CN115485553A - 用于使用捕获的电荷形成双层以及以纳米孔阵列***孔的***和方法 - Google Patents

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CN115485553A CN202180032360.8A CN202180032360A CN115485553A CN 115485553 A CN115485553 A CN 115485553A CN 202180032360 A CN202180032360 A CN 202180032360A CN 115485553 A CN115485553 A CN 115485553A
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Abstract

本发明提供了一种基于纳米孔的测序芯片，所述测序芯片可以具有带有孔洞阵列的表面，其中每个孔洞具有工作电极。通过在所述工作电极与所述对电极之间施加电压，可以在所述孔洞内建立电荷。然后，通过用膜密封所述孔洞，可以将所述电荷捕获在所述孔洞内。捕获的电荷可用于促进将孔***所述膜中。

Description

用于使用捕获的电荷形成双层以及以纳米孔阵列***孔的系 统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年5月1日提交的美国临时专利申请号63/019,206的优先权，其内容全文出于所有目的以引用方式并入本文。
通过引用合并
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都以引用方式并入本文，所达到的程度如同每个单独的出版物或专利申请都被具体地和单独地指出以引用方式并入。
技术领域
本发明的实施例总体上涉及用于对核酸进行测序的***和方法，并且更具体地涉及用于对核酸进行基于纳米孔的测序的***和方法。
背景技术
基于纳米孔的测序芯片是一种可用于DNA测序的分析工具。此类装置可以包含大量配置为阵列的传感器单元。例如，测序芯片可以包括一百万个单元的阵列，例如具有1000行乘1000列的单元。阵列的每个单元可包括膜和蛋白质孔，该蛋白质孔具有内径为一纳米等级的孔径。这种纳米孔已被证明在快速核苷酸测序中有效。
当跨浸入导电流体中的纳米孔施加电压电位时，可能存在因离子跨所述纳米孔的传导而产生的小离子电流。电流的大小对孔径和位于纳米孔内的分子类型敏感。分子可以是附着到特定核苷酸的特定标签，从而可以检测核酸特定位置处的核苷酸。可测量包含纳米孔的电路中的电压或其他信号(例如，在集成电容器上)以作为测量分子的电阻的方式，从而可以检测哪些分子在纳米孔中。
为了使测序芯片正常工作，对于给定的单元，通常只应在膜上***一个孔。如果将多个孔***单个膜中，则核苷酸同时通过多个孔产生的电签名将更难以解译。
在孔***步骤期间跨膜施加电压可促进孔***过程，可能通过降低膜的稳定性并允许孔更容易地将其自身***膜中。然而，跨膜施加过大的电压会导致膜的广泛破坏，从而使单元无法使用。
因此，将有利的是提供一种用于将单个孔可靠地***膜中同时降低过度损坏膜的风险的***和方法。
发明内容
各种实施例提供了与基于纳米孔的测序相关的技术和***，且更具体地，与形成双层或膜以及将纳米孔***双层或膜中用于测序相关的技术和***。
其他实施例涉及与本文描述的方法相关联的***和计算机可读介质。
参考以下具体实施方式和附图，可以更好地理解本发明的实施例的性质和优点。
在一些实施例中，提供了一种方法。该方法可以包括使包含成膜材料和有机溶剂的溶液流过测序芯片的孔洞上方的流动通道，以从流动通道中置换第一水溶液，同时将第一水溶液留在孔洞中，该孔洞包括与对电极电连通的工作电极；在使包含成膜材料的溶液流动的步骤期间，在工作电极和对电极之间施加第一电压，以便将电荷捕获在孔洞中的第一水溶液中；通过使第二水溶液流过流动通道从流动通道中置换包含成膜材料的溶液，从而留下覆盖孔洞的成膜材料层并且将含有捕获的电荷的第一水溶液密封在孔洞中；以及将成膜材料层减薄成能够接收用于测序应用的纳米孔的膜。
在一些实施例中，在工作电极和反电极之间施加的第一电压具有介于约10mV至2000mV之间的幅值。
在一些实施例中，在工作电极和对电极之间施加的第一电压具有至少约10mV的幅值。
在一些实施例中，在工作电极和对电极之间施加的第一电压具有至少约100mV的幅值。
在一些实施例中，在工作电极和对电极之间施加的第一电压具有至少约200mV的幅值。
在一些实施例中，在工作电极和对电极之间施加的第一电压具有至少约500mV的幅值。
在一些实施例中，减薄成膜材料层的步骤包括使流体流过成膜材料层。
在一些实施例中，该方法进一步包括使纳米孔溶液在膜上方流动；和将纳米孔***膜中，其中密封在孔洞中的捕获的电荷被配置为增加纳米孔***膜中的可能性。
在一些实施例中，该方法进一步包括测量在孔洞中的捕获的电荷；以及在将纳米孔***膜中的步骤期间在工作电极和对电极之间施加第二电压，其中第二电压至少部分地基于测量的在孔洞中的捕获的电荷。
在一些实施例中，该方法进一步包括测量在孔洞中的捕获的电荷；以及在将纳米孔***膜的步骤期间在工作电极和对电极之间施加第二电压，其中第二电压的幅值至少部分地基于第一电压的幅值。
在一些实施例中，测序芯片包含孔洞阵列。
在一些实施例中，第一电压是以具有至少10Hz至1000Hz频率的第一波形施加。
在一些实施例中，提供了一种***。该***可以包括可消耗装置，该可消耗装置包括包含对电极和测序芯片的流动池，测序芯片包括多个工作电极，每个工作电极设置在测序芯片表面上形成的孔洞中；包括泵的测序装置，该泵被配置为与可消耗装置的流动池流体连通，该可消耗装置的对电极和工作电极与测序装置电连通；控制器，其被配置为：在多个工作电极和对电极之间施加第一电压，以在测序芯片的孔洞内建立电荷；将成膜材料泵送入流动池中并使其在孔洞上方；在多个孔洞中的每个孔洞上方形成膜，以将电荷捕获在测序芯片的多个孔洞内；并且在多个膜中***孔。
在一些实施例中，将孔***多个膜中的步骤包括将纳米孔溶液泵送入流动池中，并在多个工作电极和对电极之间施加第二电压。
在一些实施例中，第一电压具有大约10mV至2000mV之间的幅值。
在一些实施例中，第一电压具有至少约200mV的幅值。
在一些实施例中，第一电压具有至少约500mV的幅值。
在一些实施例中，第二电压的幅值取决于第一电压的幅值。
在一些实施例中，第二电压的幅值取决于捕获的电荷的幅值。
在一些实施例中，第一电压是以具有至少10Hz至1000Hz频率的第一波形施加。
附图说明
专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。为了更好地理解本发明的特征和优点，参考阐述了说明性实施例的以下详细描述(在其中利用了本发明的原理)，以及附图：
图1是具有纳米孔单元阵列的纳米孔传感器芯片的实施例的俯视图。
图2示出可以用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元的实施例。
图3示出使用基于纳米孔的边合成边测序(Nano-SBS)技术执行核苷酸测序的纳米孔单元的实施例。
图4示出纳米孔单元中的电路的实施例。
图5显示在AC循环的亮时段和暗时段期间从纳米孔单元捕获的数据点实例。
图6示出纳米孔传感器单元的电路图的实施例。
图7示出了可用于促进孔***的阶梯式电压波形。
图8示出了可用于促进孔***的斜坡式电压波形。
图9A和图9B示出了在一些实施例中，一旦孔已经被***，该孔就可以消散跨膜本身积聚的电压，从而既降低了在孔已经被***之后进一步增加电压时对膜造成损害的风险，并且降低了额外的孔***的可能性。
图10A示出了阵列中的孔***数量随着电压和时间变化的曲线图，且图10B示出了膜破裂所导致的失活/短路数量随着电压和时间变化的图。
图11是根据本公开某些方面的计算机***。
图12A和图12B示出了将电荷捕获在孔洞内对膜形成和孔***的潜在影响。
图13A-13C示出了图12A和图12B中所示的影响可以通过改变膜形成过程期间的膜材料(即，脂质或三嵌段共聚物)流速来调节。
图14A-14C示出了图12A和图12B所示的影响可以通过改变膜形成过程期间施加的电压波形的频率来调节。
图15A示出了当在脂质分配期间不施加脂质分配波形时没有条纹图案，且图15B示出了当在施加脂质分配波形期间单元去激活时没有条纹图案。
具体实施方式
术语
除非另有定义，否则本文所用的科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。与本文所述的方法、装置和材料类似或等效的方法、装置和材料均可用于所公开技术的实践中。提供以下术语旨在有利于理解频繁使用的一些术语，并无限制本公开范围之意。本文中使用的缩写在化学和生物领域中具有其常规含义。
“纳米孔”指在膜中形成或以其他方式提供的孔、通道或通路。膜可以是有机膜，诸如脂质双分子层、或合成膜，诸如由聚合材料形成的膜。纳米孔可以设置成邻近或接近于传感电路或耦合至传感电路的电极，诸如，例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。在一些实例中，纳米孔具有约0.1纳米(nm)至约1000nm数量级的特征宽度或直径。在一些实施例中，纳米孔可以是蛋白质。
“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，这些核苷酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，它们具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酰胺、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可通过产生序列来实现，其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基所取代(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
除非上下文另外明确指出，否则术语“核苷酸”除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，还可理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其在使用该核苷酸的特定情况下(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等同的。
术语“标签”指可检测部分，所述可检测部分可以是原子或分子，或者是原子或分子的集合。标签可以提供光学、电化学、磁性或静电(例如，感应、电容)标记，所述标记可以借助纳米孔来检测。通常，当核苷酸附着到标签上时，所述核苷酸被称为“带标签的核苷酸”。所述标签可以通过磷酸部分附着到核苷酸上。
术语“模板”指复制到DNA核苷酸的互补链中用于DNA合成的单链核酸分子。在一些情况下，模板可以指在mRNA合成期间复制的DNA序列。
术语“引物”指为DNA合成提供起点的短核酸序列。催化DNA合成的酶(诸如DNA聚合酶)可以添加新的核苷酸至引物以用于DNA复制。
“聚合酶”指一种执行模板导向多核苷酸合成的酶。该术语涵盖全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA聚合酶为本领域技术人员熟知的，包括但不限于从强烈火球菌、嗜热高温球菌和海栖热袍菌分离或衍生的DNA聚合酶或其修饰形式。此类聚合酶包括DNA依赖性聚合酶和RNA依赖性聚合酶，诸如逆转录酶。目前已知的DNA依赖性聚合酶至少有5个家族，但是大多数DNA聚合酶属于A、B和C家族，不同家族之间的序列相似性很小，甚至没有。大多数A家族聚合酶是单链蛋白质，可包含多种酶功能，包括聚合酶、3′至5′核酸外切酶活性和5′至3′核酸外切酶活性。B家族聚合酶通常有一个单一的催化结构域，所述催化结构域具有聚合酶和3′至5′核酸外切酶活性，以及辅助因子。C家族聚合酶通常是具有聚合和3′至5′核酸外切酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌中发现了三种类型的DNA聚合酶：DNA聚合酶I(A家族)、DNA聚合酶II(B家族)和DNA聚合酶III(C家族)。在真核细胞中，三种不同的B家族聚合酶，即DNA聚合酶α、δ和ε与核复制有关，以及A家族聚合酶，即聚合酶γ用于线粒体DNA复制。其他类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。类似地，RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III、细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性的，也可以是非RNA依赖性的。
术语“亮时段”通常指带标签的核苷酸的标签通过AC信号施加的电场而被迫进入纳米孔时的时间段。术语“暗时段”通常指带标签的核苷酸的标签通过AC信号施加的电场被推出纳米孔时的时间段。AC循环可以包括亮时段和暗时段。在不同的实施例中，施加至纳米孔单元以将纳米孔单元置于亮时段(或暗时段)的电压信号的极性可以不同。
术语“信号值”指从测序单元输出的测序信号的值。根据某些实施例，测序信号是从一个或多个测序单元的电路中的点测量和/或输出的电信号，例如，信号值是(或表示)电压或电流。信号值可以表示电压和/或电流的直接测量结果和/或可以表示间接测量结果，例如，信号值可以是电压或电流达到指定值所需的测量持续时间。信号值可以表示与纳米孔的电阻率相关的任何可测量的量，并且可以从这些量中导出纳米孔(穿线和/或未穿线)的电阻率和/或电导率。作为另一个实例，信号值可以对应于光强度，例如，来自通过聚合酶添加到核酸上的附着到核苷酸的荧光团。
术语“渗透度”，也称为渗透浓度，指溶质浓度的量度。渗透度测量每单位体积溶液中溶质粒子的渗透压摩尔数量。渗透压摩尔是溶质摩尔数量的量度，所述溶质摩尔对溶液的渗透压力起作用。渗透度可实现测量溶液的渗透压力和测定溶剂如何沿分离两种不同渗透浓度的溶液的半透膜(渗透)扩散。
术语“渗透物”指任何可溶性化合物，该可溶性化合物当溶解到溶液中时会增加该溶液的渗透度。
根据某些实施例，本文公开的技术和***涉及将单个孔***基于纳米孔的测序芯片的单元的膜中。在一些实施例中，将孔***膜中降低了将额外的孔***膜中的可能性，从而自限制了进一步的孔***，并降低或消除了在***步骤期间对主动反馈的需要。
首先描述了实例纳米孔***、电路和测序操作，之后描述了用于置换DNA测序单元中纳米孔的实例技术。本发明的实施例可以以多种方式实现，包括作为过程，***和在计算机可读存储介质和/或处理器上体现的计算机程序产品，诸如被配置为执行存储在耦合到处理器的存储器上和/或由所述存储器提供的指令的处理器。
I.基于纳米孔的测序芯片
图1是具有纳米孔单元150的阵列140的纳米孔传感器芯片100的实施例的俯视图。每个纳米孔单元150包括集成在纳米孔传感器芯片100的硅基底上的控制电路。在一些实施例中，侧壁136包括在阵列140中以分隔纳米孔单元150的组，使得每组可以接收用于表征的不同样品。每个纳米孔单元可用于核酸测序。在一些实施例中，纳米孔传感器芯片100包括盖板130。在一些实施例中，纳米孔传感器芯片100还包括与诸如计算机处理器的其他电路相连接的多个管引脚110。
在一些实施例中，纳米孔传感器芯片100包括同一封装中的多个芯片，例如多芯片模块(MCM)或***级封装(SiP)。芯片可以包括例如存储器、处理器、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)、数据转换器、高速I/O接口等。
在一些实施例中，纳米孔传感器芯片100耦合至(例如，对接至)纳米芯片工作站120，该纳米芯片工作站可以包括用于执行(例如，自动执行)本文公开的过程中的各种实施例的各种组件。此类过程可包括，例如，分析物输送机构，诸如用于输送脂质悬浮液或其他膜结构悬浮液、分析物溶液和/或其他液体、悬浮液或固体的移液器。纳米芯片工作站组件还可包括机器臂，一个或多个计算机处理器和/或存储器。在纳米孔单元150的阵列140上可以检测到多个多核苷酸。在一些实施例中，每个纳米孔单元150是可以单独寻址的。
II.纳米孔测序单元
纳米孔传感器芯片100中的纳米孔单元150可以以许多不同的方式实现。例如，在一些实施例中，不同尺寸和/或化学结构的标签附着到待测序的核酸分子中的不同核苷酸。在一些实施例中，待测序的核酸分子的模板的互补链可以通过使带不同聚合物标签的核苷酸与模板杂交来合成。在一些实施方式中，核酸分子和附着的标签两者可以移动通过纳米孔，并且由于附着到核苷酸的标签的特定尺寸和/或结构，因此流过纳米孔的离子电流可以指示纳米孔中的核苷酸。在一些实施方式中，仅标签移入纳米孔中。也可以有许多不同的方式来检测纳米孔中的不同标签。
A.纳米孔测序单元结构
图2示出可以用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的实例纳米孔单元200的实施例，诸如在图1的纳米孔传感器芯片100中的纳米孔单元150。纳米孔单元200可以包括由介电层201和204形成的孔洞205；在孔洞205上方形成的膜，诸如脂质双层214；以及在脂质双层214上并通过脂质双层214与孔洞205分离的样品室215。孔洞205可以包含一定体积的电解质206，并且样品室215可以容纳包含纳米孔的主体电解质208，例如，可溶性蛋白纳米孔跨膜分子复合物(PNTMC)，以及目标分析物(例如，待测序的核酸分子)。
纳米孔单元200可以包括位于孔洞205底部的工作电极202和设置在样品室215中的对电极210。信号源228可以在工作电极202与对电极210之间施加电压信号。单个纳米孔(例如，PNTMC)可以通过由电压信号引起的电穿孔工艺***脂质双层214中，从而在脂质双层214中形成纳米孔216。阵列中的单个膜(例如，脂质双层214或其他膜结构)可以彼此既不化学连接也不电连接。因此，阵列中的每一个纳米孔单元可以是独立的测序仪，产生与纳米孔相关的单个聚合物分子所特有的数据，所述纳米孔对目标分析物起作用，并调节通过其他不可透过的脂质双层的离子电流。
用于孔***的***和方法的其他实施例在下文第III部分中描述。具体来说，这些***和方法描述了有效实现单元膜中单个孔***的自限性孔***。
如图2所示，纳米孔单元200可以在基底230(诸如硅基底)上形成。介电层201可以在基底230上形成。用于形成介电层201的介电材料可以包括，例如，玻璃、氧化物、氮化物等。用于控制电刺激并用于处理从纳米孔单元200检测到的信号的电路222可以在基底230上和/或在介电层201内形成。例如，多个图案化的金属层(例如，金属1至金属6)可以在介电层201中形成，并且多个有源装置(例如，晶体管)可以在基底230上制造。在一些实施例中，信号源228被包括作为电路222的一部分。电路222可以包括，例如，放大器、积分器、模数转换器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其他部件。电路222还可以耦合至处理器224，该处理器耦合至存储器226，其中处理器224可以分析测序数据以确定已在阵列中测序的聚合物分子的序列。
工作电极202可以在介电层201上形成，并且可以形成孔洞205的底部的至少一部分。在一些实施例中，工作电极202是金属电极。对于非法拉第传导，工作电极202可以由抗腐蚀和抗氧化的金属或其他材料制成，例如，铂、金、氮化钛和石墨。例如，工作电极202可以是具有电镀铂的铂电极。在另一个实例中，工作电极202可以是氮化钛(TiN)工作电极。工作电极202可以是多孔的，从而增加其表面积以及与工作电极202相关的产生的电容。因为纳米孔单元的工作电极可以不依赖于另一纳米孔单元的工作电极，所以在本公开中，该工作电极可以称为单元电极。
介电层204可以在介电层201之上形成。介电层204形成环绕阱205的壁。用于形成介电层204的介电材料可以包括，例如，玻璃、氧化物、一氮化硅(SiN)、聚酰亚胺或其他合适的疏水绝缘材料。介电层204的顶表面可以硅烷化。硅烷化可以在介电层204的顶表面之上形成疏水层220。在一些实施例中，疏水层220具有约1.5纳米(nm)的厚度。
由介电层壁204形成的孔洞205包括工作电极202之上的电解质206的体积。电解质206的体积可以缓冲，并且可以包括以下项的一种或多种：氯化锂(LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(CaCl2)、氯化锶(SrCl2)、氯化锰(MnCl2)和氯化镁(MgCl2)。在一些实施例中，电解质206的体积具有约三微米(μm)的厚度。
同样如图2所示，可以在介电层204的顶部上形成膜并跨过孔洞205。在一些实施例中，膜可包括在疏水层220的顶部上形成的脂质单层218。当膜到达孔洞205的开口时，脂质单层208可以转变为跨孔洞205的开口的脂质双层214。脂质双层可以包括脂质或由其组成，诸如磷脂，例如，选自二植烷酰基-磷脂酰胆碱(DPhPC)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二-O-植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰基-磷脂酰-甲基酯(DOPME)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂、1，2-二-O-植烷酰基-sn-甘油、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350]、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550]、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750]、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-乳糖酰基、GM1神经节苷脂、溶血磷脂酰胆碱(LPC)或其任意组合。例如，也可以使用其他磷脂衍生物，诸如磷脂酸衍生物(例如，DMPA、DDPA、DSPA)、磷脂酰胆碱衍生物(例如，DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC)、磷脂酰甘油衍生物(例如，DMPG、DPPG、DSPG、POPG)、磷脂酰乙醇胺衍生物(例如，DMPE、DPPE、DSPE、DOPE)、磷脂酰丝氨酸衍生物(例如，DOPS)、PEG磷脂衍生物(例如，mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、功能化-磷脂、末端活化磷脂)、二苯酰磷脂(例如，DPhPC、DOPhPC、DPhPE和DOPhPE)。在一些实施例中，双层可使用基于非脂质的材料形成，诸如两亲性嵌段共聚物(例如，聚(丁二烯)-嵌段-聚(环氧乙烷)、PEG二嵌段共聚物、PEG三嵌段共聚物、PPG三嵌段共聚物和泊洛沙姆)和其他两亲性共聚物，其可以是非离子的或离子的。在一些实施例中，双层可以由基于脂质的材料和基于非脂质的材料的组合形成。在一些实施例中，双层材料可以在包括一种或多种有机溶剂诸如链烷(例如癸烷、十三烷、十六烷等)和/或一种或多种硅油(例如，AR-20)的溶剂相中提供。
如所示，脂质双层214嵌有单个纳米孔216，该纳米孔例如由单个PNTMC形成。如上所述，纳米孔216可以通过电穿孔将单个PNTMC***脂质双层214中形成。纳米孔216可以足够大以使至少一部分目标分析物和/或小离子(例如，Na+、K+、Ca2+、Cl-)在脂质双层214的两侧之间通过。
样品室215位于脂质双层214上方，并且可以容纳目标分析物的溶液以用于表征。所述溶液可以是含有主体电解质208的水溶液，并缓冲至最佳离子浓度且维持在最佳pH以保持纳米孔216开放。纳米孔216穿过脂质双层214，并为从主体电解质208至工作电极202的离子流动提供唯一路径。除纳米孔(例如，PNTMC)和目标分析物之外，主体电解质208还可以包括以下项的一种或多种：氯化锂(LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(CaCl2)、氯化锶(SrCl2)、氯化锰(MnCl2)和氯化镁(MgCl2)。
对电极(CE)210可以是电化学电位传感器。在一些实施例中，对电极210在多个纳米孔单元之间共享，并且因此可以称为共用电极。在一些情况下，共用电位和共用电极可以为特定分组内的所有纳米孔单元或至少所有纳米孔单元所共用。共用电极可以被配置为向与纳米孔216接触的主体电解质208施加共用电位。对电极210和工作电极202可以耦合至信号源228，以提供跨脂质双层214的电刺激(例如，电压偏置)，并且可以用于感测脂质双层214的电特性(例如，电阻、电容和离子电流)。在一些实施例中，纳米孔单元200还可包括参考电极212。
在一些实施例中，作为校准的一部分，在创建纳米孔单元期间进行各种检查。一旦纳米孔单元创建，可以执行进一步的校准步骤，例如，以识别性能符合期望的纳米孔单元(例如，单元中的一个纳米孔)。此类校准检查可以包括物理检查、电压校准、开放通道校准以及具有单个纳米孔的单元识别。
B.纳米孔测序单元的检测信号
纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元，诸如纳米孔传感器芯片100中的纳米孔单元150，可以使用基于单分子纳米孔的边合成边测序(Nano-SBS)技术进行平行测序。
图3示出使用Nano-SBS技术执行核苷酸测序的纳米孔单元300的实施例。在Nano-SBS技术中，可以将待测序的模板332(例如，核苷酸分子或另一目标分析物)和引物引入纳米孔单元300样品室中的主体电解质308中。作为实例，模板332可以呈圆形或线形。核酸引物可以与模板332的一部分杂交，可以该模板的一部分添加四种带不同聚合物标签的核苷酸338。
在一些实施例中，酶(例如，聚合酶334，诸如DNA聚合酶)与纳米孔316缔合，以用于合成模板332的互补链。例如，聚合酶334可以共价附着到纳米孔316。聚合酶334可以使用单链核酸分子作为模板以催化核苷酸338掺入到引物上。核苷酸338可以包括标签种类(“标签”)，其中核苷酸是四种不同类型中的一种：A、T、G或C。当带标签的核苷酸与聚合酶334正确复合时，可以通过电动力将标签拉到(例如，负载)到纳米孔中，诸如在电场作用下产生的力，所述电场由跨脂质双层314和/或纳米孔316施加的电压生成。标签尾可以位于纳米孔316的筒体中。由于标签的独特的化学结构和/或尺寸，保持在纳米孔316的筒体中的标签可以生成独特的离子阻断信号340，从而电子识别标签所附着到的添加碱基。
如本文所用，“负载的”或“穿线的”标签可以是定位在纳米孔中和/或保持在纳米孔中或附近相当长的时间，例如，0.1毫秒(ms)至10000ms。在一些情况下，标签在从核苷酸释放之前被负载在纳米孔中。在一些情况下，在核苷酸掺入事件释放后，负载的标签穿过纳米孔(和/或被其检测)的概率适当较高，例如，90％至99％。
在一些实施例中，在将聚合酶334连接至纳米孔316之前，纳米孔316具有高电导，例如，约300皮西门子(300pS)。当标签负载在纳米孔中时，由于标签的独特的化学结构和/或尺寸，生成独特的电导信号(例如，信号340)。例如，纳米孔的电导可以为约60pS、80pS、100pS或120pS，各自对应于四种类型的带标签的核苷酸中的一种。然后，聚合酶可以进行异构化和转磷酸化反应以将核苷酸掺入到正在生长的核酸分子中并释放标签分子。
在一些情况下，一些带标签的核苷酸可以与核酸分子(模板)的当前位置不匹配(互补碱基)。不与核酸分子碱基配对的带标签的核苷酸也可以穿过纳米孔。这些未配对的核苷酸可以在比正确配对的核苷酸保持与聚合酶缔合的时间范围更短的时间范围内被聚合酶拒绝。与未配对核苷酸结合的标签可以快速穿过纳米孔，并在短时间内(例如，少于10ms)检出，而与配对核苷酸结合的标签可以负载到纳米孔中并在长时间内(例如，至少10ms)检出。因此，未配对的核苷酸可以由下游处理器至少部分地基于在纳米孔中检测核苷酸的时间来进行识别。
包括负载的(穿线的)标签的纳米孔的电导(或等效电阻)可以通过信号值(例如，流过纳米孔的电压或电流)来进行测量，从而提供标签种类的识别，并由此提供当前位置的核苷酸的识别。在一些实施例中，直流(DC)信号施加至纳米孔单元(例如，使得标签移动穿过纳米孔的方向不是反向的)。但是，使用直流电长时间操作纳米孔传感器可以改变电极的组成，使穿过纳米孔的离子浓度失衡，并产生其他不期望的效果，从而影响纳米孔单元的寿命。施加交流(AC)波形可以减少电迁移，从而避免这些不期望的效果，并具有如下所述的某些优点。本文所述的利用标记的核苷酸的核酸测序方法与施加的AC电压完全兼容，因此AC波形可用于实现这些优点。
当使用牺牲电极，即在载流反应中改变分子特性的电极(例如，含银电极)，或在载流反应中改变分子特性的电极时，在AC检测循环期间对电极再充电的能力可能有利。当使用直流信号时，电极可以在检测周期中耗尽。再充电可以防止电极达到耗尽极限，诸如变得完全耗尽，这在电极较小时(当电极足够小以提供具有每平方毫米至少500个电极的电极阵列时)可能会出现问题。在一些情况下，电极寿命与电极的宽度成比例，并且至少部分取决于电极的宽度。
用于测量流过纳米孔的离子电流的合适条件是本领域已知的，并且本文提供了实例。可以通过跨膜和孔施加电压来进行测量。在一些实施例中，使用的电压在-2000mV至+2000mV的范围内。所使用的电压优选在具有选自-2000mV、-1900mV、-1500mV、-1700mV、-1600mV、-1500mV、-1400mV、-1300mV、-1200mV、-1100mV、-1000mV、-900mV、-800mV、-700mV、-600mV、-500mV、-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV的下限以及独立地选自+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV、+400mV、+500mV、+600mV、+700mV、+800mV、+900mV、+1000mV、+1100mV、+1200mV、+1300mV、+1400mV、+1500mV、+1600mV、+1700mV、+1800mV、+1900mV和+2000mV的上限的范围内。使用的电压可以更优选地在100mV至240mV的范围内，并且最优选地在160mV至240mV的范围内。使用增加的施加电位，通过纳米孔来增加不同核苷酸之间的区别是可能的。使用AC波形和标记的核苷酸进行核酸测序在2013年11月6日提交的题为“使用标签的核酸测序”的美国专利公开号US 2014/0134616中有描述，该美国专利全文以引用方式并入本文。除了US 2014/0134616中描述的带标签的核苷酸外，还可以使用缺少糖或无环部分的核苷酸类似物，例如，五个常见核碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶的(S)-甘油核苷三磷酸(gNTP)(Horhota et al.，OrganicLetters，8：5345-5347[2006])进行测序。
C.纳米孔测序单元的电路
图4示出在纳米孔单元(诸如纳米孔单元400)中的电路400(该电路可以包括图2中的电路222的部分)的实施例。如上所述，在一些实施例中，电路400包括对电极410，该电极可以在纳米孔传感器芯片中的多个纳米孔单元或所有纳米孔单元之间共享，并且因此也可以称为作为共用电极。共用电极可以被配置为通过连接至电压源VLIQ 420而向与纳米孔单元中的脂质双层(例如，脂质双层214)接触的主体电解质(例如，主体电解质208)施加共用电位。在一些实施例中，可以利用AC非法拉第模式来用AC信号(例如，方波)调节电压VLIQ，并将其施加到与纳米孔单元中的脂质双层接触的主体电解质上。在一些实施例中，VLIQ是幅值为±200-250mV且频率介于例如25和400Hz之间的方波。对电极410和脂质双层(例如，脂质双层214)之间的主体电解质可以通过诸如，例如100μF或更大的大电容器(未示出)来进行建模。
图4还示出表示工作电极402(例如，工作电极202)和脂质双层(例如，脂质双层214)的电特性的电模型422。电模型422包括对脂质双层相关的电容进行建模的电容器426(C双层)和对纳米孔相关的可变电阻进行建模的电阻器428R孔，该电模型可以基于纳米孔中特定标签的存在而变化。电模型422还包括电容器424，所述电容器424具有双层电容(C双层)，并且表示工作电极402和孔洞205的电特性。工作电极402可以被配置为不依赖于其他纳米孔单元中的工作电极来施加不同的电位。
通路装置406是开关，该开关可以用于将脂质双层和工作电极连接至电路400或者断开与之的连接。通路装置406可以由控制线407控制，以启用或禁用跨纳米孔单元中的脂质双层施加的电压刺激。在脂质沉积以形成脂质双层之前，两个电极之间的阻抗可以非常低，因为纳米孔单元的孔洞未密封，因此通路装置406可以保持开放以避免短路情况。在脂质溶剂已经沉积到纳米孔单元以密封纳米孔单元的孔洞之后，通路装置406可以关闭。
电路400还可包括芯片上积分电容器408(ncap)。积分电容器408可以通过使用复位信号403来闭合开关401而进行预充电，使得积分电容器408连接至电压源VPRE 405。在一些实施例中，电压源VPRE 405提供幅值为例如900mV的恒定参考电压。当开关401闭合时，积分电容器408可以预充电至电压源VPRE 405的参考电压电平。
在对积分电容器408进行预充电之后，复位信号403可以用于断开开关401，以断开积分电容器408与电压源VPRE 405的连接。此时，根据电压源VLIQ的电平，对电极410的电位可以处于高于工作电极402(和积分电容器408)的电位的电平，或反之亦然。例如，在来自电压源VLIQ的方波的正相位期间(例如，AC电压源信号循环的亮周期或暗周期)，对电极410的电位处于高于工作电极402的电位的电平。在来自电压源VLIQ的方波的负相位期间(例如，AC电压源信号周期的暗时段或亮时段)，对电极410的电位处于低于工作电极402的电位的电平。因此，在一些实施例中，由于对电极410与工作电极402之间的电位差，积分电容器408可以进一步在从电压源VPRE 405的预充电电压电平预充电至较高电平的亮时段期间充电，并在暗时段期间放电至较低电平。在其他实施例中，充电和放电可以分别在暗时段和亮时段中发生。
根据模数转换器(ADC)435的采样率，积分电容器408可以在固定的时间段充电或放电，所述采样率可以高于1kHz、5kHz、10kHz、100kHz或更多。例如，以1kHz的采样率，积分电容器408可以在约1ms的时间段充电/放电，然后可以在积分时段结束时由ADC 435对电压电平进行采样和转换。特定的电压电平将对应于纳米孔中的特定标签种类，并且因此对应于模板上当前位置的核苷酸。
在由ADC 435采样之后，积分电容器408可以通过使用复位信号403来闭合开关401而再次进行预充电，使得积分电容器408再次连接至电压源VPRE 405。可以在整个测序过程的循环中重复以下步骤：对积分电容器408进行预充电，等待积分电容器408在固定的时间段充电或放电，以及由ADC 435对积分电容器的电压电平进行采样和转换。
数字处理器430可以处理ADC输出数据，例如，用于归一化、数据缓冲、数据过滤、数据压缩、数据缩减、事件提取、或将来自纳米孔单元阵列的ADC输出数据组装成各种数据帧。在一些实施例中，数字处理器430还执行下游处理，诸如碱基确定。数字处理器430可以作为硬件实施(例如，在图形处理单元(GPU)、FPGA、ASIC等中)或作为硬件和软件的组合实施。
因此，跨纳米孔施加的电压信号可用于检测纳米孔的特定状态。当纳米孔的筒体中不存在附着标签的多磷酸盐时，纳米孔的一种可能状态是开放通道状态，本文中也称为纳米孔的未穿线状态。纳米孔的另外四种可能状态各自对应于四种不同类型的标记的多磷酸核苷酸(A、T、G或C)中的一种被保持在纳米孔的筒体中的状态。纳米孔的另一种可能状态是脂质双层破裂时。
当在固定的时间段之后测量积分电容器408上的电压电平时，纳米孔的不同状态可以产生对不同电压电平的测量。这是因为积分电容器408上的电压衰减率(通过放电降低或通过充电而增加)(即，积分电容器408上的电压斜率的陡度与时间绘制图)取决于纳米孔电阻(例如，电阻器R孔428的电阻)。更特别地，由于分子(标签)的不同化学结构，与处于不同状态的纳米孔相关的电阻不同，因此可以观察到对应的不同电压衰减率，并且可以用于识别纳米孔的不同状态。电压衰减曲线可以是具有RC时间常数τ＝RC的指数曲线，其中R是与纳米孔相关的电阻(即，R孔电阻器428)，C是与R平行的膜相关的电容(即，C双层电容器426)。纳米孔单元的时间常数可以是，例如，约200-500ms。由于双层的详细实施方式，衰减曲线可以非完全拟合指数曲线，但是衰减曲线可以类似于指数曲线并且是单调的，从而实现标签检测。
在一些实施例中，与处于开放通道状态的纳米孔相关联的电阻在100MOhm至20GOhm的范围内。在一些实施例中，在标签在纳米孔的筒体内的状态下，与纳米孔相关的电阻可以在200MOhm至40GOhm的范围内。在其他实施例中，可以省略积分电容器408，因为通向ADC 435的电压仍将随电模型422中的电压衰减而变化。
积分电容器408上的电压衰减率可以以不同的方式确定。如上所述，电压衰减率可以通过在固定的时间间隔内测量电压衰减来确定。例如，积分电容器408上的电压可以首先在时间t1处由ADC 435测量，然后在时间t2处由ADC 435再次测量电压。当积分电容器408上的电压斜率相对于时间曲线较陡时，电压差较大，而当电压曲线的斜率较缓时，电压差较小。因此，电压差可以用作确定积分电容器408上的电压衰减率以及纳米孔单元状态的度量。
在其他实施例中，电压衰减率通过测量所选电压衰减量所需的持续时间来确定。例如，可以测量电压从第一电压电平V1下降或增加至第二电压电平V2所需的时间。当电压相对于时间曲线的斜率较陡时，所需的时间较少，而当电压相对于时间曲线的斜率较缓时，所需的时间较多。因此，所需的测量时间可以用作确定积分电容器ncap 408上的电压衰减率以及纳米孔单元状态的度量。本领域技术人员将理解可用于测量纳米孔的电阻的各种电路，例如，包括信号值测量技术，诸如电压或电流测量。
在一些实施例中，电路400不包括在芯片上制造的通路装置(例如，通路装置406)和额外的电容器(例如，积分电容器408(ncap))，从而有助于减小基于纳米孔的测序芯片的尺寸。由于膜(脂质双层)的薄性质，仅与膜相关的电容(例如，电容器426(CBilayer))就足以产生所需的RC时间常数，而无需额外的芯片上电容。因此，电容器426可以用作积分电容器，并且可以通过电压信号VPRE预充电并且随后可以通过电压信号VLIQ放电或充电。消除原本在电路中的芯片上制造的额外电容器和通路器件，可以显著减小纳米孔测序芯片中单个纳米孔单元的占位面积，从而有利于纳米孔测序芯片的缩放以包括越来越多的单元(例如，在纳米孔测序芯片中具有数百万个单元)。例如，测序芯片可以具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20百万个单元。在一些实施例中，芯片可以具有约8百万个孔洞。
D.纳米孔单元中的数据采样
为了执行核酸测序，积分电容器(例如，积分电容器408(ncap)或电容器426(C双层)的电压电平可以由ADC(例如，ADC 435)采样和转换，同时将带标签的核苷酸添加到核酸中。例如，当所施加的电压使得VLIQ低于VPRE时，核苷酸的标签可以通过穿过对电极和工作电极施加的跨纳米孔的电场推入纳米孔的筒体中。
1.穿线
穿线事件是将带标签的核苷酸附着到模板(例如，核酸片段)，并且标签移动进出纳米孔的筒体时。在穿线事件期间，该移动可以发生多次。当标签位于纳米孔的筒体中时，纳米孔的电阻可以更高，并且更低的电流可以流过纳米孔。
在测序期间，标签可以不在某些AC循环(称为开放通道状态)的纳米孔中，其中电流最高，因为纳米孔的电阻较低。当标签被吸引至纳米孔的筒体中时，纳米孔处于亮模式。当标签从纳米孔的筒体中推出时，纳米孔处于暗模式。
2.亮周期和暗周期
在AC循环内，ADC可以多次采样积分电容器上的电压。例如，在一个实施例中，以例如约100Hz跨***施加AC电压信号，并且ADC的获取速率可以是每个单元约2000Hz。因此，每个AC循环(AC波形的循环)可以捕获约20个数据点(电压测量)。对应于AC波形的一个循环的数据点可以称为一组。在AC循环的一组数据点中，亚组可以例如在VLIQ低于VPRE时捕获，所述亚组可以对应于亮模式(时段)，此时标签被迫进入纳米孔的筒体中。另一亚组可以对应于暗模式(时段)，此时标签在例如VLIQ高于VPRE时由所施加的电场从纳米孔的筒体中推出。
3.测得电压
对于每个数据点，当开关401断开时，积分电容器(例如，积分电容器408(ncap)或电容器426(C双层))处的电压将因VLIQ的充电/放电而以衰减的方式发生变化，例如，当VLIQ高于VpRE时从VPRE增加到VLIQ，或者当VLIQ低于VpRE时从VPRE减少到VLIQ。当工作电极充电时，最终电压值可以偏离VLIQ。积分电容器上电压电平的变化率可以由双层的电阻值控制，所述双层可以包括纳米孔，所述纳米孔反过来可以包括纳米孔中的分子(例如，带标签的核苷酸的标签)。电压电平可以在开关401断开之后的预定时间测量。
开关401可以以数据获取速率操作。开关401可以在两次数据获取之间相对短的时间段内闭合，通常在ADC测量之后立即闭合。所述开关允许在VLIQ的每一个AC循环的每一个子时段(亮或暗)期间收集多个数据点。如果开关401保持断开，则积分电容器上的电压电平以及ADC的输出值完全衰减并保持不动。相反，如果开关401闭合，积分电容器再次预充电(至VPRE)，并且准备好进行另一次测量。因此，开关401允许针对每一个AC循环的每一个子周期(亮或暗)收集多个数据点。如此多次测量可以利用固定的ADC实现更高的分辨率(例如，由于更多的测量次数，因此为8位至14位，所述次数可以取平均)。多次测量还可以提供有关进入纳米孔中穿线的分子的动力学信息。定时信息可以确定穿线发生的时间长短。这也可以用于帮助确定添加到核酸链的多个核苷酸是否正在测序。
图5显示在AC循环的亮时段和暗时段期间从纳米孔单元捕获的数据点实例。在图5中，出于说明目的，放大数据点的变化。施加到工作电极或积分电容器的电压(VPRE)处于恒定电平，诸如，例如900mV。施加到纳米孔单元的对电极的电压信号510(VLIQ)是显示为矩形波的AC信号，其中占空比可以是任何合适的值，诸如小于或等于50％，例如，约40％。
在亮周期520期间，施加到对电极的电压信号510(VLIQ)低于施加到工作电极的电压VPRE，使得标签可能通过施加在工作电极和对电极上的不同电压电平(例如，由于标签上的电荷和/或离子的流动)所引起的电场而被迫进入纳米孔的筒体中。当开关401断开时，ADC之前的节点处(例如，积分电容器处)的电压将减小。在捕获电压数据点之后(例如，在指定时间段之后)，开关401可以闭合，并且测量节点处的电压将再次增加回到VPRE。该工艺可以重复以测量多个电压数据点。以这种方式，可以在亮时段期间捕获多个数据点。
如图5所示，在VLIQ信号的符号改变之后的亮时段中的第一数据点522(也称为第一点δ(FPD))可以低于随后的数据点524。这可能是因为纳米孔(开放通道)中没有标签，因此它具有低电阻和高放电速率。在一些情况下，第一数据点522可以超过LIQ电平，如图5所示。这可能是由将信号耦合到芯片上电容器的双层电容引起的。数据点524可以在发生穿线事件之后捕获，即，标签被迫进入纳米孔的筒体中，其中纳米孔的电阻以及积分电容器的放电速率取决于标签的特定类型，所述标签被迫进入纳米孔的筒体中。如下所述，由于电荷在C双层424处累积，因此对于每次测量，数据点524可能稍微减小。
在暗周期530期间，施加到对电极的电压信号510(VLIQ)高于施加到工作电极的电压(VPRE)，使得任何标签将被推出纳米孔的筒体。当开关401断开时，因为电压信号510的电压电平(VLIQ)高于VPRE，所以测量节点处的电压增加。在捕获电压数据点之后(例如，在指定时间段之后)，开关401可以闭合，并且测量节点处的电压将再次降低回到VPRE。该工艺可以重复以测量多个电压数据点。因此，可以在暗时段期间捕获多个数据点，包括第一点δ532和后续数据点534。如上所述，在暗周期期间，任何核苷酸标签被推出纳米孔，因此除了用于归一化之外，还获得了关于任何核苷酸标签的最少信息。
图5还示出在亮周期540期间，即使施加到对电极的电压信号510(VLIQ)低于施加到工作电极的电压(VPRE)，也不会发生穿线事件(开放通道)。因此，纳米孔的电阻低，并且积分电容器的放电速率高。结果，包括第一数据点542和后续数据点544的捕获数据点显示低电压电平。
对于纳米孔的恒定电阻的每一次测量，可以预期在亮时段或暗时段期间测量的电压大致相同(例如，在既定AC循环的亮模式下，当一个标签在纳米孔中时进行测量)，但是当电荷在双层电容器424(C双层)处累积时，情况可以并非如此。这种电荷累积可以导致纳米孔单元的时间常数变长。结果，电压电平可以发生偏移，从而导致在循环中每一个数据点的实测值减小。因此，在循环内，数据点可以从一个数据点到另一个数据点有所变化，如图5所示。
关于测量的更多详细信息可见，例如，题为“具有可变电压刺激的基于纳米孔的测序”的美国专利公开号2016/0178577、题为“具有可变电压刺激的基于纳米孔的测序”的美国专利公开号2016/0178554、题为“使用对电刺激的双层响应测量进行无损双层监测”的美国专利申请号15/085,700和题为“双层形成的电增强”的美国专利申请号15/085,713，其公开内容全文出于所有目的以引用方式并入本文。
4.归一化和碱基识别
对于纳米孔传感器芯片的每一个可用的纳米孔单元，可以运行生产模式以对核酸进行测序。测序期间捕获的ADC输出数据可以进行归一化以提供更高准确度。归一化可以考虑偏移效应，诸如循环形状、增益漂移、电荷注入偏移和基线偏移。在一些实施方式中，可以扁平对应于穿线事件的亮时段周期循环的信号值，从而获得用于循环的单个信号值(例如，平均值)或可以调整测量的信号以减少循环内衰减(一种循环形状效应)。增益漂移通常会缩放整个信号，并以100秒到1,000秒的等级改变。作为示例，可以通过溶液(孔电阻)的变化或双层电容的变化来触发增益漂移。基线偏移发生的时间尺度约为100ms，并且与工作电极处的电压偏移有关。由于需要在亮时段到暗时段维持测序单元中的电荷平衡，因此可以通过从穿线的有效整流比的变化来驱动基线漂移。
在归一化之后，实施例可以确定用于穿线的通道的电压群集，其中每一个群集对应于不同的标签种类，并且因此对应于不同的核苷酸。群集可用于确定对应于既定核苷酸的既定电压的概率。作为另一个实例，群集可以用于确定区分不同核苷酸(碱基)的截止电压。
III.自限孔***
在单元的膜中***孔后，由于孔相对较高的电导，跨膜的电压开始迅速下降。跨膜的电压的下降降低了膜中额外的孔***的驱动力。
图6示出了纳米孔传感器单元的电路图600的实施例，其突出了传感器单元的各种电压和组件中可能与本文所述的***和方法相关的一些电压和组件，诸如在工作电极和对电极之间施加的电压(Vapp)602、跨双层的电压(Vbly)604、用于对工作电极(C双层)608和积分电容器(NCAP)610进行预充电的电压(Vpre)606以及向对电极施加的电压(Vliq)612。
本文描述了利用这种性质来***蛋白质孔并控制单个孔***而在***步骤期间没有主动反馈的方法和***。在这种孔***方法的一些中，通过电容性工作电极施加AC耦合电压，并且通过无孔膜的低电导来跨实施例膜维持该电压。在一些实施例中，电压可以施加到整个单元阵列，与孔***的当前状态无关。在一些实施例中，电压可以施加到具有膜的单元。施加的电压波形可以以斜坡、多个递增阶梯或其他形状逐渐增加，以产生低的额外蛋白质孔***可能性，同时还降低膜损坏的风险。这可以通过使用小的电压阶跃、电压斜坡中适度的电压增加速率等来限制电压施加瞬变而实现。
例如，在如图7所示的一些实施例中，孔***电压(Vapp)可以作为阶梯式电压波形700施加，该阶梯电压波形从0mV开始，并且每5秒以100mV的增量增加，直到最大电压2000mV(或相应的负电压)。在一些实施例中，初始电压可以是约0、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mV。在一些实施例中，阶跃增加量可以是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mV。在一些实施例中，阶跃大小可以小于约100、90、80，70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1mV。在一些实施例中，每个阶跃的持续时间可为约0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60秒。在一些实施例中，这些阶跃可以具有可变的持续时间。例如，在一些实施例中，较低电压下的一些或所有阶跃可以比较高电压下的阶跃具有更长的持续时间。在一些实施例中，最大电压约为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000mV(或相应的负电压)。在一些实施例中，可以预先确定孔***电压波形的一个或多个元素，例如初始起始电压、电压阶跃增加量的幅值、每个阶跃的持续时间和/或最大电压。
在如图8所示的一些实施例中，孔***电压可以作为斜坡电压波形800施加，该斜坡电压波形从0mV开始，并且以每分钟1V的速率增加，直到2000mV的最大电压(或相应的负电压)。在一些实施例中，初始电压可以是约0、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mV。在一些实施例中，电压增加的速率为每分钟约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0V。在一些实施例中，最大电压约为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000mV(或相应的负电压)。在一些实施例中，可以预先确定孔***电压波形的一个或多个元素，例如初始起始电压、电压增加速率和/或最大电压。
在一些实施例中，孔***电压波形的一个或多个元素可以基于所测量的单元组件的电性质和/或物理性质(诸如膜密封电阻，该电阻是在膜跨单元形成密封之后跨膜的电阻)来确定。在一些实施例中，这些测量可以在施加电压波形之前进行，使得波形在施加之前被完全确定，这与基于主动反馈的方法形成对比，该方法使用在刺激期间进行的测量来改变一个或多个刺激参数。因为本文所述的穿孔方法是自限性的，所以不需要使用主动穿孔方法，该主动穿孔方法包括测量由于孔***膜中而引起的***或***组件的电性质或物理性质的变化，然后相应地调节穿孔电压以防止第二孔***膜中。
在一些实施例中，本文所述的方法可以应用于在带悬浮膜的微孔的底部具有电容性电极并且在膜的另一侧上具有对电极的传感器阵列。在从所有单元移除***驱动电压施加之后，传感器可用于检测孔的存在。尽管在电压施加期间有可能检测到孔的存在，但是在该方法中这不是必须的，并且可以在没有对阵列中的任何单个传感器或整体上的电压施加的反馈的情况下***孔。
该方法有效地扫描克服孔***活化势垒所需的电压，该电压可以在阵列中的各个膜之间、在阵列上的小区域或大区域之间、或者在来自一个装置的阵列到来自第二装置的另一个阵列之间变化。此外，穿孔电压可以在孔突变体之间、在包括脂质双层、嵌段共聚物或其他实施方式的膜组成和构象之间变化。通过在从低到高的范围内扫描或扫过电压，单个电压波形可以足够稳健，以有效地作用于大量不同类型的孔阵列或带一定可变性的相同类型的孔阵列。
此外，通过从低电压到高电压进行扫描，孔更有可能在双层达到损坏膜的临界电压电平之前***膜中。此外，如图9A和图9B所示，一旦孔已经被***，该孔就可以消散跨膜积聚的电压，从而既降低了在孔已经被***之后当电压进一步增加时对膜造成损害的风险，并且降低了额外的孔***的可能性。只要电压阶跃的幅值或电压斜坡的增加速率不太大，孔就能有效地消散跨膜积聚的过量电压，从而降低损坏膜的风险，并降低额外的孔***的可能性。另一方面，希望增加电压阶跃的幅值或增加电压斜坡的增加速率，以便减少完成穿孔步骤所需的时间。
在一些实施例中，电压波形的上限可以通过将随着电压和时间变化的孔***的动力学和/或概率与随着电压和时间变化的膜损坏的动力学和/或概率进行比较来确定。例如，图10A示出了阵列中的孔***数量随着电压变化的曲线图，且图10B示出了通常由膜破裂和损坏所导致的去激活/短路数量随着电压变化的图。从这两个曲线图中，可以确定最佳的最大电压，该电压平衡了大量的孔***和少量的去激活/短路。
在一些实施例中，在孔***步骤期间，溶液中的孔浓度经选择为足够低以减少孔被动***膜中，同时仍然足够高以允许孔在电压辅助下***膜中。孔的被动***指孔***膜中，而无需跨膜施加电压来帮助孔***。在一些实施例中，通过被动***而***的孔的百分比小于50％、40％、30％、20％或10％，并且通过电压辅助式***而***的孔的百分比为至少50％、60％、70％、80％或90％。降低被动孔***速率可以降低向单个膜中***多个孔的可能性。
在一些实施例中，一旦在单元上放置膜，漏电流会导致电压积聚在阵列中的一个或多个单元中。这种捕获的电荷的幅值会随着时间和在单元之间变化，这使得在诱导穿孔时很难跨单元的所有膜施加均匀的电压。例如，当阵列中的单元中存在不同量的捕获的电荷时，对所有单元施加均匀的电压(Vapp)，可导致单元在穿孔步骤期间经历不同量的有效电压，这可导致带单个孔***的单元数量的高度可变性和/或在一些单元中施加过量电压，这可对膜造成损害。使用阶梯式或斜坡式电压波形可以解决这些问题。
在一些实施例中，通过使溶剂和膜材料(诸如脂质或嵌段共聚物)在单元开口上流动来实现在单元开口上形成膜。然后，例如，如果使用脂质，则可以通过以下方式将膜减薄为双层：通过跨膜施加电压，如美国专利公开号20170283867A1中进一步描述的，和/或通过操纵跨膜的渗透压不平衡，如国际专利公开号WO2018001925中进一步描述的，每一篇文献全文出于所有目的以引用方式并入本文。如本文所述，减薄的膜是足够薄(例如，厚度小于孔的长度)的膜，使得孔可以***膜中，而未减薄的膜是厚度太大(例如，厚度大于孔的长度)而不允许孔***的膜。在一些实施例中，在阵列中的单元上形成减薄的膜(即脂质双层)可以在开始穿孔过程和将孔***膜中之前完成。在其他实施例中，减薄膜的过程可以与将孔***膜的过程结合，例如，对于减薄过程和穿孔过程两者，使用相同的电压波形，诸如本文所述的任何电压波形，并且在减薄和穿孔的组合过程中，孔复合体可以流过膜。在一些实施例中，可以在膜材料已经被分配到单元上并且跨阵列中的单元形成未减薄的膜之后，施加减薄和穿孔的组合过程，因为在膜材料分配和形成初始未减薄的膜期间施加电压可能不均匀地捕获电荷。此外，在减薄和穿孔的组合过程期间，可以建立跨膜的渗透不平衡。将减薄步骤和穿孔步骤组合可以显著减少在阵列中制备多孔传感器所需的时间，从而提高传感器阵列***的产量。
本文所述的方法提供了许多益处，包括提高单孔***的成功率，降低多孔***的速率，以及降低损坏膜的可能性。
IV.膜形成和孔***时的电压控制
如上所述，测序芯片可以具有数百万个单元，其中每个单元可以包括带工作电极的孔洞。在一些实施例中，测序芯片可以是可消耗装置的一部分，其可以被出售和运送给消费者。可消耗装置可以包括流动池，该流动池设置在测序芯片上，并且在测序芯片的多个单元上形成一个或多个流动通道。在一些实施例中，可消耗装置和测序芯片可以在没有任何膜(即，脂双层或三嵌段共聚物膜)形成在孔洞上或孔洞中的情况下提供给最终用户。因此，在一些实施例中，将向最终用户提供试剂以在孔洞上或孔洞中形成膜，并在进行测序之前将纳米孔***膜中。在一些实施例中，一种试剂可包括成膜材料，诸如例如溶解或分散在溶剂(即，有机溶剂)中的脂质或三嵌段共聚物，并且另一种试剂可包括纳米孔溶液(即，由纳米孔、拴系的聚合酶和待测序的核酸形成的分子复合物)。
本文描述了用于有效形成膜并将单个纳米孔***具有数百万个单元的测序芯片中大部分孔洞中的膜中的***和方法。双层形成和孔***步骤的高效率对于产生成本有效和临床有用的结果非常重要。例如，低效率可能导致每个测序芯片可以处理的样品更少，这将推高每次测定的成本。术语“预测序方案”包括用于建立跨孔洞的膜和将孔(优选每个膜中的单个孔)***膜中的步骤和条件。
在一些实施例中，在成膜材料(即脂质或三嵌段共聚物)最初沉积到测序芯片上时施加的电压波形可以产生膜或双层的空间周期性或非周期性图案(条纹、条带、条痕)，这些图案在经受预测序方案和接受孔的能力方面不同。如图12A所示，该图案在膜或双层形成时可能是明显的，作为条痕的空间图案，该条痕由被良好膜或双层覆盖的孔洞与被失效膜或双层(短路)或厚有机相(脂质或三嵌段共聚物和溶剂)覆盖的孔洞的互补间条痕交替形成。如图12B所示，这种相同的空间图案随后也将表现为已经接受高密度单个孔的孔洞的条痕，与带较低密度或没有***孔的互补间条痕交替，后者与失效膜或双层(“短路”)或厚有机相覆盖层相关。
换句话说，在一些实施例中，在初始脂质或三嵌段共聚物沉积时，电压和流体流量(即流速)以及流体特性(即渗透压差)的组合似乎既决定了在孔洞的孔口上产生的膜或双层的质量，也决定了这些膜或双层在纳米孔预测序方案的后续阶段接受单孔的可能性。这种效应可由电压介导，由于脂质和溶剂的高电阻，电压可持续相对长的时间常数，这可有效地将电荷捕获在被覆盖的孔洞内。在一些实施例中，双层或膜电导和/或电阻可以提供关于双层或膜在孔洞内捕获电荷的效率的指示或预测。在一些实施例中，可以使用各种方法(包括例如使用SPICE的电路模拟和使用COMSOL的多物理模拟)对电压效应进行建模。可以影响膜形成和捕获的电荷的其他因素可以包括缓冲液组成、缓冲液电导率、缓冲液渗透压、电化学(能斯特)电位和电化学结电位。
捕获的电荷对双层或膜形成和孔***的影响代表了一种新的和意想不到的方法，该方法增加并可能最大化双层或膜和单孔的预测序产率，这可以提供一种在预测序和测序过程期间既增加性能又减少可变性的方法。
各种预测序条件(可消耗、流体流速、电压刺激波形形状(即，斜坡形、方形、三角形等)、电压幅值、电压极性、波形频率、占空比等)经表征和评估，以便最大化或增加双层或膜以及跨纳米微孔芯片的单孔的产率。基于这些实验，在脂质或三嵌段共聚物分配时的电压、在双层或膜减薄期间施加的电压、以及在孔***时施加的电压都可以彼此相互作用，并且可以控制电压的总和以产生高双层或膜产率和高单孔***。在一些实施例中，通过组合电压和流量，可以获得足够的捕获的电荷和电压，以产生自发减薄的双层或膜，以及孔的被动***。这种捕获的电荷和电压将在***孔时迅速消散，从而有效地防止或降低多孔的可能性。
A.成膜
在一些实施例中，双层或膜形成过程始于将可溶于有机溶剂的脂质或聚合物(即三嵌段共聚物)的溶液引入可消耗装置的流动通道中和测序芯片的孔洞上。脂质或三嵌段共聚物的溶液可以充分置换流动池中的水溶液，同时在孔洞中留下水相。在将脂质或三嵌段共聚物溶液引入孔洞的过程中，可以任选地在每个孔洞中的工作电极和设置在孔洞外(即，与测序芯片表面相对的流动池表面上)的对电极之间施加电压波形。在一些实施例中，在工作电极和对电极之间施加的电压的幅值可以是约0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mV。在一些实施例中，在工作电极和对电极之间施加的电压的幅值可以是约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775或800mV。在一些实施例中，电压波形的极性可以是正的。在其他实施例中，电压波形的极性可以是负的。极性决定了孔洞中捕获的电荷的“类型”(+ve或-ve)。取决于孔洞中的电荷和随后施加的电压的极性，在预测序方案的后续步骤中施加的电压将具有累积或减少的效果。
在一些实施例中，在脂质或三嵌段共聚物分配步骤期间，在电极之间不施加电压。在脂质分配步骤期间在电极之间施加电压可以将电荷捕获在孔洞中，从而即使当电极没有主动施加电压时，跨最终形成的双层或膜的电压也不会为零。如上所述，孔洞中捕获的电荷可提高孔被动***双层或膜的速率(即，当双层或膜形成时，如果在脂质或三嵌段共聚物分配步骤期间在孔洞中捕获电荷，则孔***的可能性可增加)。在一些实施例中，可能希望降低被动穿孔的速率，使得主动穿孔是孔***的主要机制。
在脂质或三嵌段共聚物分配步骤(其将捕获的电荷分配到孔洞中)之后，可通过引入水性缓冲液来置换有机相，从而从流动通道中移除大部分过量的脂质或三嵌段共聚物，从而留下密封并跨孔洞开口设置的脂质或三嵌段共聚物层。在一些实施例中，还可跨脂质或三嵌段共聚物层施加电压刺激，该脂质或三嵌段共聚物层跨孔洞的开口(即，厚覆盖的孔洞或原双层或原膜)而设置，以将脂质减薄成适于孔***的脂质双层或三嵌段共聚物薄层或膜。在一些实施例中，用于减薄的电压刺激的幅值可以高达约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775或800mV。在一些实施例中，电压刺激(以及本文所述的其他电压施加)可以例如作为连续斜坡、作为一系列逐渐递增的阶跃或作为单个阶跃来施加，并且可以以任一极性来施加。在一些实施例中，如果电荷已经被捕获在孔洞中，则可以选择减薄电压刺激的极性，以在施加减薄电压时进一步增加跨膜的电压。换句话说，在一些实施例中，取决于捕获的电荷和膜减薄电压各自的极性，施加来减薄膜的电压可以增加或减少任何在孔洞中捕获的电荷。此外，在一些实施例中，电极具有赝电容特性，取决于它们的极化导致不同的对地阻抗，这会影响孔洞中捕获的电荷的耗散。在一些实施例中，负极性导致比正极性更低的阻抗。
在一些实施例中，每个孔洞中的电极和相应的对电极可用于检测双层或膜是否已经形成。例如，电阻测量或其他电学测量(即电流或电容)可以指示厚覆盖单元、原双层/原膜或双层/膜的形成。在一些实施例中，可以通过测量孔***期间的电压***幅度来确定捕获的电荷量。当***孔时，当不存在捕获的电荷时，所施加的电压波形的测量电压将保持不变，但是如果存在捕获的电荷，将向上或向下偏转，这取决于捕获的电荷和所施加的电压波形各自的极性。用于测量捕获的电荷的其他技术可以包括测量膜电容或电阻或受捕获的电荷影响的其他电学测量。
B.孔/复杂流动
在孔洞上形成脂质双层或三嵌段共聚物薄层(即膜)后，纳米孔溶液，诸如由纳米孔、束缚于纳米孔的聚合酶和结合于聚合酶的核酸形成的分子复合物，可以流过膜。在一些实施例中，在工作电极和对电极之间没有主动施加电压的情况下，孔洞中捕获的电荷可以诱导纳米孔***膜中。在一些实施例中，一旦纳米孔已经被***膜中，孔洞中捕获的电荷可以通过纳米孔消散，从而降低第二纳米孔将被***膜中的可能性。在一些实施例中，可以选择溶液中纳米孔的浓度，以降低多孔的可能性。
在一些实施例中，每个孔洞中的电极和相应的对电极可用于检测孔是否已经***双层或膜中。例如，电阻或电导测量或其他电学测量(即电流或电压)可以指示孔***双层或膜中。
C.电穿孔
在一些实施例中，如果***检测到孔没有***双层或膜中，可以向该孔洞施加电压刺激以诱导穿孔。在一些实施例中，可以选择所施加电压的幅值和/或波形，以便降低多孔的可能性。例如，在一些实施例中，所施加电压的幅值可以等于或小于约300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775或800mV。在一些实施例中，所施加电压的幅值可以部分地基于孔洞中捕获的电荷的幅值。例如，在一些实施例中，捕获的电荷的幅值加上所施加的电压的幅值可以等于或小于约300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775或800mV。在一些实施例中，如果电荷已经被捕获在孔洞中，则可以选择穿孔电压刺激的极性，以在施加穿孔电压刺激时进一步增加跨膜的电压。在一些实施例中，在孔流动和/或穿孔期间，溶液中纳米孔的浓度可以在约1pM至1uM之间，以降低多孔的可能性。要使用的孔的浓度可以取决于膜材料、缓冲液组成和孔***期间施加的电压波形。
D.释放、调节和/或操纵捕获的电荷
在一些实施例中，孔洞中捕获的电荷可以***纵。例如，在一些实施例中，可以在电穿孔步骤之前释放捕获的电荷。在其他实施例中，可以调节或者增加或者减少捕获的电荷的幅值。例如，在一些实施例中，可以调整每个孔洞中捕获的电荷，使得每个孔洞中捕获的电荷大约相同(即，在约5％、10％、15％、20％或25％内)。例如，在一些实施例中，可以通过施加极性与孔洞中捕获的电荷相反的电压来释放(部分或完全)捕获的电荷。或者，如果施加使电极负极化的电压，则可以降低它对地的阻抗，从而将捕获的电荷排走。电压的施加可以更普遍地用于调节捕获的电荷的幅值。例如，在一些实施例中，可以通过施加极性与孔洞中捕获的电荷相匹配的电压来增加捕获的电荷。在一些实施例中，电极可以是法拉第的，并且缓冲液成分包括可以进行氧化还原反应的试剂。
在一些实施例中，在脂质分配步骤期间施加电压波形以在孔洞中捕获电荷也可以跨芯片诱发条痕图案，如图12A和图12B所示，这与(1)双层/薄膜和(2)双层/膜形成期间厚覆盖的孔洞的面积相关，如图12A所示。如图12B所示，在穿孔后，条痕也与(1)高密度的单孔和(2)低密度单孔和/或失效双层/膜或厚覆盖的单元的面积相关。条痕图案还与孔洞中捕获的电荷的不同量相关，这是基于成膜材料跨孔洞的流速和膜形成期间施加的电压波形的频率而发生的。
在一些实施例中，条痕图案和捕获的电荷分布可以被改变或操纵。例如，在一些实施例中，脂质或聚合物(即，三嵌段共聚物)分配期间的流速或流体速度可以改变条痕图案和捕获的电荷分布，如图13A-13C所示。图13A示出了施加50Hz波形时1μL/s的脂质流速。图13B示出了施加50Hz波形时2μL/s的脂质流速。图13C示出了施加50Hz波形时4μL/s的脂质流速。在脂质或膜分配步骤期间，增加脂质或聚合物的流速或流体速度会减少跨芯片的条痕的数量，但会增加条痕的宽度，而降低流速或流体速度会增加跨芯片的条痕的数量，并减少条痕的宽度。
在一些实施例中，在膜形成期间施加的电压波形频率可用于改变条痕图案和捕获的电荷，如图14A-14C所示。在图14A-14C中，脂质流速保持恒定在4μL/s，而在脂质分配期间施加的电压波形的频率从25Hz(如图14A所示)向图14B中的50Hz和图14C中的100Hz变化。在脂质或聚合物分配期间增加电压波形的频率导致跨芯片的条痕数量增加，宽度减小，或者相反，在脂质或聚合物分配期间降低电压波形的频率导致跨芯片的条痕数量减少，宽度增加。在一些实施例中，电压波形的频率可以大于约10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900或1000Hz。在一些实施例中，电压波形的频率可以小于约10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900或1000Hz。
在一些实施例中，条痕似乎是由脂质或聚合物分配期间施加的电压波形引起的。在一些实施例中，条痕可通过在膜形成期间的脂质或聚合物分配步骤期间不施加电压波形来减少或消除，如图15A所示，或通过在脂质分配波形期间使单元去激活来减少或消除，如图15B所示。
IV.计算机***
本文提到的任何计算机***可以利用任何数量的子***，其中可能是任选的。这种子***的实例在图11的计算机***1110中示出。在一些实施例中，计算机***包括单个计算机设备，其中子***可以是计算机设备的部件。在其他实施例中，计算机***包括多个计算机设备，每个计算机设备是具有内部组件的子***。计算机***可以包括台式计算机和膝上型计算机、平板电脑、移动电话和其他移动装置。
图11所示的子***经由***总线1180互连。示出附加子***，诸如打印机1174、键盘1178、存储装置1179、监视器1176(其与显示适配器1182联接)等。耦合至I/O控制器1171的***装置和输入/输出(I/O)装置可以通过本领域已知的任何数量的装置，诸如I/O端口1177(例如，USB、
Figure BDA0003920559570000321
)连接至计算机***。例如，I/O端口1177或外部接口1181(例如，以太网、Wi-Fi等)可用于将计算机***1110连接至广域网，诸如互联网、鼠标输入器件或扫描仪。通过***总线1180的互连允许中央处理器1173与每一个子***通信并控制对来自***存储器1172或存储器件1179(例如，固定磁盘，诸如硬盘驱动器，或光盘)的多个指令的执行，以及子***之间的信息交换。***存储器1172和/或存储装置1179可以具体表现为计算机可读介质。另一个子***是数据收集装置1175，诸如照相机、麦克风、加速度计或其他传感器等。本文提到的任何数据均可以从一个部件输出至另一部件，并可以输出给用户。
计算机***可以包括多个相同的部件或子***，例如，通过外部接口1181、通过内部接口或通过可移动存储装置连接在一起，该可移动存储装置可以从一个部件连接或移动至另一个部件。在一些实施例中，计算机***、子***或装置在网络上通信。在这种情况下，一台计算机可以视为客户端，另一台计算机可以视为服务器，其中每一台计算机均可以视为同一计算机***的一部分。客户端和服务器可以各自包括多个***、子***或组件。
实施例的各方面可以使用硬件电路(例如，APSIC或FPGA)和/或使用具有一般可编程处理器的计算机软件，以控制逻辑的形式，以模块化或集成方式来实施。如本文所用，处理器可包括单核处理器、在同一集成芯片上的多核处理器、或在单电路板上或联网的多个处理单元，以及专用硬件。基于本文提供的公开内容和启示，本领域普通技术人员将知道并理解使用硬件以及硬件和软件的组合实现本发明实施例的其他方式和/或方法。
可以使用任何合适的计算机语言诸如Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift或脚本语言诸如Perl或Python，使用例如传统技术或面向对象技术，将本申请中描述的任何软件组件或功能实现为由处理器执行的软件代码。软件代码可以作为一系列指令或命令存储在计算机可读介质上，以进行存储和/或传输。合适的非暂时性计算机可读介质可以包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁性介质(诸如硬盘驱动器或软盘)、或光学介质(诸如光盘(CD)或DVD(数字通用磁盘)、闪存等)。所述计算机可读介质可以是这种存储或传输设备的任何组合。
也可以使用载波信号对此类程序进行编码和发送，载波信号适合于通过符合包括互联网在内的各种协议的有线、光学和/或无线网络来传输。如此，计算机可读介质可以使用经这种程序编码的数据信号来创建。可以将以程序代码编码的计算机可读介质与兼容装置打包在一起，或者与其他装置分开提供(例如，经由互联网下载)。任何此类计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品(例如，硬盘驱动器、CD或整个计算机***)上或内部，并且可以存在于***或网络内的不同计算机产品上或内部。计算机***可以包括监测器、打印机或其他合适的显示器，用于向用户提供本文提到的任何结果。
本文描述的任何方法可以由包括一个或多个处理器的计算机***完全或部分地执行，该计算机***可以构造为用于执行步骤。因此，实施例可以针对被配置成执行本文描述的任何方法的步骤的计算机***，可能具有执行相应步骤或相应步骤组的不同组件。尽管以编号的步骤呈现，但是可以同时或在不同时间或以不同顺序执行本文所述方法的步骤。此外，部分的这些步骤可以与其他方法中其他步骤的部分一起使用。另外，全部或部分步骤可以任选。另外，任何方法的任何步骤都可以用模块、单元、电路或用于执行这些步骤的***的其他装置来执行。
在不脱离本发明实施例的精神和范围的情况下，可以以任何合适的方式组合特定实施例的具体细节。然而，本发明的其他实施例可以针对与每个单独方面或者这些单独方面的特定组合有关的特定实施例。
尽管为了清楚理解的目的先前已经相当详细地描述了前述实施例，但是本发明并不局限于所提供的细节。还有许多实现本发明的替代方法。所公开的实施例是说明性的而不是限制性的。为了说明和描述的目的，已经给出了本发明的示例性实施例的以上描述。并不旨在穷举本发明或将本发明限制为所描述的精确形式，并且根据以上教导，许多修改和变化是可能的。
当特征或要素在本文中被称为在另一特征或要素“上”时，它可以直接在另一特征或要素上，或者也可以存在中间特征和/或要素。相反，当特征或要素被称为“直接在”另一特征或要素“上”时，则不存在中间特征或要素。还将理解，当特征或要素被称为“连接”、“附接”或“耦接”至另一特征或要素时，它可以直接连接、附接或耦接到另一特征或要素，或者可以存在中间特征或要素。相反，当特征或要素被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接耦接”至另一特征或要素时，则不存在中间特征或要素。尽管对于一个实施例进行了描述或示出，但是如此描述或示出的特征和要素可以应用于其他实施例。本领域的技术人员还将认识到，提及与另一特征“相邻”设置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或位于其之下的部分。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并非旨在限制本发明。例如，如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确地指出。还将进一步理解，当在本说明书中使用术语“包括”和/或“包含”时，其指定了所规定的特征、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作、要素、组分和/或它们的组。如本文所用，术语“和/或”包括相关联的列出项目中的一者或多者的任何组合和所有组合，并且可以缩写为“/”。
为了便于描述，在本文中可以使用空间上相对的术语，诸如“下方”、“下面”、“低于”、“上方”、“上面”等，以描述一个要素或特征与另外的要素或特征的关系，如附图中所展示。应当理解，除了附图中描绘的取向之外，空间上相对的术语还旨在涵盖装置在使用或操作中的不同取向。例如，如果附图中的装置是倒置的，则描述为在其他要素或特征“下方”或“之下”的要素于是将定向为在其他要素或特征“上方”。因此，示例性术语“下方”可以涵盖“上方”和“下方”这两个取向。可以以其他方式定向该装置(旋转90度或以其他取向)，并且据此解释本文所用的空间上相对的描述语。类似地，除非另外具体地指出，否则“向上”、“向下”、“垂直的”、“水平的”等术语在本文中仅用于解释的目的。
尽管本文可以使用术语“第一”和“第二”来描述各种特征/要素(包括步骤)，但是除非上下文另外指出，否则这些特征/要素不应受这些术语的限制。这些术语可以用于将一个特征/要素与另一个特征/要素区分开。因此，在不脱离本发明的教导内容的情况下，下面讨论的第一特征/要素可以被称为第二特征/要素，并且类似地，下面讨论的第二特征/要素可以被称为第一特征/要素。
在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”和诸如“包含”和“含有”的变型意味着可以在方法和物品(例如，组合物以及包括装置和方法的设备)中共同采用各种组分。例如，术语“包括”将被理解为暗示包括任何所规定的要素或步骤，但是不排除任何其他要素或步骤。
如本文在说明书和权利要求书中所用，包括如在示例中所用，并且除非另外明确地指定，否则所有数字都可以被解读为好像前面有词语“约”或“大约”，即使该术语没有明确地出现。当描述幅值和/或位置时，可以使用短语“约”或“大约”来指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可以具有为规定值(或值的范围)的+/-0.1％、规定值(或值的范围)的+/-1％、规定值(或值的范围)的+/-2％、规定值(或值的范围)的+/-5％、规定值(或值的范围)的+/-10％等的值。除非上下文另外指出，否则本文给出的任何数值也应当被理解为包括约或大约该值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。本文叙述的任何数值范围旨在包括其中所包含的所有子范围。还应当理解，如本领域技术人员适当理解的那样，当公开了某个值时，则还公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围。例如，如果公开了值“X”，则还公开了“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，在X是数值的情况下)。还应当理解，在整个本申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及介于10和15之间的值被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
尽管上面描述了各种说明性实施例，但是在不脱离如权利要求书所描述的本发明范围的情况下，可以对各种实施例进行多种改变中的任一种。例如，在替代性实施例中，可以经常改变执行所描述的各种方法步骤的顺序，而在其他替代性实施例中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。在一些实施例中，可以包括各种装置和***实施例的任选特征，而在其他实施例中可以不包括。因此，前面的描述主要是为示例性目的而提供的，并且不应当解释为限制在权利要求书中阐述的本发明范围。
本文所包括的示例和图示以图示而非限制的方式示出了其中可以实践本主题的具体实施例。如所提及的，可以利用其他实施例并且从中得出其他实施例，使得可以在不脱离本公开范围的情况下进行结构上和逻辑上的代替和改变。本发明主题的这些实施例在本文可以单独或共同地由术语“本发明”来指代，这仅仅是为了方便，而并非要在实际上公开了多于一个本发明构思的情况下将本申请的范围主动限制于任何单个本发明构思。因此，尽管本文已经展示和描述了具体实施例，但是为实现相同目的而计算的任何布置可以代替所示的具体实施例。本公开旨在覆盖各种实施例的任何和所有的修改或变型。在回顾以上描述之后，以上实施例的组合以及本文未明确描述的其他实施例对于本领域的技术人员将是显而易见的。

Claims (21)

1.一种方法，所述方法包括：
使包含成膜材料和有机溶剂的溶液流过测序芯片的孔洞上方的流动通道，以从所述流动通道置换第一水溶液，同时将所述第一水溶液留在所述孔洞中，所述孔洞包含与对电极电连通的工作电极；
在使包含所述成膜材料的所述溶液流动的步骤期间，在所述工作电极与所述对电极之间施加第一电压，以便将电荷捕获在所述孔洞中的所述第一水溶液中；
通过使第二水溶液流过所述流动通道，从所述流动通道置换包含所述成膜材料的所述溶液，从而留下覆盖所述孔洞的成膜材料层，并将含有捕获的电荷的所述第一水溶液密封在所述孔洞中；以及
将所述成膜材料层减薄成能够接纳用于测序应用的纳米孔的膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述工作电极与所述对电极之间施加的所述第一电压具有介于约10mV至2000mV之间的幅值。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述工作电极与所述对电极之间施加的所述第一电压具有至少约10mV的幅值。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述工作电极与所述对电极之间施加的所述第一电压具有至少约100mV的幅值。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在所述工作电极与所述对电极之间施加的所述第一电压具有至少约200mV的幅值。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述工作电极与所述对电极之间施加的所述第一电压具有至少约500mV的幅值。
7.根据权利要求1所述的方法，其中减薄所述成膜材料层的步骤包括使流体在所述成膜材料层上方流动。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其进一步包括：
使纳米孔溶液在所述膜上方流动；以及
将纳米孔***所述膜中，其中密封在所述孔洞中的所述捕获的电荷被配置为增加纳米孔***所述膜中的可能性。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括：
测量在所述孔洞中的所述捕获的电荷；以及
在将所述纳米孔***所述膜中的步骤期间，在所述工作电极与所述对电极之间施加第二电压，其中所述第二电压至少部分地基于所测量的在所述孔洞中的捕获的电荷。
10.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括：
测量在所述孔洞中的所述捕获的电荷；以及
在将所述纳米孔***所述膜中的步骤期间，在所述工作电极与所述对电极之间施加第二电压，其中所述第二电压具有幅值，所述幅值至少部分地基于所述第一电压的幅值。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述测序芯片包括孔洞阵列。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一电压作为具有至少10Hz至1000Hz频率的第一波形来施加。
13.一种***，所述***包括：
可消耗装置，其包括包含对电极和测序芯片的流动池，所述测序芯片包括多个工作电极，每个工作电极设置在形成于所述测序芯片的表面上的孔洞中；
包括泵的测序装置，所述泵被配置为与所述可消耗装置的所述流动池流体连通，所述可消耗装置的所述对电极和所述工作电极与所述测序装置电连通；
控制器，其被配置为：
在所述多个工作电极与所述对电极之间施加第一电压，以在所述测序芯片的所述孔洞内建立电荷；
将成膜材料泵送入所述流动池中并使其在所述孔洞上方；
在多个孔洞的每个孔洞上方形成膜，以将所述电荷捕获在所述测序芯片的所述多个孔洞内；
在多个所述膜中***孔。
14.根据权利要求13所述的***，其中在所述多个膜中***孔的步骤包括将纳米孔溶液泵送入所述流动池中，并在所述多个工作电极与所述对电极之间施加第二电压。
15.根据权利要求13所述的***，其中所述第一电压具有介于约10mV至2000mV之间的幅值。
16.根据权利要求13所述的***，其中所述第一电压具有至少约200mV的幅值。
17.根据权利要求13所述的***，其中所述第一电压具有至少约500mV的幅值。
18.根据权利要求14所述的***，其中所述第二电压具有幅值，所述幅值取决于所述第一电压的幅值。
19.根据权利要求14所述的***，其中所述第二电压具有幅值，所述幅值取决于捕获的电荷的幅值。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的***，其中所述第一电压作为具有至少10Hz至1000Hz频率的第一波形来施加。
21.根据权利要求13至19中任一项所述的***，其中所述测序芯片包括孔洞阵列。
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