CN115461451A - 用于激活和增幅nk细胞的经基因改造的细胞株以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于激活NK细胞的经基因改造的细胞。根据一方面的用于激活NK细胞的经基因改造的细胞可以从样品中协同诱导NK细胞的增殖和激活，并因此能够有利地用于增殖NK细胞的方法、由此增殖的NK细胞或NK细胞活性的测量方法、或诊断与NK细胞活性相关的疾病的方法。

Description

用于激活和增幅NK细胞的经基因改造的细胞株以及其用途
技术领域
本申请要求于2020年6月9日提交的韩国专利申请第10-2020-0069854号以及于2021年4月8日提交的韩国专利申请第10-2021-0046106号的优先权，并且上述整个说明书为本申请的参考文献。
涉及一种用于激活和增幅(amplifying，扩增)NK细胞的经基因改造的细胞株以及其用途，更具体地，涉及一种使用所述细胞株增殖NK细胞的方法、或使用所述细胞株测量NK细胞的活性程度的方法。
背景技术
NK细胞(自然杀伤细胞；natural killer cell)是一种对先天免疫很重要的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞对病毒感染的细胞或癌细胞有反应，这些反应取决于NK这些反应取决于激活受体(activating receptor)和抑制受体(inhibitory receptor)与靶细胞中各自的配体(ligand)反应而发出的信号(signal)。通常，当激活信号强于抑制信号时，NK细胞可以攻击靶细胞，但当抑制信号更强时，NK细胞不作出攻击。因此，正常细胞不会受到NK细胞的攻击，因为NK细胞的抑制受体配体(MHC；major histocompatibility complex)存在并发出抑制信号。
癌细胞中的一部分在细胞表面的MHC发生异常而可能会减少。在这种情况下，NK细胞没有抑制信号，因此NK细胞攻击靶细胞。NK细胞分泌穿孔素(perforin)刺破感染细胞或癌细胞的细胞膜，并具有释放颗粒酶(granzyme)来杀死这些细胞的细胞毒性。在具有B细胞淋巴瘤和许多其他癌症患者的情况下，发现NK细胞的数量或抗癌活性存在缺陷，并已知NK细胞功能异常与这些癌症的发生密切相关。
因此，利用这些NK细胞的抗癌能力对癌症患者进行治疗的方法正在兴起，而开发一种用于确保大量的高性能NK细胞的增殖方法很重要。此外，已知具有NK细胞功能下降或异常的人与癌症和各种疾病有关，因此需要开发一种测量NK细胞的活性的方法。
现时被报道的用于增殖NK细胞的方法是使用各种高浓度的昂贵细胞因子或同时使用外周血单核细胞或癌细胞株的方法。但是，这需要很高的成本，并且增幅率不是很高。此外，在许多研究中，除了NK细胞之外，也伴随着诸如T细胞等的其他淋巴细胞的增幅，因此也显示出在基于NK细胞的免疫细胞治疗中不适合的方面。因此，开发一种用于仅选择性增幅NK细胞的有效方法是一项重要问题，虽然已经对此进行了研究(韩国注册专利10-1525199)，但仍不完善。
一方面，在检查NK细胞的活性程度的方法中，细胞毒性(cytotoxicity)检查是一种查看直接杀死靶癌细胞(K562细胞株)的功能的测试，目前用于临床检查室。最近，正介绍一种不需要细胞分离过程的使用全血的细胞毒性检查来代替需要复杂的细胞分离过程的外周血单核细胞。然而，当使用全血时，需要各种类型的细胞因子，但出现了增加检查成本的问题而需要克服。
发明内容
技术问题
一方面提供一种细胞株或饲养细胞(feeder cell)，其用于培养NK细胞，其经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)以及膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbIL-21)。
另一方面提供一种增殖NK细胞的方法，包括收获含有混合的NK细胞群(mixedimmune cells)的血液样品；以及使所述NK细胞群的至少一部分与用于激活NK细胞的经基因改造的细胞接触，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane boundinterleukin-21：mbIL-21)。
另一方面提供一种检查NK细胞的活性程度的方法，包括：收获含有混合的NK细胞群的血液样品；使所述混合的NK细胞群的至少一部分与用于激活NK细胞的经基因改造的细胞接触以激活NK细胞，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane boundinterleukin-21：mbIL-21)；以及分析所激活的NK细胞的激活程度。
另一方面提供一种诊断与NK细胞相关的疾病的方法或提供与诊断有关的信息的方法，包括：收获含有混合的NK细胞群的血液样品；使所述混合的NK细胞群的至少一部分与用于激活NK细胞的经基因改造的细胞接触以激活NK细胞，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbIL-21)；以及分析所激活的NK细胞的激活程度。
技术方案
一方面提供一种细胞株，其经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membranebound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane boundinterleukin-21：mbIL-21)。
所述细胞株可用作仅选择性增幅NK细胞的饲养细胞。一般而言，作为用于NK细胞增殖的具有代表性的饲养细胞的K562细胞株，其仅用于NK细胞的增殖，因此K562细胞株本身不应增殖。因此，在与NK细胞一起培养之前，通过进行对所述K562细胞株照射强放射线(例如，50Gy至100Gy)的预处理，使所述K562细胞株本身完全不增殖，而仅有助于NK细胞的增殖。一方面，为了NK细胞的有效增殖，大多数细胞因子如IL-2和IL-15必须持续露出于NK细胞。因此，当进行基因改造在基于癌细胞株的饲养细胞中以表达细胞因子如IL-2和/或IL-15时，经放射线照射等预处理的癌细胞株在培养过程中不能长期存活，存在NK细胞的选择性增殖效率降低的问题。在一实施例中，当NK细胞在K562的存在下短期露出于IL-18或IL-21时，细胞增幅效果直到第21天也没有出现，但当同时露出于IL-18和IL-21时，确认细胞增幅效果造在28天后出现。因此，可得知，在IL-18和IL-21的情况下，尽管在培养开始日只有一次露出和短期露出，但对NK细胞的增殖有效果。换言之，在根据一方面的经基因改造以表达mbIL-18和mbIL-21的饲养细胞株中，尽管IL-18和IL-21的短期表达，NK细胞增殖的效率并未降低，而仅NK细胞可以被选择性增幅。
在本说明书中使用的术语“饲养细胞(feeder cells，也称为支持细胞)”可以指通过产生各种代谢物来帮助靶NK细胞增殖的细胞，这些细胞尽管没有通过照射放射线而***和增殖的能力，但具有代谢活性。在本说明书中可以使用的饲养细胞是导入了基因的动物细胞株(cell line)，其可以是人慢性骨髓性白血病细胞株(例如，K562细胞)、RPMI8866、EBV_LCL、721.221、HFWT、和NK-92等。
在本说明书中使用的术语“经基因工程(genetic engineering)”或“基因改造的(genetically engineered)”是指将至少一种基因修饰(genetic modification)导入细胞的行为或由此产生的细胞。
具体地，所述经基因改造的细胞可以包括编码上述基因的外源性基因(exogenousgene)。术语“外源性(exogenous)”是指将参考分子(referenced molecule)或参考活性(referenced activity)导入宿主细胞中。分子可以被***宿主染色体，例如，作为导入宿主基因物质的编码核酸(encoding nucleic acid)，或作为非染色体基因物质如质粒。关于编码核酸的表达，所述术语“外源性”表示所述编码核酸以可表达的形式导入在个体内。关于生物合成活性，所述术语“外源性”是指导入宿主母细胞的活性。生物合成活性的来源(source)可以是例如同源性(homologous)或异源性(heterologous)编码核酸，其在被导入在宿主母细胞后表达参考活性。因此，术语“内源性(endogenous)”是指在所述宿主细胞中存在的参考分子或活性。类似地，关于编码核酸的表达，术语“内源性”是指包括在个体中的编码核酸的表达。术语“异源性(heterologous)”是指来自不同于所提及物种的来源的分子或活性，而术语“同源性(homologous)”是指来自宿主母细胞的分子或活性。因此，编码核酸的外源性表达可以利用异源性(heterologous)或同源性(homologous)编码核酸中的任何一种或两种。
因此，所述细胞可以包括编码mbIL-18和mbIL-21OX40L的核酸。更具体地，所述细胞可以是由包括编码mbIL-18和mbIL-21的核酸的载体转化的。
在本说明书中使用的“载体”是指能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的载体，其并且是指包括可操作地连接以表达基因***物的调节元素的基因建体。根据一实施例的载体可以包括用于表达的调节元素，例如，启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、加尾信号和/或增强子，并且载体的启动子可以是组成型的或诱导型的。此外，所述载体可以是能够在宿主细胞中稳定表达所述融合蛋白的用于表达的载体。所述用于表达的载体可以是通常在相关领域中用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白的。可以使用本领域已知的各种方法构建所述重组载体。例如，所述载体可以包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择标记，并且在可复制的载体的情况下，其可以包括复制来源。此外，载体可以自我复制或导入宿主DNA，所述载体可以是选自由质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒和牛痘病毒组成的组中。
此外，在所述载体中，编码上述融合蛋白的多核苷酸序列可以与启动子可操作地连接。在本说明书中使用的术语“可操作地连接”是指用于用于核酸表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录因子的结合位点阵列)与另一核酸序列之间的功能结合，从而所述表达调控序列调控所述另一核酸序列的转录和/或翻译。
在本说明书中，“膜结合白细胞介素(membrane bound interleukin)”是指与细胞膜结合的白细胞介素，并且可以具有与细胞外分泌的白细胞介素不同的含义。mbIL-18可与SEQ ID NO：1的核酸序列或其氨基酸序列具有约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性。mbIL-21可与SEQ ID NO：2的核酸序列或其氨基酸序列具有约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性。
另一方面提供一种用于培养NK细胞的组合物，其包括经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbIL-21)的细胞。
所述经基因改造的细胞的具体细节如上所述。
根据一具体实施例的用于培养NK细胞的组合物，其包括经基因改造以表达mbIL-18和mbIL-21的细胞，其可以诱导NK细胞(例如，自然杀伤细胞)的增幅和/或激活，因此可有效用于NK细胞的培养、分离或增殖等。
另一方面提供一种增殖NK细胞的方法，包括收获含有混合的NK细胞(mixedimmune cells)群的血液样品；以及使所述混合的NK细胞群的至少一部分与用于激活NK细胞的经基因改造的细胞接触，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbIL-21)。
在一具体实施例中，使接触的步骤包括共培养与所述经基因改造的细胞混合的NK细胞群以刺激、激活或增幅(expanding)所述NK细胞的亚群(subpopulation)。
在本说明书中使用的术语“NK细胞的刺激”可指在体外或体内增加自然杀伤细胞的活性，例如细胞毒活性，或产生、增加、增幅或增殖激活的自然杀伤细胞。
在一具体实施例中，所述NK细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。因此，在特定具体实施例中，NK细胞可以是选自由巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞(CD8+CTL)、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞组成的组中的任何一种。在特定具体实施例中，NK细胞可以是自然杀伤细胞或T淋巴细胞。所述混合的NK细胞可以包括选自由巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞组成的组的至少一种。
在本说明书中使用的术语“自然杀伤细胞(Natural Killer cells)”或“NK细胞”是指构成先天免疫***主要成分的细胞毒性淋巴细胞，其被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL；large granular lymphocyte)，并构成从由普通淋巴祖细胞(CLP；common lymphoidprogenitor)产生的B和T淋巴细胞分化的第三细胞。所述“自然杀伤细胞”或“NK细胞”包括源自任何组织来源(source)的未经额外修饰的自然杀伤细胞，并且可以包括成熟的自然杀伤细胞以及自然杀伤祖细胞。所述自然杀伤细胞响应干扰素或巨噬细胞衍生的细胞因子而被激活，自然杀伤细胞包括两种类型的表面受体，其控制细胞的细胞毒活性，且标记为“激活受体”和“抑制受体”。自然杀伤细胞可以由任何来源产生，例如来自胎盘组织、胎盘灌注、脐带血、胎盘血、外周血、脾脏、肝脏等的造血细胞，例如来自造血干细胞或前驱体。
在一具体实施例中，所述自然杀伤细胞可以是激活的自然杀伤细胞。所述激活的自然杀伤细胞可以指与母细胞例如造血细胞或自然杀伤祖细胞相比，其中细胞毒性或自然杀伤祖细胞本来的免疫调节能力被激活的细胞。
在一具体实施例中，激活的自然杀伤细胞或富含(enriched)激活的自然杀伤细胞的群可以通过检测至少一种在功能上相关的标志物来评估，例如，CD16、CD57、CD69、CD94、CD161、CD158a、CD158b、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM-1、2B4、NKp46、CD94、KIR(例如，KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR3DL1)和激活受体的NKG2家族(例如，NKG2A、NKG2C、NKG2D)。
在一具体实施例中，所述共培养可以在细胞因子存在下进行。
在本说明书中使用的术语“细胞因子”可以指在细胞信号传递中起作用的蛋白(约5kDa至20kDa)。细胞因子由细胞释放并影响释放细胞因子的细胞和/或其他细胞的行为。细胞因子的非限制性实例包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、单核因子和集落刺激因子。细胞因子可由广泛的细胞产生，包括(但不限于)免疫细胞，例如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞和单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞和***。细胞因子可以由一种或多种类型的细胞产生。细胞因子通过受体起作用，在免疫***中特别重要，调节体液免疫和细胞免疫反应之间的平衡，并调节细胞群的成熟、生长和反应性(responsiveness)。本说明书中的细胞因子可以是天然发生的细胞因子或天然发生的细胞因子的突变形式。在本申请中使用的“天然发生的”也可称为野生型，并且包括对立基因的变种。天然发生的细胞因子的突变形式或“突变”是指源自天然发生的序列以改变细胞因子的功能、活性和/或特异性的特定突变。在一具体实施例中，突变可以增强细胞因子的功能、活性和/或特异性。在另一具体实施例中，突变可以减少细胞因子的功能、活性和/或特异性。突变可包括细胞因子的一个或多个氨基酸残基的缺失或添加。
所述细胞因子可以是选自由骨形成蛋白(BMP；Bone morphogenetic protein-)家族、趋化因子配体(CCL；Cheomkine ligands)家族、CKLF样MARVEL穿膜结构域成员(CMTM；CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member)家族、C-X-C基序配体(CXCL；C-X-C motif ligand ligand)家族、生长/分化因子(GDF；Growth/differentiationfactor)家族、生长激素、干扰素(IFN；Interferon)家族、白细胞介素(IL；Interleukin)家族、肿瘤坏死因子(TNF；Tumor necrosis factors)家族，糖磷脂酰肌醇(GPI；glycophosphatidylinositol)、分泌型Ly-6/uPAR相关蛋白1(SLUPR-1；Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 1)、分泌型Ly-6/uPAR相关蛋白2(SLUPR-2)以及其组合组成的组中的任何一种。
在一具体实施例中，所述细胞因子是白细胞介素或其突变。许多白细胞介素由辅助CD4 T淋巴细胞以及单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。白细胞介素可以促进T和B淋巴细胞和造血细胞的发育和分化。白细胞介素的非限制性例子包括IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8(CXCL8)、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、或IL36。因此，在特定具体实施例中，所述细胞因子可以是包括(但不限于)IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8(CXCL8)、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35或IL36的野生型和突变型的白细胞介素或其突变。
在另一具体实施例中，添加到所述共培养的细胞因子可以是IL-18和IL-21。更具体地，所述共培养可以包括在IL-2和IL-15的存在下进行培养的同时，将IL-18和IL-21添加到培养基中。所述IL-21可以以1ng/ml至20ng/ml、1ng/ml至15ng/ml、1ng/ml至10ng/ml或2ng/ml至8ng/ml的浓度使用。所述IL-18可以以10ng/ml至200ng/ml、10ng/ml至180ng/ml、20ng/ml至160ng/ml、20ng/ml至120ng/ml、20ng/ml至40ng/ml、20ng/ml至80ng/ml、40ng/ml至160ng/ml、40ng/ml至120ng/ml、40ng/ml至80ng/ml、80ng/ml至160ng/ml、或80ng/ml至120ng/ml的浓度使用。在一具体实施例中，通过在共培养时将细胞露出于IL-18和IL-21，NK细胞的增殖可能会更加协同地增加。
在一具体实施例中，所述共培养可以是进行2天至30天。
在一具体实施例中，所述经基因改造的细胞可以是经50Gy至300Gy的放射线处理的。
在一具体实施例中，所述样品可以是来自个体的生物样品，例如，包括人在内的哺乳动物等。此外，所述生物样品可以是从个体中分离的，并可以是血液、全血、血清、血浆、淋巴液、尿液、粪便、组织、细胞、器官、骨髓、唾液、痰液、脑脊液或其组合。另外，所述生物样品可以包括外周血单核细胞(PBMC；peripheral blood mononuclear cell)、纯化的NK细胞或原代静息细胞(primary resting cell)(即直接从血液中分离的)。
另一方面提供一种检查NK细胞的活性程度的方法，包括：收获含有混合的NK细胞群的血液样品；使所述混合的NK细胞群的至少一部分与用于激活NK细胞的经基因改造的细胞接触以激活NK细胞，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane boundinterleukin-21：mbIL-21)；以及分析所激活的NK细胞的激活程度。
另一方面提供一种诊断与NK细胞相关的疾病的方法或提供与诊断有关的信息的方法，包括：收获含有混合的NK细胞群的血液样品；使所述混合的NK细胞群的至少一部分与用于激活NK细胞的经基因改造的细胞接触以激活NK细胞，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbIL-21)；以及分析所激活的NK细胞的激活程度。
在本发明的检查NK细胞的活性程度的方法中，将所述NK细胞的激活与正常NK细胞比较的步骤包括，具体地，当正常NK细胞为对照组在与试验组相同的条件下用所述经基因改造的细胞进行刺激时，判断在正常NK细胞中出现的激活现象在试验组中显着地高、不出现或程度显着地低的情况为异常。通过上述步骤，可以确定与异常NK细胞相关的疾病的病理学的征兆、病毒感染、癌细胞存在和特定癌症，并可预测上述疾病的预后。所述“正常NK细胞”是指没有疾病的个体所拥有或来源于所述个体的NK细胞，并且没有具有所述疾病的个体至少没有已知会影响NK细胞活性的身体上、遗传或外源性条件。
在一具体实施例中，所述方法还可包括从样品中分离所需的NK细胞。根据需要，可以在其他血细胞或淋巴细胞的存在下进行刺激后进行上述步骤，并且可以在进行上述步骤之后进行所述刺激步骤以获得仅包括NK细胞作为淋巴细胞的样品。分离的NK细胞的纯化程度和其样品的组成可以根据试验所需的程度而变化。NK细胞可以根据需要使用从样品中纯化的，也可以在增殖后使用，以确保适合试验的条件或细胞量。
然而，由于特定因子的组合是对NK细胞特异的，当在本发明的方法中使用对所述NK细胞特异的因子的组合时，分离所述NK细胞的步骤可能不是必需的。
在一具体实施例中，所述测量激活程度的步骤包括选自由测量脱粒(degranulation)、细胞毒性(cytotoxicity)活性以及由NK细胞刺激所分泌的细胞因子中的至少一种。
所述脱粒活性可以意味着通过例如分泌穿孔素(perforin)或颗粒酶(granzyme)来诱导靶细胞的裂解，这可以使用荧光激活细胞分选术(FACS；fluorescence-activatedsingle cell sorting)来进行分析。具体地，在刺激从全血样品中分离的外周血单个核细胞(PBMC；peripheral blood mononuclear cell)或纯粹分离的NK细胞后，可以使用一种通过使用荧光染料偶联的抗体测量与脱粒成比例的CD107a表达的方法。
例如，所述细胞毒性活性在与包括能够激活用铕(europium)荧光染料标记的NK细胞的靶细胞的培养物一起培养后，可以使用酶标仪(microplate reader)测量通过靶细胞裂解释放的荧光染料的量。
在一具体实施例中，所述细胞因子可以选自IFN-γ、TNF-α、TNF-β、MIP-1α、MIP-1βPANTES、IL-8和IL-10中。可以使用FACS、细胞内细胞因子染色或酶联免疫吸附剂测定(ELISA；enzyme linked immunosorbent assay)来进行如上所述的NK细胞免疫活性因子的表达分析。具体地，在使用荧光染料偶联的特定抗体对NK细胞表面进行染色后，可以使用通过透化(permeabilization)细胞和用荧光染料偶联的其他特异免疫激活因子(例如，IFN-γ抗体)染色所述细胞因子等来测量NK细胞中免疫活性因子表达的方法。
在一具体实施例中，与所述NK细胞活性相关的疾病显示异常的NK细胞活性程度，例如，可以是过敏性免疫疾病、自身免疫疾病、免疫排斥反应、免疫缺陷疾病、组织细胞增多症、癌症、2型糖尿病、寄生虫感染疾病和病毒性疾病。所述过敏性免疫疾病可以选自哮喘和鼻窦炎中的至少一种，所述自身免疫疾病可以选自狼疮、多发性硬化(multiplesclerosis)、1型糖尿病和类风湿性关节炎中的至少一种，或所述组织细胞增多症可以选自噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH；hemophagocytic lymphohistiocytosis)、X连锁淋巴增生症(XLP；X-linked lymphoproliferative disease)和XLP2中的至少一种。噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)可包括第2组朗格汉斯细胞组织细胞增多症、红细胞性淋巴组织细胞增多症(家族性、偶发性)、感染相关噬血细胞综合征、病毒相关噬血细胞综合征、伴有巨大***病的组织细胞增多症或网状红细胞增多症的含义。所述“癌症”意旨包括肿瘤、血癌或实体癌，并且包括损害个体的NK细胞的协同活性或在特定条件下不引起NK细胞作为靶细胞的协同活性。在一具体实施例中，所述癌症可以选自由肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、小肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、口腔癌、脑瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、***、肉瘤、***癌、尿道癌、膀胱癌、睾丸癌、血癌、淋巴瘤、皮肤癌、牛皮癣和维腺瘤组成的组。在一具体实施例中，所述癌症可以是胰腺癌或B细胞淋巴瘤(B celllymphoma)。在一具体实施例中，所述病毒性疾病可以是乙型肝炎。在一具体实施例中，所述免疫缺陷疾病可以是迪乔治综合症(DiGeorge synderome)或Chediak-Higashi综合征(Chedial-Higashi syndrome)。
与所述NK细胞活性相关的疾病信息可在相比于正常NK细胞的试验组的NK细胞的激活未被检测到时，则可以判断为异常NK细胞，或者在对特定受体失去活性的细胞对靶细胞产生或不产生异常活性时，则可以判断所述靶细胞与特定疾病有关。
另一方面提供一种由所述增殖NK细胞的方法制备的NK细胞。
另一方面提供一种细胞治疗剂，其包括所述免疫细胞或其细胞群作为有效成分。
另一方面提供一种使用所述免疫细胞或其细胞群作为有效成分来预防或治疗癌症或传染性疾病的药物组合物。
另一方面提供一种所述免疫细胞或其细胞群在制备药物中的用途。
另一方面提供一种治疗疾病的方法，其包括将所述免疫细胞或其细胞群施用于个体。
在本说明书中使用的术语“疾病”可以指一个病理状况，特别是癌症、传染性疾病、炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病、退行性疾病、与细胞凋亡有关的疾病和移植物排斥。
在本说明书中使用的术语“治疗”可以指或包括减轻、抑制进展或预防疾病、病症或病态或其一种或多种症状，并且“有效成分”或“药学有效量”是指在本申请中提供的实施发明的过程中所使用的组合物的任何量，其足以减轻、抑制进展或预防疾病、病症或病态或其一种或多种症状。
在本说明书中使用的术语“施用”、“导入”和“植入”可互换使用，并且可以指通过导致根据一具体实施例的组合物至少部分定位到所需部位的方法或途径将根据一具体实施例的组合物放置到个体中。根据一具体实施例的组合物可以通过将细胞或细胞成分的至少一部分递送至个体中的期望位置的任何合适的途径来施用。细胞在施用于个体后的存活期可以短至几个小时，例如从24小时到几天，或长达几年。
在本说明书中使用的术语“分离的细胞”，例如，“分离的免疫细胞”等是指实际上从该细胞起源的组织分离的细胞，例如，造血细胞。
根据以具体实施例的药物组合物的施用方法没有特别限定，根据所期望的方法，可以口服施用或非口服施用，例如静脉内、皮下、腹腔内、吸入或局部应用。施用量根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、***率和疾病的严重程度而具有广泛的范围。一日施用量是指施用于需要治疗的个体的足以减轻疾病症状的根据一方面的用于治疗的物质的量。用于治疗的物质的有效量可以根据特定化合物、疾病的状态和严重程度、需要治疗的对象而变化，并且可以由本领域的普通技术人员确定。作为一个非限制性实例，根据一方面的组合物用于个体的施用量可以根据患者的年龄、体重、性别、施用形式、健康状况和疾病程度而变化。对于体重为70kg的成年患者，例如，可以以1,000细胞/次至10,000细胞/次、1,000细胞/次至约100,000细胞/次、1,000细胞/次至1000,000细胞/次、1,000细胞/次至约10,000,000细胞/次、1,000细胞/次至100,000,000细胞/次、1,000细胞/次至1,000,000,000细胞/次、1,000细胞/次至约10,000,000,000细胞/次，每天以一定的时间间隔分开施用一次至数次，或者可以以一定的时间间隔施用数次。
“个体”是指需要治疗疾病的对象，更具体地，可以指人或非人的灵长类动物、诸如小鼠(mouse)、大鼠(rat)狗、猫、马和牛等的哺乳类动物。
根据一具体实施例的药物组合物可以包括药学上可接受的载体和/或添加剂。例如，所述药物组合物可以包括无菌水、生理盐水、常规缓冲剂(磷酸、柠檬酸、其他有机酸等)、稳定剂、盐、抗氧化剂(抗坏血酸等)、表面活性剂、悬浮剂、等渗剂或防腐剂等。为了局部施用，还可以包括有机物如生物聚合物(biopolymer)等、无机物如羟基磷灰石等，具体而言，还可以包括与胶原基质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化学衍生物等的组合。当根据一具体实施例的药物组合物被制剂成合注射的剂型时，免疫细胞或增加其活性的物质可以溶解在药学上可接受的载体中，或者可以冻结成溶解的溶液的状态。
根据一具体实施例的药物组合物可以根据其施用方法或剂型在需要时适当地包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、镇痛剂、缓冲剂、还原剂和抗氧化剂等。适用于本发明的药学上可接受的载体和制剂包括上述示例，并详细描述于[雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)，第十九版，1995]。根据一具体实施例的药物组合物可以根据本发明所属领域的普通技术人员可以容易地执行的方法，通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂制剂化，从而被制备成单位剂型，或者可以通过将组合物放入多剂量容器中来制备。此时，剂型可以是在油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳剂的形式，或粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。
有益效果
与未经基因改造的细胞相比，根据一方面的经基因改造的细胞可以增加NK细胞的增殖和活性至少2倍至几倍，因此其可以通过增殖NK细胞用作细胞治疗剂。
附图说明
图1a是确认根据一方面的饲养细胞中的mbIL-18和mbIL-21的表达特性的图表。
图1a是显示生成mbIL-18和mbIL-21以制备根据一方面的饲养细胞的慢病毒基因的示意图。
图1b是确认根据一方面的饲养细胞中的mbIL-18和mbIL-21的表达特性的图表。
图2a是显示当根据一方面的饲养细胞和NK细胞在完全RPMI 1640培养基中培养时NK细胞的扩增倍数(Fold expansion)(左)和纯度(右)的图表。
图2b是显示当根据一方面的饲养细胞和NK细胞在DS培养基中培养时NK细胞的扩增倍数(左)和纯度(右)的图表。
图2c是比较当根据一方面的饲养细胞和NK细胞在完全RPMI 1640培养基和DS培养基中培养时NK细胞的扩增倍数(左)和纯度(右)的图表。
图3a和图3b是在RPMI 1640培养基和DS培养基中用根据一方面的饲养细胞(蓝色)和K562饲养细胞(红色)增幅NK细胞后，比较在所增幅的NK细胞中表达的标志物的图表。
图4a是确认通过使用根据一方面的饲养细胞增幅的正常供体(HD)NK细胞的细胞毒性的图表。
图4b是确认通过使用根据一方面的饲养细胞增幅的正常供体(HD)NK细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC；antibody-dependent cell-medicatedcytotoxicity)的图表。
图5a和图5b是测量由根据一方面的饲养细胞刺激的NK细胞的CD107a表达的图表。
图5c和图5d是测量由根据一方面的饲养细胞刺激的NK细胞的靶细胞裂解率的图表。
具体实施方式
在下文中，公开优选的实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本发明，本发明的内容不受以下实施例的限制。
[实施例]
实施例1.制备经基因改造的饲养细胞(Feeder cell)
制备饲养细胞，其表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbIL-18)和膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbIL-21)。
具体地，将人源mbIL18基因(SEQ ID NO：1)和mbIL21基因(SEQ ID NO：2)克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-RFP中，从而制备重组慢病毒生产用载体(图1a)。然后，通过使用lipofectamin3000(Invitrogen)和包装载体将所制备的重组基因(pCDH-CMV-RFP-mbIL-1821)转染到293FT细胞。一段时间后换上新鲜培养基，培养细胞48小时，然后回收含有病毒的培养基。将所回收的培养基以500×g离心10分钟，并使用0.45μm的过滤器仅分离含有病毒的纯培养基，从而生产表达mbIL18-mbIL21的慢病毒。然后，将1ml的表达mbIL18-mbIL21的慢病毒溶解在9ml的包括K562细胞的培养基中，并加入聚凝胺(polybrene)(8μg/ml)，从而进行细胞培养48小时。接着，为了仅选择受感染的细胞，使用高速自动细胞分选仪仅选择表达红色荧光的细胞，并通过荧光激活细胞分类(FACS；fluorescence-activated cellsorting)仪分析有否表达mbIL18-mbIL21，从而生产表达mbIL18-mbIL21的K562细胞株(在下文称为“K562-mbIL18-mbIL21”)。
[试验例]
试验例1.经基因改造的饲养细胞的细胞特性
为了确认根据一方面的经基因改造的饲养细胞的mbIL-18和mbIL-21的表达特性，确认mRNA和表面蛋白的表达水平。
具体地，通过使用RNeasy迷你试剂盒(Mini Kit)(Qiagen，芬洛，荷兰)分离在所述实施例1中制备的K562-mbIL18-mbIL21细胞株和K562饲养细胞株的总RNA，并且使用IMPLEN超微量分光光度计(Nanophotometer)P330(IMPLEN，慕尼黑，德国)进行量化。之后，使用QuantiTect反转录试剂盒(Reverse Transcription Kit)(Qiagen)将分离的RNA转换为cDNA，然后使用QuantiTect SYBR绿PCR试剂盒(Qiagen)和Rotor-Gene Q(Qiagen)在标准20μl的反应体积中进行聚合酶链式反应(PCR；Polymerase Chain Reaction)。在此，使用下表1中的引物，并且所有试验重复实施3次。
【表1】
Figure BDA0003905632400000151
图1b是确认根据一方面的饲养细胞中的mbIL-18和mbIL-21的表达特性的图表。
结果，如图1b所示，在实施例1的饲养细胞中检测到mbIL-18和mbIL-21mRNA，但在K562饲养细胞中检测不到mbIL-18和mbIL-21mRNA。即，可以看出，根据一具体实施例的经基因改造的饲养细胞具有mbIL-18和mbIL-21的表达特性。
试验例2.通过K562-mbIL18-mbIL21细胞的NK细胞激活和增幅
确认根据一方面的经基因改造的饲养细胞的培养基的NK细胞激活和增幅。
2-1.完全RPMI 1640培养基
具体地，在提供有5％CO2的培养基中，将在所述实施例1中制备的K562-mbIL18-mbIL21细胞株在T-75烧瓶中进行培养，所述烧瓶为37℃且装有25ml的完全RPMI1640培养基。此后，在400×g条件下离心3分钟，并将细胞沉淀物重悬于5ml的完全RPMI 1640培养基中以收获饲养细胞(feeder cell)。之后，为了防止所述饲养细胞过度生长，使用Gammacell3000Elan辐射器以100Gy的伽马射线照射所述饲养细胞并用于后续试验。
为了分离外周血单核细胞(PBMCs；peripheral blood mononuclear cells)，将正常供体的全血和PBS以1：2比率(10ml的全血：20ml的PBS)稀释，并覆盖在15ml的人淋巴细胞分离液(Lymphoprep)上。接着，在室温下以1200×g的条件下无刹车离心25分钟(加速1，减速0)，并从棕黄层(buffy coat layer)收获细胞，且在400×g下离心7分钟的同时，用PBS洗涤3次。将3×106个的所分离的外周血单核细胞和0.5×106个经100Gy-照射的K562-mbIL18-mbIL21接种到包括1ml的NK细胞培养基的24孔板上，然后加入含有20U/ml的IL-2的1ml的NK细胞培养基，使培养基总体积为2ml/孔且IL-2的终浓度为10U/ml，然后轻轻吸取(pipetting)且混合后，在37℃下且5％的CO2培养基中进行培养。培养第7天，向培养基中加入100U/ml的IL-2和5ng/ml的IL-15，并在每2天至3天更换一次新培养基的同时，进行培养14天。作为对照组，使用K562细胞。
NK细胞的增幅通过使用异硫氰基荧光素(FITC；Fluorescein isothiocyanate)-偶联的小鼠抗人CD3和PE-Cy5-偶联的小鼠抗人CD56单克隆抗体进行确认，并且当用K562细胞和IL-2/IL-15处理时，以NK细胞的纯度作为基线(baseline)确认每个扩增倍数(Foldexpansion)。
图2a是显示当根据一方面的饲养细胞和NK细胞在完全RPMI 1640培养基中培养时NK细胞的扩增倍数(左)和纯度(右)的图表。
结果，如图2a所示，可以确认出，在K562饲养细胞的情况下，NK细胞增加直到培养后第35天，在那之后没有发生进一步的增幅。相反，可以确认出，在实施例1的饲养细胞的情况下，直至第42天，NK细胞的扩增倍数呈增加模式。此外，可以确认出，使用实施例1的饲养细胞培养的NK细胞的纯度显着高于使用K562饲养细胞培养的NK细胞的纯度。即，根据一方面的饲养细胞不仅显着增加NK细胞的活性，而且允许NK细胞的长期培养，使得NK细胞可以大量增殖并用作细胞治疗剂。
2-2.DS(DMEM+补充)培养基
除了使用由Miller集团发表的DS培养基(血液学治疗杂志(JOURNAL OFHEMATOTHERAPY)4:149-158(1995))之外，其中在DMEM培养基中补充有葡萄糖4.5g/L和谷氨酰胺584mg/L，以与所述试验例2-1相同的方法进行。
图2b是显示当根据一方面的饲养细胞和NK细胞在DS培养基中培养时NK细胞的扩增倍数(左)和纯度(右)的图表。
结果，如图2b所示，可以确认出，实施例1的饲养细胞和比较例1的细胞都增加了NK细胞的扩增倍数，直至第42天。然而，可以确认出，与比较例1的细胞相比，在实施例1的饲养细胞中，NK细胞的扩增倍数显着增加了约2倍至6倍或更多。此外，可以确认出，使用实施例1的饲养细胞培养的NK细胞的纯度显着高于使用K562饲养细胞培养的NK细胞的纯度。
基于上述结果，比较了RPMI 1640培养基和DS培养基中的NK增幅效率。
图2c是比较当根据一方面的饲养细胞和NK细胞在完全RPMI 1640培养基和DS培养基中培养时NK细胞的扩增倍数(左)和纯度(右)的图表。
结果，如图2c所示，可以确认出，不管培养基的种类如何，实施例1的细胞与K562饲养细胞相比具有增加的扩增倍数和NK细胞纯度。然而，可以确认出，当比较在不同培养基中培养的相同细胞时，与完全RPMI 1640培养基相比，实施例1的细胞在DS培养基中具有显着更高的NK细胞扩增倍数。即，根据一方面的饲养细胞可以根据培养基的种类选择性地增幅NK细胞，因此可以具有培养基选择特征。
试验例3.通过K562-mbIL18-mbIL2细胞增幅的NK细胞的表型特性
确认了由K562-mbIL18-mbIL2细胞在RPMI 1640培养基和DS培养基中增幅的NK细胞的表型特性。
具体地，为了分离外周血单核细胞(PBMCs)，将正常供体的全血和PBS以1：2比率(10ml的全血：20ml的PBS)稀释，并覆盖在15ml的人淋巴细胞分离液(Lymphoprep)上。接着，在室温下以1200×g的条件下无刹车离心25分钟(加速1，减速0)，并从棕黄层(buffy coatlayer)收获细胞，且在400×g下离心7分钟的同时，用PBS洗涤3次。此后，用FACS缓冲液(含1％FBS的PBS)洗涤2×105个增幅的来自正常供体的NK细胞，然后用别藻蓝蛋白(APC；Allophycocyanin)-花氰染料7(Cyanine7)偶联的小鼠抗人CD3和PE-Cyanine7偶联的抗人CD56膜抗体处理15分钟。然后，收获细胞，并分别用不同的荧光偶联的抗人CD16、CD67、CD69、NK2G2A、NK2G2C、NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2/3和KIR3DL1膜抗体进一步染色30分钟。之后，用FACS缓冲液洗涤所述细胞，然后使用FACS Calibur获取数据，并用Kaluza分析。
图3a和图3b是在RPMI 1640培养基和DS培养基中用根据一方面的饲养细胞(蓝色)和K562饲养细胞(红色)增幅NK细胞后，比较在所增幅的NK细胞中表达的标志物的图表。
结果，如图3a和图3b所示，可以确认出，在使用根据一方面的饲养细胞增幅的NK细胞中表达表面标志物如CD16、CD67、CD69、NK2G2A、NK2G2C、NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2/3和KIR3DL1。
即，可以看出通过根据一方面的饲养细胞增幅的NK细胞具有NK细胞的完整功能特性。
试验例4.确认通过K562-mbIL18-mbIL2细胞增幅的NK细胞的细胞毒性
为了确认由根据一方面的饲养细胞增幅的NK细胞作为抗体治疗剂的效能，在第14天，NK细胞对靶细胞的细胞毒性通过基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；carboxyfluorescein succinimidyl ester)的分析法测量4小时。
具体而言，向FACS缓冲液加入靶细胞后，用0.5μM的CFSE在37℃下染色10分钟，并用完全培养基(RPMI或DS)洗涤两次。然后，将5×104个靶细胞三重置于96孔圆底板中，并与所述试验例3的来自正常供体(HD)的NK细胞混合至0.5：1、1：1和2：1的效能细胞对目标细胞(E:T；effector-to-target)的比率。将板以1,500rpm离心3分钟，然后在37℃下在5％CO2的培养基中培养4小时。此后，然后将混合的细胞转移到FACS管中，并将1μl的1mg/mL的碘化丙啶(PI；propidium iodide)(SigmaAldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)添加到每个管中。然后通过使用FACS Calibur收获细胞并使用Kaluza软件进行分析。在减去自发死亡的靶细胞的百分比后，计算死亡的靶细胞之百分比(CFSF阳性和PI阳性)。
图4a是确认通过使用根据一方面的饲养细胞增幅的正常供体(HD)NK细胞的细胞毒性的图表。
图4b是确认通过使用根据一方面的饲养细胞增幅的正常供体(HD)NK细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC；antibody-dependent cell-medicatedcytotoxicity)的图表。
结果，如图4a所示，可以确认出，使用实施例1的饲养细胞增幅的NK细胞表现出与使用K562饲养细胞增幅的NK细胞相同的细胞毒性。此外，可以确认出，在DS培养基中培养的NK细胞的细胞毒性表现出与在RPMI培养基中培养的NK细胞相同的细胞毒性。并且，如图4b所示，可以确认出，使用实施例1的饲养细胞增幅的NK细胞对结合于利妥昔单抗的Raji细胞表现出与使用K562饲养细胞增幅的NK细胞相似的ADCC活性。另外，可以确认出，在DS培养基中培养的NK细胞的ADCC表现出与在RPMI培养基中培养的NK细胞相似的ADCC活性。换言之，通过根据一方面的饲养细胞增幅的NK细胞表现出细胞毒性，因此可以用作抗体治疗剂。
试验例5.确认通过K562-mbIL18-mbIL2细胞刺激的NK细胞的活性程度
5-1.通过CD107a表达的脱粒活性确认
为了确认由根据一方面的经基因改造的饲养细胞刺激的NK细胞在全血中的细胞活性程度，测量了与脱粒成比例的NK细胞表面上的CD107a表达程度。具体地，将所述试验例3的正常供体(HD)全血100μl、2×105个K562饲养细胞或在实施例1中制备的K562-mbIL18-mbIL21饲养细胞株、以及PE偶联的抗人CD107a在FACS管中进行培养。1小时后，加入莫能菌素(Monensin)和布雷非德菌素A(brefeldin A)(BD生物科学)，并进一步培养4小时。然后，通过用抗人CD3和CD56抗体染色并获得NK细胞，且测量CD107a表达。
图5a和图5b是测量由根据一方面的饲养细胞刺激的NK细胞的CD107a表达的图表。
结果，如图5a所示，可以确认出，在由实施例1的饲养细胞刺激的NK细胞中，CD107a的表达以依赖于IL-2浓度的方式增加。具体地，如图5b所示，可以确认出，与由K562饲养细胞刺激的NK细胞相比，由实施例1的饲养细胞刺激的NK细胞在相同的IL-2浓度下具有显着高的CD107a表达。
换言之，与使用K562饲养细胞相比，使用根据一方面的饲养细胞的NK细胞活性可以更有用地用作诊断NK细胞活性程度的方法。
5-2.通过细胞裂解(cell lysis)的细胞毒性确认
为了确认由根据一方面的经基因改造的饲养细胞刺激的NK细胞在全血中的细胞活性程度，通过基于CFSE的分析测量靶细胞的细胞毒性16小时至20小时。具体地，将靶细胞(K562饲养细胞或实施例1的饲养细胞)添加到FACS缓冲液后，在37℃下用0.5μM的CFSE染色10分钟，并用完全培养基(RPMI或DS)洗涤两次。之后，将5×104个靶细胞三重置于FACS管中，并将添加有IL-2的完全培养基和所述正常供体(HD)全血以200ul、100ul和50ul的体积比率混合。FACS管在37℃下在5％CO2培养基中培养16小时至20小时。此后，然后将混合的细胞转移到FACS管中，并将1μl的1mg/mL的碘化丙啶(PI；propidium iodide)(SigmaAldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)添加到每个管中。然后通过使用FACS Calibur收获细胞并使用Kaluza软件进行分析。在减去自发死亡的靶细胞的百分比后，计算死亡的靶细胞之百分比(CFSF阳性和PI阳性)。
图5c和图5d是测量由根据一方面的饲养细胞刺激的NK细胞的靶细胞裂解率的图表。
结果，如图5c所示，可以确认出，在由实施例1的饲养细胞刺激的NK细胞中，靶细胞裂解率以依赖于IL-2浓度的方式增加。具体地，如图5d所示，可以确认出，与由K562饲养细胞刺激的NK细胞相比，由实施例1的饲养细胞刺激的NK细胞在相同的IL-2浓度下具有显着高的靶细胞裂解率。
换言之，与使用K562饲养细胞相比，使用根据一方面的饲养细胞的NK细胞激活可以更有用地用作诊断NK细胞活性程度的方法。
以上对本发明的描述是为了举例说明，本发明所属领域的普通技术人员可以理解，在不改变本发明的技术思想或本质特征的情况下，可以很容易地将其修改为其他具体形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。
<110> 社会福祉法人 三星生命公益财团(Samsung Life Public WelfareFoundation) 首尔大学校 产学协力团(SNU R&DB Foundation)
<120> 用于激活和增幅的经基因改造的细胞系(Genetically engineered cell linefor activating and expanding)
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<151> 2021-04-08
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mbIL18
<400> 1
tactttggca agcttgaatc taaattatca gtcataagaa atttgaatga ccaagttctc 60
ttcattgacc aaggaaatcg gcctctattt gaagatatga ctgattctga ctgtagagat 120
aatgcacccc ggaccatatt tattataagt atgtataaag atagccagcc tagaggtatg 180
gctgtaacta tctctgtgaa gtgtgagaaa atttcaactc tctcctgtga gaacaaaatt 240
atttccttta aggaaatgaa tcctcctgat aacatcaagg atacaaaaag tgacatcata 300
ttctttcaga gaagtgtccc aggacatgat aataagatgc aatttgaatc ttcatcatac 360
gaaggatact ttctagcttg tgaaaaagag agagaccttt ttaaactcat tttgaaaaaa 420
gaggatgaat tgggggatag atctataatg ttcactgttc aaaacgaaga c 471
<210> 2
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mbIL21
<400> 2
caaggtcaag atcgccacat gattagaatg cgtcaactta tagatattgt tgatcagctg 60
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cagcatctgt cctctagaac acacggaagt gaagattcc 399

Claims (15)

1.一种饲养细胞，其用于培养NK细胞，其经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18和膜结合白细胞介素-21。
2.根据权利要求1所述的饲养细胞，其中，所述饲养细胞选自由K562、RPMI8866、EBV_LCL、721.221、HFWT以及NK-92细胞组成的组中。
3.根据权利要求1所述的饲养细胞，其包括膜结合白细胞介素-21和编码膜结合白细胞介素-21的核酸。
4.一种用于培养NK细胞的组合物，其包括根据权利要求1至3中任一项所述的饲养细胞。
5.一种增殖NK细胞的方法，包括：
收获含有NK细胞群的血液样品；以及
使所述NK细胞群的至少一部分与用于激活NK细胞的经基因改造的细胞接触，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18和膜结合白细胞介素-21。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述接触的步骤包括共培养所述经基因改造的细胞和NK细胞群以增幅NK细胞亚群。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述共培养在细胞因子存在下进行。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞因子选自由IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8即CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、和IL36组成的组的至少一种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述细胞因子为IL-18和IL-21。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述共培养进行2天至30天。
11.根据权利要求5所述的方法，其中，所述血液样品是全血样品。
12.根据权利要求5所述的方法，其中，所述经基因改造的细胞经50Gy至300Gy的放射线处理。
13.一种检查NK细胞的活性的方法，包括：
收获含有NK细胞群的血液样品；
使所述NK细胞群的至少一部分与用于激活NK细胞的经基因改造的细胞接触以激活NK细胞，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18和膜结合白细胞介素-21；以及
分析所激活的NK细胞的激活程度。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述血液样品是全血样品。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，分析NK细胞的激活程度包括选自测量脱粒活性、细胞毒性活性以及由NK细胞刺激分泌的细胞因子中的至少一种。
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