CN115485379A - 用于体外mRNA转录的合成DNA模板 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA的制造。与现有方法相比，本方法无质粒、快速且便宜，其允许在免疫疗法中筛选潜在的新抗原。

Description

用于体外mRNA转录的合成DNA模板

发明领域

本发明涉及用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选或监测的mRNA的制造。与现有方法相比，本方法无质粒、快速且便宜，其允许在免疫疗法中筛选潜在的新抗原。

发明背景

在例如癌症免疫疗法中，免疫***被被动或主动利用来靶向并杀死癌细胞。通过这种方式，可以实现比常规癌症治疗药更高的对恶性细胞的特异性。因此，这种方法避免了脱靶毒性，同时仍能诱导高效的抗癌反应。

在主动免疫疗法中，免疫细胞被刺激并被引导以主动对抗癌症，虽然更具挑战性，但这种方法非常有前景。主动免疫疗法高度依赖于对抗原特异性免疫细胞、例如杀伤性T细胞和产生抗体的B细胞的有效刺激。一种体内诱导T细胞反应的方法是基于它们与抗原呈递细胞(APC)、特别是树突状细胞(DC)的相互作用，这些细胞经过修饰以在其表面呈递靶抗原时具有增强的免疫刺激特征。

在抗原呈递细胞的修饰中，编码免疫刺激性抗原的mRNA被引入需要制造编码mRNA的APC。在本方法中，mRNA免疫疗法是基于在产生RNA之前将靶抗原肽克隆到质粒载体中。这需要将编码免疫刺激抗原的mRNA组合成串联小基因中的一串抗原，克隆到用于体外转录的细菌质粒载体中。这种标准的实验室程序需要长时间的工作方案，包括充分的质粒筛选和高成本的试剂，导致最终产品中可能存在细菌污染的风险。

因此，需要一种用于制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选或监测的mRNA的替代方法。

发明概述

在解决上述问题时，本发明改为利用掺入单一抗原的无质粒合成DNA模板用于体外转录和制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA。

以3种合成寡核苷酸的组装PCR制备无质粒合成DNA模板(SDT)，其特征在于，所述合成寡核苷酸包含：

-编码RNA聚合酶的寡核苷酸(寡核苷酸1)；

-编码3'非翻译区(3'UTR)的寡核苷酸(寡核苷酸3)；和

-编码感兴趣抗原的寡核苷酸(寡核苷酸2)，其含有重叠，所述重叠分别与编码RNA聚合酶启动子的寡核苷酸和编码3'UTR的寡核苷酸桥接。

在一个实施方案中，寡核苷酸1中使用的RNA聚合酶启动子是选自包括T7启动子、SP6启动子和T3启动子的列表的RNA聚合酶；更特别是T7启动子；甚至更特别是修饰的RNA聚合酶T7启动子。

寡核苷酸3包含在翻译终止和转录后修饰中很重要的也被称为尾序列的3'非翻译区(3'UTR)；在一个具体的实施方案中，寡核苷酸3包含编码RNA稳定剂序列的3'UTR，例如来自兔β珠蛋白的3'UTR。为了进一步稳定mRNA，寡核苷酸3可进一步包括编码3'多A尾的序列。

在一个实施方案中，寡核苷酸3进一步包含将膜蛋白和非膜蛋白都引导至细胞中的内体区室(例如溶酶体)的运输结构域；特别是细胞质内体/溶酶体靶向信号，其有效地将抗原靶向该区室。在一个具体实施方案中，寡核苷酸3包含LAMP多肽的腔结构域，例如LAMP-1、LAMP-2多肽或DC LAMP多肽。

在另一个实施方案中，寡核苷酸1进一步包含5'非翻译区(5'UTR)以及用于调节真核细胞中转录物翻译的前导序列或前导RNA；特别是编码翻译增强子的5'UTR，例如β球蛋白增强子启动子。

由于抗原呈递细胞中编码抗原的正确运输在免疫疗法中很重要，因此可以在用于制造合成DNA模板的任一合成寡核苷酸中包括进一步的翻译增强剂。在一个具体实施方案中，寡核苷酸1进一步包含内质网(ER)信号序列以促进蛋白质转移到ER中，例如人LMP1的信号序列。

因此，一方面，本发明提供了通过如本文提供的3种合成寡核苷酸的组装PCR获得的无质粒合成DNA模板(SDT)；更特别地，所述无质粒SDT在制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA中的用途。

在另一个方面，本发明提供了一种制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA的方法，所述方法包括如本文提供的3种合成寡核苷酸的组装PCR，产生对应于用于mRNA分子的体外转录(iVT)的无质粒合成DNA模板(SDT)的无质粒dsDNA组装PCR产物。因此，在一个实施方案中，制造mRNA的方法进一步包括从组装PCR反应获得的无质粒SDT的iVT。任选地，在iVT之前通过PCR扩增无质粒dsDNA组装PCR分子。

因此，在一个具体实施方案中，本发明提供了一种无质粒制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA的方法，所述方法包括：

·包括如本文提供的3种合成寡核苷酸的组装PCR，产生无质粒dsDNA组装PCR产物；

·对所述组装PCR产物进行PCR扩增，产生无质粒SDT扩增产物；和

·所述无质粒SDT扩增产物的无质粒iVT。

在一个实施方案中，SDT扩增产物的无质粒iVT是使用具有RNA聚合酶和聚合酶A的核苷5-三磷酸(NTP)组合(mix)进行足以产生mRNA产物的时间；特别是具有选自SP6、T3和T7RNA聚合酶的RNA聚合酶；更特别是使用具有T7 RNA聚合酶和聚合酶A的核苷5-三磷酸(NTP)组合。在下文实例中，iVT在37℃进行2小时。

在一个实施方案中，SDT扩增产物的无质粒iVT进一步包括通过DNA酶处理来降解SDT，用LiCl沉淀mRNA产物。换言之，在SDT扩增产物的无质粒iVT中，由SDT与具有RNA聚合酶和聚合酶A的NTP组合反应获得的mRNA产物通过DNA酶处理(以降解SDT)进一步纯化；特别是DnasI处理，然后是LiCl(2.5M)沉淀，去除上清液。mRNA沉淀用冰冷的70％乙醇洗涤，干燥，溶于水，过滤，使用前于-80℃保存。

附图简要说明

图1：上图：A：用于mRNA共转录加帽的CleanCap(cCAP)试剂AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG)。B：SNA-mRNA的结构。mRNA编码单一新抗原，其N端侧接信号肽(SP)，C端侧接内体运输结构域(DC-Lamp)。mRNA由5'和3'UTR和多A尾稳定。

图2：单一新抗原设计。每个小基因编码一个27聚体(该图中的27聚体代表一个随机序列)，其包含位于中心位置的突变氨基酸，在其N端和COOH端侧侧接野生型序列的13个氨基酸。

图3：制造工艺流程图。

图4：合成DNA模板(SDT)(中间体I和II)的示意图。

图5：SDT SNA-mRNA。三种合成的脱氧核糖核酸寡核苷酸(PAGE纯化的Ultramers，IDT)通过PCR组装循环(PAC)一起组装成一个dsDNA分子，该分子通过PCR进一步扩增以生成无质粒合成DNA模板(SDT)。无质粒SDT照此用于体外转录反应(iVT)以产生无质粒SNA-mRNA。脱氧核糖核酸寡核苷酸#1(橙色)和#3(紫色)用于每个SDT组装PCR，其分别包含标准序列，例如T7启动子、3'和5'UTR以及衍生自人Lamp1的信号序列和来自人DC-Lamp蛋白序列内体运输结构域。寡核苷酸#2(绿色)呈现27聚体新抗原序列，该序列对每个患者研究都是特定的。

图6显示了单一模型抗原的功能测试图。无质粒的单一新抗原mRNA(SNA-mRNA)用于电穿孔表达HLA-A2的K562细胞。然后将这些细胞与来自HLA-A2+健康供体的CD8+T淋巴细胞共培养，这些CD8+T淋巴细胞已用编码相应T细胞受体链的mRNA进行电穿孔。

发明详述

本发明的一个目的是提供一种无质粒(即不使用质粒、表达载体和宿主生物体)制造编码抗原的mRNA的方法，所述抗原本文也称为靶特异性抗原，所述mRNA通常用于免疫疗法。

在整个说明书中使用的术语“靶”不限于本文可能描述的具体实例。可以靶向任何传染原，例如病毒、细菌或真菌。此外，可以靶向任何肿瘤或癌细胞。

在整个说明书中使用的术语“靶特异性抗原”不限于本文可能描述的具体实例。本领域技术人员将清楚本发明涉及抗原呈递细胞中免疫刺激的诱导，而与呈递的靶特异性抗原无关。待呈递的抗原将取决于人们打算在受试者中引发免疫反应的靶的类型。靶特异性抗原的典型实例是对肿瘤、细菌和真菌细胞或对具体病毒蛋白或病毒结构具有特异性的表达或分泌标记。

在整个说明书中使用的术语“抗原呈递细胞”包括所有抗原呈递细胞。具体的非限制性实例是树突细胞、树突细胞系、B细胞或B细胞系。树突细胞或B细胞可以从患者或健康受试者的血液中分离或产生。患者或受试者可以是先前疫苗接种的受试者，也可以不是。

在整个说明书中使用的术语“癌症”和/或“肿瘤(tumor)”并不旨在限制可能已经举例说明的癌症或肿瘤的类型。因此，该术语涵盖所有增生性疾病，例如肿瘤(neoplasma)、不典型增生、恶化前病变或癌变前病变、异常细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤、癌症或转移，其中癌症选自：白血病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、中枢神经***癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、***癌、乳腺癌、神经胶质瘤、结肠癌、膀胱癌、肉瘤、胰腺癌、结直肠癌、头颈癌、肝癌、骨癌、骨髓癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、甲状腺癌、血液癌和淋巴瘤。

使用根据本发明的方法获得的无质粒mRNA可以通过电穿孔、病毒转导(例如通过慢病毒、腺病毒或痘苗病毒)、mRNA脂质体转染或DNA转染引入抗原呈递细胞中。与病毒转导相比，mRNA电穿孔因其高效率和在临床环境中广泛接受的用途而特别优选。为了引入靶特异性抗原，可以使用抗原特异性肽或蛋白质负载(pulse)细胞作为mRNA电穿孔的替代方法。引入的无质粒mRNA可以是基于已知肿瘤特异性标志物的特异性合成序列，或者可以从(a)肿瘤细胞系或从患者的肿瘤活检中分离。

在本发明的上下文中，“mRNA”是指“信使RNA”并且是指使用DNA作为模板产生并且其自身编码抗原的转录物。mRNA通常包含5'非翻译区、抗原编码区和3'非翻译区。mRNA在细胞中的半衰期有限。根据本发明，将通过体外转录从DNA模板制备mRNA。除了根据本发明的修饰之外，还可以通过进一步稳定修饰和加帽对其进行修饰。在本发明的情况下，DNA模板是通过合成寡核苷酸序列的组装PCR获得的合成DNA模板。

“合成寡核苷酸”是使用称为核苷亚磷酰胺(nucleoside phosphoramidite)的结构单元化学合成的。这些可以是正常的或修饰的核苷，它们具有保护基团以防止它们的胺、羟基和磷酸基团不正确地相互作用。一次添加一个亚磷酰胺，将5'羟基脱保护并添加新的碱基，依此类推。链在3'至5'方向上生长，这相对于生物合成是反向的。最后，去除所有保护基团。然而，作为一个化学过程，会发生一些不正确的相互作用，导致一些有缺陷的产物。合成的寡核苷酸序列越长，缺陷就越多，因此该过程仅适用于生产短核苷酸序列。目前对于具有足够质量以直接用于生物学应用的寡核苷酸的实际限制是约200bp(碱基对)。HPLC可用于分离具有正确序列的产物。同时，大量的寡核苷酸可以在基因芯片上并行合成。为了在随后的基因合成过程中获得最佳性能，应该单独并以更大规模制备它们。

通常，一组单独设计的寡核苷酸在自动固相合成仪上制成，经过纯化，然后通过特定的退火和标准连接或聚合酶反应连接。为了提高寡核苷酸退火的特异性，合成步骤依赖于一组热稳定的DNA连接酶和聚合酶。迄今为止，已经描述了几种基因合成方法，例如磷酸化重叠寡核苷酸的连接、Fok I方法和用于基因合成的修饰形式的连接酶链式反应。此外，还已经描述了几种PCR组装方法。它们通常使用彼此重叠的约100至200个核苷酸长的寡核苷酸，使用10至30bp的典型重叠。这些寡核苷酸旨在覆盖两条链的大部分序列，并且通过重叠延伸(OE)PCR、热力学平衡内翻外(TBIO)PCR或组合方法逐步生成全长分子。最常见的合成基因的大小范围从600至1,200bp，尽管通过连接先前组装的低于1,000bp的片段可以制成更长的基因。在这个大小范围内，有必要测试几个候选克隆，通过自动测序方法确认克隆的合成基因的序列。

关于转录后调控，已经证明真核生物mRNA的某些5'和3'非翻译区(UTR)分别在翻译效率和RNA稳定性中起主要作用。3'非翻译区通常从翻译产物(即抗原)的终止密码子延伸到通常在转录过程后附接的多A序列。哺乳动物mRNA的3'非翻译区通常具有称为AAUAAA六核苷酸序列的同源区。该序列可能是多A附接信号，常常位于多A附接位点上游10至30个碱基处。3'非翻译区可包含一个或多个反向重复序列，这些重复序列能够折叠形成茎环结构，其作为外切核糖核酸酶的屏障或与已知增加RNA稳定性的蛋白质(例如RNA结合蛋白)相互作用。

根据本发明，5'和/或3'非翻译区可以与可转录的并且特别是编码核酸如信号肽、启动子序列、运输蛋白等功能性连接，从而使从所述可转录抗原核酸转录的RNA的稳定性和/或翻译效率增加。

本发明上下文中使用的多A尾优选由约100-150个腺苷组成，更特别是120-125个腺苷，优选>100个腺苷，平均约150个腺苷。术语“多A尾”或“多A序列”是指通常位于RNA分子3'端的腺苷酸残基序列。本发明提供了这样的序列，在RNA转录过程中，基于与编码链互补的链中重复的胸苷酸残基，通过DNA模板的待附接序列，而所述序列通常不在DNA中编码，而是在细胞核中转录后通过不依赖模板的RNA聚合酶附接到RNA的游离3'端。根据本发明，这种类型的多A序列被理解为表示至少20、优选至少40、优选至少80、优选至少100并且优选最多500、优选最多400、优选最多300、优选最多200并且特别是最多150个连续的A核苷酸并且特别是约120个连续的A核苷酸的核苷酸序列，其中术语“A核苷酸”是指腺苷酸残基。

实施例

编码单一肿瘤特异性抗原的合成mRNA的说明

已经制备了编码一种肿瘤特异性新抗原的无质粒合成mRNA。合成mRNA编码信号肽、新抗原肽，其与内体靶向蛋白相连，该蛋白设计用于在HLA I类和II类的情况下对编码的表位进行最佳加工和呈递。每个抗原序列编码约27个氨基酸的寡肽。显然，抗原性寡肽的大小可以变化并且通常在约20至约50个氨基酸的范围内。mRNA由5'和3'非翻译区(UTR)和称为多A尾的延伸的多聚腺苷酸化区域稳定。

在下文中，这些编码一种肿瘤特异性新抗原的无质粒合成mRNA也被称为：

描述性名称：单一新抗原mRNA(SNA-mRNA)

简短说明：编码一种新抗原的合成mRNA

公司或实验室代码：SNA-mRNA

SNA-mRNA的结构

信使核糖核酸(mRNA)由4种核苷酸的单链聚合物组成：腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷单磷酸，具有5'端帽结构和3'端多A尾。核苷酸通过核糖的3'和5'磷酸残基相互连接

LMCT生产的无质粒体外合成mRNA的结构由以下元件组成：

·5'帽1结构

·5'翻译增强子(TE)(5'UTR)

·开放阅读框(ORF)

·3'RNA稳定序列(3'UTR)

·3'多A尾。

在细胞质中，ORF对应于感兴趣基因(GoI)的编码区，并将被翻译成氨基酸聚合物，即蛋白质。

帽1修饰迫使RNA聚合酶在未甲基化鸟苷(G)的3'OH基团处开始转录。ORF编码融合蛋白，所述融合蛋白由信号肽(SP)、对应于新抗原的27个氨基酸长的多肽和源自树突细胞-溶酶体相关膜蛋白(DC-LAMP/CD208)的内体运输结构域组成(图1)。ORF侧接5'和3'非翻译区(UTR)，然后是120个腺苷残基(A120)或150个腺苷残基(A150)的多A尾。UTR和长度为120或150个核苷酸的多A尾有助于mRNA的稳定性和翻译效率。

每个研究受试者的新抗原序列都不同(图2)。在单核苷酸变体(SNV)的情况下，小基因编码27聚体，由两侧侧接野生型蛋白质的13个氨基酸的突变的氨基酸组成。在***缺失移码突变的情况下，小基因编码包括预计与患者HLA同种异型结合的移码序列的27聚体。

一般性质

信使RNA对核糖核酸酶高度敏感，在制造和操作过程中应始终只使用最高纯度的材料极其小心地处理(应避免内毒素和核酸酶)。皮肤表面和血清都是核糖核酸酶的高来源，应始终避免与mRNA接触。

当储存在-15℃以下时，无质粒信使RNA在水溶液中非常稳定。

使用无质粒mRNA的一个主要优点是其安全性属性。RNA在体内的半衰期非常短，只能瞬时翻译成蛋白质，直到无处不在的核糖核酸酶降解mRNA分子。此外，与质粒DNA或含有病毒载体的DNA不同，mRNA不需要穿过核膜即可被翻译成蛋白质，并且不能整合到捕获mRNA的细胞的宿主基因组中。

SNA-mRNA是mRNA，因此被认为与天然mRNA类似地在体内快速降解。

SNA-mRNA的各种成分的功能如下(Bonehill 2004)：SP和DC.Lamp编码的氨基酸将融合蛋白引导至内质网和内溶酶体途径，从而使蛋白质降解并加载到HLA II类分子。此外，由于内质网(ER)应激反应，蛋白质将部分重新引导至细胞质和蛋白酶体，从而确保高效的HLA I类呈递。5'和3'UTR旨在实现最佳稳定性。120个核苷酸的多A尾确保最佳稳定性。在药品物质的生产过程中，SNA-mRNA在DC中被电穿孔。电穿孔后不久(几分钟内)，mRNA被翻译成蛋白质，蛋白质将自身***ER中，随后在I类(蛋白酶体)和II类(内溶酶体)抗原加工途径中进行加工。27聚体表位的设计是这样的，根据目前的知识，预计将产生与患者的HLA-A、-B、-C(I类)的等位基因结合的8聚体、9聚体或10聚体肽和/或与患者的HLA II类等位基因结合的12-16聚体肽。

使用具有类似设计的报告构建体(图1)，我们可以证明在4小时内完整的蛋白质(绿色荧光蛋白(GFP)报告蛋白)在细胞中表达，随后在溶酶体区室中降解(Bonehill2004)。

类似地，肽在HLA膜蛋白的背景下被加工和呈递(使用例如由如图6所示的类似设计的mRNA编码的p53和gp100表位)。

与患者DC上的HLA结合的新表位肽对患者来说是“外来的”(即在肿瘤出现之前不存在于患者的任何组织中)，预计会激活患者的CD4和/或CD8 T细胞并将它们分别分化为产生干扰素γ(IFN-γ)的T辅助1(TH1)细胞和分化为细胞毒性杀伤性T细胞(CTL)。在接种疫苗后的几天和几周内，预计这些T细胞迁移到肿瘤组织并通过各种免疫机制选择性地杀死肿瘤细胞。T细胞可以作为记忆细胞存活并继续保护患者免受肿瘤复发。

制造过程和过程控制的说明

起始材料的制造过程可分为两部分：

·第I部分：无质粒合成DNA模板(SDT)的生产(＝中间体1)

o 3种合成ssDNA寡核苷酸的组装PCR和dsDNA模板的初步形成、纯化和测序

o经验证的IM1序列的无质粒扩增(＝中间体2)

·第II部分：mRNA的无质粒生产和纯化

o SDT的无质粒体外转录成mRNA、纯化和装瓶

起始材料A的制造过程流程图如图3所示。

起始材料是合成DNA模板(SDT，图4)，包含修饰的T7 RNA聚合酶启动子的DNA序列，然后是作为5'UTR的β珠蛋白翻译增强子序列。开放阅读框(ORF)包括位于Lamp1信号肽(SP)和内体运输结构域DC-LAMP序列之间的感兴趣的单一新抗原序列，然后是下游的β珠蛋白3'UTR区域。

图5显示了SDT SNA-mRNA的逐步生产。三种合成脱氧核糖核酸寡核苷酸(Ultramers，IDT)被设计为在组装聚合酶反应(aPCR)中杂交在一起，形成用于mRNA分子的无质粒体外转录(iVT)的dsDNA模板。3种ssDNA寡核苷酸显示了转录的mRNA的高细胞稳定性和可翻译性的所有基本特征，此外还增强了转录的单个新抗原肽的抗原膜呈递。具体而言，寡核苷酸#1编码修饰的RNA聚合酶T7启动子、作为5'非翻译区(UTR)的用于有效蛋白质翻译的β珠蛋白增强子启动子和来自人Lamp1的信号序列。寡核苷酸#2可以编码任何所需的新抗原序列，并包含与寡核苷酸#1和#3重叠的序列。寡核苷酸#3引入了用于I类和II类抗原呈递的来自DC-LAMP的内体转运结构域以及来自兔β珠蛋白的3'非翻译区(UTR)。寡核苷酸#1和#3提供基本的mRNA序列特征并用于每种SDT SNA-mRNA生产，而寡核苷酸#2可以从头合成每个待测试的患者特异性新抗原序列。

SDT SNA-mRNA生产的主要步骤是：

1.组装PCR和SDT形成、纯化和通过测序分析和毛细管凝胶电泳的鉴定(中间体I)。

2.序列验证的SDT批次根据mRNA生产所需的数量进一步扩增(中间体II)。

经过纯化、无菌过滤和充分的质量控制后，无质粒SDT用于体外mRNA合成。

mRNA无菌生产的主要步骤：

1.mRNA的体外转录和随后去除残留的SDT DNA

2.纯化mRNA，然后过滤和无菌装瓶并储存SNA mRNA

SDT SNA-mRNA的体外转录、沉淀和纯化：

SDT SNA-mRNA从合成DNA模板(SDT)开始分批生产。添加CleanCap/NTP组合和T7RNA聚合酶后，在37℃进行2小时的体外转录。反应混合物还含有用于mRNA的多A加尾的聚合酶A。随后，通过DnaseI处理降解SDT，并使用LiCl沉淀纯化mRNA。经过两个洗涤步骤后，沉淀的mRNA溶解在注射用水中。将该批次过滤并无菌填充在冷冻管中，随后储存在-80℃等待QC测试结果。

体外测定

为了测试所得mRNA的功能，我们进行了“抗原呈递测定”。为此，将单一模型抗原mRNA电穿孔到表达HLA-A2的K562细胞中。然后将这些细胞与来自HLA-A2+健康供体的CD8+T淋巴细胞共培养，该CD8+T淋巴细胞已用编码相应T细胞受体链的mRNA进行电穿孔(如图6所示意的)。一旦识别出它们相应的抗原表位，细胞就会分泌IFN-γ。

在上述表格中，相应SNA-mRNA混合物的结果与串联小基因(例如27个氨基酸的5个新抗原，每个由81个核苷酸编码)相当，其开放阅读框长度为405bp，必须被克隆到细菌质粒(pLMCT)载体中。pLMCT-TMG DNA用作体外转录的模板。

Claims (14)

1.以3种合成寡核苷酸的组装PCR制备的无质粒合成DNA模板(SDT)，其特征在于，所述合成寡核苷酸包含：

-编码RNA聚合酶启动子的寡核苷酸(寡核苷酸1)；

-编码3'非翻译区(3'UTR)的寡核苷酸(寡核苷酸3)；和

-编码感兴趣抗原的寡核苷酸(寡核苷酸2)，其含有重叠，所述重叠分别与编码RNA聚合酶的寡核苷酸和编码用于抗原呈递的序列的寡核苷酸桥接。

2.根据权利要求1所述的SDT，其中寡核苷酸1中使用的RNA聚合酶启动子是选自包括T7启动子、SP6启动子和T3启动子的列表的RNA聚合酶启动子；更特别是T7启动子；甚至更特别是修饰的RNA聚合酶T7启动子。

3.根据权利要求1所述的SDT，其中寡核苷酸3包含编码RNA稳定剂序列的3'UTR，例如来自兔β珠蛋白的3'UTR。

4.根据权利要求1所述的SDT，其中寡核苷酸3可进一步包括编码3'多A尾的序列。

5.根据权利要求2所述的SDT，其中寡核苷酸1进一步包含用于调节真核细胞中转录物翻译的也被称为前导序列或前导RNA的5'非翻译区(5'UTR)；特别是编码翻译增强子的5'UTR，例如β球蛋白增强子启动子。

6.根据权利要求3所述的SDT，其中寡核苷酸3进一步包含用于抗原呈递的序列，例如将膜蛋白和非膜蛋白都引导至细胞中的内体区室(例如溶酶体)的运输结构域；特别是细胞质内体/溶酶体靶向信号，其有效地将抗原靶向该区室；在一个具体实施方案中，寡核苷酸3包含LAMP多肽的腔结构域，例如LAMP-1、LAMP-2多肽或DC LAMP多肽。

7.根据权利要求2所述的SDT，其中寡核苷酸1进一步包含内质网(ER)信号序列以促进蛋白质转移到ER中，例如人LMP1的信号序列。

8.权利要求1至7中任一项所述的SDT在无质粒制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA中的用途。

9.无质粒制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA的方法，所述方法包括如前述权利要求中所定义的3种合成寡核苷酸的组装PCR，产生无质粒dsDNA组装PCR产物。

10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括dsDNA组装PCR产物的无质粒体外转录(iVT)。

11.根据权利要求10所述的方法，其中在iVT之前通过PCR扩增dsDNA组装PCR分子。

12.根据权利要求10所述的方法，其中dsDNA组装PCR产物的无质粒体外转录(iVT)包括使所述dsDNA组装PCR产物与具有RNA聚合酶和聚合酶A的核苷5-三磷酸(NTP)组合接触足以产生mRNA产物的时间；特别是具有选自SP6、T3和T7 RNA聚合酶的RNA聚合酶；更特别是与具有T7 RNA聚合酶和聚合酶A的核苷5-三磷酸(NTP)组合接触。

13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括通过DNA酶处理(以降解SDT)纯化mRNA产物；特别是DnasI处理，然后是LiCl(2.5M)沉淀，去除上清液。

14.无质粒制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA的体外方法，所述方法包括：

·包括如前述权利要求中所定义的3种合成寡核苷酸的组装PCR，产生dsDNA组装PCR产物；

·对所述组装PCR产物进行PCR扩增，产生无质粒SDT扩增产物；和

·所述SDT扩增产物的无质粒iVT；特别是根据如权利要求12和13所述的iVT。

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