用在脂肪中会降低狗的适口性。
2.3.实施例3
评价了表6的组合物。
表6
Figure BDA0003924485870000201
抗微生物功效
测试了当在脂肪中以1000ppm加入时的组合物14和组合物18的抗微生物功效。
如图3所示，组合物14和组合物18均在接种后1.5小时将所有沙门氏菌属菌株抑制在计数阈值以下。然而对于组合物14，在接种后4小时，沙门氏菌再次超出计数阈值(1log10UFC/g)。
适口性
狗的适口性结果示于表7。
表7
Figure BDA0003924485870000202
1统计显著性
如表7所示，组合物18的丁酸、异戊酸和乳酸的组合不会降低宠物的适口性。
2.4.实施例4
评价了表8的组合物。
表8
Figure BDA0003924485870000203
Figure BDA0003924485870000211
抗微生物功效
测试了当在脂肪中以1000ppm加入时的组合物17的抗微生物功效。
如图4所示，组合物17在接种后6小时(最多)灭活接种的细菌。
适口性
狗和猫的适口性结果示于表9。
表9
Figure BDA0003924485870000212
1统计显著性
如表9所示，组合物17中丁酸、异戊酸和乳酸的组合有利地不会降低狗和猫的适口性。
2.5.实施例5
评价了表10的组合物。
表10
Figure BDA0003924485870000213
Figure BDA0003924485870000221
抗微生物功效
测试了当在脂肪中以1000ppm加入时的组合物9、10、11、12、19的抗微生物功效。
如图5所示，组合物19是第一种在计数阈值以下(在接种后5小时)灭活沙门氏菌属接种物的组合物。这种抑制在接种后71天保持不变。
适口性
狗和猫的适口性结果示于表11。
表11
Figure BDA0003924485870000222
1统计显著性
如表11所示，组合物19中丁酸、乙酸和乳酸的组合显著增加了狗的饮食消耗。
此外，组合物19有利地不会降低猫的适口性。
2.6.实施例6
评价了表12的组合物。
表12
Figure BDA0003924485870000223
适口性
狗的适口性结果示于表13。
表13
Figure BDA0003924485870000231
1统计显著性
如表13所示，包含小于30％乳酸的组合物13显著降低了狗的饮食消耗。
2.7.实施例7
评价了表14的组合物。
表14
Figure BDA0003924485870000232
抗微生物功效
在3种真菌菌株上测试了当在适口性增强剂中以5000ppm加入时的组合物20的抗微生物功效。
ΔCt的结果如表15所示。通常认为大于约6的ΔCt表明有效的抗微生物组合物。
表15
Figure BDA0003924485870000233
组合物20提供了对3种微生物菌株的良好抑制性能。

Claims (6)

1.抗微生物组合物用于向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物，优选针对沙门氏菌属Salmonella和/或霉菌的抗微生物活性的用途，所述抗微生物组合物由以下组成：
(i)至少30％的乳酸，和
(ii)至少两种选自乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的羧酸。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗微生物组合物包含小于80％的乳酸。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述宠物食品产品为宠物食品成分，优选选自脂肪、动物粉、植物粉和适口性增强剂。
4.一种用于向宠物食品产品提供针对一种或多种不期望的微生物，优选针对沙门氏菌属和/或霉菌的抗微生物活性的方法，其包括：
a)提供宠物食品产品，
b)将小于1％的抗微生物组合物掺入所述宠物食品产品中，所述抗微生物组合物由以下组成：
(i)至少30％的乳酸，和
(ii)至少两种选自乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的羧酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗微生物组合物包含小于80％的乳酸。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述宠物食品产品为宠物食品成分，优选选自脂肪、动物粉、植物粉和适口性增强剂。
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