CN115466248A

CN115466248A - 二萜类化合物及其提取方法和用途

Info

Publication number: CN115466248A
Application number: CN202210118858.2A
Authority: CN
Inventors: 雍建平; 卢灿忠; 奥拉特德·奥拉戈克·扎克斯; 卢祯灿; 卢健
Original assignee: Zhongke Yuhui Xiamen New Material Technology Co ltd; Xiamen Institute of Rare Earth Materials
Current assignee: Zhongke Yuhui Xiamen New Material Technology Co ltd; Xiamen Institute of Rare Earth Materials
Priority date: 2022-02-08
Filing date: 2022-02-08
Publication date: 2022-12-13

Abstract

本发明公开了二萜类化合物及其提取方法和用途。本发明所述的二萜类化合物选自具有下述结构的二萜类化合物A、二萜类化合物B或二萜类化合物C。本发明还公开了所述二萜类化合物的分离方法及其在制备治疗癌症的药物中的用途。

Description

二萜类化合物及其提取方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及二萜类化合物及从筋骨草中的提取方法、在***/癌症方面的用途。

背景技术

癌症已成为世界范围内最主要的致死性疾病，癌症可于任何年龄在各种器官及组织中发生。因此开发新的抗癌药物是亟待解决的难题。

然而，大部分癌症患者发觉病情时通常已是中期至晚期，临床治疗总体效果较差，尤其是多药耐药性的不断出现，使得癌症的治疗困难重重。虽然部分小分子抗癌化疗药、抗体药已经进入临床。然而大部分临床应用的抗癌的新药基本上都依赖进口，治疗费用高昂。我国自主研发的新抗癌药物相对甚少。因此，开发出活性高、副作用低的新型抗癌药物来满足临床的需求迫在眉睫。尤其是从传统中药中发现新的抗肿瘤候选化合物，是当今药物研发的主流。

唇形科植物筋骨草(Ajuga decumbens Thunb.)是一年生草本植物，别名白毛夏枯草。主要分布于我国长江以南各省区(如：江苏、安徽、浙江、上海、四川、福建、湖北、湖南、广东、广西、贵州、云南等地)，干燥全草入药。具有清热解毒，凉血平肝。用于上呼吸道感染，扁桃体炎，咽炎，支气管炎，肺炎，肺脓疡，胃肠炎，肝炎，阑尾炎，乳腺炎，急性结膜炎，高血压；外用治跌打损伤，外伤出血，痈疖疮疡，烧烫伤，毒蛇咬伤等。入选中国药典(1977，一部)。我国南方民间将其用于治疗痈疽疗疮、火眼、乳痈、咽喉炎、肠胃炎、急性结膜炎、烫伤、狗咬伤、蛇咬伤以及外伤出血等症状(福建药物志.第一册：福州：福建人民出版社，1979.410)。平潭岛人将本地产的“筋骨草”称之为“居家常备的无副作用的抗生素”。鉴于近年来发明人在天然药物研究方面的深厚积累以及在小分子抗肿瘤药物研究方面取得良好结果，对福建省平潭岛生长的筋骨草进行了提取分离，以期从中发现具有抗肿瘤活性的新药候选化合物或先导化合物。

发明内容

本发明提供了二萜类化合物及该二萜类化合物及其提取方法和用途。

本发明提供一种二萜类化合物，其选自具有下述结构的二萜类化合物A、二萜类化合物B或二萜类化合物C：

根据本发明的实施方案，所述二萜类化合物B为无色固体，其熔点为 98-99℃。

本发明还提供上述二萜类化合物的晶体，例如所述二萜类化合物的晶体选自二萜类化合物A晶体、二萜类化合物C晶体中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述二萜类化合物A晶体属于单斜晶系，空间群为 P2₁，

α＝90.00°，β＝94.046(5)°，γ＝90.00°。

根据本发明的实施方案，所述二萜类化合物A晶体为无色针状晶体。

根据本发明的实施方案，所述二萜类化合物A晶体的熔点为185-186℃。

根据本发明的实施方案，所述二萜类化合物C晶体属于三斜晶系，其空间群为P2₁，

α＝90.00°，β＝100.858(2')°，γ＝90.00°。

根据本发明的实施方案，所述二萜类化合物C晶体为无色柱状晶体。

根据本发明的实施方案，所述二萜类化合物C晶体的熔点为148-149℃。

本发明还提供上述二萜类化合物或其晶体的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

(1)将筋骨草粉碎，经乙醇水溶液提取，所得提取液经浓缩得到总浸膏；

(2)将步骤(1)所得的总浸膏用水分散，再用有机溶剂萃取，所得萃取液经浓缩得到有机溶剂浸膏；

(3)将步骤(2)中所得的有机溶剂浸膏进行柱分离得到粗组分；

(4)将步骤(3)中所得的粗组分进行分离纯化，得到所述的二萜类化合物或其晶体。

根据本发明的实施方案，步骤(1)中，所述乙醇水溶液中乙醇的质量分数可以为50-80％，例如50％、60％、70％或80％。

根据本发明的实施方案，步骤(1)中，乙醇水溶液提取可以为浸泡提取或回流提取。

优选地，所述浸泡提取的条件包括：浸泡温度为15-30℃，优选为20-25℃；浸泡时间为20-40天，优选为25-35天，例如为28天，29天，30天，31天，32天。

优选地，所述回流提取可选用本技术领域已知的方法，例如所述回流提取的条件包括：回流温度为70-100℃，优选为79-90℃；回流时间为10-24h，例如为12-15h。

根据本发明的实施方案，步骤(2)中，所述总浸膏与水的质量体积比(g/mL) 为(0.2-3):1，例如(0.5-2):1，示例性为1:1。

根据本发明的实施方案，步骤(2)中，所述有机溶剂与水的体积比为1:(0.2-3)，例如1:(0.5-2)，示例性为1:2。

根据本发明的实施方案，步骤(2)中，所述有机溶剂选自与水不互溶的有机溶剂。优选地，所述有机溶剂可以选自包括但不限于石油醚、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇中的至少一种。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述柱分离包括但不限于硅胶柱分离、反向硅胶柱分离、凝胶柱分离、大孔树脂柱富集分离、和/或、制备液相色谱分离。

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，所述分离纯化可以通过柱分离、重结晶和制备液相色谱分离中的至少一种或两种以上。

根据本发明的实施方案，步骤(3)或(4)中，所述硅胶柱分离具体包括：采用展开剂进行梯度洗脱，得到了不同极性的粗组分。

优选地，所述展开剂选自石油醚和/或乙酸乙酯，优选采用V_石油醚/V_乙酸乙酯＝1:0 至0:1进行梯度洗脱，即从纯的石油醚(V_石油醚/V_乙酸乙酯＝1:0)开始，逐渐增加乙酸乙酯的量同时减少石油醚的量，最终变成纯的乙酸乙酯(V_石油醚/V_乙酸乙酯＝0:1)。优选地，所述梯度洗脱按照石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:0、0.9:0.1、0.8:0.2、 0.7:0.3、0.6:0.4、0.5:0.5、0.4:0.6、0.3:0.7、0.2:0.8、0.1:0.9、0:1顺次进行洗脱。

优选地，所述柱分离至少进行一次，例如两次。

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，所述柱分离选取极性差值较大的组分进行，例如选取R_f差值为0.5-1的3-5个组分。

根据本发明的实施方案，步骤(3)或(4)中，所述液相色谱分离的条件优选如下：流动相选自甲醇和含0.3wt％磷酸的水的混合液，其中V_甲醇:V_{含0.3wt％磷酸的水}＝7:3，柱温为15-30℃，优选为20-30℃；检测波长为200-400nm。

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，所述重结晶的溶剂选自四氢呋喃、甲醇和水的混合溶剂。优选地，所述四氢呋喃、甲醇和水的体积比为(1-3):1:1，例如2:1:1。

根据本发明的实施方案，通过步骤(3)和/或(4)的制备液相色谱分离得到二萜类化合物B。

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，还包括在显微镜下分离不同的晶体，得到二萜类化合物A和二萜类化合物C。需要说明的是，所述不同的晶体是指晶体的外观不同，所述外观包括形状、颜色；所述形状可以为针状、片状、块状。

优选地，所述在显微镜下分离不同的晶体具体是指，根据晶体的外观状态不同，将不同晶形的晶体挑选出来。

根据本发明的示例性的实施方案，所述二萜类化合物或其晶体的提取方法，具体包括以下步骤：

(1)将筋骨草粉碎，用乙醇水溶液浸泡，过滤浓缩得到总浸膏；

(2)将步骤(1)所得的总浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和氯仿分别萃取3-5次，将不同极性的萃取液分别浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和氯仿浸膏；

(3)将步骤(2)中所得的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱分离，采用所述展开剂进行梯度洗脱，得到了不同极性的粗组分(I)；所述粗组份(I)通过TLC分析，合并相似组份，得到了不同极性粗组份(II)；

优选地，将步骤(2)中所得的乙酸乙酯浸膏进行第一次硅胶柱分离，采用所述展开剂进行梯度洗脱，所述梯度洗脱具有如上文所述含义，收集V_石油醚/V_乙酸乙酯＝2:1和1:1的洗脱组份，得到了不同极性的粗组分(I)；所述粗组份(I)通过 TLC分析，合并相似组份，得到了不同极性粗组份(II)；

(4)通过HPLC分析不同极性的粗组份(II)，合并相似组份，得到不同极性的粗组份(III)；所述粗组份(III)通过硅胶柱分离、制备液相色谱分离及重结晶，得到A-C所示的二萜类化合物；

优选地，所述重结晶的溶剂为四氢呋喃、甲醇和水的混合液，其中，V_四氢呋喃:V _甲醇:V_水＝2:1:1。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物中至少包括上述二萜类化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物、或二萜类化合物的晶体。

根据本发明的实施方案，所述药物组合物含有至少一种药学上可接受的药用辅料；例如，所述药用辅料可以选自赋形剂、载体和/或稀释剂。其中，所述药学上可接受的药用辅料是指惰性、无毒的药用辅料。

根据本发明的实施方案，所述药用辅料还可以选自下述辅料中的一种或多种：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、防腐剂和包衣材料的药学可接受的辅助材料。

本发明还提供一种药物制剂，所述药物制剂至少包括上述二萜类化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物、或二萜类化合物的晶体。

根据本发明的实施方案，所述药物制剂含有上述药物组合物。

根据本发明的实施方案，所述药物制剂为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

优选地，所述的制剂可以选自片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、颗粒剂、口服溶液剂、注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明还提供上述二萜类化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物、二萜类化合物的晶体、所述药物组合物、或所述药物制剂在制备治疗癌症的药物中的用途。

根据本发明的实施方案，所述癌症包括但不限于肺癌、胃癌、乳腺癌或***。

有益效果

本发明从筋骨草中分离获得的3个二萜类化合物A-C对多种癌细胞(如胃癌细胞株、大肠癌细胞株、乳腺癌和***细胞株)均具有很强的抑制活性。

本发明的提取方法通过对植物提取液进行初步纯化(如柱分离、制备板分离、制备液相色谱分离等)后，然后重结晶，并快速准确的获取高纯度的目标化合物 (纯度可高达98％)，对含有复杂成分的植物提取液中具体化合物、尤其是手性对映体的快速分离和鉴定具有重要意义。

发明人惊奇地发现，通过本发明的方法，可以得到待分离化合物的不同结晶形式，从而易于进一步分离，尤其是可以通过显微镜直观观察实现分离。该方法用于分离对映异构体更实用。

本发明采用CCK8方法对本发明所述的二萜类化合物A-C进行了体外抗肿瘤测试，该类化合物对胃癌细胞株、肺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MCF-7及***细胞株具有抑制活性。

附图说明

图1为化合物A的HPLC色谱图；

图2为化合物B的HPLC色谱图；

图3为化合物C的HPLC色谱图；

图4为化合物A的球棍模型图；

图5为化合物C的球棍模型图；

图4和图5中，红色球代表氧原子O，白色球代表氢原子H，黑色球代表碳原子C；

图6为化合物A的HMBC相关图；

图7为化合物B的HMBC相关图；

图8为化合物C的HMBC相关图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

下述实施例中采用的仪器与试剂：

筋骨草(2018年采自福建省平潭岛)，本发明中所使用的化学试剂均为市售化学纯试剂；CCK8试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；DMEM高糖培养基(赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司)；EDTA(胰酶)(gibco)；胎牛血清Foetal Bovine Serum(BiologicalIndustries)；磷酸缓冲盐溶液；96孔细胞培养板；多功能酶标仪。

实施例1：二萜类化合物A、B、C提取、分离及结构鉴定

二萜类化合物A、B、C的提取、分离按照如下过程进行：

(a)将20公斤干燥的筋骨草(2018年采自福建省平潭岛)粉碎，分别装入2个20L 的塑料桶中，加入10L乙醇质量分数为70％的乙醇水溶液室温浸泡1个月，过滤、浓缩即得浸膏。两桶药材分别重复上述浸泡、过滤、浓缩提取3次，将获得的浸膏合并，得到总浸膏；

(b)将步骤(a)所得的1公斤浸膏分散在1000mL水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和氯仿分别萃取5次，每次石油醚、乙酸乙酯和氯仿用量为500毫升。将不同极性的萃取液分别浓缩即得不同极性的石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和氯仿浸膏；

(c)将步骤(b)中所得的乙酸乙酯浸膏进行第一次硅胶柱分离，采用V_石油醚/V _乙酸乙酯为1:0至0:1进行梯度洗脱(分别为1:0、0.9:0.1、0.8:0.2、0.7:0.3、0.6:0.4、 0.5:0.5、0.4:0.6、0.3:0.7、0.2:0.8、0.1:0.9、0:1)，收集V_石油醚/V_乙酸乙酯为1:0.5和0.5:0.5 洗脱得到的组份，共50个不同极性的组份(Fr₁-Fr₅₀)(I)；

(d)将步骤(c)中获得的50个组份首先通过初步的TLC检测，合并相似组份，获得了30个组份(II)。然后分别对组份(II)进行HPLC定性分析(色谱条件：V_甲醇:V_{水(含0.3％磷酸)}为7:3，柱温为室温，检测波长是200-400nm)，对相似组份进行合并。然后选取极性差值较大(核心物质保留时间差值大约为0.5-5分钟)的5个组份接着分别进行第一次硅胶柱分离，将得到的组分进行初步的TLC分析后，对近似组份进行合并，并选择极性差值较大(R_f差值大约为0.2-0.6)的组份进行第二次硅胶柱分离，然后将第二次柱分离后的组份进行制备高效液相色谱分离，将制备色谱分离获得的组份进行重结晶，其中，重结晶的溶剂为四氢呋喃、甲醇和水的混合溶剂，其体积比V_四氢呋喃:V_甲醇:V_水＝2：1：1。在显微镜下挑选出无色针状和无色柱状的晶体获得了二萜类化合物A和化合物C。

发明人发现，仅通过柱分离，制备板分离或中压制备色谱分离只能获得化合物A和其对映异构体、化合物C和其对映异构体的混合物(经TLC检测是一个点，HPLC分析也是保留时间相同，但¹HNMR分析为混合物)，而惊奇地发现，该混合物在四氢呋喃、甲醇和水混合溶剂中，化合物A和其对映异构体、化合物 C和其对映异构体都很容易形成大量晶体，且化合物A和其对映异构体、化合物 C和其异构体的晶体外观状态在显微镜下有细微差异，因此可以采取在显微镜下挑选不同晶体形式，实现化合物A及其对映体、C及其对映体的分离。化合物B 和A、C的极性相差比较大，通过制备液相色谱分离制备。

对分离得到的二萜类化合物A、B和C，通过HPLC测定了其纯度：A的纯度 98.70％,Rt＝20.187min；B的纯度98.809％,Rt＝14.172min；C的纯度99.641％，Rt＝14.420min；(色谱条件：色谱条件：C₁₈柱；流动相：V_甲醇:V_水＝7:3；检测波长:254nm。其化合物A的HPLC色谱图见图1，B的HPLC色谱图见图2，C的HPLC 色谱图见图3)。

通过NMR和高分辨质谱分析，确定了其结构，通过XRD分析确定了其晶型及绝对构型。

二萜类化合物A的表征数据如下：无色针状晶体，熔点：185-186℃，单斜晶系，空间群为P2₁，

α＝90.00°, β＝94.046(5)°,γ＝90.00°,

(通过XRD确定的晶体球棍模型结构见图4)；HR-MSfor C₂₅H₃₆O₆+Na:计算值：455.2404,实验值：455.2404；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm,J/Hz):δ_H 0.66(3H,s,H₃-19),0.77(3H,d,6.6, H₃-20),1.03(1H,m,H-3β),1.36(2H,m,H₂-11),1.40(1H,m,H-10),1.47(1H,m, H-2β),1.49(1H,m,H-7α),1.52(2H,m,H₂-1),1.56(1H,m,H-8),1.75(3H,d,7.2, H₃-4'),1.78(3H,s,H₃-5'),1.85(1H,m,H-2α),1.97(1H,m,H-3α),2.14(1H,m, H-12β),2.26(1H,m,H-12α),2.46(1H,d,J＝3.4Hz,H-17β),3.12(1H,s,H-17α),3.27(1H,s,OH-6),3.56(1H,m,H-6),4.40(1H,d,J＝11.9Hz,H-18α),4.41(1H,d, J＝11.9Hz,H-18β),4.84(2H,d,J＝1.8Hz,H₂-16),5.93(1H,s,H-14),6.89(1H,q, J＝7.0Hz,H-3')；如图6所示。

二萜类化合物B的表征数据如下：无色固体，熔点：98-99℃；¹HNMR(400MHz,CD₃OD,ppm,J/Hz):δ_H 0.79(3H,s,H₃-19),0.90(3H,d,J＝5.9Hz, H₃-20),1.16(1H,dd,J＝13.6,1.16Hz,H-1β),1.36(1H,d,J＝15.6Hz,H-11β),1.50(1H, d,J＝3.8Hz,H-7β),1.68(1H,m,H-7α),1.74(3H,d,J＝8.0Hz,H₃-4'),1.81(3H,s, H₃-5'),1.94(3H,s,H₃-2”'),1.98(1H,m,H-8),2.05(2H,m,H₂-2),2.12(3H,s,H₃-2”), 2.38(1H,m,H-17β),2.40(1H,m,H-1α),2.48(1H,t,J＝15.6Hz,H-11α),3.03(1H,m, H-17α),3.07(1H,m,H-10),4.48(1H,d,J＝12.5Hz,H-18β),4.78(1H,d,J＝3.2Hz, H-12),4.82(1H,d,J＝3.1Hz,H-6),4.88(2H,m,H₂-16),5.03(1H,d,J＝12.5Hz, H-18α),5.66(1H,m,H-3),5.97(1H,s,H-14),6.97(1H,q,J＝8.0Hz,H-3')；如图7所示。

二萜类化合物C的表征数据如下：无色柱状晶体，熔点：148-149℃,三斜晶系，空间群为P2₁，

α＝90.00°, β＝100.858(2')°,γ＝90.00°,

(通过XRD确定的晶体球棍模型结构见图5)；HR-MSfor C₃₁H₄₂O₁₁+Na:计算值：543.2928，实验值：543.2928；

¹H NMR(400MHz,CD₃OD,ppm,J/Hz):δ_H 0.80(3H,s,H₃-19),0.90(3H,d, J＝6.6Hz,H₃-20),1.17(1H,dd,J＝8.2,2.6Hz,H-3β),1.50(1H,dd,J＝9.5,3.84Hz, H-7β),1.62(1H,d,J＝2.2Hz,H-2β),1.67(1H,d,J＝2.0Hz,H-11β),1.74(1H,d, J＝11.8Hz,H-7α),1.80(3H,dd,J＝7.1,1.2Hz,H₃-4'),1.86(3H,t,J＝1.3Hz,H₃-5'),1.93 (3H,s,H₃-2”),2.11(3H,s,H₃-2””),2.14(1H,m,H-2α),2.23(3H,s,H₃-2”'),2.25(1H,d, J＝11.0Hz,H-10),2.37(1H,m,H-17β)2.40(1H,d,J＝4.0Hz,H-3α),2.65(1H,dd, J＝16.1,10.6Hz,H-11α),2.97(1H,dd,J＝4.1,2.1Hz,H-17α),4.49(1H,d,J＝12.5Hz, H-18β),4.71(1H,dd,J＝11.5,4.4Hz,H-6),4.92(2H,m,H₂-16),5.01(1H,d,J＝12.5Hz, H-18α),5.71(1H,td,J＝10.9,4.7Hz,H-1),5.97(1H,d,J＝10.6Hz,H-12),6.03(1H,q, J＝3.3Hz,H-14),7.03(1H,q,J＝7.1Hz,H-3')；如图8所示。

通过上述表征确知二萜类化合物A-C的结构如下所示：

应用例1：体外抗肿瘤活性测试

对实施例1提取的化合物A-C进行了体外抗肿瘤活性测试，主要研究了其对肺癌细胞株A549和***细胞株Hela的抑制活性(细胞株的来源：宁夏医科大学)。具体的测试过程以化合物B对肺癌细胞株A549的抑制活性测试过程为例进行阐述：

1.测试样品浓度配制

称取化合物B 23.7mg，加入5mL的塑料离心管中，用DMSO稀释至1mL。即得浓度为23.7mg/mL的初始浓度。然后将初始浓度用DMSO进行倍比稀释，依次获得11.85mg/mL，5.93mg/mL,2.96mg/mL，1.48mg/mL，0.74mg/mL 5 个不同的浓度梯度，置于4℃冰箱保存待用。

2.肺腺癌细胞株(A549)的培养及抑制活性测试

将肺腺癌细胞株(A549)置于37℃，饱和湿度，含有5％的CO₂培养箱中培养 24小时，当细胞处于对数生长期时，吸弃上清培养液，并用0.25％胰蛋白酶-EDTA 溶液消化后，使用高糖培养基终止消化。并将细胞接种于96孔板中，使得细胞密度为5000个/孔。将96孔板置于培养箱中培养24小时。随之吸弃96孔板中的细胞培养液。并向96孔板中补加100μL的高糖培养基，然后每孔加入不同浓度的测试样品1μL(每个浓度设置5个复孔)，接着置于37℃，饱和湿度，5％CO₂的培养箱中继续培养48h后，每个孔加入10μL CCK8，继续在37℃培养箱中孵育1-4h后。在多功能酶标仪上测定450nm波长下每孔的吸光度值。按照抑制率％＝[(对照细胞OD-加药细胞OD)/(对照细胞OD-空白OD)]×100。阴性对照为V_{高糖培养基}/V_DMSO＝10:1的混合溶液。

3.***细胞株Hela的培养及抑制活性测试

化合物B对***细胞株Hela的测试过程参照肺腺癌细胞株(A549)的培养及抑制活性测试，区别在于将肺腺癌细胞株(A549)替换为***细胞株Hela。

其化合物B对肺腺癌细胞株(A549)和***细胞株Hela的抑制率参见表1。

表1化合物B对两种肿瘤细胞株的抑制效果

化合物B	肺腺癌细胞株(A549)	***细胞株Hela
			IC<sub>50</sub>(μM)	0.152	9.17×10<sup>4</sup>

化合物A、C及其晶体对肺腺癌细胞株(A549)和***细胞株Hela的抑制率均具有与化合物B基本相当的抑制效果。

以上对本发明示例性的实施方式进行了说明。但是，本申请的保护范围不拘囿于上述实施方式。本领域技术人员在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种二萜类化合物，其特征在于，其选自具有下述结构的二萜类化合物A、二萜类化合物B或二萜类化合物C：

2.根据权利要求1所述的二萜类化合物，其特征在于，所述二萜类化合物B为无色固体，其熔点为98-99℃。

3.权利要求1或2所述的二萜类化合物的晶体，其特征在于，所述二萜类化合物的晶体选自二萜类化合物A晶体、二萜类化合物C晶体中的至少一种。

优选地，所述二萜类化合物A晶体属于单斜晶系，空间群为P2₁，

α＝90.00°，β＝94.046(5)°，γ＝90.00°。

优选地，所述二萜类化合物A晶体为无色针状晶体。

优选地，所述二萜类化合物A晶体的熔点为185-186℃。

优选地，所述二萜类化合物C晶体属于三斜晶系，其空间群为P2₁，

α＝90.00°，β＝100.858(2')°，γ＝90.00°。

优选地，所述二萜类化合物C晶体为无色柱状晶体。

优选地，所述二萜类化合物C晶体的熔点为148-149℃。

4.权利要求1或2所述的二萜类化合物、或权利要求3所述的晶体的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

(2)将步骤(1)所得的总浸膏用水分散，用有机溶剂萃取，所得萃取液经浓缩得到有机溶剂浸膏；

(3)将步骤(2)中所得的有机溶剂浸膏进行柱分离得到粗组分；

(4)将步骤(3)中所得的粗组分进行分离纯化得到所述的二萜类化合物或其晶体。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇水溶液中乙醇的质量分数为50-80％。

优选地，步骤(1)中，乙醇水溶液提取可以为浸泡提取或回流提取。

优选地，步骤(2)中，所述总浸膏与水的质量体积比(g/mL)为(0.2-3):1。

优选地，步骤(2)中，所述有机溶剂与水的体积比为1:(0.2-3)。

优选地，步骤(2)中，所述有机溶剂选自与水不互溶的有机溶剂。优选地，所述有机溶剂可以选自包括但不限于石油醚、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇中的至少一种。

优选地，步骤(3)中，所述柱分离包括但不限于硅胶柱分离、反向硅胶柱分离、凝胶柱分离、大孔树脂柱富集分离、和/或、制备液相色谱分离。

优选地，步骤(4)中，所述分离纯化可以通过柱分离、重结晶和制备液相色谱分离中的至少一种或两种以上。

6.根据权利要求4或5所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)或(4)中，所述硅胶柱分离具体包括：采用展开剂进行梯度洗脱，得到了不同极性的粗组分。优选地，所述展开剂选自石油醚和/或乙酸乙酯，优选采用V_石油醚/V_乙酸乙酯＝1:0至0:1进行梯度洗脱。优选地，所述梯度洗脱按照石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:0、0.9:0.1、0.8:0.2、0.7:0.3、0.6:0.4、0.5:0.5、0.4:0.6、0.3:0.7、0.2:0.8、0.1:0.9、0:1顺次进行洗脱。

优选地，步骤(3)或(4)中，所述液相色谱分离的条件如下：流动相选自甲醇和含0.3wt％磷酸的水的混合液，其中V_甲醇:V_{含0.3wt％磷酸的水}＝7:3，柱温为15-30℃，优选为20-30℃；检测波长为200-400nm。

优选地，步骤(4)中，所述重结晶的溶剂选自四氢呋喃、甲醇和水的混合溶剂。优选地，所述四氢呋喃、甲醇和水的体积比为(1-3):1:1。

优选地，通过步骤(3)和/或(4)的液相色谱分离得到二萜类化合物B。

优选地，步骤(4)中，还包括在显微镜下分离不同的晶体，得到二萜类化合物A和二萜类化合物C。

7.根据权利要求4-6任一项所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法具体包括以下步骤：

(4)通过HPLC分析不同极性的粗组份(II)，合并相似组份，得到不同极性的粗组份(III)；所述粗组份(III)通过硅胶柱分离、制备液相色谱分离及重结晶，得到A-C所示的二萜类化合物优选地，所述重结晶的溶剂为四氢呋喃、甲醇和水的混合液，其中，V_四氢呋喃:V_甲醇:V_水＝2:1:1。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中至少包括权利要求1或2所述的二萜类化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物、或权利要求3所述的晶体。

9.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂至少包括权利要求1或2所述的二萜类化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物、或权利要求3所述的晶体。

优选地，所述药物制剂含有权利要求8所述的药物组合物。

10.权利要求1或2所述的二萜类化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物、或权利要求3所述的晶体、权利要求8所述的药物组合物、或权利要求9所述的药物制剂在制备治疗癌症的药物中的用途。

优选地，所述癌症包括但不限于肺癌、胃癌、乳腺癌或***。