CN115462312A - 一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，属于种植技术领域，包括花粉获取，去雄，杂交，获取杂交胚，杂交胚培养获得杂交苗，炼苗移栽驯化。本发明优点：花粉活力高：花粉检测活力达92％；获得杂交后代多：比较杂交后采收种子育苗，本发明可以获得更多杂交后代，提高杂交的成功率，种子育苗的杂交成功率不足25％，本方法成功率达90％；缩短育苗周期：本方法可以避免种子播种育苗周期长的缺点，将育苗周期缩短至90天，杂交当年即可获得大量杂交后代种苗，加快了远缘杂交育种的时间；可以获得壮苗，提高幼苗成活率：胚抢救过程中可以对幼苗进行壮苗处理，增加幼苗的成活率，避免了杂交种子播种时容易产生弱苗难以成活的缺点。

Description

一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法
技术领域
本申请涉及植物种植技术领域，尤其涉及一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法。
背景技术
樱属Cerasus植物隶属蔷薇科Rosaceae李亚科Prunusoidea，全球约150种，分布于欧亚大陆至北美洲的北半球温带，大多数樱花既有桃之艳丽，又有梅之芳香，是著名的春季木本观花植物和秋色叶树种。我国野生樱花资源丰富，现有野生樱花资源超过52种或变种，占世界樱属植物资源的1/3以上，其中有很多观赏价值非常高的樱花种类，但我国樱花育种工作还处于比较初级的阶段，这些樱花种质资源大多还处于待利用和待开发状态，因此利用这些樱花资源杂交育种培育新品种是一件非常有必要的工作。
樱花远缘杂交育种是对于樱花育种工作有着重要的意义，尤其是对于中国原生樱花的开发工作意义深远。樱花远缘杂交也存在亲和性低，容易败育的问题，胚抢救技术是解决此类问题的一项重要技术，是克服远缘杂交不亲和和败育问题的重要技术手段。
专利公开号为CN110050690A，专利名称为南方地区甜樱桃与中国樱桃种间杂交胚挽救成苗方法的专利，包括以下步骤：
1)收集花粉及授粉：以中国樱桃(Prunus.pseudocerasus L.)为父本，采集铃铛花期的自然花；在室内剥下花药，20-30℃干燥的条件***干；待花药开裂散粉后，采集于小玻璃瓶中并密封置于1-6℃的冰箱中保存备用；以欧洲甜樱桃(Prunus.avium L.)为母本，母本自交不亲和，铃铛期花朵进行人工不去雄授粉；授粉后立即套硫酸纸袋并5-10d后换网袋；
2)采果及低温层积处理：分别采摘母本处于硬核期胚长/种长PF>0.5的杂交幼果，鲜果放入透明塑料保鲜盒，置1-6℃低温冰箱内贮存30-40d；
3)幼胚接种及萌发培养：低温处理结束后，冲洗干净果实，剥去果肉取胚；在超净工作台中进行消毒；剥去内种皮接种于含有第一外源生长促进添加剂的1/2MS固体培养基上，置于培养室培养；
4)继代扩繁培养：取萌发的幼胚无菌新梢，截取1.5-2.5cm长的茎段接种于继代培养基MS上，继代培养基MS加入第二外源生长促进添加剂；置于培养室培养35-45d；
5)生根培养：杂种苗继代培养后，将株高2cm以上生长健壮的丛生芽新梢接种于附加第三外源生长促进添加剂生根培养基1/2MS中；置于培养室培养35-45d，得到杂种幼苗；
6)炼苗移栽：将杂种苗炼苗10-20d，移栽入营养钵；移栽时间为2月中旬。
上述的专利存在以下的缺点：和其他樱花品种通用性不足，甜樱桃和樱花物种差异较大，胚抢救所采用的方法和材料有较大差异，操作复杂，成活率低。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供了一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法。本发明的目的即在克服樱花远缘杂交不亲和的障碍，提供一种获得的樱花远缘杂交后代繁殖方法。解决樱花远缘杂交不亲和，杂交胚胎成活率低的问题。
本发明采用了如下技术方案：一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：
1)花粉获取：在父本树上选取花药未散花粉的樱花，用镊子取下花药置于垫有硫酸纸袋的培养皿中，干燥使雄蕊开裂散出花粉，随后将散出的花粉连同花药装入5ml离心管中，4℃冷藏备用或-80℃冷冻保存；
2)去雄方法：授粉前1天选取未开放的大蕾期樱花进行人工去雄，去雄后用硫酸纸袋进行套袋；
3)杂交方法：将冷藏或冷冻的花粉恢复至常温，使用小笔刷蘸取花粉，对已经提前去雄的雌蕊进行授粉，蘸取一次可授3-4朵花，然后进行授粉后处理；
4)获取杂交胚：母本花朵授粉25-30天后，采集幼果，对幼果清洗消毒，转移至托盘中备用；用杂交胚剥离方法获得干净的杂交胚；
5)杂交胚培养获得杂交苗：将杂交胚接种至胚抢救培养基的培养瓶中，接种方式为胚尖朝下，浅插在培养基上，接种后培养30-35天之后将诱导出的苗转入壮苗培养基中进行壮苗培养，30天后将壮苗转移至生根培养基中进行生根培养，25-30天后获得杂交苗；
6)炼苗移栽驯化：生根培养25-30天后，选择4-5片叶，3-4条根的幼苗，将组培瓶打开进行炼苗，使杂交苗生长环境温度、湿度与外界环境一致，7-14天后，清洗掉杂交苗根部残留的培养基，移栽种植，种植后浇透水，转移至小拱棚中保湿，7-15天后打开小拱棚进行正常管理。
作为优选，步骤1)中，花粉干燥方式：自然散光干燥12-24小时，然后放入干燥皿中干燥8小时。
作为优选，步骤3)中，授粉后处理：授粉后用硫酸纸袋进行套袋处理，5-7天后去除纸袋，改用尼龙网袋套袋。
作为优选，步骤4)中，对幼果清洗消毒方法：自来水清洗干净，转移至超净工作台，75％酒精消毒30s-1min，无菌水清洗2-3遍，10％次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟或0.1％HgCl溶液浸泡消毒5分钟，无菌水清洗4-5遍。
作为优选，步骤4)中，杂交胚剥离方法：用手术钳以垂直于果实腹缝线的角度轻轻夹开幼果，用镊子顺夹缝打开种壳，取出种子，再用镊子剥去种皮，获得干净的杂交胚，剥皮过程不能伤及胚尖部位。
作为优选，步骤5)中，所述胚抢救培养基：MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L。
作为优选，步骤5)中，胚抢救培养基中的培养方式为：接种后在温度为25℃-28℃、湿度为70％-80％的无光条件下培养5-7天，随后转移至有光条件下继续培养，培养30-35天之后进行壮苗培养。
作为优选，步骤5)中，所述壮苗培养基：MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+NAA0.2mg/L。
作为优选，步骤5)中，所述生根培养基：WPM+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L。
作为优选，步骤6)中，移栽种植选择装有泥炭：珍珠岩＝1:1基质的50孔林木高脚穴盘中种植。
本樱花远缘杂交胚抢救方法优点：
1、花粉活力高：采用本方法中的花粉获取方法获取的花粉，花粉检测活力达92％；
2、获得杂交后代多：较比杂交后采收种子育苗，本胚抢救方法可以获得更多杂交后代，提高杂交的成功率，种子育苗的杂交成功率不足25％，本方法成功率达90％，极大的提高了远缘杂交后代的成活率；
3、缩短育苗周期：本方法可以避免种子播种育苗周期长的缺点，将育苗周期缩短至90天，杂交当年即可获得大量杂交后代种苗，加快了远缘杂交育种的时间；
4、可以获得壮苗，提高幼苗成活率：胚抢救过程中可以对幼苗进行壮苗处理，增加幼苗的成活率，避免了杂交种子播种时容易产生弱苗难以成活的缺点。
5、确定了樱花胚抢救的时间，为授粉后25-30天。
6、操作简单：果实不需要进行低温层积处理。
7、胚抢救培养基调整为MS培养基，生根培养基调整为WPM培养基。
8、明确移栽基质:采用泥炭、珍珠岩(1:1)混合基质，幼苗炼苗成活率更高，成活率95％以上，比现有技术成活率提高10％。
具体实施方式
下面通过对本申请进行详细说明，本申请的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
在本申请的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“前”、“后”、“左”和“右”等指示的方位或位置关系为基于本申请工作状态下的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：
1)花粉获取：在父本树上选取花药未散花粉的樱花，用镊子取下花药置于垫有硫酸纸袋的培养皿中，自然散光干燥12小时，然后放入干燥皿中硅胶干燥8小时，使雄蕊开裂散出花粉，随后将散出的花粉连同花药装入5ml离心管中，4℃冷藏备用；
2)去雄方法：授粉前1天选取未开放的大蕾期樱花进行人工去雄，去雄后用硫酸纸袋进行套袋；
3)杂交方法：将冷藏或冷冻的花粉恢复至常温，使用小笔刷蘸取花粉，对已经提前去雄的雌蕊进行授粉，蘸取一次可授3朵花，授粉后用硫酸纸袋进行套袋处理，5天后去除纸袋，改用尼龙网袋套袋。
4)获取杂交胚：母本花朵授粉25天后，采集幼果，幼果用自来水清洗干净，转移至超净工作台，75％酒精消毒1min，无菌水清洗2-3遍，10％次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，无菌水清洗4遍，转移至托盘中备用；用手术钳以垂直于果实腹缝线的角度轻轻夹开幼果，用镊子顺夹缝打开种壳，取出种子，再用镊子剥去种皮，获得干净的杂交胚，剥皮过程不能伤及胚尖部位。
5)杂交胚培养获得杂交苗：将杂交胚接种至装有MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基的培养瓶中，接种方式为胚尖朝下，浅插在培养基上，接种后在温度为25℃、湿度为70％的无光条件下培养5天，随后转移至有光条件下继续培养，30天之后将诱导出的苗转入MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基中进行壮苗培养，30天后将壮苗转移至WPM+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L培养基中进行生根培养，25天后获得杂交苗。
6)炼苗移栽驯化：生根培养25天后，选择4片叶，3条根的幼苗，将组培瓶打开进行炼苗，使杂交苗生长环境温度、湿度与外界环境一致，7天后，清洗掉杂交苗根部残留的培养基，移栽至装有泥炭：珍珠岩(1:1)基质的50孔林木高脚穴盘中种植，种植后浇透水，转移至小拱棚中保湿，7天后打开小拱棚进行正常管理。
实施例2
一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：
1)花粉获取：在父本树上选取花药未散花粉的樱花，用镊子取下花药置于垫有硫酸纸袋的培养皿中，自然散光干燥24小时，然后放入干燥皿中硅胶干燥8小时，使雄蕊开裂散出花粉，随后将散出的花粉连同花药装入5ml离心管中，-80℃冷冻保存；
2)去雄方法：授粉前1天选取未开放的大蕾期樱花进行人工去雄，去雄后用硫酸纸袋进行套袋；
3)杂交方法：将冷藏或冷冻的花粉恢复至常温，使用小笔刷蘸取花粉，对已经提前去雄的雌蕊进行授粉，蘸取一次可授4朵花，授粉后用硫酸纸袋进行套袋处理，7天后去除纸袋，改用尼龙网袋套袋。
4)获取杂交胚：母本花朵授粉30天后，采集幼果，幼果用自来水清洗干净，转移至超净工作台，75％酒精消毒1min，无菌水清洗3遍，0.1％HgCl溶液浸泡消毒5分钟，无菌水清洗5遍，转移至托盘中备用；用手术钳以垂直于果实腹缝线的角度轻轻夹开幼果，用镊子顺夹缝打开种壳，取出种子，再用镊子剥去种皮，获得干净的杂交胚，剥皮过程不能伤及胚尖部位。
5)杂交胚培养获得杂交苗：将杂交胚接种至装有MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基的培养瓶中，接种方式为胚尖朝下，浅插在培养基上，接种后在温度为28℃、湿度为80％的无光条件下培养7天，随后转移至有光条件下继续培养，35天之后将诱导出的苗转入MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基中进行壮苗培养，30天后将壮苗转移至WPM+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L培养基中进行生根培养，30天后获得杂交苗。
6)炼苗移栽驯化：生根培养30天后，选择5片叶，4条根的幼苗，将组培瓶打开进行炼苗，使杂交苗生长环境温度、湿度与外界环境一致，14天后，清洗掉杂交苗根部残留的培养基，移栽至装有泥炭：珍珠岩(1:1)基质的50孔林木高脚穴盘中种植，种植后浇透水，转移至小拱棚中保湿，15天后打开小拱棚进行正常管理。
实施例3
一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：
1)花粉获取：在父本树上选取花药未散花粉的樱花，用镊子取下花药置于垫有硫酸纸袋的培养皿中，自然散光干燥20小时，然后放入干燥皿中硅胶干燥8小时，使雄蕊开裂散出花粉，随后将散出的花粉连同花药装入5ml离心管中，4℃冷藏备用；
2)去雄方法：授粉前1天选取未开放的大蕾期樱花进行人工去雄，去雄后用硫酸纸袋进行套袋；
3)杂交方法：将冷藏或冷冻的花粉恢复至常温，使用小笔刷蘸取花粉，对已经提前去雄的雌蕊进行授粉，蘸取一次可授4朵花，授粉后用硫酸纸袋进行套袋处理，7天后去除纸袋，改用尼龙网袋套袋。
4)获取杂交胚：母本花朵授粉28天后，采集幼果，幼果用自来水清洗干净，转移至超净工作台，75％酒精消毒1min，无菌水清洗3遍，10％次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，无菌水清洗5遍，转移至托盘中备用；用手术钳以垂直于果实腹缝线的角度轻轻夹开幼果，用镊子顺夹缝打开种壳，取出种子，再用镊子剥去种皮，获得干净的杂交胚，剥皮过程不能伤及胚尖部位。
5)杂交胚培养获得杂交苗：将杂交胚接种至装有MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基的培养瓶中，接种方式为胚尖朝下，浅插在培养基上，接种后在温度为26℃、湿度为75％的无光条件下培养6天，随后转移至有光条件下继续培养，33天之后将诱导出的苗转入MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基中进行壮苗培养，30天后将壮苗转移至WPM+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L培养基中进行生根培养，28天后获得杂交苗。
6)炼苗移栽驯化：生根培养28天后，选择5片叶，4条根的幼苗，将组培瓶打开进行炼苗，使杂交苗生长环境温度、湿度与外界环境一致，10天后，清洗掉杂交苗根部残留的培养基，移栽至装有泥炭：珍珠岩(1:1)基质的50孔林木高脚穴盘中种植，种植后浇透水，转移至小拱棚中保湿，10天后打开小拱棚进行正常管理。
本樱花远缘杂交胚抢救方法关键创新点：
1、花粉干燥方式：自然散光干燥12-24小时，然后放入干燥皿中干燥8小时；
2、去雄方法：授粉前1天选取未开放的大蕾期樱花进行人工去雄，去雄后用硫酸纸袋进行套袋；
3、授粉后处理：授粉后用硫酸纸袋进行套袋处理，5-7天后去除纸袋，改用尼龙网袋套袋；
4、杂交胚提取时间：母本花朵授粉25-30天后；
5、幼果消毒方法：自来水清洗干净，转移至超净工作台，75％酒精消毒30s，无菌水清洗2-3遍，10％次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，无菌水清洗4-5遍；
6、杂交胚剥离方法：用手术钳以垂直于果实腹缝线的角度轻轻夹开幼果，用镊子顺夹缝打开种壳，取出种子，再用镊子剥去种皮，获得干净的杂交胚；
7、胚抢救培养基：MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L；
8、壮苗培养基：MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+NAA0.2mg/L；
9、生根培养基：WPM+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L。
以上和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)花粉获取：在父本树上选取花药未散花粉的樱花，用镊子取下花药置于垫有硫酸纸袋的培养皿中，干燥使雄蕊开裂散出花粉，随后将散出的花粉连同花药装入5ml离心管中，4℃冷藏备用或-80℃冷冻保存；
2)去雄方法：授粉前1天选取未开放的大蕾期樱花进行人工去雄，去雄后用硫酸纸袋进行套袋；
3)杂交方法：将冷藏或冷冻的花粉恢复至常温，使用小笔刷蘸取花粉，对已经提前去雄的雌蕊进行授粉，蘸取一次可授3-4朵花，然后进行授粉后处理；
4)获取杂交胚：母本花朵授粉25-30天后，采集幼果，对幼果清洗消毒，转移至托盘中备用；用杂交胚剥离方法获得干净的杂交胚；
5)杂交胚培养获得杂交苗：将杂交胚接种至胚抢救培养基的培养瓶中，接种方式为胚尖朝下，浅插在培养基上，接种后培养30-35天之后将诱导出的苗转入壮苗培养基中进行壮苗培养，30天后将壮苗转移至生根培养基中进行生根培养，25-30天后获得杂交苗；
6)炼苗移栽驯化：生根培养25-30天后，选择4-5片叶，3-4条根的幼苗，将组培瓶打开进行炼苗，使杂交苗生长环境温度、湿度与外界环境一致，7-14天后，清洗掉杂交苗根部残留的培养基，移栽种植，种植后浇透水，转移至小拱棚中保湿，7-15天后打开小拱棚进行正常管理。
2.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：步骤1)中，花粉干燥方式：自然散光干燥12-24小时，然后放入干燥皿中干燥8小时。
3.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：步骤3)中，授粉后处理：授粉后用硫酸纸袋进行套袋处理，5-7天后去除纸袋，改用尼龙网袋套袋。
4.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：步骤4)中，对幼果清洗消毒方法：自来水清洗干净，转移至超净工作台，75％酒精消毒30s-1min，无菌水清洗2-3遍，10％次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟或0.1％HgCl溶液浸泡消毒5分钟，无菌水清洗4-5遍。
5.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：步骤4)中，杂交胚剥离方法：用手术钳以垂直于果实腹缝线的角度轻轻夹开幼果，用镊子顺夹缝打开种壳，取出种子，再用镊子剥去种皮，获得干净的杂交胚，剥皮过程不能伤及胚尖部位。
6.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：步骤5)中，所述胚抢救培养基：MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：步骤5)中，胚抢救培养基中的培养方式为：接种后在温度为25℃-28℃、湿度为70％-80％的无光条件下培养5-7天，随后转移至有光条件下继续培养，培养30-35天之后进行壮苗培养。
8.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：
步骤5)中，所述壮苗培养基：MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+NAA0.2mg/L。
9.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：
步骤5)中，所述生根培养基：WPM+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L。
10.根据权利要求1所述的一种通过胚抢救技术获得樱花远缘杂交后代的方法，其特征在于：
步骤6)中，移栽种植选择装有泥炭：珍珠岩＝1:1基质的50孔林木高脚穴盘中种植。
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CN103283606A (zh) * 2013-06-24 2013-09-11 四川农业大学 一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法
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ELISABETH GARIN等: ""Somatic embryogenesis in wild cherry (Prunus avium)"", 《PLANT CELL，TISSUE AND ORGAN CULTURE》 *

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