CN115477725A - 一种动态监测脂滴的聚合物荧光探针、合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种动态监测脂滴的聚合物荧光探针，所述荧光探针的化学结构式如下：
；本发明所述聚合物荧光探针CMMA‑co‑PEGMA400的用途为应用于生物体系中脂质小滴的动态传感检测；所述的传感检测包含荧光检测、细胞成像等；所述荧光探针的光稳定性较好，水溶性好，生物毒性低，探针和细胞共孵育，细胞存活率在90%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于聚乙二醇甲基丙烯酸酯的标记细胞内脂滴的聚合物荧光探针，以及光谱测试、细胞成像；属于生物医药技术领域。
背景技术
脂质小滴是一种动态的细胞内细胞器，受与蛋白质结合的磷脂单分子层限制，可存储中性脂质，主要是甘油三酯和胆固醇酯。脂质小滴在能量稳态和脂质代谢中起核心作用。此外，脂质小滴有助于细胞蛋白质运输和蛋白质成熟。脂质小滴过多或过少与各种人类疾病相关，例如胰岛素抵抗，癌症，肥胖症，肝病，心血管疾病和神经退行性疾病。由于脂质小滴提供了更疏水和更粘稠的环境，因此能够区分这些差异之一的任何荧光染料都具有作为脂质小滴探针的潜力。
脂滴特异性聚合物荧光探针可以直观地观察脂滴在细胞内的含量以及脂滴的形态和变化过程，有助于研究脂滴相关疾病的发展历程。尽管目前已有部分脂滴荧光探针实现商业化，但是基于聚合物的脂滴探针报道较少，大多数已知的小分子探针光稳定性不好，其中先天生物分子也发射（自发荧光），生物毒性大，pH稳定性差。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种动态监测脂滴的聚合物荧光探针、合成方法及其应用，实现以下发明目的：制备一种聚合物荧光探针，光稳定性好、pH稳定性好，生物毒性小，用于细胞内脂滴监测的可靠性高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种动态监测脂滴的聚合物荧光探针，所述荧光探针的化学结构式如下：
所述合成方法包括制备7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮、制备( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯、制得荧光探针。
所述制备7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮的方法为，将7- ( 二乙氨基)香豆素-3-甲醛溶解于甲醇中，在0℃下缓慢加入硼氢化钠反应0.4-0.6h后，移入常温继续反应 2.8-3.2 h ，经过分离提纯，得到7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮。
所述7- ( 二乙氨基)香豆素-3-甲醛与硼氢化钠的摩尔比为1：0.65-0.75；所述7-( 二乙氨基)香豆素-3-甲醛与甲醇的质量比为0.01:0.9-1.1。
所述制备( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯的方法为，将 7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮和三乙胺在0℃下溶于DMF，在氮气环境下缓慢加入甲基丙烯酰氯，搅拌0.9-1.1 h后，移入常温反应5.8-6.2h，反应完成后，分离得到( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯。
所述7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮和三乙胺的摩尔比为4.8-5.2:1；所述三乙胺和甲基丙烯酰氯的体积比为2.3-2.4:1；所述三乙胺和DMF的体积比为1：115-117。
所述制得荧光探针的方法为，将( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯、PEGMA400、RAFT试剂CTA和引发剂AIBN 溶解在无水1，4-二氧六环中，首先用液氮冻结体系，然后抽真空，直到体系解冻，最后向体系中填充氮气，使冻融循环重复三次，然后在74-76℃、氮气环境下反应23-25 h，得到荧光探针。
所述( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯与PEGMA400的摩尔比为1:14.5-15.5；所述PEGMA400与RAFT试剂CTA的摩尔比为29-30:1；所述RAFT试剂CTA与引发剂AIBN的摩尔比为4.8-5.2:1；所述PEGMA400与1，4-二氧六环的质量体积比为1g:7.2-7.3 mL。
所述聚合物荧光探针在生物体系中脂质小滴的动态传感检测中的应用。
所述传感检测包含荧光检测、细胞成像。
探针CMMA-co-PEGMA400的合成路线如下：
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
本发明所述聚合物荧光探针CMMA-co-PEGMA400的用途为应用于生物体系中脂质小滴的动态传感检测；所述的传感检测包含荧光检测、细胞成像等。
本发明所述荧光探针是基于聚乙二醇甲基丙烯酸酯的荧光探针，该探针合成步骤简单，在常见极性溶剂中的最大吸收波长的变化较小；
所述荧光探针具有一定的极性依赖性，对极性环境敏感，随着常见溶剂的极性减小，探针的荧光强度显著增加。
所述荧光探针的强度在pH=1-12范围内变化很小，表现出较好的耐pH性能，在生理环境下(pH=7.4)的稳定性好。
所述荧光探针的光稳定性较好，水溶性好，生物毒性低，探针和细胞共孵育，细胞存活率在90 %以上。
所述荧光探针检测细胞内脂滴具有可靠性、准确性的特点，对LDs 具有良好的靶向性，脂滴标记染料BODIPY和探针CMMA-co-PEGMA400对Hela细胞的Pearson共定位系数为0.97。
附图说明
图1是实施例一中化合物2 ( 7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮 )的1H NMR图谱；
图2是实施例一中化合物2 ( 7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮 )的13C NMR图谱；
图3是实施例一中化合物3 (( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯 )的1H NMR图谱；
图4是实施例一中化合物3 (( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯 )的13C NMR图谱；
图5是实施例一中探针CMMA-co-PEGMA400的1H NMR图谱；
图6是探针CMMA-co-PEGMA400在常见不同极性溶剂中的紫外吸收光谱；
图7是探针CMMA-co-PEGMA400在常见不同极性溶剂中的荧光发射光谱；
图8是探针CMMA-co-PEGMA400在Dioxane与PBS不同比例的混合溶液的荧光发射光谱；
图9是探针CMMA-co-PEGMA400在不同pH Dioxane/PBS(V/V=1:1)的荧光发射光谱；
图10是探针CMMA-co-PEGMA400选择性的柱状图；
图11是探针CMMA-co-PEGMA400光稳定性的测试图；
图12是探针CMMA-co-PEGMA400水溶性的测试图；
图13为探针浓度和吸光度的线性关系图；
图14是探针CMMA-co-PEGMA400 的GPC淋洗曲线；
图15是探针CMMA-co-PEGMA400MTT细胞毒性的柱状图；
图16是探针CMMA-co-PEGMA400应用于不同类型的细胞中脂滴的荧光成像图；
图17是探针CMMA-co-PEGMA400和BODIPY应用于细胞中的脂滴共定位测试结果。
其中a) HeLa细胞的明场；b) CMMA-co-PEGMA400 (10µg/mL) 染色蓝色通道；c)BODIPY ( 5.0µM ) 染色绿色通道；d)为 (b)和(c)的合并图像；e)为 (b)和(c)的强度散点图；f) 为b)和c)的荧光共定位曲线。蓝光通道为CMMA-co-PEGMA400：激发波长λex=405 nm，采集波长440-480 nm。BODIPY绿色通道：激发波长λex=405 nm，收集波长为500-560 nm。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。
实施例1:探针化合物CMMA-co-PEGMA400的合成：
合成路线如下：
具体合成方法如下：
（1）制备7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮
将化合物1 ( 7- ( 二乙氨基)香豆素-3-甲醛 ) ( 0.1 mmol，24.5 mg ) 溶解于3 mL（2.37g）甲醇 (MeOH) 中，在0℃下缓慢加入NaBH4 ( 硼氢化钠 ) ( 0.07 mmol，2.65mg ) 反应0.5 h后，移入常温继续反应 3 h ，反应结束后加入适量蒸馏水猝灭反应，用二氯甲烷 ( CH2Cl2 ) 萃取三次，用无水硫酸钠干燥，过滤，通过柱层析法(石油醚和乙酸乙酯的体积为 3:1 )分离提纯，得到化合物2 ( 7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮 ) ( 23.28 mg )，产率94%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.76 (s, 1H),7.46 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.21 (s,1H), 4.29 (s, 2H), 3.42 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 1.12 (s, 6H)。
上述产率是以化合物1为计算基准，采用实际得到的化合物2的质量除以理论得到化合物2的质量，即为化合物2的产率。
（2）制备( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯
将化合物2 ( 7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮 )(0.094 mmol，23.28 mg )和TEA ( 三乙胺 ) ( 0.0188 mmol，25.86 μL)在0℃下溶于DMF( N,N-二甲基甲酰胺 ) (3 mL)，在氮气环境下用注射器缓慢加入甲基丙烯酰氯(methacryloyl chloride ) （0.113 mmol，11μL），搅拌1 h后，移入常温反应6 h，反应完成后，用水和二氯甲烷的混合液(体积比为1:3)萃取三次，取二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥，然后过滤，通过柱层析 ( 石油醚和乙酸乙酯的体积比为20:1 ) 得到黄色固体粉末化合物3 ( CMMA ) (( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯 ) (21.64mg，73%)。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.67 (s, 1H), 7.36 (d, J = 8.7 Hz,1H), 6.95 (d, J = 38.0 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 6.19 (s, 1H), 5.64 – 5.60 (m,1H), 5.11 (s, 2H), 3.44 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.98 (s, 3H), 1.23 (t, J = 7.2Hz, 6H)。
上述产率是以化合物2为计算基准，采用实际得到的化合物3的质量除以理论得到化合物3的质量，即为化合物3的产率。
（3）制得荧光探针
在Schlenk管中，将纯化的香豆素荧光单体化合物3 ( CMMA ) (21.64 mg，0.069mmol)、化合物4 PEGMA400 ( 分子量为400的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯 ) (411.7 mg，1.03mmol)、RAFT试剂(CTA)( 12.558 mg，0.0345 mmol)和引发剂AIBN(1.132 mg，0.0069 mmol)溶解在无水1，4-二氧六环(3mL)中，首先用液氮冻结体系，然后用真空泵抽真空，直到体系解冻，最后向体系中填充氮气，使冻融循环重复三次，达到除氧的效果。然后在75℃、氮气环境下反应24 h，得到聚合物探针CMMA-co-PEGMA400(105.46 mg，产率54%)，用1000g/mol的截留分子量膜透析法纯化72 h。
上述聚合物探针的产率是以RAFT试剂(CTA)(0.0345 mmol)为计算基准，用实际制得的聚合物探针CMMA-co-PEGMA400的质量(105.46 mg )除以理论得到的聚合物探针 CMMA-co-PEGMA400 ( 0.0345 mmol，193.30mg )的质量，并乘以100%计算得到产率。
实施例2：探针CMMA-co-PEGMA400在常见极性溶剂中的紫外吸收光谱
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO )中，制成1 mg/mL储备液。将储备液与常见的有机溶剂和PBS稀释成10 μg/mL工作溶液，进行紫外吸收测试。如图6所示，发现其吸收峰在380 nm左右，最大吸收波长在上述极性的溶剂中有微小的变化，这意味着在基态时偶极矩受不同溶剂的影响较小。
实施例3：探针CMMA-co-PEGMA400在常见极性溶剂中的荧光发射光谱
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO ) 中，制成1mg/mL储备液。将储备液与常见的有机溶剂和PBS (0.1 mol/L，pH = 7.4) 稀释成10 μg/mL工作溶液，以380 nm的激发波长测试其荧光发射强度。如图7所示，探针在390-550nm的波长范围 ( Wavelength ) 内显示出了一定的荧光强度。在缓冲溶剂PBS中，几乎没有荧光发射行为，随着常见溶剂的极性减小，探针的发射发生了蓝移现象，且荧光强度显著增加，这表明合成的聚合物探针具有一定的极性依赖性。
实施例4：探针CMMA-co-PEGMA400在二恶烷 (1,4-Dioxane)与PBS不同比例的混合溶液的荧光发射光谱
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO ) 中，制成1mg/mL储备液。配制一系列等梯度体积比的Dioxane-PBS混合溶液，将2 mL不同比例的极性混合溶剂与储备液稀释成10μg/mL工作溶液,以激发波长380 nm检测其荧光发射。如图8所示，该聚合物探针在纯PBS中几乎没有荧光，随着极性的减小，荧光强度增强明显，这表明了该探针对极性环境敏感。
实施例5：探针CMMA-co-PEGMA400在不同pH环境的荧光光谱测试。
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO ) 中，制成1mg/mL储备液。配置一系列不同pH的Dioxane/PBS（V/V=1/1）的混合溶液，将储备液与2 mL混合溶液配置成10 μg/mL工作溶液检测荧光发射图谱。如图9所示，在380 nm的激发波长下，测得探针在pH=1-12 ( 横坐标各pH分别为0.998、1.954、3.020、3.743、5.034、6.094、7.047、7.4、8.006、9.093、10.009、10.845、12.072 )环境下的最大发射峰，并以pH值为横坐标、465 nm处的发射峰为纵坐标绘制点线图。上述对聚合物探针在环境中荧光强度的检测，说明探针的荧光强度在pH=1-12范围内变化很小，且聚合物探针CMMA-co-PEGMA400表现出较好的耐pH性能，对于后续聚合物探针用于生物体系中提供了理论支持。
实施例6：探针CMMA-co-PEGMA400选择性柱状图数据
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO ) 中，制成1mg/mL储备液。取20 μL储备液置于2 mL PBS混合溶液中，分别加入20μL 10μM的竞争分子标准溶液。在激发波长为380 nm下，立即检测溶液的荧光发射光谱变化，由图10可以发现，其他干扰离子2， HS-；3，H2O2；4，TBHP；5，NO2 2-；6，SO4 2-；7，CI-；8，HSO3 -；9， CIO-；10，HCO3 -；11，CYS；12，Na+；13，Mg2+；14，Ca2+对CMMA-co-PEGMA400化合物的荧光几乎没有影响，表明聚合物探针CMMA-co-PEGMA400具有一定的抗干扰能力。
实施例7：探针CMMA-co-PEGMA400光稳定性测试
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO ) 中，制成1mg/mL储备液。配置Dioxane与THF等比例(V/V=1/1)的混合溶液，将储备液与混合溶液配置成10 μg/mL工作溶液，在激发波长为380 nm下，对配置的工作溶液在4500 s内连续进行测试，图11结果表明探针的荧光强度变化很小，结合实施例5、6和7，进一步说明探针CMMA-co-PEGMA400具有良好的实验稳定性。
实施例8：探针CMMA-co-PEGMA400水溶性测试
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO ) 中，制成1mg/mL储备液。取20 μL PBS ( 0.1 mol/L，pH = 7.4 ) 加入一系列浓度梯度的探针。从图12中可以看到，探针吸光度随着其加入的浓度升高而升高，图13可见，在0-300 μg/mL浓度范围内，聚合物探针的吸光度与其浓度呈现出良好的线性关系，皮尔逊相关系数为0.998，这些结果有效地证明了探针CMMA-co-PEGMA400在水溶液中具有良好的溶解性。
实施例9：探针CMMA-co-PEGMA400聚合度测试
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于色谱纯的四氢呋喃 ( THF )中，分子量及分子量分布采用美国Wyatt公司的DAWNEOS型凝胶渗透色谱-多角度激光光散射联用仪(SEC-MALLS)测定，MZ 103+MZ 104 色谱柱，色谱级THF为流动相，流速0.5 mL/min，25 °C。测试结果如图14和表1，聚合物探针为单峰，符合正态分布，说明聚合物结构单一，为均一的聚合物。其Mn=5603，Mw=7341，分子量分布为1.31。
表1聚合物探针CMMA-co-PEGMA400的分子量分布数据
实施例10：探针CMMA-co-PEGMA400MTT细胞毒性测试
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO ) 中，制成1mg/mL储备液。
用含有10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）和1%（v/v）抗生素（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素，Hyclone）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Hyclone）培养Hela细胞，在 37 ℃，5% CO2 的无菌箱中培养3天，控制细胞密度为1×105/mL，得到细胞培养液。取上述细胞密度为1×105/mL的细胞培养液加入96孔板内，每孔加入100μL细胞培养液，用体积含量为99.9% DMEM和0.1% DMSO的混合液稀释探针CMMA-co-PEGMA400，加入96孔板内，使探针在每个孔内的形成最终的浓度分别为0、2、5、10、20、30 μg/mL。
随后，在37℃下，在二氧化碳 (5%) 和空气 (95%) 的环境中，将细胞培养24小时。然后用PBS缓冲液清洗HeLa细胞，然后每孔加入200 μL DMEM培养基，再加入40 μL的MTT (5 mg/mL ) ，并在37℃，二氧化碳 (5%) 和空气 (95%) 的环境中继续培养4小时。
弃去孔中的培养基和MTT，在孔中各加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡30min，使结晶产物充分溶解以溶解残留的MTT-甲臜结晶。
活细胞中呈黄色MTT被还原成紫色的甲臜。用微孔板读数器在570 nm测量溶液的吸光度。首先测定空白对照组的吸光度数值，并以此为细胞存活率基准，然后依次测试最终的浓度分别为0、2、5、10、20、30 μg/mL CMMA-co-PEGMA400的细胞组的吸光度，将测试的吸光度与之前测定空白对照组的吸光度比值，以此测定细胞存活率。
从图15中可以看到，随着探针浓度升高，探针浓度在0、2、5、10、20、30 μg/mL的存活率依次为102.07%、100.70%、99.74%、96.93%、92.98%和90.67%，细胞存活率均在90 %以上，表明这种生物毒性较低的探针适合用于细胞成像。
实施例11：探针CMMA-co-PEGMA400应用于细胞中脂滴的荧光成像
取实施例1制备的探针CMMA-co-PEGMA400溶于二甲基亚砜 ( DMSO ) 中，制成1mg/mL储备液。配置1mL终浓度为10 μg/mL的实施例1所得荧光探针PBS溶液，然后加入到不同处理后的HeLa细胞中。
正常细胞组：用含有 10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）和 1%(v/v)抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，Hyclone）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Hyclone）培养HeLa细胞，在 37℃，5% CO2 的无菌箱中培养3天，控制细胞密度为1×105/mL。细胞成像前，将 1mL 密度为 1×105/mL的细胞培养液接种在玻璃底培养皿，放置于培养箱中使其贴壁，当贴壁的细胞超过培养皿底部70%时，细胞直接成像或者加入探针后成像。
饥饿( Starve ) 细胞组：用含有 10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）和 1%(v/v)抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，Hyclone）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Hyclone）培养HeLa细胞，在 37℃，5%CO2 的无菌箱中培养3天，然后将培养基更换为不加任何高糖的含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基培养5 h获得饥饿细胞；培养过程中控制细胞密度为1×105/mL。
细胞成像前，将 1mL 密度为 1×105/mL的细胞培养液接种在玻璃底培养皿，放置于培养箱中使其贴壁，当贴壁的细胞超过培养皿底部70%时，加入探针后成像。
油酸 ( Oleic acid ) 细胞组： 用含有 10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）和 1%(v/v)抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，Hyclone）的 Dulbecco 改良 Eagle培养基（DMEM，Hyclone）培养HeLa细胞，在 37℃，5%CO2 的无菌箱中培养3天，培养过程中控制细胞密度为1×105/mL。
细胞成像前，将 1mL 密度为 1×105/mL的细胞培养液接种在玻璃底培养皿，放置于培养箱中使其贴壁，当贴壁的细胞超过培养皿底部70%时，加入10 µL浓度为10 µM的油酸处理1 h获得油酸细胞组，加入探针后成像。
动态脂滴成像：第一组为不加探针的正常细胞组成像，第二组采用饥饿培养细胞组的细胞与CMMA-co-PEGMA400 20μL (10μg/mL ) 探针共同孵育30 min后成像；第三组为正常细胞与CMMA-co-PEGMA400 20 μL (10 μg/mL ) 探针共同孵育30 min后成像；第四组为油酸细胞组与CMMA-co-PEGMA400 20μL (10μg/mL ) 探针共同孵育30 min在不同的时间范围扫描成像。
四组细胞均用徕卡SP8倒置荧光共聚焦显微镜成像，激发波长为405 nm，发射波长接收范围为440~480 nm(蓝色通道)。
如图16所示，饥饿处理的细胞比正常细胞的荧光强度更弱，而用油酸处理后的细胞显示出较强的荧光，进一步表明，聚合物探针对于检测细胞内脂滴的可靠性。饥饿处理细胞的脂滴水平低于正常培养的细胞，油酸刺激后细胞产生更多的脂滴。注：图16中Merge为合并通道，Blue为蓝色通道，Bright为明场通道。No Probe为不加探针处理的细胞组，Starve为饥饿细胞组，Oleic acid为油酸处理的细胞组。
实施例12：探针CMMA-co-PEGMA400和BODIPY应用的脂滴共定位测试
我们利用商业上可以买到的不同发射波长范围的脂滴标记染料BODIPY和探针CMMA-co-PEGMA400对Hela细胞进行了共同定位实验。
用含有10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）和1%（v/v）抗生素（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素，Hyclone）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Hyclone）培养Hela细胞，在 37 ℃，5% CO2 的无菌箱中培养3天，控制细胞密度为1×105/mL，得到细胞培养液。
取2mL细胞培养液，分别加入20 µL终浓度为10µg/mL的探针CMMA-co-PEGMA400和5µL终浓度为5.0µM的BODIPY染料，在37℃，5%CO2下共孵育30min，进行脂滴共定位测试。
用探针CMMA-co-PEGMA400染色的细胞显示出清晰的球形荧光点(图17 b)，并与商用靶向脂滴的染料BODIPY重叠良好(图17 d)，计算Pearson共定位系数为0.97。分析结果中包括的共定位轮廓和散点图(图17 e，f)也很好地支持了探针CMMA-co-PEGMA400对LDs 的良好靶向性。
Claims (10)
1.一种动态监测脂滴的聚合物荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的化学结构式如下：
2.权利要求1所述聚合物荧光探针的合成方法，其特征在于：所述合成方法包括制备7-( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮、制备( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯、制得荧光探针。
3.权利要求2所述聚合物荧光探针的合成方法，其特征在于：所述制备7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮的方法为，将7- ( 二乙氨基)香豆素-3-甲醛溶解于甲醇中，在0℃下缓慢加入硼氢化钠反应0.4-0.6 h后，移入常温继续反应 2.8-3.2h ，经过分离提纯，得到7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮。
4.权利要求3所述聚合物荧光探针的合成方法，其特征在于：所述7- ( 二乙氨基)香豆素-3-甲醛与硼氢化钠的摩尔比为1：0.65-0.75；所述7- ( 二乙氨基)香豆素-3-甲醛与甲醇的质量比为0.01:0.9-1.1。
5.权利要求2所述聚合物荧光探针的合成方法，其特征在于：所述制备( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯的方法为，将 7- ( 二乙基氨基 ) -3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮和三乙胺在0℃下溶于DMF，在氮气环境下缓慢加入甲基丙烯酰氯，搅拌0.9-1.1 h后，移入常温反应5.8-6.2h，反应完成后，分离得到( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯。
6.权利要求5所述聚合物荧光探针的合成方法，其特征在于：所述7- ( 二乙基氨基 )-3- ( 羟甲基 ) -2H-1-苯并吡喃-2-酮和三乙胺的摩尔比为4.8-5.2:1；所述三乙胺和甲基丙烯酰氯的体积比为2.3-2.4:1；所述三乙胺和DMF的体积比为1：115-117。
7.权利要求2所述聚合物荧光探针的合成方法，其特征在于：所述制得荧光探针的方法为，将( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯、PEGMA400、RAFT试剂CTA和引发剂AIBN 溶解在无水1，4-二氧六环中，首先用液氮冻结体系，然后抽真空，直到体系解冻，最后向体系中填充氮气，使冻融循环重复三次，然后在74-76℃、氮气环境下反应23-25 h，得到荧光探针。
8.权利要求7所述聚合物荧光探针的合成方法，其特征在于：所述( 7-( 二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基 )甲基丙烯酸甲酯与PEGMA400的摩尔比为1:14.5-15.5；所述PEGMA400与RAFT试剂CTA的摩尔比为29-30:1；所述RAFT试剂CTA与引发剂AIBN的摩尔比为4.8-5.2:1；所述PEGMA400与1，4-二氧六环的质量体积比为1g:7.2-7.3 mL。
9.权利要求1所述的聚合物荧光探针在生物体系中脂质小滴的动态传感检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述传感检测包含荧光检测、细胞成像。
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| CN116903782A (zh) * | 2023-07-09 | 2023-10-20 | 齐鲁工业大学(山东省科学院) | 一种基于苯并噻二唑的聚丙烯酸酯类荧光探针、合成方法及在监测脂滴中的应用 |
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Non-Patent Citations (1)
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| WEI-LONG CUI等: "A water-soluble polymer fluorescent probe via RAFT polymerization for dynamic monitoring of cellular lipid droplet levels and zebrafish imaging" * |
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| CN116903782B (zh) * | 2023-07-09 | 2024-06-11 | 齐鲁工业大学(山东省科学院) | 一种基于苯并噻二唑的聚丙烯酸酯类荧光探针、合成方法及在监测脂滴中的应用 |
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