CN115505014A - 一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途 - Google Patents

一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115505014A
CN115505014A CN202211280994.8A CN202211280994A CN115505014A CN 115505014 A CN115505014 A CN 115505014A CN 202211280994 A CN202211280994 A CN 202211280994A CN 115505014 A CN115505014 A CN 115505014A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methanol
extract
dichloromethane
silica gel
beta
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211280994.8A
Other languages
English (en)
Inventor
杨国栋
刘昱甫
刘永林
马瑜
李诒光
陈杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangzhong Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Jiangzhong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangzhong Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Jiangzhong Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN202211280994.8A priority Critical patent/CN115505014A/zh
Publication of CN115505014A publication Critical patent/CN115505014A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/85—Verbenaceae (Verbena family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C67/52—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by change in the physical state, e.g. crystallisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C67/56—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C67/58—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by liquid-liquid treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/80—Phthalic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/06—Benzopyran radicals
    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation, decoction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/35—Extraction with lipophilic solvents, e.g. Hexane or petrol ether
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉公开了一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途，涉及中药提取技术领域。该提取物包括肉苁蓉苷D、地黄苷和大波斯菊苷。所获得的裸花紫珠提取物和现有技术相比，成分明确、使用安全性获得极大提高，同时发挥协同抗炎作用，抗炎效果好，具有良好的应用前景。

Description

一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途。
背景技术
裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.Et Arn.为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属Callicarpa L.植物。裸花紫珠以茎枝和叶入药，具有散瘀消肿、抗菌止血、消炎解毒、驱风祛湿之功效。主治化脓性炎症、急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血、创伤出血等症，外用治烧、烫伤及外伤出血等。研究表明裸花紫珠主要含有黄酮类、萜类、苯丙素类和挥发油等成分，具有止血、抗血栓形成、抗炎、抑菌、细胞毒活性、增强免疫等药理活性。
中国专利申请CN201610139149.7公开了一种裸花紫珠提取物在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用，所述裸花紫珠提取物是裸花紫珠的地上部分分离提取获得，提取步骤包括：(a)将裸花紫珠的地上部分干燥、粉碎，用乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)取正丁醇取物除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液；再用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩裸花紫珠提取物。
中国专利申请CN201510306705.0公开了一种具有抗炎活性的裸花紫珠提取物，含有24～36％的黄酮类化合物、0.8％～3％的苯乙醇苷类化合物、15％～27％的二萜类化合物。其由以下步骤制备：(1)取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加热回流提取1-3次，得提取液，过滤后所得滤液浓缩成浸膏A；(2)步骤(1)所得浸膏A均匀分散于水中，依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取，除去溶剂，分别得到石油醚萃取有效部位B、乙酸乙酯萃取部位C；(3)将有效部位B与有效部位C以重量比为1～3:1的比例混合，即得。
目前，裸花紫珠提取物仅仅能够确定其中几种化合物，无法明确提取物中的全部成分，导致药效存在不确定性；另外，对于裸花紫珠中的具有药理活性的特定化合物的特定提取方法仍较为缺乏，仍待完善。
发明内容
本发明的目的是提供一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途，针对现有技术存在的问题，提供一种成分明确的、抗炎活性好的裸花紫珠提取物，并提供从裸花紫珠中提取特定成分的方法。
术语解释：
本发明中，流动相比例均为体积比，纯度百分数均为质量分数。
本发明中，数值范围均包括两个端点数值以及其中的任意实数，例如“30～90％”包括但不限于30％、31％、32％、32.5％、33.1％、33.333％、60％、70％、80％、90％等。
本发明中，所涉及单体化合物的分子结构式分别如下：
(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside：
Figure BDA0003898227050000021
phoebenoside A：
Figure BDA0003898227050000022
(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside：
Figure BDA0003898227050000023
blumenol C glucoside：
Figure BDA0003898227050000031
异毛蕊花糖苷：
Figure BDA0003898227050000032
myricoside：
Figure BDA0003898227050000033
肉苁蓉苷D：
Figure BDA0003898227050000034
地黄苷：
Figure BDA0003898227050000035
calceolariosideB：
Figure BDA0003898227050000036
4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside：
Figure BDA0003898227050000041
luteolin-7-O-glucuronide：
Figure BDA0003898227050000042
木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷：
Figure BDA0003898227050000043
木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷：
Figure BDA0003898227050000044
大波斯菊苷：
Figure BDA0003898227050000045
luteolin-7-O-β-L-rhamnopyranosyl(1,2)-β-D-glucopyranoside：
Figure BDA0003898227050000046
芹菜-7-O-β-D-新橙皮苷：
Figure BDA0003898227050000047
2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate：
Figure BDA0003898227050000051
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种裸花紫珠提取物，其特征在于，包括肉苁蓉苷D、地黄苷和大波斯菊苷。
优选地，所述裸花紫珠提取物中，肉苁蓉苷D、地黄苷和大波斯菊苷的质量比为1-10:3-8:0.5-3。
另一方面，本发明提供上述裸花紫珠提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 6在MCI柱上分离，用30～90％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱后，合并得到Fr 6-1～6-5；
其中，Fr 6-1经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇30∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr 6-1-1～6-1-6共6个组分。Fr 6-1-3经ODS柱色谱，甲醇-水45-50:50-55等度洗脱，制备液相分别通过42-48％甲醇、40-45％甲醇等度分离得到地黄苷；Fr 6-4用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇80∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr 6-4-1～6-4-6共6个组分；Fr 6-4-2经制备液相通过52-58％甲醇分离得到肉苁蓉苷D；选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6、Fr 4、Fr 3；
S4、Fr 4经反相填料YMC柱色谱加压分离用60-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-1、Fr 4-2、Fr 4-3；
其中，组分Fr 4-3经Sephadex LH-20柱、甲醇分离，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-3-1、Fr 4-3-3；Fr 4-3-3采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇30：1～1：1梯度洗脱得到4个组分Fr 4-3-3-1～4-3-3-5，Fr 4-3-3-1再经制备液相通过42-48％甲醇等度洗脱得到大波斯菊苷。
再一方面，本发明提供一种裸花紫珠提取物，包括(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside、phoebenoside A、(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside、blumenol C glucoside、异毛蕊花糖苷、myricoside、肉苁蓉苷D、地黄苷、calceolariosideB、4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、luteolin-7-O-glucuronide、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、luteolin-7-O-β-L-rhamnopyranosyl(1,2)-β-D-glucopyranoside、芹菜-7-O-β-D-新橙皮苷和2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate。
优选地，所述裸花紫珠提取物中，(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside、phoebenoside A、(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside、blumenol C glucoside、异毛蕊花糖苷、myricoside、肉苁蓉苷D、地黄苷、calceolariosideB、4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、luteolin-7-O-glucuronide、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、luteolin-7-O-β-L-rhamnopyranosyl(1,2)-β-D-glucopyranoside、芹菜-7-O-β-D-新橙皮苷和2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate的质量比为1-5:5-15:1-5:2-6:0.5-5:10-15:1-10:0.1-1.5:1-5:3-8:0.5-4:3-8:0.5-3:0.5-3:1-3:1-5:0.5-4；进一步优选为3.2:8:2.2:3.8:1.7:12:4.2:0.8:2.2:5.4:1.2:5.4:1.6:1.1:1.8:2.3:1.3。
再一方面，本发明提供上述裸花紫珠提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6、Fr 4、Fr 3；
S3、Fr 6在MCI柱上分离，用30～90％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱后，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-1-4、Fr 6-1-3；
其中，Fr 6-1经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇30∶1～1∶1梯度洗脱，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-1-4、Fr 6-1-3；
Fr 6-1-3经ODS柱色谱，甲醇-水45-50:50-55等度洗脱，制备液相分别通过42-48％甲醇、40-45％甲醇等度分离得到化合物8和11；Fr 6-1-4再经制备液相分别通过43-46％甲醇、45-50％甲醇分离得到化合物15、16；
Fr 6-4用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇80∶1～1∶1梯度洗脱选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-4-2、Fr 6-4-1；
Fr 6-4-1经制备液相通过50-55％甲醇分离得到化合物1；Fr 6-4-2经制备液相通过52-58％甲醇分离得到化合物4和7；
S4、Fr 4经反相填料YMC柱色谱加压分离用60-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-1、Fr 4-2、Fr 4-3；
其中，Fr 4-1通过正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇20∶1～1∶1梯度洗脱获得化合物2和6；组分Fr4-2在硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇50∶1～5∶1梯度洗脱后；再经制备液相通过52-58％甲醇得到化合物3和10；
组分Fr 4-3经Sephadex LH-20柱、甲醇分离，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-3-1、Fr 4-3-3；
Fr 4-3-1采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇20∶1～5∶1梯度洗脱得到化合物9和12；洗脱比例二氯甲烷：甲醇10：1、7：1；Fr 4-3-3采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇30：1～1：1梯度洗脱，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-3-3-3、Fr 4-3-3-1；
Fr 4-3-3-1再经制备液相通过42-48％甲醇等度洗脱得到化合物13和14；Fr 4-3-3-3再经制备液相通过42-50％甲醇纯化得到化合物5；
S5、Fr 3在MCI柱上分离，用40-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱后，再经制备液相通过45-55％甲醇分离得到化合物17，
其中，化合物1-17分别依次为(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside、phoebenoside A、(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside、blumenol C glucoside、异毛蕊花糖苷、myricoside、肉苁蓉苷D、地黄苷、calceolariosideB、4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、luteolin-7-O-glucuronide、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、luteolin-7-O-β-L-rhamnopyranosyl(1,2)-β-D-glucopyranoside、芹菜-7-O-β-D-新橙皮苷、2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate。
优选地，步骤S1中，所述加水冷浸的时间为6-18h，加热煎煮的次数为2-5次，每次1-5h，乙酸乙酯萃取的次数为1-5次。
优选地，步骤S2、中，二氯甲烷-甲醇的体积比为400-600：1、200-400：1、100-300：1、50-150：1、50-100：1、15-40：1、10-20：1、5-15：1、1-8：1。作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：500：1、300：1、200：1、100：1、70：1、20：1、15：1、10：1、5：1。
优选地，步骤S3、中，甲醇-水溶剂体系为30-60％甲醇、50-70％甲醇、60-80％甲醇、70-90％甲醇、85-90％甲醇洗脱。作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：50％甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、90％甲醇。
洗脱Fr 6-1所用二氯甲烷-甲醇的体积比为10-30：1、10-20：1、10-15：1、5-12：1、3-10：1、1-8：1。作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：20：1、15：1、12：1、10：1、8：1、6：1。
洗脱Fr 6-4所用二氯甲烷-甲醇的体积比为60-80：1、20-40：1、15-30：1、10-20：1、5-15：1、1-8：1。作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：70：1、30：1、20：1、15：1、10：1、5：1。
优选地，步骤S4、中，甲醇-水溶剂体系为60-70％甲醇、70-80％甲醇、80-90％甲醇、90-95％甲醇。作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：65％甲醇、75％甲醇、85％甲醇、95％甲醇。
洗脱Fr 4-1所用二氯甲烷-甲醇的体积比为10-20：1、1-10：1。作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：10：1、8：1。
洗脱Fr 4-2所用二氯甲烷-甲醇的体积比为25-50：1、15-25：1、10-20：1、8-15：1、5-10：1。作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：30：1、20：1、15：1、10：1、5：1。
洗脱Fr 4-3-1所用二氯甲烷-甲醇的体积比为10-20∶1、5-10∶1；作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：10：1、7：1。
洗脱Fr 4-3-3所用二氯甲烷-甲醇的体积比15-30：1、10-20：1、5-15：1、1-10：1；作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：20：1、15：1、10：1、5：1。
优选地，步骤S5、中，甲醇-水溶剂体系为40-60％甲醇、50-70％甲醇、60-80％甲醇、70-85％、80-95％甲醇。作为本发明的一个具体实施例，按照以下体积比进行梯度洗脱：50％甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、90％甲醇。
再一方面，本发明提供上述裸花紫珠提取物的药物。
再一方面，本发明提供一种从裸花紫珠中提取(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside的方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 6在MCI柱上分离，用30～90％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，合并得到Fr 6-1～6-5；
其中，Fr 6-1经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇30∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr 6-1-1～6-1-6共6个组分；Fr 6-1-4再经制备液相纯化得到化合物15、16；
Fr 6-4用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇80∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr 6-4-1～6-4-4共6个组分，Fr 6-4-1经制备液相纯化得(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside。
再一方面，本发明提供一种从裸花紫珠中提取phoebenoside A的方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 4经反相填料YMC柱色谱加压分离用60-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，得到4个组分Fr 4-1～4-4；其中，Fr 4-1通过正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇20∶1～1∶1梯度洗脱；收集二氯甲烷：甲醇7：1脱段获得phoebenoside A。
再一方面，本发明提供一种从裸花紫珠中提取(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside的方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 4经反相填料YMC柱色谱加压分离用60-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，得到4个组分Fr 4-1～4-4；
其中，组分Fr4-2在硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇50∶1～5∶1梯度洗脱后，收集10：1洗脱段，再经高效液相纯化得到(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside。
再一方面，本发明提供一种从裸花紫珠中提取blumenol C glucoside的方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 6在MCI柱上分离，用30～90％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，合并得到Fr 6-1～6-5；
其中，Fr 6-4用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇80∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr6-4-1～6-4-4共6个组分，Fr 6-4-2经高效液相色谱纯化得到blumenol Cglucoside。
再一方面，本发明提供一种从裸花紫珠中提取calceolarioside B的方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 4经反相填料YMC柱色谱加压分离用60-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，得到4个组分Fr 4-1～4-4；
其中，组分Fr 4-3经Sephadex LH-20柱、甲醇分离，合并得到Fr 4-3-1～4-3-5共5个组分，Fr 4-3-1采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇20∶1～5∶1梯度洗脱得到calceolarioside B。
再一方面，本发明提供一种从裸花紫珠中提取4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside的方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 4经反相填料YMC柱色谱加压分离用60-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，得到4个组分Fr 4-1～4-4；
其中，组分Fr4-2在硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇50∶1～5∶1梯度洗脱后，再经制备液相纯化得到化合物4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside。
再一方面，本发明提供一种从裸花紫珠中提取luteolin-7-O-glucuronide的方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 6在MCI柱上分离，用30～90％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，合并得到Fr 6-1～6-5；
其中，Fr 6-1经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到Fr 6-1-1～6-1-6共6个组分；Fr 6-1-3经ODS柱色谱，45-50:50-55甲醇-水等度洗脱，制备液相分离得到luteolin-7-O-glucuronide。
再一方面，本发明提供一种从裸花紫珠中提取2-O-butyl-1-O-(2′-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate的方法，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 3在MCI柱上分离，用40-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱后，再经制备液相通过45-55％甲醇分离得到2-O-butyl-1-O-(2′-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate。
再一方面，本发明提供上述裸花紫珠提取物，或上述制备方法所制备的裸花紫珠提取物，或上述提取方法制备的提取物在制备治疗抗炎药物中的应用。
最后，本发明提供肉苁蓉苷D在制备治疗抗炎药物中的应用。
本发明中，所述肉苁蓉苷D、裸花紫珠提取物的应用，均包括肉苁蓉苷D、裸花紫珠提取物作为唯一活性成分应用，或者肉苁蓉苷D、裸花紫珠提取物与其他至少一种抗炎活性成分联合使用。
活性成分可以以固体剂型或液体剂型口服给药，所述固体剂型例如胶囊、片剂、锭剂、糖锭剂、颗粒和粉剂，所述液体剂型例如酏剂、糖浆剂、乳剂、分散体和混悬液。活性成分还可以以无菌液体剂型例如分散体、混悬液或溶液胃肠外给药。可以用于将活性成分进行给药的其它剂型还有用于局部给药的软膏、乳膏、滴剂、经皮贴剂或粉剂；用于眼睛给药的眼用溶液或混悬液形式，即滴眼液；用于吸入或鼻内给药的喷雾剂或粉末组合物，或用于直肠或***给药的乳膏、软膏、喷雾剂或栓剂。明胶胶囊包含活性成分和粉状载体，例如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。可以使用类似的稀释剂来制备压制片剂。片剂和胶囊都可以被制备成缓释产品以在数小时内提供药物的持续释放。压制片剂可以包糖衣或包膜衣以掩盖任何令人不愉快的味道和保护该片剂不受空气影响，或者可以包肠溶衣用于在胃肠道内选择性崩解。用于口服给药的液体剂型可包含着色剂和矫味剂以增加患者的接受性。一般而言，水、合适的油、盐水、右旋糖(葡萄糖)水溶液、以及相关的糖溶液和二醇类如丙二醇或聚乙二醇是合适的胃肠外溶液的载体。用于胃肠外给药的溶液优选包含活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂和根据需要使用的缓冲物质。抗氧化剂例如单独或组合的亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸是合适的稳定剂。还可以使用柠檬酸及其盐和EDTA钠。此外，胃肠外溶液还可以包含防腐剂，例如苯扎氯铵、尼泊金甲酯或尼泊金丙酯和氯丁醇。对于吸入给药而言，本发明的化合物可以方便地从加压包装或喷雾器中以喷雾剂形式递送。该化合物还可以以进行配制的粉末形式递送，该粉末组合物可以在吹入粉末吸入器装置的帮助下吸入。优选的用于吸入的递送***是定量吸入(MDI)气雾剂，其可以配制成活性成分在合适的推进剂中的混悬液或溶液，所述推进剂例如碳氟化合物或烃。对于眼睛给药而言，眼用制剂可以用活性成分在合适眼用载体中的合适重量百分比的溶液或混悬液进行配制，从而保持化合物与眼睛表面接触足够的时间以使化合物渗透到眼睛的角膜和内部区域。
本发明的有益效果为：
针对现有技术存在的问题，提供一种成分明确的、抗炎活性好的裸花紫珠提取物及其制备方法，并提供从裸花紫珠中提取特定成分的方法。所获得的裸花紫珠提取物和现有技术相比，成分明确、使用安全性获得极大提高，同时抗炎效果好，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的提取工艺流程图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
下述实施例中，裸花紫珠药材购自海南白沙恒生源种植专业合作社，经江西中医药大学范崔生教授鉴定为裸花紫珠C.nudiflora，凭证标本(No.Y202101G)存放于江中药谷科研中心。
Bruker Avance-III HD 600MHz型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；TripleTOF 5600高分辨飞行时间质谱联用仪(美国AB Sciex公司)；ThermoUItiMate 3000型高效液相(美国赛默飞世尔科技公司)；依利特P3500半制备液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；YMC-Triart C18半制备色谱柱(10mm×250mm，5μm，日本YMC公司)；MCI-凝胶(75～150μm，日本三菱化学公司)，Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(美国GE Healthcare公司)；柱色谱色谱硅胶(100～200目、200～300目，青岛海洋化工厂)；MS204S/01型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；脂多糖、***(美国Sigma公司)；磷酸盐缓冲液、DMEM高糖培养基(中国Solarbio公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；NO和CCK8试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；所用试剂均为色谱纯或分析纯。
实施例1
裸花紫珠干燥叶3.0kg，加水冷浸12h，然后加热煎煮3次，每次3h，趁热过滤合并滤液，减压浓缩至浸膏，将浸膏用适量水混悬分散，加入适量的乙酸乙酯，萃取3次，减压回收溶剂，得浸膏314g。硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷：甲醇500：1、300：1、200：1、100：1、70：1、20：1、15：1、10：1、5：1进行梯度洗脱，通过薄层色谱初步判断以流分在硅胶板上展开的高度为选择标准，将展开高度接近的流分进行合并，最后得到9个流分Fr 1～9；Fr1部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇30:1，Fr 2部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇25:1，Fr 3部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇22:1，Fr 4部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇20:1，Fr 5部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇15:1，Fr 6部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇12:1，Fr 7部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 8部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇8:1，Fr 9部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇5:1；
选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6、Fr 4、Fr 3。
Fr 6(30.14g)在MCI柱上分离，甲醇-水溶剂体系梯度洗脱(50％甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、90％甲醇)后，通过薄层色谱初步判断以流分在硅胶板上展开的高度为选择标准，将展开高度接近的流分进行合并，合并得到Fr 6-1～6-5；Fr 6-1部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇12:1，Fr 6-2部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇15:1，Fr 6-3部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇12:1，Fr 6-4部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 6-5部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇8:1；
选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-1、Fr 6-4。
其中Fr 6-1(8.11g)经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得到Fr 6-1-1～6-1-6共6个组分；其中二氯甲烷：甲醇20：1、15：1、12：1、10：1、8：1、6：1，通过薄层色谱初步判断以流分在硅胶板上展开的高度为选择标准，将展开高度接近的流分进行合并，得到Fr6-1-1～6-1-6共6个组分，Fr 6-1-1部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇12:1，Fr 6-1-2部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇12:1，Fr 6-1-3部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇12:1，Fr 6-1-4部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 6-1-5部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1；Fr 6-1-6部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1；
选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-1-4、Fr 6-1-3。
Fr 6-1-3(1.04g)经ODS柱色谱、甲醇-水(48:52)洗脱、制备液相色谱43％甲醇反复分离纯化得到化合物8(0.8mg)和11(1.2mg)。Fr 6-1-4(0.95g)再经半制备型高效液相色谱54％甲醇纯化得到化合物15(1.8mg)、16(2.3mg)。
Fr 6-4(5.81g)用正相硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到Fr 6-1-1～6-1-6共6个组分；分别为二氯甲烷：甲醇20：1、15：1、12：1、10：1、8：1、6：1。通过薄层色谱初步判断以流分在硅胶板上展开的高度为选择标准，将展开高度接近的流分进行合并，Fr6-4-1部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 6-4-2部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 6-4-3部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 6-4-4部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇8:1，Fr 6-4-5部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇8:1；Fr 6-4-6部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇8:1；
选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-4-2、Fr 6-4-1。
Fr 6-4-1经半制备型高效液相色谱49％甲醇纯化得到化合物1(3.2mg)。Fr 6-4-2经半制备型高效液相色谱44％甲醇纯化得到化合物4(3.8mg)和7(4.2mg)。
Fr 4(86.82g)经反相填料YMC柱色谱加压分离，然后用甲醇-水(95％甲醇、85％甲醇、75％甲醇、65％甲醇)梯度洗脱，通过薄层色谱初步判断以流分在硅胶板上展开的高度为选择标准，将展开高度接近的流分进行合并，得到4个组分Fr 4-1～4-4；Fr 4-1部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇12:1，Fr 4-2部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇12:1，Fr 4-3部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 4-4部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1；
选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-1、Fr 4-2、Fr 4-3。
Fr 4-1(12.37g)通过正相硅胶柱色谱分离，洗脱比例二氯甲烷：甲醇10：1、8：1，获得化合物2(8mg)和6(12mg)。组分Fr 4-2(9.12g)在硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，洗脱比例二氯甲烷：甲醇30：1、20：1、15：1、10：1、5：1；再经半制备高效液相51％甲醇纯化得到化合物3(2.2mg)和10(5.4mg)。
组分Fr 4-3(6.34mg)经Sephadex LH-20柱二氯甲烷-甲醇(1∶1)分离，通过薄层色谱初步判断以流分在硅胶板上展开的高度为选择标准，将展开高度接近的流分进行合并，合并得到Fr 4-3-1～4-3-5共5个组分，Fr 4-3-1部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 4-3-2部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 4-3-3部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 4-3-4部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇8:1，Fr 4-3-5部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇8:1；
选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-3-1、Fr 4-3-3。
Fr 4-3-1(1.34g)采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇(20∶1～5∶1)梯度洗脱，洗脱比例二氯甲烷：甲醇30：1、20：1、15：1、10：1、5：1；得到化合物9(2.2mg)(10：1洗脱流分)和12(5.4mg)(5：1洗脱流分)。
Fr 4-3-3(2.54g)采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇(20∶1～5∶1)梯度洗脱，洗脱比例二氯甲烷：甲醇30：1、20：1、15：1、10：1、5：1；通过薄层色谱初步判断以流分在硅胶板上展开的高度为选择标准，将展开高度接近的流分进行合并，得到4个组分Fr 4-3-3-1～4-3-3-4，Fr 4-3-3-1部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 4-3-3-2部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr 4-3-3-3部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇10:1，Fr4-3-3-4部分选择的展开剂为二氯甲烷-甲醇8:1；
选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-3-3-3、Fr 4-3-3-1。
Fr 4-3-3-1再经半制备高效液相40％甲醇纯化得到化合物13(1.6mg)和14(1.1mg)。Fr 4-3-3-3再经半制备高效液相45％甲醇纯化得到化合物5(1.7mg)。
Fr 3(61.15g)在MCI柱上分离，用甲醇-水溶剂体系梯度(50％甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、90％甲醇)洗脱后；70％甲醇洗脱部分部分再经制备高效液相39％甲醇纯化得到化合物17(1.3mg)。
将上述步骤所得化合物1-17单体混合，得裸花紫珠提取物A。
实施例2
制备方法同实施例1，得3.4mg化合物7、1.8mg化合物8、2.1mg化合物14，将所得化合物7、8、14单体混合，得裸花紫珠提取物B。
实施例3结构鉴定
化合物1：无色油状物，分子式C19H30O7Na，ESI-MS m/z:393.1[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:5.89(1H,br s,H-4),5.79(1H,dd,J＝15.4,6.5Hz,H-8),5.65(1H,dd,J＝15.4,9.2Hz,H-9),4.41(1H,t,J＝6.5Hz,H-1'),4.36(1H,d,J＝7.8Hz,H-7),3.83(1H,m,H-6'),3.67(1H,dd,J＝11.9,5.4Hz,H-6'),3.36(1H,m,H-5'),3.29(m,6H,H-4'),3.22(1H,m,H-3'),3.18(1H,m,H-2'),2.69(1H,d,J＝9.3Hz,H-6),2.44(1H,d,J＝16.8Hz,H-2),2.06(1H,d,J＝16.8Hz,H-2),1.95(3H,s,H-11),1.30(3H,d,J＝4.8Hz,H-10),1.04(3H,s,H-11),1.01(3H,s,H-12)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:37.1(C-1),48.3(C-2),202.1(C-3),126.1(C-4),165.9(C-5),56.8(C-6),77.0(C-7),138.2(C-8),128.8(C-9),21.0(C-10),23.8(C-11),28.0(C-12),27.6(C-13),102.5(C-1'),75.3(C-2'),78.0(C-3'),71.5(C-4'),78.1(C-5'),62.7(C-6')。上述数据与文献报道基一致(Zhu LH,Bao TH,Deng Y,etal.Constituents from Apium graveolens and their anti-inflammatory effects[J].J Asian Nat Prod Res,2017,19:1079-1086)，故鉴定该化合物为(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside。
化合物2：无定形粉末，分子式C19H32O7Na，ESI-MS m/z:395.2[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:4.37(1H,d,J＝7.8Hz,H-1'),3.92(1H,m,H-9),3.87(1H,dd,J＝5.1,2.4Hz,H-6'),3.67(1H,dd,J＝11.8,5.3Hz,H-6'),3.36(1H,d,J＝8.7Hz,H-3'),3.34(1H,d,J＝1.3Hz,H-4'),3.28(1H,m,H-5'),3.19(1H,dd,J＝4.3,1.5Hz,H-2'),2.55(1H,m,H-7),2.45(1H,m,H-3),2.32(1H,td,J＝12.1,5.9Hz,H-7),1.83(1H,m,H-2),1.77(3H,s,H-13),1.68(1H,m,H-8),1.31(1H,d,J＝6.3Hz,H-10),1.21(3H,s,H-11),1.21(3H,s,H-12)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:37.7(C-1),38.4(C-2),35.1(C-3),201.6(C-4),131.7(C-5),168.5(C-6),27.1(C-7),36.4(C-8),77.7(C-9),21.8(C-10),27.2(C-11),27.6(C-12),11.8(C-13),104.1(C-1'),75.4(C-2'),77.9(C-3'),71.7(C-4'),78.3(C-5'),62.8(C-6')。上述数据与文献报道一致(Nguyen TVT,Tran T M,Nguyen TL,et al.MegastigmaneGlycosides From Phoebe tavoyana[J].Natural Product Communications,2019,14(6),1-4)，故鉴定该化合物为phoebenoside A。
化合物3：白色粉末，分子式C19H30O7Na，FAB-MS m/z:393.2[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:5.89(1H,br s,H-4),5.79(1H,dd,J＝15.4,6.5Hz,H-8),5.66(1H,dd,J＝15.4,9.3Hz,H-7),4.41(1H,m,H-9),4.36(1H,d,J＝7.8Hz,H-1'),3.83(1H,dd,J＝11.8,2.4Hz,H-6'),3.67(1H,dd,J＝11.7,5.4Hz,H-6'),3.37(1H,m,H-3'),3.34(1H,d,J＝8.9Hz,H-4'),3.30(1H,d,J＝9.2Hz,H-2'),3.18(1H,m,H-5'),2.69(1H,d,J＝9.3Hz,H-6),2.44(1H,d,J＝16.8Hz,H-2),2.06(1H,d,J＝16.8Hz,H-2),1.95(3H,d,J＝1.3Hz,CH3-13),1.30(3H,d,J＝6.4Hz,CH3-10),1.04(3H,s,CH3-12),1.02(3H,s,CH3-11)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:37.1(C-1),48.3(C-2),202.1(C-3),126.1(C-4),165.9(C-5),56.8(C-6),128.8(C-7),138.2(C-8),77.0(C-9),21.0(C-10),27.6(C-11),28.0(C-12),23.8(C-13),102.5(C-1′),75.3(C-2′),78.1(C-3′),71.5(C-4′),78.0(C-5′),62.7(C-6′)。以上数据与文献报道一致(Kuang H X,Yang B Y,Xia Y G,et al.Chemical constituents fromthe flower of Datura metel L[J].Arch Pharm Res,2008,31:1094-7.)，故鉴定该化合物为(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside。
化合物4：红棕色油状固体，分子式C19H31O7，FAB-MS m/z:371.2[M－H]-。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:5.81(1H,s,H-4),4.33(1H,d,J＝7.8Hz,H-1'),3.85(1H,d,J＝1.6Hz,H-6'),3.83(1H,m,H-9),3.66(1H,m,H-6'),2.50(1H,d,J＝17.4Hz,H-2),2.06(3H,d,J＝1.4Hz,H-13),2.00(1H,m,H-6),1.98(1H,d,J＝5.8Hz,H-2),1.81(1H,m,H-7),1.70(1H,m,H-8),1.68(1H,m,H-7),1.62(1H,m,H-8),1.26(3H,d,J＝6.3Hz,H-10),1.11(3H,s,H-12),1.03(3H,s,H-11)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:37.4(C-1),48.1(C-2),202.4(C-3),125.4(C-4),169.9(C-5),52.6(C-6),26.7(C-7),37.4(C-8),77.9(C-9),21.9(C-10),29.0(C-11),27.5(C-12),25.0(C-13),104.0(C-1′),75.3(C-2′),78.2(C-3′),71.7(C-4′),77.6(C-5′),62.8(C-6′)。以上波谱数据与文献报道一致(Matsunami K,Otsuka H,TakedaY.Structural revisions of blumenol C glucoside and byzantionoside B[J].ChemPharm Bull(Tokyo),2010,58:438-41.)，故鉴定该化合物为blumenol C glucoside。
化合物5：白色粉末，分子式为C29H37O15，ESI-MS m/z:625.2[M+H]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:1.11(3H,d,J＝6.2Hz,Rha-H-6″′),2.81(2H,m,H-7),3.31～4.07(12H,m,sugar-H,H-8),4.40(1H,d,J＝7.9Hz,Glc-H-1″),5.21(1H,s,Rha-H-1″′),6.29(1H,d,J＝15.9Hz,H-α),6.58(1H,dd,J＝2.1,8.0Hz,H-6),6.69(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),6.72(1H,d,J＝2.0Hz,H-2),6.80(1H,d,J＝8.2Hz,H-5′),6.97(1H,dd,J＝2.1,8.2Hz,H-6′),7.07(1H,d,J＝2.1Hz,H-2′),7.61(1H,d,J＝15.6Hz,H-β)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:131.5(C-1),117.1(C-2),146.8(C-3),146.1(C-4),116.5(C-5),121.3(C-6),36.6(C-7),72.3(C-8),127.7(C-1′),114.7(C-2′),146.8(C-3′),149.8(C-4′),116.5(C-5′),123.2(C-6′),115.2(C-α),144.7(C-β),168.3(C＝O),104.2(C-1″),76.0(C-2″),81.6(C-3″),70.4(C-4″),76.2(C-5″),62.3(C-6″),103.0(C-1″′),72.3(C-2″′),72.0(C-3″′),74.0(C-4″′),70.6(C-5″′),18.5(C-6″′)。以上数据与文献报道一致(Su B N,Ma L P,Jia Z J.Iridoid andphenylpropanoid glycosides from Pedicularisartselaeri[J].Planta Med,1998,64(8):720-723.)，故鉴定该化合物为异毛蕊花糖苷。
化合物6：无定形粉末，分子式C34H43O19；FAB-MS m/z:755.2[M–H]-。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.60(1H,d,J＝15.9Hz,H-β'),7.08(1H,d,J＝2.1Hz,H-2””),6.99(1H,dd,J＝8.2,2.1Hz,H-6””),6.82(1H,d,J＝8.2Hz,H-5””),6.71(1H,d,J＝2.1Hz,H-2),6.69(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),6.57(1H,dd,J＝8.1,2.1Hz,H-6),6.26(1H,d,J＝15.9Hz,H-α'),5.29(1H,d,J＝1.8Hz,H-1”),5.22(1H,d,J＝2.7Hz,H-1”'),4.94(1H,t,J＝9.6Hz,H-4'),4.39(1H,d,J＝7.9Hz,H-1'),4.07(1H,m,H-α),3.88(1H,m,H-3'),3.85(1H,d,J＝9.2Hz,H-4”'),3.74(1H,m,H-α),3.68(1H,dd,J＝9.4,3.3Hz,H-3”),3.63(1H,s,H-5”'),3.56(1H,m,H-5'),3.42(1H,m,H-4”),2.80(2H,m,H-β),1.13(3H,d,J＝6.2Hz,H-6”)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:131.5(C-1),116.2(C-2),146.1(C-3),144.6(C-4),117.0(C-5),121.2(C-6),72.2(C-α),36.5(C-β),104.1(C-1′),75.9(C-2′),80.4(C-3′),70.3(C-4′),76.4(C-5′),62.2(C-6′),102.1(C-1″),72.4(C-2″),80.1(C-3″),72.5(C-4″),68.8(C-5″),18.7(C-6″),111.4(C-1″′),78.5(C-2″′),80.0(C-3″′),74.8(C-4″′),65.7(C-5″′),127.6(C-1″″),115.2(C-2″″),146.9(C-3″″),149.9(C-4″″),116.6(C-5″″),123.3(C-6″″),114.6(C-α'),148.0(C-β'),168.2(C＝O)。光谱数据与文献报道一致(
Figure BDA0003898227050000201
,Bedir E,Kirmizibekmez H,et al.Secondary metabolites from Phlomisoppositiflora[J].NatProd Res,2005,19:493-501.)，故鉴定该化合物为myricoside。
化合物7：白色粉末；分子式C31H40O15Na；ESI-MS m/z:675.2[M+Na]+。1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ:7.67(1H,d,J＝15.9Hz,H-α'),7.20(1H,d,J＝1.9Hz,H-2'),7.09(1H,dd,J＝8.2,2.0Hz,H-6'),6.83(1H,d,J＝7.8Hz,H-5'),6.82(1H,d,J＝2.4Hz,H-2),6.74(1H,d,J＝8.1Hz,H-5),6.69(1H,dd,J＝8.2,2.1Hz,H-6),6.38(1H,d,J＝15.9Hz,H-β'),5.21(1H,s,H-1),4.93(1H,t,J＝9.3Hz,H-4″),4.39(1H,d,J＝7.9Hz,H-1″),4.07(1H,t,J＝9.7Hz,H-3″),3.89(3H,s,OCH3),3.85(1H,m,H-3),3.82(3H,s,OCH3),2.83(2H,m,H-α),1.11(3H,d,J＝6.2Hz,H-6)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:132.9(C-1),112.8(C-2),147.9(C-3),147.5(C-4),117.1(C-5),121.1(C-6),36.5(C-7),72.3(C-8),127.6(C-1'),111.8(C-2'),147.4(C-3'),149.4(C-4'),116.5(C-5'),124.4(C-6'),149.4(C-7'),115.1(C-8'),168.3(C-9'),104.2(C-1″),76.0(C-2″),81.5(C-3″),70.4(C-4″),76.0(C-5″),62.4(C-6″),103.0(C-1″′),72.1(C-2″′),72.3(C-3″′),73.8(C-4″′),70.6(C-5″′),18.4(C-6″′),56.4(3'-OCH3),56.5(3-OCH3)。以上数据与文献报道一致(陈一,叶彩云,赵勇.广防风中苯乙醇类化学成分研究[J].中草药,2017,48(19):3941-3944.)，故鉴定该化合物为肉苁蓉苷D。
化合物8：棕黄色油状物；分子式C31H40O15Na；ESI-MS:m/z:675.2[M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,600MHz)δ:7.67(1H,d,J＝15.9Hz,H-7”'),7.21(1H,d,J＝2.0Hz,H-2”'),7.09(1H,dd,J＝8.2,2.0Hz,H-6”'),6.82(2H,dd,J＝8.2,10.0Hz,H-5,5”'),6.75(1H,d,J＝2.1Hz,H-2),6.70(1H,dd,J＝8.2,2.2Hz,H-6),6.38(1H,d,J＝15.9Hz,H-8”'),5.21(1H,brs,H-1”),4.93(1H,t,J＝9.4Hz,H-4'),4.39(1H,d,J＝7.9Hz,H-1'),3.90(3H,s,OCH3),3.82(3H,s,OCH3),2.83(2H,m,H-8),1.11(3H,d,J＝6.2Hz,H-6”)；13C-NMR(CD3OD,150MHz)δ:168.3(C-9”'),151.1(C-4”'),149.5(C-3”'),147.9(C-7”'),147.6(C-3),147.4(C-4),132.9(C-1),127.5(C-1”'),124.4(C-6”'),121.1(C-6),117.1(C-5),116.5(C-5”'),115.0(C-8”'),112.8(C-2),111.7(C-2”'),104.2(C-1'),103.0(C-1”),81.5(C-3'),76.2(C-2'),76.1(C-5'),73.8(C-4”),72.4(C-2”),72.1(C-7),72.1(C-3”),70.6(C-4'),70.4(C-5”),62.4(C-6'),56.5(4-OCH3),56.4(4”'-OCH3),36.6(C-8),18.4(C-6”)。以上数据与文献报道一致(TeborgD,Junior P.Martynoside and the novel dimeric openchainmonoterpene glucoside digipen-stroside from Penstemondigitalis[J].Planta Med,1989,55:474-476.)，故鉴定该化合物为地黄苷。
化合物9：棕色油状物；分子式C23H25O11；ESI-MS m/z 477[M-H]-。1H-NMR(CD3OD,600MHz)δ:7.58(1H,d,J＝2.3Hz,H-7″),7.04(1H,d,J＝2.3Hz,H-2″),6.90(1H,dd,J＝8.2,2.3Hz,H-6″),6.79(1H,d,J＝8.2Hz,H-5″),6.68(1H,d,J＝2.3Hz,H-2),6.65(1H,d,J＝8.1Hz,H-5),6.64(1H,d,J＝15.4Hz,H-8″),6.55(1H,dd,J＝8.0,2.3Hz,H-6),4.51(1H,dd,J＝2.4,12.0Hz,H-6'a),4.35(m,1H),4.33(1H,t,H-6'b),3.96(1H,m,H-α),3.72(1H,m,H-α),2.80(2H,m,H-β)；13C-NMR(CD3OD,150MHz)δ:131.4(C-1),116.5(C-2),146.8(C-3),146.1(C-4),116.3(C-5),121.2(C-6),72.4(C-α),36.7(C-β),104.6(C-1'),75.1(C-2'),77.9(C-3'),71.7(C-4'),75.5(C-5'),64.6(C-6'),127.7(C-1″),114.8(C-2″),147.2(C-3″),149.6(C-4″),117.1(C-5″),123.2(C-6″),144.7(C-7″),115.0(C-8″),169.2(C-9″)。以上数据与文献报道数据基本一致(
Figure BDA0003898227050000213
T,
Figure BDA0003898227050000211
D,
Figure BDA0003898227050000212
Phenylethanoidglycosides fromScutellariagalericulata[J].Turk J Chem,2002,26(4):465–471.)，故鉴定该化合物为calceolarioside B。
化合物10：白色粉末，分子式C26H31O11，FAB-MS m/z:519.2[M－H]-。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.15(1H,dd,J＝8.3,1.5Hz,H-5),7.04(1H,d,J＝2.0Hz,H-2),6.95(1H,d,J＝1.9Hz,H-2′),6.93(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz,H-6),6.82(1H,dd,J＝8.1,2.0Hz,H-6′),6.77(1H,d,J＝8.1Hz,H-5′),4.72(1H,d,J＝4.4Hz,H-1″),4.24－4.275(2H,m,H-9,H-9′),3.88(3H,s,OCH3),3.86(1H,s,OCH3),3.85(s,0H),3.69(2H,m,H-9′),3.49(1H,m,H-6″a),3.47(1H,m,H-6″b),3.39-3.40(4H,m,H-2″-5″),3.39(d,J＝1.3Hz,0H),3.14(2H,m,H-8,H-8′)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:137.5(C-1),111.6(C-2),147.5(C-3),151.0(C-4),118.0(C-5),119.8(C-6),87.1(C-7),55.5(C-8),72.7(C-9),133.7(C-1′),111.0(C-2′),147.4(C-3′),149.1(C-4′),116.1(C-5′),120.1(C-6′),87.5(C-7′),55.4(C-8′),72.7(C-9′),56.4(4-OCH3),56.7(4'-OCH3),102.9(C-1″),74.9(C-2″),77.8(C-3″),71.3(C-4″),78.2(C-5″),62.5(C-6″)。以上数据与文献报道一致(李宁,谭宁华,周俊.大叶仙茅中一个新的木脂素苷(英文)[J].云南植物研究,2003(06):711-716.)，故鉴定该化合物为4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside。
化合物11淡黄色粉末，分子式C21H17O12，ESI-MS m/z:462.1[M-H]-。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.45(1H,dd,J＝8.4,2.1Hz,H-6′),7.43(1H,d,J＝2.2Hz,H-2′),6.94(1H,d,J＝8.3Hz,H-5′),6.79(1H,d,J＝2.2Hz,H-8),6.64(1H,s,H-3),6.51(1H,d,J＝2.2Hz,H-6),5.21(1H,d,J＝7.9Hz,H-1″),3.56–4.19(4H,m,H-2″-H-5″)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:166.9(C-2),104.2(C-3),184.1(C-4),163.0(C-5),101.4(C-6),164.4(C-7),96.0(C-8),158.9(C-9),107.3(C-10),123.5(C-1′),114.3(C-2′),147.1(C-3′),151.2(C-4′),116.8(C-5′),120.5(C-6′),101.0(C-1″),74.4(C-2″),77.0(C-3″),72.8(C-4″),76.7(C-5″),170.8(C-6″)。以上数据与文献报道一致(Rabelo A S,Oliveira I
Figure BDA0003898227050000221
A G etal.Antinociceptive,anti-inflammatory and antioxidant activities of aqueousextract from Remirea maritima(Cyperaceae).[J].J Ethnopharmacol,2013,145:11-7.)，故鉴定该化合物为luteolin-7-O-glucuronide。
化合物12：淡黄色粉末，分子式C21H19O11，ESI-MS m/z:447[M－H]-。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:12.99(1H,s,5-OH),7.47(1H,dd,J＝8.5,2.3Hz,H-6'),7.45(1H,d,J＝2.2Hz,H-2'),7.33(1H,d,J＝8.5Hz,H-5'),6.62(1H,s,H-3),6.46(1H,d,J＝2.1Hz,H-8),6.22(1H,d,J＝2.1Hz,H-6),4.95(1H,d,J＝7.6Hz,H-1″),3.93-3.44(6H,m,sugar-H)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:165.5(C-2),103.2(C-3),183.8(C-4),159.5(C-5),100.3(C-6),166.3(C-7),95.1(C-8),163.3(C-9),105.4(C-10),119.8(C-1'),114.9(C-2'),148.7(C-3'),150.0(C-4'),118.0(C-5'),127.3(C-6'),105.1(C-1″),71.3(C-2″),74.8(C-3″),78.5(C-4″),77.5(C-5″),62.4(C-6″)。以上数据与文献报道一致(凌云,何板作,鲍燕燕,等.浮萍的化学成分研究[J].中草药,1999(2):88-90.)，故鉴定该化合物为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物13：淡黄色粉末，分子式C21H19O11，ESI-MS m/z:447[M－H]-。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:12.92(1H,s,5-OH),7.47(1H,d,J＝8.5Hz,H-6'),7.45(1H,brs,H-2'),7.33(1H,d,J＝8.5Hz,H-5'),6.62(1H,s,H-3),6.46(1H,d,J＝2.1Hz,H-8),6.22(1H,d,J＝2.1Hz,H-6),4.95(1H,d,J＝7.6Hz,H-1″),3.93-3.44(6H,m,H-2″-6″)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:183.8(C-4),166.3(C-2),165.5(C-7),163.3(C-5),159.5(C-9),150.0(C-4'),148.7(C-3'),127.3(C-1'),119.8(C-6'),118.0(C-5'),114.9(C-2'),105.4(C-10),105.1(C-3),103.2(C-1″),100.3(C-6),95.1(C-8),78.5(C-3″),77.5(C-5″),74.8(C-2″),71.3(C-4″),62.4(C-6″)。以上数据与文献报道一致(冀敏,李淑娟,马超美.窄叶蓝盆花花序化学成分及其抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究[J].内蒙古大学学报(自然科学版),2014,45(4):398-403.)，故鉴定该化合物为木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物14：淡黄色粉末，分子式C21H19O10，ESI-MS m/z:447[M－H]-。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.90(2H,d,J＝8.4Hz,H-6',H-2'),6.94(2H,d,J＝8.4Hz,H-5',H-3'),6.84(1H,s,H-3),6.67(1H,s,H-8),6.51(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),5.08(1H,d,J＝6.3Hz,H-1″)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:166.8(C-2),104.1(C-3),184.1(C-4),159.0(C-5),101.2(C-6),164.8(C-7),96.1(C-8),162.9(C-9),107.1(C-10),123.0(C-1'),129.7(C-2'，6'),117.1(C-3'，5'),163.2(C-4'),101.6(C-1″),74.7(C-2″),77.9(C-3″),71.3(C-4″),78.4(C-5″),62.5(C-6″)。以上数据与文献报道一致(任东春,杨念云,钱士辉,等.川芎地上部分化学成分研究[J].中国中药杂志,2007,2(4):1418.)，故鉴定该化合物为大波斯菊苷。
化合物15：淡黄色粉末，分子式C23H21O12，ESI-MS m/z:489[M－H]-。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.43(1H,dd,J＝8.3,2.3Hz,H-6'),7.41(1H,d,J＝2.2Hz,H-2'),6.91(1H,d,J＝8.3Hz,H-5'),6.77(1H,d,J＝2.2Hz,H-8),6.61(1H,s,H-3),6.47(1H,d,J＝2.2Hz,H-6),5.30(1H d,J＝1.8Hz,H-1"'),5.21(1H,d,J＝7.7Hz,H-1"),1.34(3H,d,J＝6.2Hz,H-6"')；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:184.0(C-4),166.9(C-2),164,4(C-7),163,0(C-5),159,1(C-9),151,3(C-4′),147,1(C-3′),123,5(C-1′),120,5(C-6′),116,8(C-5′),114,3(C-2′),107,1(C-10),104,2(C-3),102,6(C-1″′),100,9(C-6),99,8(C-1″),95,9(C-8),79,1(C-5″),79,0(C-3″),78,3(C-2″),74,0(C-4″′),72,2(C-3″′),72,2(C-2″′),71,4(C-4″),70,0(C-5″′),62,4(C-6″),18,3(C-6″′)。以上数据与文献报道一致(Raimundo RG,Nascimento,Jackelyne A,et al.New flavonoids from Margaritopsiscarrascoanawith antioxidant activity[J].Química Nova,2015,38(1),60-65.)，故鉴定该化合物为luteolin-7-O-β-L-rhamnopyranosyl(1,2)-β-D-glucopyranoside。
化合物16：黄色粉末，分子式C27H29O14，ESI-MS m/z:577.2[M－H]-。1H-NMR(CD3OD,600MHz)δ:7.78(2H,d,H-2′,6′),6.94(2H,m,H-3′,5′),6.79(1H,d,J＝2.2Hz,H-8),6.66(1H,s,H-3),6.46(1H,d,J＝2.2Hz,H-6),5.30(1H,d,J＝1.8Hz,H-1″′),5.21(1H,d,J＝7.6Hz,H-1″),1.34(3H,d,J＝6.2Hz,H-6″′)；13C-NMR(CD3OD,150MHz)δ:184.0(C-4),166.8(C-7),164.4(C-2),163.0(C-5),162.9(C-4′),159.0(C-9),129.6(C-2′,6′),123.0(C-1′),117.1(C-3′,5′),107.0(C-10),104.1(C-3),102.5(C-6),101.0(C-1″′),99.8(C-1″),95.9(C-8),79.1(C-2″),79.0(C-3″),78.3(C-5″),74.0(C-4″′),72.2(C-2″′),72.2(C-3″′),71.4(C-4″),70.0(C-5″′),62.4(C-6″),18.3(C-6″′)。以上数据与文献报道基本一致(陈琳,向彩朋,韩佳欣,等.华南胡椒的化学成分及其抗胆碱酯酶活性研究[J].天然产物研究与开发,2018,30(9):1569.)，故鉴定该化合物为芹菜素-7-O-β-D-新橙皮苷。
化合物17：黄色粉末，分子式C20H29O4，ESI-MS m/z:333.2[M－H]-。1H-NMR(CD3OD,600MHz)δ:7.73(2H,dd,J＝5.7,3.3Hz,H-3,6),7.63(2H,dd,J＝5.8,3.3Hz,H-4,5),4.30(4H,m,H-1'),4.23(2H,m,H-1”),1.72(3H,m,H-2',2”),1.45(4H,m,H-3',a”),1.36(6H,m,H-3”,4”,5”),0.95(9H,m,3×CH3,H-4',6”,b”)；13C-NMR(CD3OD,150MHz)δ:169.3(CO),133.6(C-4),132.4(C-5),130.6(C-1,2),129.9(C-3,6),69.1(C-1”),66.7(C-1'),40.2(C-2”),31.7(C-2'),31.6(C-3”),30.1(C-4”),25.0(C-a”),24.0(C-5”),20.3(C-3'),14.4(C-4',6”),11.4(C-b”)。上述氢谱和碳谱数据与文献一致(高程海,易湘茜,林琳,等.海洋来源邻苯二甲酸酯类化学成分和构效关系研究[J].天然产物研究与开发,2013,25(10):1320-1324.)，故鉴定该化合物为2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate。
纯度鉴定：
Figure BDA0003898227050000241
Figure BDA0003898227050000251
实施例3抗炎活性评价
3.1细胞的培养及毒性评价
BV2小胶质细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中37℃、5％CO2条件下培养，生长至90％进行传代。采用CCK8法检测化合物对BV2细胞存活率的影响。同时将对数生长期的BV2细胞接种于96孔板中，密度为每孔9×103，每孔100μL，细胞贴壁后，将实验分为空白组；***组；给药组(25μmol/L)，每组3个复孔，于37℃、5％CO2条件下培养24h。加入10％CCK-8培养基，在37℃下培养2h。之后，在450nm处测试吸光度。
3.2NO含量的测定
将BV2细胞接种于96孔板，密度为9×103/孔。细胞贴好后，将实验分为空白组、LPS组、***组和不同浓度给药组，每组设置3个复孔。空白组加入新鲜培养液，***组和给药组在加入LPS刺激前预处理3.5h，然后和LPS组一起加入终浓度为1μg/mLLPS，培养24小时后，收集上清液，严格按照NO检测试剂盒说明书进行测定。
3.3统计学分析
利用软件GraphPad Prism 8.0进行数据处理和统计学分析；以NO抑制率表示化合物体外抗炎活性强度，每个实验重复3次，所有数值均以平均值±SD形式表示。
3.4结果统计
巨噬细胞作为炎症发生发展过程的重要角色，当其受到外源体等入侵后会分泌一定的促炎因子和抗炎因子，在机体的炎症反应过程中发挥重要作用，因此抑制炎症介质的释放以及相关的信号通路的激活是缓解炎症的重要手段。NO是一种值得注意的炎症介质，在中枢神经***中过量的NO会激活小胶质细胞和引起炎症反应，具有神经毒性。其与多种炎症疾病的发生和发展密切相关，通常被认为是炎症产生的标志和用作体外抗炎药物筛选模型。我们采用LPS刺激BV2细胞产生炎症介质NO对所分离的化合物进行抗炎活性初筛。首先，采用CCK8方法测定化合物对BV2细胞存活率的影响，以确保后续实验在无毒条件下进行。实验结果表明，当化合物浓度为25μmol·L-1时，所有化合物对BV2细胞存活率均高于80％。之后，我们采用Griess法进一步测试了不同提取物对LPS诱导BV2细胞产生NO的抑制作用，结果如下：
Figure BDA0003898227050000261
从上表数据可以看出，化合物1-17均呈现出一定的抗炎效果，其中，化合物7的抗炎效果显著优于其他化合物和***。同时，裸花紫珠提取物A(化合物1-17的混合物)的抗炎效果达到50.97±0.04(25μmol·L-1)(％)，裸花紫珠提取物A(化合物7、8、14的混合物)的抗炎效果达到48.64±0.02(25μmol·L-1)(％)，优于任一种单体化合物，证明组合后实现了协同增效的抗炎效果，且该提取物成分明确，相比于现有技术的裸花紫珠提取物，具有明显优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种裸花紫珠提取物，其特征在于，包括肉苁蓉苷D、地黄苷和大波斯菊苷。
2.根据权利要求1所述的裸花紫珠提取物，其特征在于，所述裸花紫珠提取物中，肉苁蓉苷D、地黄苷和大波斯菊苷的质量比为1-10:3-8:0.5-3。
3.权利要求1-2任一项所述裸花紫珠提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 6在MCI柱上分离，用30～90％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱后，合并得到Fr6-1～6-5；
其中，Fr 6-1经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇30∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr 6-1-1～6-1-6共6个组分，Fr 6-1-3经ODS柱色谱，甲醇-水45-50:50-55等度洗脱，制备液相分别通过42-48％甲醇、40-45％甲醇等度分离得到地黄苷；Fr 6-4用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇80∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr 6-4-1～6-4-6共6个组分；Fr 6-4-2经制备液相通过52-58％甲醇分离得到肉苁蓉苷D；选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6、Fr 4、Fr 3；
S4、Fr 4经反相填料YMC柱色谱加压分离用60-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-1、Fr 4-2、Fr 4-3；
其中，组分Fr 4-3经Sephadex LH-20柱、甲醇分离，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-3-1、Fr 4-3-3；Fr 4-3-3采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇30：1～1：1梯度洗脱得到4个组分Fr 4-3-3-1～4-3-3-5，Fr 4-3-3-1再经制备液相通过42-48％甲醇等度洗脱得到大波斯菊苷。
4.一种裸花紫珠提取物，其特征在于，包括(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside、phoebenoside A、(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside、blumenol C glucoside、异毛蕊花糖苷、myricoside、肉苁蓉苷D、地黄苷、calceolariosideB、4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、luteolin-7-O-glucuronide、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、luteolin-7-O-β-L-rhamnopyranosyl(1,2)-β-D-glucopyranoside、芹菜-7-O-β-D-新橙皮苷和2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate。
5.根据权利要求4所述的裸花紫珠提取物，其特征在于，所述裸花紫珠提取物中，(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside、phoebenoside A、(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside、blumenol C glucoside、异毛蕊花糖苷、myricoside、肉苁蓉苷D、地黄苷、calceolariosideB、4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、luteolin-7-O-glucuronide、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、luteolin-7-O-β-L-rhamnopyranosyl(1,2)-β-D-glucopyranoside、芹菜-7-O-β-D-新橙皮苷和2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate的质量比为1-5:5-15:1-5:2-6:0.5-5:10-15:1-10:0.1-1.5:1-5:3-8:0.5-4:3-8:0.5-3:0.5-3:1-3:1-5:0.5-4。
6.权利要求4-5任一项所述裸花紫珠提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6、Fr 4、Fr 3；
S3、Fr 6在MCI柱上分离，用30～90％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱后，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-1-4、Fr 6-1-3；
其中，Fr 6-1经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇30∶1～1∶1梯度洗脱，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-1-4、Fr 6-1-3；
Fr 6-1-3经ODS柱色谱，甲醇-水45-50:50-55等度洗脱，制备液相分别通过42-48％甲醇、40-45％甲醇等度分离得到化合物8和11；Fr 6-1-4再经制备液相分别通过43-46％甲醇、45-50％甲醇分离得到化合物15、16；
Fr 6-4用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇80∶1～1∶1梯度洗脱选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 6-4-2、Fr 6-4-1；
Fr 6-4-1经制备液相通过50-55％甲醇分离得到化合物1；Fr 6-4-2经制备液相通过52-58％甲醇分离得到化合物4和7；
S4、Fr 4经反相填料YMC柱色谱加压分离用60-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，选取提取量最多的3种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-1、Fr 4-2、Fr 4-3；
其中，Fr 4-1通过正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇20∶1～1∶1梯度洗脱获得化合物2和6；组分Fr4-2在硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇50∶1～5∶1梯度洗脱后；再经制备液相通过52-58％甲醇得到化合物3和10；
组分Fr 4-3经Sephadex LH-20柱、甲醇分离，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-3-1、Fr 4-3-3；
Fr 4-3-1采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇20∶1～5∶1梯度洗脱得到化合物9和12；洗脱比例二氯甲烷：甲醇10：1、7：1；Fr 4-3-3采用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇30：1～1：1梯度洗脱，选取提取量最多的2种成分，按照极性从高到低，依次为Fr 4-3-3-3、Fr 4-3-3-1；
Fr 4-3-3-1再经制备液相通过42-48％甲醇等度洗脱得到化合物13和14；Fr4-3-3-3再经制备液相通过42-50％甲醇纯化得到化合物5；
S5、Fr 3在MCI柱上分离，用40-95％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱后，再经制备液相通过45-55％甲醇分离得到化合物17；
其中，化合物1-17分别依次为(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside、phoebenoside A、(6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside、blumenol C glucoside、异毛蕊花糖苷、myricoside、肉苁蓉苷D、地黄苷、calceolariosideB、4,4'-dimethoxy-3'-hydroxy-7',9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、luteolin-7-O-glucuronide、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、luteolin-7-O-β-L-rhamnopyranosyl(1,2)-β-D-glucopyranoside、芹菜-7-O-β-D-新橙皮苷、2-O-butyl-1-O-(2'-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate。
7.包括权利要求1-2、4-5任一项所述裸花紫珠提取物或权利要求3或6所述制备方法所制备的裸花紫珠提取物的药物。
8.一种从裸花紫珠中提取(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、裸花紫珠叶加水冷浸，然后加热煎煮，合并滤液，减压浓缩至浸膏1，将浸膏用水混悬分散，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得浸膏2；
S2、浸膏2经硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇600:1～1∶1进行梯度洗脱，得到9个流分Fr 1～9；
S3、Fr 6在MCI柱上分离，用30～90％甲醇的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱，合并得到Fr6-1～6-5；
其中，Fr 6-1经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇30∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr 6-1-1～6-1-6共6个组分；Fr 6-1-4再经制备液相纯化得到化合物15、16；
Fr 6-4用正相硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇80∶1～1∶1梯度洗脱得到Fr 6-4-1～6-4-4共6个组分，Fr 6-4-1经制备液相纯化得(6S,7R)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7-O-β-D-glucoside。
9.权利要求1-2、4-5任一项所述裸花紫珠提取物或权利要求3或6所述制备方法所制备的裸花紫珠提取物，或权利要求8所述提取方法制备的提取物在制备治疗抗炎药物中的应用。
10.肉苁蓉苷D在制备治疗抗炎药物中的应用。
CN202211280994.8A 2022-10-19 2022-10-19 一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途 Pending CN115505014A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211280994.8A CN115505014A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211280994.8A CN115505014A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115505014A true CN115505014A (zh) 2022-12-23

Family

ID=84510759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211280994.8A Pending CN115505014A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115505014A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Geethangili et al. Cytotoxic constituents from Andrographis paniculata induce cell cycle arrest in jurkat cells
CN105294720A (zh) 一种二聚色酮生物碱类化合物及其制备方法和应用
US20110160152A1 (en) Extracts of aquilaria hulls and use thereof in the treatment of cancer
WO2009093255A2 (en) A new nutraceutical composition from garcinia mangostana
CN102504006A (zh) 一组伊贝母中的甾体皂苷类化合物
Yuan et al. Anti-inflammatory and analgesic activities of Neolamarckia cadamba and its bioactive monoterpenoid indole alkaloids
CN105348192A (zh) 一种翅荚决明中抗病毒活性的异喹啉生物碱类化合物及其制备方法
CN101899082B (zh) 三萜皂苷类化合物、用途及制备方法
CN103626824A (zh) 一种雪胆葫芦烷型四环三萜化合物，含有该化合物的药物组合物及其应用
CN111205347A (zh) 齐墩果烷型三萜皂苷类化合物及其提取方法和用途
CN115505014A (zh) 一种裸花紫珠提取物、其制备方法及用途
CN109180632B (zh) 一种从雷公藤中分离出的化合物的制备方法
Zhang et al. Phenolic metabolites from the stems and leaves of sophora flavescens
WO2017215679A2 (zh) 苯丁酸氮芥的药物组合物及其抗抑郁的医药用途
CN106588948B (zh) 含氧桥环烯醚萜类化合物及其制备方法和用途
CN109206392B (zh) 一种香豆素类化合物及其制备方法与应用
CN111529515A (zh) 12,15-二氧-α-蛇床烯在制药中的应用
CN108530505A (zh) 一种黄酮苷类化合物及其制备方法和应用
CN114349723B (zh) 多烯炔类化合物及其制备方法和应用
CN114456137B (zh) 螺环萘类化合物及其制备方法和应用
CN109265467B (zh) 一种中药女贞子来源的七环内酯化合物及其作为抗老年痴呆药物的应用
CN111217886B (zh) 乌苏烷型三萜皂苷类化合物及其制备方法和应用
CN113214154B (zh) 三聚苄基异喹啉生物碱、其制法和药物组合物与用途
CN118001268B (zh) 一种苯并呋喃木脂素类化合物的应用及其制备方法
CN110256511B (zh) 一类含硫螺环缩酮倍半萜化合物及其应用和另一类含硫螺环缩酮倍半萜化合物的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination