CN115461119A - 用于生产乳样产物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于生产哺乳动物乳样产物如人乳样产物的方法，该方法包括：生成源自哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)例如人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，以及从乳腺细胞中表达哺乳动物乳样产物，例如，人乳样产物。

Description

用于生产乳样产物的方法
技术领域
本发明涉及一种用于体外生产哺乳动物乳样产物的方法，例如，生产人乳样产物的方法，该方法包括：通过培养和分化，和/或包括乳腺细胞的乳腺样腺体类器官，生成源自哺乳动物诱导多能干细胞(hiPSC)例如人诱导多能干细胞(hiPSC)的此类乳腺细胞，以及从此类乳腺细胞和/或乳腺样腺体类器官中表达哺乳动物乳样产物，例如，人乳样产物。本发明还涉及能够由此类方法获得的哺乳动物乳样产物，例如，人乳样产物。
背景技术
哺乳动物的尤其是人类的乳汁是具有多种组分的复杂流体，每种组分可充分地有助于婴儿和甚至母体的健康。越来越多证据表明人母乳在至少前6个月中是最合适的营养来源。人乳中许多组分在牛奶中要么完全缺乏，要么含量很低，要么不太活跃，而这些组分是生产婴儿配方食品的基础。其包括，例如，乳铁蛋白、生长因子、长链多价不饱和脂肪酸或低聚糖。虽然最近在婴儿配方食品组分方面有了重大发展，人乳组分当前一直被用作开发婴儿配方食品的黄金标准，要想实现人造母乳在当前制造工艺下是根本无法实现的。
目前，人乳的唯一来源是人类供体(进行母乳喂养的母亲)。用于非商业用途(人乳库(human milk biobank))和商业用途的捐赠均有报道。然而，母乳捐赠是有限的，并且受到监管和安全方面的严格管控，有时还受到来自伦理或宗教的约束。
在哺乳动物的尤其是人乳中发现的干细胞称为母乳干细胞(hBSC)。hBSC表现出高度适于人造并可在培养中分化为多种类型细胞的特点，更重要地是，hBSC可分化为形成人类乳腺腺体的小叶肺泡结构所需的三种细胞系(Hassiotou F.等人，Stem Cells，2012)。然而，使用hBSC生产人母乳既不现实也不可持续，因为它需要人类供体。
目前已知一种具有干细胞功能的细胞系，这项技术被称为诱导多能干细胞(iPSC)。目前已提出一种可靠的用以由人类iPSC(hiPSC)生成人乳腺样类器官的两步方案(Ying Qu等人，Stem Cell Report，第8卷，205-215，2017年2月14日)。
相应地，本发明的目的在于在培养的细胞中再现哺乳动物乳例如人乳的表达。本发明的目的还在于在培养的细胞中制备针对客户定制的哺乳动物乳样产物，例如人乳样产物，培养的细胞可适应于受体的特定需求和/或生成人乳生物活性物质，以补充基于牛奶的现有婴儿营养解决方案。
发明内容
本发明解决了上述技术问题。
在一个方面，本发明提供了一种用于生产可食用的哺乳动物乳样产物的方法，该方法包括：
A')生成源自哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)的乳腺细胞；
B')从源自哺乳动物诱导多能干细胞的此类乳腺样腺体类器官中表达该哺乳动物乳样产物。
另一方面，本发明提供了一种能够通过以下方法获得的哺乳动物乳样产物，该方法包括：
A')生成源自哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)的乳腺细胞；
B')从源自哺乳动物诱导多能干细胞的此类乳腺细胞中表达该哺乳动物乳样产物。
另一方面，本发明提供了一种能够通过以下方法获得的哺乳动物乳样产物，该方法包括：
A')生成源自哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)的乳腺细胞；
B')从源自哺乳动物诱导多能干细胞的此类乳腺细胞中表达该哺乳动物乳样产物；其用于治疗。
另一方面，本发明提供了能够通过以下方法获得的哺乳动物乳样产物的用用途，该方法包括：
A')生成源自哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)的乳腺细胞；
B')从源自哺乳动物诱导多能干细胞的此类乳腺细胞中表达该哺乳动物乳样产物；其用作对受试者有需要的治疗剂。
在一个方面，本发明提供了一种用于生产可食用的人乳样产物的方法，该方法包括：
A)生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞；
B)从源自人诱导多能干细胞的此类乳腺样腺体类器官中表达该人乳样产物。
另一方面，本发明提供了一种能够通过以下方法获得的人乳样产物，该方法包括：
A)生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞；
B)从源自人诱导多能干细胞的此类乳腺细胞中表达该人乳样产物。
另一方面，本发明提供了一种能够通过以下方法获得的人乳样产物，该方法包括：
A)生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞；
B)从源自人诱导多能干细胞的此类乳腺细胞中表达该人乳样产物；其用于治疗。
另一方面，本发明提供了一种使用能够通过以下方法获得的人乳样产物的用途，该方法包括：
A)生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞；
B)从源自人诱导多能干细胞的此类乳腺细胞中表达该人乳样产物；其用作对受试者有需要的治疗剂。
具体实施方式
定义
在本发明的上下文中，术语“体外”指在试管、培养皿、生物反应器或生物体外其他地方进行或发生。
在本发明的上下文中，术语“哺乳动物”指属于哺乳类动物物种的动物，例如，人、牛、猴、骆驼、绵羊和山羊等。
在本发明的上下文中，术语“乳腺细胞”或“乳腺样细胞”指表达CK18细胞标记物并源自哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)尤其是人诱导多能干细胞(hiPSC)的分泌型上皮细胞。如本文所用，人诱导多能干细胞(hiPSC)是可商购获得的并可选自任何合适的hiPSC细胞系。在本发明的上下文中，合适的人诱导多能干细胞系为，例如，hiPSC细胞系603，如根据本发明所用，其可从Fujifilm Cellular Dynamics公司(FCDI)商购获得。也可如Ying Qu等人(2017年，同上)所述选择另外的合适的hiPSC。在本发明的一个实施方案中，hiPSC未经工程化。在一个实施方案中，其未经工程化为包括外源核酸和/或包括外源核酸的诱导型基因表达***，其中，该诱导型基因表达***被配置成表达激素或信号传导因子。在一个实施方案中，外源核酸和/或包括外源核酸的诱导型基因表达***促进细胞分化为乳腺细胞。
在本发明的上下文中，术语“乳腺样腺体类器官”或“乳腺样类器官”指小型和简化的乳腺腺体，其以二维或三维(2D/3D)生长并包含如上文所定义的乳腺细胞。
在本发明的上下文中，术语“人乳样产物”和/或“人母乳样产物”指由根据本发明的方法产生的乳腺细胞和/或乳腺样腺体类器官表达的可食用产物。根据本发明，“人乳样产物”是如下所定义的“标准人乳样产物”或“非标准人乳样产物”。人乳样产物的非限制性示例选自：补充剂、强化剂、人母乳替代物(或代用品)和仅富含一种和/或一部分通常可在营养良好的母亲的母乳中发现的生物活性物质和常量及微量营养物质的成分。
在本发明的一个实施方案中，人乳样产物的组分与营养良好的母亲的母乳的组分(例如，就生物活性物质和常量及微量营养物质及其含量而言)类似。在此类实施方案中，人乳样产物也可以称为“标准人乳样产物”和/或“人母乳代用品”或“人母乳替代物”。在此类实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物至少包括通常可在营养良好的母亲的母乳中发现的常量和微量营养物质。在一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物包含：蛋白质、肽、脂质(包括亚油酸和α-亚麻酸)、碳水化合物、维生素(包括维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、叶酸、维生素C和生物素)、矿物质(包括铁、钙、磷、镁、钠、氯化物、钾、锰、碘、硒、铜和锌)、胆碱、肌醇和左旋肉碱。在一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物还包含选自以下的至少一种生物活性物质：生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如乳脂球和/或外泌体)和来自外泌体的生物活性物质(例如miRNA)和分泌型IgA。在一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物不是天然形成的人类***分泌的产物。
在另一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物可适应于将接收该产物的婴儿的特定需求。该产物可以仅包括一种和/或一部分通常可在营养良好的母亲的母乳中发现的生物活性物质和常量及微量营养物质。在此类实施方案中，人母乳样产物也可称为术语“非标准人乳样产物”。在一个实施方案中，根据本发明的非标准人乳样产物包含选自以下的营养物质或生物活性物质中的一种或多种：蛋白质、肽、脂质(包括亚油酸和α-亚麻酸)、碳水化合物(包括人乳低聚糖)、维生素(包括维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、叶酸、维生素C和生物素)、矿物质(包括铁、钙、磷、镁、钠、氯化物、钾、锰、碘、硒、铜和锌)、胆碱、肌醇、左旋肉碱、生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如乳脂球和/或外泌体)、来自外泌体的生物活性物质(例如miRNA)和分泌型IgA。
在本发明的上下文中，术语“未修饰的人乳样产物”指经过根据本发明的方法的步骤A)和B)生成的乳腺细胞和/或乳腺样腺体类器官表达的但未受根据本发明的方法的任选步骤C)的进一步处理的人乳样产物。未修饰的人乳样产物可以包括标准人乳样产物和非标准人乳样产物。非标准人乳样产物的非限制性示例选自：补充剂、强化剂和仅富含一种和/或一部分通常可在营养良好的母亲的母乳中发现的生物活性物质和常量及微量营养物质的成分。
在本发明的上下文中，术语“修饰的人乳样产物”指经过根据本发明的方法的步骤A)和B)生成的乳腺细胞和/或乳腺样腺体类器官表达的并经受根据本发明的方法的任选步骤C)的进一步处理的人乳样产物。
修饰的人乳样产物可以包括标准人乳样产物和非标准人乳样产物。
在本发明的上下文中，术语“EB”指类胚体。
在本发明的上下文中，术语“mEB”指“MammoCult培养基培养的类胚体”。
在本发明的上下文中，术语“类胚体(EB)”、“MammoCult培养基培养的类胚体(mEB)”、“乳腺球”和/或“球体”指由多能干细胞(PSC)在本发明的方法的步骤A)中悬浮形成的三维聚集体。
在本发明的上下文中，术语“婴儿”指年龄在12个月以下的儿童，如年龄在9个月以下的儿童，尤其是年龄在6个月以下的儿童。
在本发明的上下文中，婴儿可为任何足月婴儿或早产婴儿。在本发明的一个实施方案中，该婴儿选自早产婴儿和足月婴儿。
术语“足月婴儿”指以足月或37周龄或更大的胎龄出生的婴儿。
术语“早产婴儿”指以小于37周的胎龄出生的婴儿。
在本发明的上下文中，术语“出生体重”指出生后获得的胎儿或新生儿的首个体重。
在本发明的上下文中，术语“低出生体重”指小于2500g(最重至并包括2499g)的出生体重。
在本发明的上下文中，术语“非常低出生体重”指小于1500g(最重至并包括1499g)的出生体重。
在本发明的上下文中，术语“极低出生体重”指小于1000g(最重至并包括999g)的出生体重。
术语“小于胎龄婴儿”指出生体重低于妊娠期增长图表中出生体重参考平均值超过2个标准差的婴儿，或是出生体重低于从同一胎龄婴儿获得的人群体重数据的第10百分位的婴儿。术语“小于胎龄婴儿”包括由于组成型起因或遗传起因或者因宫内生长受限而造成出生时个头偏小的婴儿。
在本发明的上下文中，术语“幼儿”或“学步儿童”指年龄在1岁和3岁之间的儿童。
如本文所用，术语“婴儿配方食品”指旨在用于婴儿的营养组合物，并且如CodexAlimentarius,(Codex STAN 72-1981)中所定义以及Codex Alimentarius,(Codex STAN72-1981)中定义的婴儿特制品(包括特殊医疗用途食品)。该术语也指用于为出生后头几个月内的婴儿提供特定营养的食料，其本身即可满足这类人群的营养需求(符合2006年12月22日颁布的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的欧盟委员会指令91/321/EEC2006/141/EC中第2(c)条的规定)。婴儿配方食品涵盖1段婴儿配方食品和2段婴儿配方食品或者较大婴儿配方食品。通常，1段婴儿配方食品从婴儿出生起作为母乳替代物，而2段婴儿配方食品或者较大婴儿配方食品从婴儿第6个月起作为母乳替代物。
“成长乳”(或GUM)从一岁开始提供。它通常为适合幼儿的特定营养需要的含乳饮料。这些是用于与其他食物结合喂食给12个月至2到3岁儿童的营养组合物。
在本发明的上下文中，术语“强化剂”是指包含一种或多种对婴儿或幼儿具有营养有益效果的营养物质的组合物。
所谓术语“乳强化剂”指用于强化或补充人母乳、婴儿配方食品、成长乳或经其他营养物质强化的人母乳的任何组合物。因此，本发明的人乳强化剂可在溶解于人母乳、婴儿配方食品、成长乳或用其它营养物质强化的人母乳中后施用，或者它可以作为独立组合物施用。
当作为独立组合物施用时，本发明的人乳强化剂也可被鉴定为“补充剂”。在一个实施方案中，本发明的乳强化剂是补充剂。
术语“人乳强化剂”指用于强化或补充人母乳或经其它营养物质强化的人母乳的任何组合物。根据本发明的“人乳强化剂”可旨在施用于早产、具有非常低出生体重(VLBW)或具有极低出生体重(ELBW)的婴儿。
根据本发明的乳强化剂可为粉末或液体形式。
液体形式的乳强化剂组合物具有一些特定有益效果。例如，如果要与递送一定重量或体积的校准液滴的包装相连接，那么液体配制物可能更为方便。
此外，液体配制物更易与待强化的组合物混合，而粉末配制物在一些情况下可能结块。
根据本发明的方法
如本文所定义的根据本发明的方法包括如本文所定义的步骤A)和B)中的任一步骤和如本文所定义的任选步骤C)。
步骤A—生成来自hiPSC的乳腺细胞和/或乳腺样类器官
根据本发明的方法，在步骤A)中生成乳腺样细胞和/或类器官结构。
可根据任何已公布的利用iPSC的方法来生成此类乳腺样细胞和/或类器官结构。
在一个实施方案中，此类乳腺样细胞和/或类器官结构可根据Ying Qu等人在StemCell Reports第8卷第205至215页(其全文据此引入)所描述的过程生成。
更精确地说，上文提到的科技出版物(本文以下也称其为“Ying Qu出版物”或YingQu等人(2017年))中描述的方法表示一种两步方案，用以由iPSC生成人乳腺样细胞和/或类器官。
该方案优选地包括第一步骤(步骤1)：分化和富集来自iPSC的含非神经外胚层细胞的球体(mEB/乳腺球)，和第二步骤(步骤2)：生成来自使用基质凝胶和I型胶原蛋白的混合3D漂浮凝胶培养物培养10天形成的mEB(乳腺球)的乳腺样类器官。
在步骤1中，通过在完全MammoCult培养基(StemCell Technologies)中培养hiPSC，分化和富集来自hiPSC的含非神经外胚层细胞的球体(mEB/乳腺球)。优选地，完全MammoCult培养基由基础培养基、增殖补充剂、肝素(通常4μg/mL)和氢化可的松(通常0.48μg/mL)构成。通常每三天更换培养基。然后，上述步骤中获得的mEB(乳腺球)为非神经外胚层细胞进行富集。
在步骤2中，按照Ying Qu等人(2017年)的方案，通过首先制备基于混合漂浮凝胶(例如基质凝胶和I型胶原蛋白)的3D培养物生成乳腺样类器官。然后，10天形成的mEB(乳腺球)在补充有甲状旁腺激素(pTHrP)的完全EpiCultB培养基中漂浮的混合凝胶中生长5天。然后，针对诱导分支和肺泡分化以制备乳腺样类器官/乳腺细胞，在补充有氢化可的松、胰岛素、FGF10和HGF的完全EpiCultB培养基中培养细胞。通过向补充有BSA(催乳培养基)的完全EpiCultB培养基中添加催乳素、氢化可的松和胰岛素并且培养5天，乳蛋白质通常在第35天诱导表达。Ying Qu等人(2017年)所描述的过程通常在第40天完成。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，其中此类步骤A)包括：
i)通过在合适的培养基(例如，MammoCult培养基)中培养iPSC，引导iPSC分化为非神经外胚层细胞，并于10天后收集所形成的乳腺球；以及
ii)在合适的***(例如，如Hastiotou F.等人2012年在Stem Cells中所描述的混合漂浮凝胶培养***)使此类乳腺球生长至少10天，以生成乳腺细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种用于生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，其中此类步骤A)包括：
i)通过在合适的培养基(例如，MammoCult培养基)中在非贴壁的乳腺球形成条件下培养iPSC，引导iPSC分化为非神经外胚层细胞；以及
ii)在合适的3D***中(例如，由基质蛋白如基质凝胶和/或胶原蛋白构成的混合漂浮凝胶，或非贴壁培养皿中的悬浮式培养物中)中使此类乳腺球生长至少10天，以生成乳腺细胞。
在一个实施方案中，通过应用经过补充特定因子(例如，甲状旁腺激素(pTHrP)、氢化可的松、胰岛素、FGF10和HGF)而进行调理的培养基(例如，EpiCultB)，获得步骤A)中的乳腺定型。
在本发明的一个实施方案中，方法包括：在步骤A)中生成乳腺样类器官。
在本发明的一个实施方案中，该在步骤A)中生成乳腺样类器官的方法包括：在选自以下的条件下培养上述细胞：2D单层细胞，2D而具有粘附的EB，在非贴壁培养皿中悬浮和在混合漂浮凝胶中。
在优选的实施方案中，混合漂浮凝胶包括基质凝胶和I型胶原蛋白。
在另一个优选的实施方案中，步骤A)中的乳腺球(mEB)在合适的***(例如，如Hastiotou F.等人2012年在Stem Cells中所描述的混合漂浮凝胶培养***)中生长至少15天。
在更优选的实施方案中，步骤A)中的乳腺球(mEB)在合适的***(例如，如Hastiotou F.等人2012年在Stem Cells中所描述的混合漂浮凝胶培养***)中生长20天。
在一个实施方案中，根据本发明的方法提供根据步骤A)[例如，在步骤A)i)和/或步骤A)ii)中]的培养条件，该培养条件适应于生成源自能够分泌标准人乳样产物的人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞。
在一个实施方案中，根据本发明的方法提供根据步骤A)[例如，在步骤A)i)和/或步骤A)ii)中]的培养条件，该培养条件适应于生成源自能够分泌非标准人乳样产物的人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞。
在一个优选的实施方案中，提供了一种用于生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，其中此类步骤A)包括：在合适的3D培养***中(例如，3D悬浮条件下)引导hiPSC分化为乳腺腺体细胞(例如，乳腺细胞)持续至少42天。
在另一个优选的实施方案中，提供了一种用于生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，其中此类步骤A)包括：
i)通过在合适的3D培养***中(例如，3D悬浮条件下)在合适的培养基(例如，MammoCult培养基)中培养hiPSC至少12天(第-2天到第10天)，引导hiPSC分化为非神经外胚层细胞；以及
ii)在合适的3D包埋***中(例如，在由基质蛋白诸如基质凝胶和/或I型胶原蛋白构成的混合漂浮凝胶)中使所形成的mEB(乳腺球)生长至少30天，优选32天，以生成乳腺细胞。
在本发明的特别优选的实施方案中，提供了一种生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，其中步骤A)i)定义如下：
i)通过在标准iPSC培养基E8(包括如Chen等人2011年在Nat Methods中所描述的DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁、***钠、FGF2、胰岛素、NaHCO3和转铁蛋白、TGFβ1或NODAL)或mTeSRTM中孵育hiPSC持续2天(第-2天到第0天)，由hiPSC生成类胚体(EB)，并且通过在包括基础培养基和增殖补充剂并补充有肝素(通常为4μg/mL)和氢化可的松(通常为0.48μg/mL)的完全MammoCult培养基(StemCell Technologies)中孵育EB持续10天(第0天到第10天)，生产高度富含非神经外胚层细胞的mEB(乳腺球)，并且其中
步骤A)ii)被进一步分为子步骤并且包括以下步骤ii)、iii)和iv)：
ii)在补充有EpiCult增殖补充剂和甲状旁腺激素(pTHrP)的完全EpiCultB培养基中孵育mEB(乳腺球)储蓄5天(第10天到第15天)；
iii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FGF10和HGF的EpiCultB培养基中孵育mEB(乳腺球)持续20天(第15天到第35天)，促进分支和肺泡分化和乳腺细胞特化；以及
iv)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-***的EpiCultB培养基中孵育mEB(乳腺球)持续7天(第35天到第42天)，诱导乳蛋白质表达。
步骤iv)优选地导致分化出乳蛋白质表达细胞尤其是乳腺细胞和/或乳腺样腺体类器官。
在本发明的另一特别优选的实施方案中，提供了一种生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，其中步骤A)i)定义如下：
i)通过在标准iPSC培养基E8(包括如Chen等人2011年在NatMethods中所描述的DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁、***钠、FGF2、胰岛素、NaHCO3和转铁蛋白、TGFβ1或NODAL)或mTeSRTM中孵育hiPSC持续2天(第-2天到第0天)，由hiPSC生成类胚体(EB)，并且通过在补充有MammoCult增殖补充剂、氢化可的松和肝素的MammoCultB培养基中孵育EB持续10天(第0天到第10天)，生产高度富含非神经外胚层细胞的mEB(乳腺球)，其中步骤A)ii)被进一步分为子步骤并且包括以下步骤ii)、iii)和iv)：
ii)将所形成的mEB(乳腺球)包埋在补充有EpiCult增殖补充剂和甲状旁腺激素(pTHrP)的EpiCultB培养基中漂浮的基质凝胶和I型胶原蛋白的混合物中持续5天(第10天到第15天)；
iii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FGF10和HGF的EpiCultB培养基中孵育包埋的mEB(乳腺球)持续20天(第15天到第35天)，促进分支和肺泡分化和乳腺细胞特化；以及
iv)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-***的EpiCultB培养基中孵育mEB(乳腺球)持续7天(第35天到第42天)，诱导乳蛋白质表达。
步骤iv)优选地导致分化出乳蛋白质表达细胞尤其是乳腺细胞和/或乳腺样腺体类器官。
本文所提及的标准iPSC培养基E8(包括如Chen等人2011年在Nat Methods中所描述的DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁、***钠、FGF2、胰岛素、NaHCO3和转铁蛋白、TGFβ1或NODAL)可商购获得，例如，来自ThermoFischer Scientific的“Essential 8TM培养基”，目录编号A1517001(还可参见https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1517001#/A1517001)。
mTeSRTM培养基可从STEMCELL Technologies公司商购获得，目录编号85850(还可参见https://www.stemcell.com/mtesr1.html)。此类培养基还描述于2007年9月CurrentProtocols in Stem Cell Biology第1期第2卷中的“Defined,Feeder-Independentmedium for human hembryonic stem cell culture”。
在一个实施方案中，在如上文针对特别优选的实施方案所定义的步骤iii)和/或iv)优选地导致形成/分化出至少乳腺细胞、腔细胞和基底细胞。在此上下文中，乳腺细胞优选地表达一种或多种、优选地选自以下的所有标记物：β-酪蛋白、乳蛋白质和激素受体。此外，腔细胞优选地表达一种或多种、优选地选自以下的所有标记物：EpCAM、MUC1、CD49F、GATA3、CK8和CK18。此外，基底细胞优选地表达选自以下的一种或多种标记物：CK14、α-平滑肌肌动蛋白和P63。
在另一个实施方案中，在上述针对特别优选的实施方案定义的步骤ii)和/或iv)中诱导mEB(乳腺球)之后，可获得乳腺样腺体类器官，其表达选自以下的一种或多种标记物：β-酪蛋白、乳蛋白质和激素受体，腔细胞，该腔细胞表达选自以下的一种或多种标记物：EpCAM、MUC1、CD49F、GATA3、CK8和CK18，和基底细胞，该基底细胞表达选自以下的一种或多种标记物：CK14、α-平滑肌肌动蛋白和P63。
在本发明的一个实施方案中，提供了上述用于生产标准人乳样产物的方法。
在另一个实施方案中，提供了上述用于生产非标准人乳样产物的方法。
在(步骤A的)一个实施方案中，控制营养物质和仿生刺激的递送，以影响细胞生长、分化和组织形成。在(步骤A的)一个实施方案中，此类控制在生物反应器中进行。
步骤B—表达人母乳样产物
在本发明的一个实施方案中，上述方法包括：从源自优选地根据步骤A)制备的人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺样类器官表达人乳样产物。优选地，在诱导表达来自此类乳腺细胞和/或乳腺样腺体类器官的人乳样产物后表达人乳样产物。
在一个实施方案中，通过应用补充有催乳因子(例如，催乳素、氢化可的松和胰岛素)的特定培养基(例如，EpiCultB)，诱导泌乳的乳腺细胞。
具体地讲，从源自优选地根据步骤A)制备的人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺样类器官获得的人乳样产物含有人乳中的生物活性物质，其选自包含以下项的组或由以下项组成的组：蛋白质、脂质或低聚糖，优选地，人乳低聚糖等。具体地讲，发明人设法与根据如上文所执行的步骤A)i)至iv)的特别优选的方案保持一致，尤其就低聚糖(包括乳糖和一些HMO)、脂质(包括4种脂肪酸)、蛋白质(7种检测到的，包括酪蛋白)和miRNA(75种检测到的，包括11种通常在HBM中检测到的)而言。
在一个实施方案中，从源自优选地根据步骤A)制备的人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺样类器官获得的人乳样产物含有人乳中的生物活性物质，其选自包括以下项的组或由以下项组成的组：低聚糖、脂质、蛋白质、外泌体和miRNA。
在另一个实施方案中，从源自优选地根据步骤A)制备的人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺样类器官获得的人乳样产物含有人乳中的生物活性物质，该生物活性物质选自包括以下项的组或由以下项组成的组：乳糖、6'SL、C-4:0脂肪酸、C-8:0脂肪酸、C-10:0脂肪酸、C-14:0脂肪酸、C-15:0脂肪酸、C-16:0脂肪酸、C-16:1n7脂肪酸、C-17:0脂肪酸、C-18:0脂肪酸、C-18:1n9脂肪酸、C-18:1脂肪酸、C-18:2n6脂肪酸、C-20:0脂肪酸、C-20:1n9脂肪酸、C-18:3n3脂肪酸、C-22:0脂肪酸、乳铁蛋白、白蛋白、催乳素、α-S1酪蛋白、血红蛋白β亚基、血红蛋白α亚基、α-乳白蛋白、α-2-巨球蛋白、β-酪蛋白、胆盐激活脂肪酶、κ-酪蛋白、乳凝集素、CD14、脂肪酸合酶、IgA、pIgR、血清白蛋白、黄嘌呤脱氢酶、外泌体、miR-21-5p、miR-181a-5p、miR-30d-5p、miR-30b-5p、miR-22-3p、miR-146b-3p、miR-30c-5p、miR-30a-5p、miR-30e-5p和miR-148b-3p。
在本发明的一个实施方案中，从源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺样类器官中获得的人乳样产物为标准人乳产物。在本发明的另一个实施方案中，从源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺样类器官中获得的人乳样产物为非标准人乳产物。
步骤C—进一步进行处理，以生产修饰的人母乳样产物
在本发明的一个任选的实施方案中，本文所描述的方法包括另外的步骤C)，其针对能够由步骤B)获得的人乳样产物执行，并包括：对此类产物执行另外的处理，以提供修饰的人乳样产物。
在一个特定实施方案中，对本发明的人母乳样产物执行的另外的处理步骤C)可选自：纯化步骤、分离过程、提取过程、分级步骤、富集过程、酶处理、添加另外的组分(例如，不可由人类乳腺的腺体类器官表达的组分(诸如例如，免疫球蛋白、益生菌和/或矿物质)或其组合)。
人乳样产物
标准人母乳样产物
在本发明的一个实施方案中，人母乳样产物是标准人母乳样产物。
根据科学研究文献，母乳喂养的有益效果为人们所熟知，而使用标准人母乳样产物的可能性使其带来许多同样熟知的健康有益效果。
在此类实施方案中，标准人母乳样产物可在无法实现实际母乳喂养的情况下用作母乳喂养的替代物。
在此类实施方案中，使用标准人母乳样产物旨在用于例如支持分泌较少乳汁或在生产6个月后停止泌乳的女性延长母乳喂养的时间。
类似地，使用标准人母乳样产物旨在用于例如允许在疾病使母亲无法实际完成母乳喂养的情况下也能实现母乳喂养。
在另一个实施方案中，标准人母乳样产物旨在在母乳无法自然开始分泌的情况下使用，例如，婴儿是经过领养的。
在一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物不是天然形成的人母乳分泌的产物。
在一个实施方案中，标准人母乳样产物用于为婴儿提供最佳营养。
在一个实施方案中，标准人母乳样产物用于实现婴儿的健康生长。
在一个实施方案中，标准人母乳样产物用于预防婴儿感染和过肥以及促进婴儿免疫发展。
在一个实施方案中，标准人母乳样产物是未修饰的人母乳样产物。
在另一个实施方案中，标准人母乳样产物为修饰的人母乳样产物。
在一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物包含：蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素和矿物质。
在另一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物包含：蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和生物活性物质。
在一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物包含：蛋白质、脂质(包括亚油酸和α-亚麻酸)、碳水化合物、维生素(包括维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、叶酸、维生素C和生物素)、矿物质(包括铁、钙、磷、镁、钠、氯化物、钾、锰、碘、硒、铜和锌)、胆碱、肌醇和左旋肉碱。
在另一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物还包含选自以下的至少一种生物活性物质：生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如乳脂球和/或外泌体)和来自外泌体的生物活性物质(例如miRNA)和分泌型IgA。
可以根据本发明的方法，例如，通过包括添加生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如，乳脂球和/或外泌体)、来自外泌体的生物活性物质(例如miRNA)和分泌型IgA的步骤C)，制备此类标准人母乳样产物。
在一个实施方案中，标准人母乳样产物含有益生菌。
此类标准人母乳样产物可根据本发明的方法，例如，通过包括添加可从几种可商购获得的来源获得的益生菌(例如，乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌)的步骤C)来进行制备。
在此类实施方案中，标准人母乳样产物可用于优化胃肠道功能和/或促进免疫。
在一个实施方案中，标准人母乳样产物含有分泌型IgA和益生菌。
此类标准人母乳样产物可根据本发明的方法，例如，通过包括添加益生菌和分泌型IgA的组合的步骤C)进行制备，该组合可根据，例如，专利申请WO2009/156301和WO2009/156367中所描述进行制备，其内容据此以引用方式并入本文。在此类实施方案中，标准人母乳样产物可用于预防免疫球蛋白缺乏症和/或预防婴儿和幼儿的复发感染。
非标准人母乳样产物
在一个实施方案中，根据本发明的非标准人乳样产物可选自：乳强化剂、补充剂和/或适应于特殊目的的人母乳代用品。
人乳强化剂和人乳生物活性补充剂
在一个实施方案中，本发明的方法提供了一种非标准人母乳样产物，其可用于强化从哺乳期母亲获得的天然人母乳或用于强化婴儿配方食品。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了一种非标准人母乳样产物，其可用作对其有需要的婴儿或幼儿的补充剂。
在此类实施方案中，非标准人母乳样产物可用于提供健康生长和/或降低发展通常与婴儿或幼儿的特定病状相关的疾病的风险(诸如例如，哮喘、过敏、认知改变)和/或促进赶上生长速度、发展免疫、预防感染。
值得注意的是，结合根据本发明的方法的事实情况，此类强化剂或补充剂中的人类来源的成分(尤其是生物活性成分)应当使此类成分保持完整或更高的功能性。
优选地，非标准人母乳样产物旨在用作强化剂。此类非标准人母乳样产物旨在用作强化剂，并且可根据本发明的方法，例如，通过包括从能够由步骤B)获得的未修饰的人母乳样产物中分离和/或富集(某些)生物活性物质的步骤C)进行制备。此类分离步骤可通过对能够由步骤B)获得的未修饰的人母乳样产物进行经典的分级、富集和/或纯化来进行。
旨在用作补充剂的非标准人母乳样产物可包含选自以下的一种或多种生物活性物质：人乳低聚糖(例如，2FL、3FL、LNT、LnNT、DiFl、6SL和/或3SL)、脂质、生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)、肝素结合表皮生长因子)、细胞因子(例如，转化生长因子β2(TGFβ-2))和IL-1。IL-2、IL-6、IL-10、IL-18、干扰素γ(INF-γ)、TNF-α、胞外囊泡(例如，乳脂球和/或外泌体)、包括微RNA的外泌体和抗微生物/保护生物活性物质(例如，IgA、乳铁蛋白、溶菌酶、乳凝集素)。此类旨在用作补充剂的非标准人母乳样产物可根据本发明的方法，例如，通过包括从能够由步骤B)获得的未修饰的人母乳样产物中分离这些生物活性物质的步骤C)进行制备。此类分离步骤可通过对能够由步骤B)获得的未修饰的人母乳样产物进行经典的分级、富集和/或纯化来进行。
在一个实施方案中，非标准人母乳样产物是一种补充剂或乳强化剂，其含有岩藻糖基化人乳低聚糖，例如，2FL和/或3FL。此类补充剂或乳强化剂用于使因FUT2基因不活跃而不分泌岩藻糖基化低聚糖的女性的母乳特性更完整。
此类旨在用作强化剂或补充剂的非标准人母乳样产物可根据本发明的方法，例如，通过包括从能够由步骤B)获得的未修饰的人母乳样产物中分离和/或富集岩藻糖基化低聚糖(例如，2FL和/或3FL)的步骤C)进行制备。
在此类实施方案中，非标准人母乳样产物可用于优化胃肠道功能和/或促进免疫。
用于患有遗传疾病的婴儿的人母乳样产物
在一个实施方案中，根据本发明的非标准人母乳样产物可适应于解决先天患有遗传疾病的婴儿的特定需求。
半乳糖血症
在此类实施方案中，非标准人母乳样产物可适应于患有半乳糖血症的婴儿的需要。半乳糖血症是影响婴儿半乳糖代谢能力的罕见遗传疾病。
在此类实施方案中，非标准人母乳样产物应不含乳糖和/或含有乳糖的糖类。在此类实施方案中，非标准人母乳样产物可用于使受半乳糖血症影响的婴儿健康生长。
在一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过包括针对能够由步骤B)获得的未修饰的人母乳样产物进行的酶处理(乳糖酶处理)或膜分级和超滤处理的步骤C)，获得不含乳糖和/或含有乳糖的糖类的非标准人母乳样产物。
在另一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过在步骤A)中使用GMOα-乳白蛋白缺陷型人类细胞生成hiPSC，来获得不含乳糖和/或含有乳糖的糖类的非标准人母乳样产物。
苯丙酮尿症
在此类实施方案中，非标准人母乳样产物可适应于患有苯丙酮尿症(PKU)的婴儿的需要。PKU的出现是由于将苯丙氨酸转化为酪氨酸的苯丙氨酸羟化酶缺失或无法作用。如不予治疗，此症将使大脑中毒而导致重度精神发育迟滞。
在此类实施方案中，非标准人母乳样产物应不含或减少苯丙氨酸。
在此类实施方案中，非标准人母乳样产物可用于使受PKU影响的婴儿健康生长。
在一个实施方案中，非标准人母乳样产物减少了苯丙氨酸，其方式使得苯丙氨酸含量相对于接收苯丙氨酸的受试者的体重保持在20mg/kg以下。
在一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过包括针对能够由步骤B)获得的未修饰的人母乳样产物进行酶处理(蛋白质水解)或过滤处理的步骤C)，获得减少或不含苯丙氨酸的非标准人母乳样产物。
在一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过包括针对能够由步骤B)获得的未修饰的人母乳样产物进行酶处理(蛋白质水解)或过滤处理的步骤C)，获得减少苯丙氨酸的非标准人母乳样产物。
在另一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过在步骤B)中提供可提供有限量的或不提供苯丙氨酸的培养基(诸如例如，来自乳清的含有糖巨肽(GMP)的培养基)，获得减少苯丙氨酸的非标准人母乳样产物。
应当理解，本文所公开的详细说明的各个方面和实施方案是制造和使用本发明的具体方式的示例，当结合权利要求书和本文的详细说明进行考虑时这些内容并不限制本发明的范围。还应当理解，本发明的各方面和实施方案的特征可与本发明的相同或不同的方面和实施方案的其他特征组合。
如在具体实施方式和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。
本发明的附加实施方案
i)用于体外生产非标准人乳样产物的方法，该方法包括：
A)生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞乳腺样腺体类器官；
B)从此类来自所述人诱导多能干细胞的所述乳腺细胞中分泌所述人乳样产物。
ii)根据实施方案i)所述的方法，该方法任选包括：步骤C)，由此根据权利要求1所述的人乳样产物进一步经过处理，以生成修饰的人乳样产物。
iii)根据实施方案i)或ii)所述的用于生产人乳样产物的方法，其中根据步骤A)的培养条件适应于生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，该乳腺细胞能够分泌非标准人乳样产物。
iv)根据实施方案ii)或iii)中任一项所述的方法，其中通过向步骤B)的该人乳样产物中添加未由步骤B)中该乳腺细胞分泌的一种或多种人母乳组分，在步骤C)中获得修饰的人乳样产物。
v)根据实施方案i)至iv)中任一项所述的方法，其中该乳腺细胞是在步骤A)中生成的乳腺样腺体类器官结构的一部分。
vi)人乳样产物，所述人乳样产物能够根据实施方案i)至v)中任一项所述的方法获得。
vii)根据实施方案vi)所述的人乳样产物，其用于治疗。
viii)根据实施方案vi)所述的人母乳样产物作为母乳喂养替代物的用途。
附图说明
图1：示出了根据Ying Qu论文中概述的方案并如本发明方法的步骤A)中的一个替代方案所应用的人诱导多能干细胞(hiPSC)的分化。
图2：示出了根据本发明方法中针对步骤A)的优选的和特别优选的实施方案的人诱导多能干细胞(hiPSC)的分化。
图3：示出了如根据本发明生产的hiPSC的三维器官型培养物非常适用于乳腺腺体的特化。示出了针对3D分化方案(42天)的Nanog、TUBB3、FOXA2、TP63、KR-14、EpCAM、KRT8和CSN2的mRNA表达。从左至右的标记物：多能性的阶段(Nanog)、细胞系(外胚层和内胚层)(TUBB3、FOXA2)、基底细胞/肌上皮标记物(TP63和KR-14)、管腔上皮标记物(EpCAM、KRT8)和乳蛋白质(CSN2(酪蛋白β))。
图4：示出了作为比较实施例而生成的hiPSC的二维器官型培养物。示出了针对2D分化方案(31天)的Nanog、TUBB3、FOXA2、TP63、KR-14、EpCAM、KRT8和CSN2的mRNA表达。从左至右的标记物：多能性的阶段(Nanog)、细胞系(外胚层和内胚层)(TUBB3、FOXA2)、基底细胞/肌上皮标记物(TP63和KR-14)、管腔上皮标记物(EpCAM、KRT8)和乳蛋白质(CSN2(酪蛋白β))。
实验部分
实施例1
将hiPSC培养和分化为乳腺细胞，以获得人乳样产物
根据Ying Qu等人在Stem Cell Report(2017年2月14日第8卷第205至215页)中所描述的过程从hiPSC开始培养乳腺细胞，从而收集由此分泌的人乳样产物，其能够用于治疗和/或作为根据本发明的母乳喂养替代物。
实施例2
将hiPSC培养和分化为3D乳腺细胞，以获得人乳样产物
根据本发明的方法中的上述步骤A)和步骤B)从hiPSC开始培养乳腺细胞，从而收集由此分泌的人乳样产物，其能够用于治疗和/或作为根据本发明的母乳喂养替代物。
实施例3
另选的将hiPSC培养和分化为乳腺细胞，以获得人乳样产物的方法
可从另选的培养条件下高效从hiPSC获得乳腺细胞的分化，该条件包括如下所描述的条件1至条件4：
1.涂覆有玻连蛋白的培养皿上的作为单层细胞的2D培养物源自EB并在含有以下成分的培养基中培养至少28天：含L-谷氨酰胺的RPMI 1640；胎牛血清(FBS)；胰岛素；表皮生长因子(EGF)；氢化可的松；青链霉素混合物(青霉素/链霉素：抗生素-抗真菌溶液)。
2.涂覆有玻连蛋白的培养皿上的粘附的细胞聚集体(EB)的2D培养物源自EB并在含有以下成分的培养基中培养至少28天：含L-谷氨酰胺的RPMI 1640；胎牛血清(FBS)；胰岛素；表皮生长因子(EGF)；氢化可的松；青链霉素混合物(抗生素-抗真菌溶液)。
3.3D培养物在MammoCult培养基中悬浮培养至少10天，然后，在甲状旁腺激素的存在下，在特定培养基(例如，EpiCultB)中，在混合漂浮凝胶(例如基质凝胶和I型胶原蛋白)中再培养5天，然后在胰岛素、HGF、氢化可的松和FGF10的存在下再培养25天。
4.EB的3D培养物在MammoCult培养基中悬浮(超低贴壁培养皿)培养至少10天，然后，在甲状旁腺激素的存在下，在特定培养基(例如，EpiCultB)中，在悬浮培养基中再培养5天，然后在胰岛素、HGF、氢化可的松和FGF10的存在下再培养25天。
实施例4
基于人诱导多能干细胞(hiPSC)系603的2D和3D乳腺细胞分化
(a)基于人诱导多能干细胞(hiPSC)系603的3D乳腺细胞分化：
人诱导多能干细胞(hiPSC)系603用于3D乳腺细胞的分化。人诱导多能干细胞(hiPSC)系603购自Fujifilm Cellular Dynamics公司(FCDI)。
(i)针对(根据本发明的)3D分化方案，通过在37℃、5％的CO2和95rpm振荡培养的条件下在含有10uM ROCK抑制剂的E8培养基中孵育hiPSC的单细胞一夜，形成EB(球体)。第二天，用E8替换培养基(第-2天到第0天)。
接下来的一天，用Mammo1培养基(MammoCult培养基，具有增殖补充剂、肝素(4μg/mL)和含有青霉素/链霉素的氢化可的松(0.48μg/mL))替换培养基培养10天(第0天到第10天)。
每两天更换一次培养基。
(ii)在Mammo2培养基(EpiCultB加补充剂、100ng/ml的pTHrP，加青霉素/链霉素)中培养5天之后进行上述分化。(在第10天到第15天中)每三天更换一次培养基。
(iii)为了诱导分支的上皮结构、肺泡分化和乳腺细胞特化，用Mammo3培养基(完全EpiCultB，氢化可的松(1μg/ml)、胰岛素(10μg/ml)、FGF10(50ng/ml)、HGF(50ng/ml)和青霉素/链霉素)喂养mEB(球体/乳腺球)20天。(在第15天到第35天中)每三天更换一次培养基。
(iv)最后，为了诱导乳生物活性物质的生产(3D)，使用Mammo4培养基(完全EpiCultB，10％的FBS、催乳素(10μg/ml)、氢化可的松(1μg/ml)、胰岛素(10μg/ml)、孕酮、β-***和青霉素/链霉素)培养7天，并且(在第35天到第42天中)每三天更换一次培养基。在所有分化过程中，将球体维持在悬浮培养物中(以95rpm振荡)。分化过程在第42天结束。结果在图3中示出。
(b)基于人诱导多能干细胞(hiPSC)系603的2D乳腺细胞分化
人诱导多能干细胞(hiPSC)系603还可用于2D乳腺细胞的分化。人诱导多能干细胞(hiPSC)系603购自Fujifilm Cellular Dynamics公司(FCDI)。
针对(用于比较的)2D分化方案，在所有分化阶段中使用乳糖培养基(RPMI 1640，20％的FBS、1mM的谷氨酰胺、4μg/ml的胰岛素、20ng/ml的EGF、0.5μg/ml的含青霉素/链霉素的氢化可的松)。在37℃和5％的CO2下孵育细胞。每两天更换一次培养基。结果在图4中示出。
(c)结果
使用定量RT-PCR(图3：3D分化；图4：2D分化)捕捉乳腺细胞衍生期间的不同分化阶段。在2D和3D的设置中均减少作为多能性标记物的NaNog表达，同时细胞变得成熟和进行分化。神经外胚层和内胚层标记物微管蛋白β3III(TUBB3)和叉头框蛋白A2(FOXA2)未以3D格式显著表达，并且TUBB3的提高仅在2D设置中可捕捉。这表明，hiPSC的模式向非神经外胚层细胞系发展，从而富集3D格式的乳腺祖细胞。发明人研究了常用基底细胞/肌上皮标记物诸如p63(p53-同源核蛋白)和细胞角蛋白14(KRT-14)的表达模式。两种***中均可明显检测到两种标记物。另外，上皮细胞粘附分子(EpCAM)和细胞角蛋白8(KRT8)仅在3D***中进行追踪，并且KRT8在2D格式下仅部分得以表达。因此，在器官型设置中的3D平台表达了共同的乳腺组织、管腔和基底的标记物。此类乳腺样类器官表达人母乳特含的蛋白质，其包括CSN2(酪蛋白β)、乳蛋白肽和激素受体。腔细胞特别表达EpCAM、MUC1、CD49F、GATA3、CK8和CK18，而基底细胞将特别表达CK14、α-平滑肌肌动蛋白和P63。最终，EpCAM和CD49F双阳性细胞可以在第10天与第35天之间的较早祖细胞阶段检测到。有趣的是，CSN2的表达仅在3D器官型***的最后一个时间点(第42天)进行捕捉而不可在2D引导分化平台中进行捕捉。
如下文所描述，乳腺样类器官分泌体的分析示出了人乳特含生物活性物质的分泌，该生物活性物质包含低聚糖(包括乳糖和一些HMO)、脂质(包括4种脂肪酸)、蛋白质(7种检测到的，包括酪蛋白)和miRNA(75种检测到的，包括11种通常在HBM中检测到的)。
根据“Austin and Benet,Quantitative determination of non-lactose milkoligosaccharides,Analytica Chimica Acta 2018,1010,86-96”中所描述的过程以极小的改动分析原代细胞上清液中是否存在乳糖或人乳低聚糖。用UHPLC分析样本，并且针对乳糖的校准曲线和7种HMO(2'FL、3FL、DFL、LNT、LNnT、3'SL和6'SL)的混合物定量检测到的乳糖或人乳低聚糖(HMO)。上述方法的估计限值为0.1mg/L。在原代细胞上清液中，乳糖(0.22mg/l)和6'SL(0.32mg/l)在第42天进行检测。
通过与火焰电离检测器耦合的气相色谱在培养基和细胞上清液中分析脂肪酸。简单来说，分析在第42天获得的上清液，以研究几种脂质中是否有脂肪酸存在。配备7693自动取样机的7890A气相色谱仪配备有熔融石英CP-Sil 88毛细管柱(100％氰丙基聚硅氧烷)，该自动取样机配备有制备性站点模块；使用100m×0.25mm ID×0.25mm的膜厚度，同时使用以250℃加热的分流进样器(1:25的比率)和在300℃下***作的火焰电离检测器。通过甲醇氯酸(methanolic chloridric acid)直接对样本进行酯交换反应来进行脂肪酸甲酯(FAME)的制备。使用毛细管气相色谱(GC)FID法进行FAME的分离。FAME的识别通过保留时间(RT)进行，并与外标进行比较。脂肪酸的定量通过使用甲基C11:0作为内标进行计算。用TAGC13:0作为第二内标来控制上述方法的酯交换性能。添加内标后，将溶液与2mL甲醇、2mL甲醇/HCI(3N)和1mL己烷进行混合。以100℃加热60分钟后，使样本冷却至室温(约15分钟)，然后通过添加2mL水停止上述反应。离心后，将有机相直接注入GC中。
来自实施例4a的方案在第42天的脂肪酸结果在表1(观察到的培养基与上清液之间的差异)中报告。
下文在表1中列出了细胞上清液样本中的表达的脂肪酸。
Figure BDA0003911800740000231
Figure BDA0003911800740000241
使用SDS-PAGE特性分析法，然后针对通过LC-MSMS法为进行同一性确认进行的胶条分离，分析细胞上清液中的蛋白质。针对SDS-PAGE分析法，将所制备的样本的总体积装载到凝胶上。添加人乳样本作为对照，以用于比较。通过LC-MSMS法切割所选的胶体区(胶条)，以查看人类蛋白质。最终，将胶条提交进行胶内胰蛋白酶消化，并通过LC-MSMS法进行分析。用Peaks Studio分析LC-MSMS的数据，并与UniProt的人类蛋白质数据库进行匹配。
下文中的表2列出了所有切除的胶条的最佳候选。
细胞上清液中表达的蛋白质的名称
乳铁蛋白
白蛋白
催乳素
α-S1酪蛋白
血红蛋白β亚基
血红蛋白α亚基
α-乳白蛋白
α-2-巨球蛋白
β-酪蛋白
胆盐激活脂肪酶
κ-酪蛋白
乳凝集素
CD14
脂肪酸合酶
IgA
pIgR
血清白蛋白
黄嘌呤脱氢酶
使用ExoQuick聚合物网进行外泌体分离和miRNA特性分析。ExoQuick聚合物通过形成网络并收集一定大小的所有外泌体来使外泌体沉淀。一旦形成ExoQuick网格，便可容易地使用简单低速的离心法将外泌体沉淀为球粒。该外泌体是完整的，随时可进行蛋白质或RNA分析，并对功能研究而言具有生物活性。将沉淀缓冲液以0.25倍的比例添加至样本，然后涡旋。将混合物以4℃孵育一夜。在孵育后，将样本在1500xg下进行离心30分钟。通过在具有用于QC的缓冲液XE(QIAGEN)或来自HTG EdgeSeq公司用于miRNA特性分析的miRNAWhole Transcriptome Assay裂解缓冲液的初始体积中涡旋，重新悬浮上述外泌体的球粒。为了评估胞外囊泡(EV)分离，首先将上清液以3000g离心15分钟，以去除细胞球粒和碎片。然后，使用100微升的培养基和ExoQuick缓冲液(0.25倍的比例)以4℃进行过夜沉淀。通过以1500g离心30分钟回收EV沉淀物。对每个样本进行两次沉淀，将一次EV沉淀重新悬浮于缓冲液XE(QIAGEN)中，以进行进一步可能的分析，第二次仅在50μl的HTG裂解缓冲液中进行，以在通过HTG进行miRNA特性分析之前以10倍进行浓缩。
对于miRNA特性分析，在裂解的第一步中直接使用样本。因此，直接使用全样本并用等离子体裂解缓冲液以比率1:1进行裂解。接下来，添加蛋白酶K(1/10)，并且在Thermomixer上将样本以50℃和600rpm孵育3小时。将EV重新悬浮于裂解缓冲液中并在相同条件下进行裂解，在裂解孵育之前，增加以95℃孵育10分钟的步骤。在HTG EdgeSeq公司的miRNA Whole Transcriptome Assay的V2过程后，在HTG处理器上使用70μl的油对26μl的溶胞产物进行处理。为了给文库编入索引以及扩增文库，通过使用
Figure BDA0003911800740000251
热启动2XMaster Mix GC缓冲液的PCR(95℃、4分钟；16个循环：95℃、15秒；56℃、45秒；68℃、45秒；68℃、10分钟；保持在4℃)，用Illumina公司的适配器和索引标记样本，并在机器人液体处理器SciClone NGS WorkStation(Perkin Elmer公司)上使用AMPure(以2.5的比例)进行清理。在Hamilton机器人上使用定制的池化程序获得池。基于GX Touch Chip HS定量来池化样本。通过AMPure磁珠(1.8的比例)第二次手动纯化池，以去除可能剩余的痕量的引物二聚体，并用Qubit定量池，以调整最终浓度为2nM。作为最后一步，对于MiSeq测序，以20pM和5％的PhiX峰在MiSeq上装载池，并且使用150V3试剂盒针对MiSeq上50个碱基单读段进行测序。
简单而言，在细胞上清液中检测到974种miRNA，其中超过75种为乳样本中高度表达的miRNA。
下文的表3列出了十大高度表达的miRNA。
miRNA的名称 log2计数 CV
miR-21-5p 9.76 0.01
miR-181a-5p 9.07 0.03
miR-30d-5p 8.63 0.01
miR-30b-5p 8.63 0.01
miR-22-3p 8.49 0.01
miR-146b-3p 8.40 0.01
miR-30c-5p 8.12 0.04
miR-30a-5p 7.63 0.02
miR-30e-5p 7.26 0.01
miR-148b-3p 6.77 0.04
本文的研究成果提供了一种新颖的基于iPSC的3D器官型模式，其用于研究正常乳腺细胞命运和功能以及母乳生物活性物质的生产如何调节和发展。
应当理解，对本文描述的目前优选的实施方案作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将为显而易见的。可在不脱离本发明的实质和范围并在不减少所伴随的优点的情况下作出这些变化和修改。因此，此类变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (29)

1.用于生产哺乳动物乳样产物的方法，所述方法包括：
A)生成源自哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)的乳腺细胞乳腺样腺体类器官；
B)从此类来自所述哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)的所述乳腺细胞中分泌所述哺乳动物乳样产物。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法用于在体外生产非标准人乳样产物，所述方法包括：
A)生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞乳腺样腺体类器官；B)从此类来自所述人诱导多能干细胞的所述乳腺细胞中分泌所述人乳样产物；
其中此类所述非标准人乳样产物包含选自以下的营养物质或生物活性物质中的一种或多种：蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质、胆碱、肌醇、左旋肉碱、生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡、来自外泌体的生物活性物质和分泌型IgA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法任选包括步骤C)，由此所述根据权利要求1所述的人乳样产物进一步经过处理，以生成修饰的人乳样产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤C)选自：纯化步骤、分离过程、分级步骤、富集过程、酶处理、添加另外的组分及其组合。
5.根据权利要求2至4所述的用于生产人乳样产物的方法，其中根据步骤A)的培养条件适应于生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，所述乳腺细胞能够分泌非标准人乳样产物。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中通过向步骤B)的所述人乳样产物中添加未由步骤B)中所述乳腺细胞分泌的一种或多种人母乳组分，在步骤C)中获得修饰的人乳样产物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述乳腺细胞是在步骤A)中生成的乳腺样类器官结构的一部分。
8.人乳样产物，所述人乳样产物能够根据权利要求1至7中任一项所述的方法获得。
9.根据权利要求8所述的人乳样产物，其用于治疗。
10.根据权利要求8所述的人母乳样产物作为母乳喂养替代物的用途。
11.用于体外生产人乳样产物的方法，所述方法包括：
A)生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞乳腺样腺体类器官；
B)从此类来自所述人诱导多能干细胞的所述乳腺细胞中分泌所述人乳样产物；
其中此类所述步骤A)包括：
i)通过在合适的3D培养***中，例如在3D悬浮条件下，在合适的培养基例如MammoCult培养基中培养hiPSC至少12天，引导hiPSC分化为非神经外胚层细胞；以及
ii)在合适的3D包埋***中，例如，在由基质蛋白诸如基质凝胶和/或I型胶原蛋白构成的混合漂浮凝胶中使所形成的mEB(乳腺球)生长至少30天，例如32天，以生成乳腺细胞。
12.根据权利要求11所述的用于生产人乳产物的方法，其中步骤A)i)定义如下：
i)通过在包含DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁、***钠、FGF2、胰岛素、NaHCO3和转铁蛋白、TGFβ1或NODAL的标准iPSC培养基E8，或mTeSRTM培养基中孵育hiPSC持续2天，由hiPSC生成类胚体(EB)，并且通过在包含基础培养基、增殖补充剂以及补充有肝素和氢化可的松的完全MammoCult培养基中孵育EB持续10天，生产高度富含非神经外胚层细胞的mEB(乳腺球)，并且其中
步骤A)ii)被进一步分为子步骤并且包括以下步骤ii)、iii)和iv)：
ii)在补充有EpiCult增殖补充剂和甲状旁腺激素(pTHrP)的完全EpiCultB培养基中孵育mEB(乳腺球)持续5天；
iii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FGF10和HGF的EpiCultB培养基中孵育mEB(乳腺球)持续20天，促进分支和肺泡分化和乳腺细胞特化；以及
iv)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-***的EpiCultB培养基中孵育mEB(乳腺球)持续7天，诱导乳蛋白质表达。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的用于生产人乳产物的方法，其中步骤A)i)定义如下：
i)通过在包含DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁、***钠、FGF2、胰岛素、NaHCO3和转铁蛋白、TGFβ1或NODAL的标准iPSC培养基E8中孵育hiPSC持续2天，由hiPSC生成类胚体(EB)，并且通过在补充有MammoCult增殖补充剂、氢化可的松和肝素的MammoCultB培养基中孵育EB持续10天，生产高度富含非神经外胚层细胞的mEB(乳腺球)，并且其中步骤A)ii)被进一步分为子步骤并且包括以下步骤ii)、iii)和iv)：
ii)将所形成的mEB(乳腺球)包埋在补充有EpiCult增殖补充剂和甲状旁腺激素(pTHrP)的EpiCultB培养基中漂浮的基质凝胶和I型胶原蛋白的混合物中持续5天；
iii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FGF10和HGF的EpiCultB培养基中孵育包埋的mEB(乳腺球)持续20天，促进分支和肺泡分化和乳腺细胞特化；以及
iv)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-***的EpiCultB培养基中孵育mEB(乳腺球)持续7天，诱导乳蛋白质表达。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的用于生产人乳样产物的方法，其中步骤iii)和/或iv)导致形成/分化成至少乳腺细胞、腔细胞和基底细胞。
15.根据权利要求14所述的用于生产人乳样产物的方法，其中乳腺细胞表达选自以下的一种或多种标记物：β-酪蛋白、乳蛋白质和激素受体，腔细胞表达选自以下的一种或多种所有标记物：EpCAM、MUC1、CD49F、GATA3、CK8和CK18，基底细胞表达选自以下的一种或多种标记物：CK14、α-平滑肌肌动蛋白和P63。
16.根据权利要求11至13中任一项所述的用于生产人乳样产物的方法，其中在步骤ii)和/或iv)中诱导mEB(乳腺球)之后，获得乳腺样腺体类器官，其表达选自以下的一种或多种标记物：β-酪蛋白、乳蛋白质和激素受体，包括腔细胞，所述腔细胞表达选自以下的一种或多种标记物：EpCAM、MUC1、CD49F、GATA3、CK8、CK18，和基底细胞，所述基底细胞表达选自以下的一种或多种标记物：CK14、α-平滑肌肌动蛋白和P63。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的用于生产人乳样产物的方法，其中所述人乳样产物是标准人乳产物，其包含：蛋白质、肽、脂质(包括亚油酸和α-亚麻酸)、碳水化合物、维生素(包括维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、叶酸、维生素C和生物素)、矿物质(包括铁、钙、磷、镁、钠、氯化物、钾、锰、碘、硒、铜和锌)、胆碱、肌醇和左旋肉碱，并且任选还包含选自以下的至少一种生物活性物质：生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如，乳脂球和/或外泌体)，来自外泌体的生物活性物质(例如，miRNA)和分泌型IgA。
18.根据权利要求11至16中任一项所述的用于生产人乳样产物的方法，其中所述人乳样产物是非标准人乳产物，其包含选自以下的营养物质或生物活性物质中的一种或多种：蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质、胆碱、肌醇、左旋肉碱、生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡、来自外泌体的生物活性物质和分泌型IgA。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，所述方法包括步骤C)，其中所述人乳样产物进一步经过处理，以生成修饰的人乳样产物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中步骤C)选自：纯化步骤、分离过程、分级步骤、富集过程、酶处理、添加另外的组分及其组合。
21.根据权利要求11至20中任一项所述的用于生产人乳样产物的方法，其中根据步骤A)的培养条件适应于生成源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳腺细胞，所述乳腺细胞能够分泌非标准人乳样产物。
22.根据权利要求11至21中任一项所述的方法，其中通过向步骤B)的所述人乳样产物中添加未由步骤B)中所述乳腺细胞分泌的一种或多种人母乳组分，在步骤C)中获得修饰的人乳样产物。
23.根据权利要求11至22中任一项所述的方法，其中所述乳腺细胞是在步骤A)中生成的乳腺样类器官结构的一部分。
24.人乳样产物，所述人乳样产物能够根据权利要求11至23中任一项所述的方法获得。
25.根据权利要求24所述的人乳样产物，所述人乳样产物包含生物活性物质，所述生物活性物质包含以下项或由以下项组成：乳糖、6'SL、C-4:0脂肪酸、C-8:0脂肪酸、C-10:0脂肪酸、C-14:0脂肪酸、C-15:0脂肪酸、C-16:0脂肪酸、C-16:1n7脂肪酸、C-17:0脂肪酸、C-18:0脂肪酸、C-18:1n9脂肪酸、C-18:1脂肪酸、C-18:2n6脂肪酸、C-20:0脂肪酸、C-20:1n9脂肪酸、C-18:3n3脂肪酸、C-22:0脂肪酸、乳铁蛋白、白蛋白、催乳素、α-S1酪蛋白、血红蛋白β亚基、血红蛋白α亚基、α-乳白蛋白、α-2-巨球蛋白、β-酪蛋白、胆盐激活脂肪酶、κ-酪蛋白、乳凝集素、CD14、脂肪酸合酶、IgA、pIgR、血清白蛋白、黄嘌呤脱氢酶、外泌体、miR-21-5p、miR-181a-5p、miR-30d-5p、miR-30b-5p、miR-22-3p、miR-146b-3p、miR-30c-5p、miR-30a-5p、miR-30e-5p和miR-148b-3p。
26.根据权利要求24或25所述的人乳样产物，所述人乳样产物为标准人乳样产物，其包含：蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质、胆碱、肌醇和左旋肉碱，并且任选还包含选自以下的至少一种生物活性物质：生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡、来自外泌体的生物活性物质(例如miRNA)和分泌型IgA。
27.根据权利要求24或25所述的人乳样产物，所述人乳样产物为非标准人乳样产物，并且包含选自以下的营养物质或生物活性物质中的一种或多种：蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质、胆碱、肌醇、左旋肉碱、生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡、来自外泌体的生物活性物质和分泌型IgA。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的人乳样产物，其用于治疗。
29.根据权利要求24至27中任一项所述的人母乳样产物作为母乳喂养替代物的用途。
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