CN115452976A - 一种测定眼球壁中那他霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定眼球壁中那他霉素的方法。其采用液相色谱‑质谱联用法测定眼球壁待测液中那他霉素的含量；液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为有机酸水溶液，流动相A中的有机酸占流动相A体积的0.002％～0.1％；流动相B为有机酸与乙腈的混合液，流动相B中的有机酸占流动相B体积的0.002％～0.1％；流动相A和流动相B的体积比为x:(100‑x)，其中，10≤x≤80；有机酸为甲酸或乙酸；眼球壁待测液包括那他霉素和内标物。该方法的检测限低、准确度高且操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定眼球壁中那他霉素的方法。
背景技术
真菌性角膜炎(Fungal Keratitis,FK)也被称为角膜真菌病，是由真菌直接感染角膜引起的一种严重威胁视力的眼部疾病，致盲率极高，近年来发病率呈逐年上升。根据研究数据显示，有超过100种真菌会引起眼球壁中的角膜感染，其中主要的致病菌有镰刀菌属、曲霉菌属、头孢菌属、青霉菌属等。真菌性角膜炎诊断和治疗困难、预后极差，以往因临床治疗手段、医学技术水平等限制，临床治疗效果不甚理想,致盲率一直居高不下。
那他霉素(或称纳他霉素，或称纳塔霉素，英文名称“Natamycin”)是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，具有较强的抑菌作用。那他霉素是第一个被FBA批准的眼用抗真菌药物，具有广谱、双效的抗真菌作用，既可以抑制各种霉菌、酵母菌的生长，又能抑制真菌毒素的产生。那他霉素在眼局部用药比其在全身用药更加安全可靠，但仍有可能有偶发的眼部不良反应，如异物感、刺激、疼痛、瘙痒感等。
在眼局部用药的过程中，眼球壁外层从外到内为三层，外层的前1/6为角膜，后5/6为巩膜，作用为保护眼内组织、维持眼球形状；中层为葡萄膜，有三部分组成，分别为虹膜、睫状体和脉络膜，作用为遮光以及为眼内组织提供营养；内层为视网膜，作用为感光及视觉信息的产生、传递。通常可以使用玻璃体腔注射那他霉素，经过扩散以及房水循环使药物进入各个眼组织。然而，那他霉素眼内通透性差，虽然那他霉素能很好的穿透角膜，其可在角膜基质内达到有效浓度，但目前缺少那他霉素在眼球壁中浓度的测定方法，而影响药物的药代动力学研究。
因此，亟待提供一种测定眼球壁(角膜、巩膜、虹膜、脉络膜、视网膜)中那他霉素的方法，用于玻璃体腔注射那他霉素的药代及毒代研究，以提高那他霉素用药的安全性和有效性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中缺乏眼球壁(角膜、巩膜、虹膜、脉络膜、视网膜)中那他霉素的检测方法的弊端，从而提供了一种测定眼球壁(角膜、巩膜、虹膜、脉络膜、视网膜)中那他霉素的方法，所述检测方法的检测限低、准确度高且操作简便。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种测定眼球壁中那他霉素的方法，其采用液相色谱-质谱联用法测定眼球壁待测液中那他霉素的含量；
所述液相色谱-质谱联用法中的液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为有机酸水溶液，所述流动相A中的有机酸占所述流动相A体积的0.002％～0.1％；所述流动相B为有机酸与乙腈的混合液，所述流动相B中的有机酸占所述流动相B体积的0.002％～0.1％；所述流动相A和所述流动相B的体积比为x:(100-x)，其中，10≤x≤80；所述有机酸为甲酸或乙酸；
所述眼球壁待测液包括那他霉素和内标物。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法采用液质联用仪；更佳地，所述液质联用仪的型号为SCIEX/Triple Quad 4500。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法中，所述液相色谱的色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶，例如YMC-Triart C18。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法中，所述液相色谱的色谱柱的规格为50mm×2.1mm,1.9μm。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法中，所述液相色谱的柱温为30～50℃，例如40℃。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法中，所述液相色谱的进样量为1～20μL，例如5μL。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法中，所述质谱的离子源为电喷雾电离ESI。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法中，所述质谱的离子化模式为正离子化模式。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法中，所述质谱采用多反应检测模式；更佳地，所述多反应监测模式中，所述那他霉素的母离子的质荷比为666.3，子离子的质荷比为503.3；进一步更佳地，当内标物为甲苯磺丁脲，所述甲苯磺丁脲中的母离子的质荷比为271.1，子离子的质荷比为154.8。
本发明中，较佳地，所述液相色谱-质谱联用法中，所述质谱的扫描间隔时间为70～90ms，例如80ms。
本发明中，较佳地，所述液相色谱的洗脱方式采用梯度洗脱；更佳地，不同时间段，所述流动相A和所述流动相B的体积比如下表所示：
本发明中，较佳地，所述液相色谱的流动相的流速为0.4～0.6mL/min，例如0.5mL/min。
本发明中，较佳地，所述流动相A中的甲酸占所述流动相A体积的0.05％～0.1％，例如0.1％。
本发明中，较佳地，所述流动相B中的甲酸占所述流动相B体积的0.05％～0.1％，例如0.1％。
本发明中，较佳地，所述眼球壁包括角膜、巩膜、虹膜、脉络膜和视网膜中的一种或多种。
本发明中，较佳地，所述眼球壁为新西兰大白兔的眼球壁。
本发明中，较佳地，所述内标物为甲苯磺丁脲。
本发明中，较佳地，所述眼球壁待测液的制备方法包括如下步骤：S1、将含有那他霉素的眼球壁剪碎后，得到眼球壁样品，加入匀浆液进行研磨匀浆，得到眼球壁匀浆液；S2、将S1中所述眼球壁匀浆液与内标物进行第一次涡旋混匀；S3、将S2中所述涡旋混合的溶液进行离心，取上清液进行第二次涡旋混匀，即得所述眼球壁待测液。
其中，较佳地，所述眼球壁样品与所述匀浆液的体积比为1:(8～20)，例如1:10。
其中，较佳地，所述匀浆液为甲醇和水的混合液；更佳地，所述甲醇占所述匀浆液的体积的10％～50％，例如50％。
其中，较佳地，所述第一次涡旋混匀和第二次涡旋混匀的速度均为3～8m/sec，例如8m/sec。
其中，较佳地，所述第一次涡旋混匀和第二次涡旋混匀的转动时间均为50～70s，例如60s。
其中，较佳地，所述第一次涡旋混匀和第二次涡旋混匀的次数均为至少3次，例如3次。需要延长匀浆时间、匀浆速度及匀浆次数，使得眼球壁中的组织匀浆均匀。
其中，较佳地，所述离心的温度为4℃。
其中，较佳地，所述离心的离心力为4700×g。
其中，较佳地，所述离心的时间为10min。
本发明中，较佳地，在检测所述眼球壁待测液之前，建立标准曲线；更佳地，所述标准曲线的建立包括如下步骤：
①配制那他霉素标准品工作液和内标工作液；
②将步骤①中所述的标准品工作液与空白眼球壁基质混合，得到标准样品溶液；
③将步骤①中所述的内标工作液加入步骤②中所述的标准样品溶液，进行涡旋混合、离心，取上清液，涡旋混合，得到标准品待测液；
④采用所述液相色谱-质谱联用法分析步骤③中所述标准品待测液，测得那他霉素与所述内标物的峰面积比；
⑤根据所述那他霉素与所述内标物的峰面积比和所述标准品工作液的浓度拟合，得到回归方程，并绘制所述标准曲线，即可。
其中，较佳地，步骤①中，所述标准品工作液包括那他霉素和稀释液；所述稀释液为50％甲醇水溶液。
其中，较佳地，步骤①中，所述标准品工作液的配制方法包括以下步骤：将所述那他霉素与稀释液混合，得到标准品储备液；再将所述标准品储备液与所述稀释液混合，即可。
其中，较佳地，步骤①中，所述标准品工作液中的那他霉素的浓度为4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL或2000ng/mL。
其中，较佳地，步骤①中，所述内标工作液包括甲苯磺丁脲与内标稀释液；较佳地，所述内标稀释液为乙腈。
其中，较佳地，步骤①中，所述内标工作液的配制方法包括以下步骤：将所述内标物与所述内标稀释液混合，即得内标储备液；再将所述内标储备液与所述内标稀释液混合，即可。
其中，较佳地，步骤①中，所述内标工作液的浓度为45～55ng/mL，例如50ng/mL。
其中，较佳地，步骤②中，所述标准样品溶液中那他霉素的浓度为0.2ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL或100ng/mL。
其中，较佳地，当步骤②中所述空白眼球壁基质为角膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.0067x-0.00034(r＝0.9942，r2＞0.98)。
其中，较佳地，当步骤②中所述空白眼球壁基质为巩膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.0057x-0.000031(r＝0.9963，r2＞0.98)。
其中，较佳地，当步骤②中所述空白眼球壁基质为虹膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.00548x-0.000227(r＝0.9970，r2＞0.98)。
其中，较佳地，当步骤②中所述空白眼球壁基质为脉络膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.00531x-0.000142(r＝0.9972，r2＞0.98)。
其中，较佳地，当步骤②中所述空白眼球壁基质为视网膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.00498x-0.00000603(r＝0.9967，r2＞0.98)。
其中，回归方程的回归方法具体如下：提取MRM色谱图，拟合标准曲线，标准曲线以标准品工作液浓度为横坐标，以标准品工作液与内标峰面积比值为纵坐标，设置权重为1/x2，忽略原点，拟合线性标准曲线。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各优选实例。
本发明所用试剂和原料均可市售可得。
本发明得积极进步效果在于：
1)本发明建立了一种眼球壁(角膜、巩膜、虹膜、脉络膜、视网膜)中那他霉素的检测方法。其操作简便、用时短，从而有利于分析那他霉素在实验兔体内得药代/毒代动力学。
2)本发明的检测方法所需的样本进样量低、所需的分析时间短；本发明检测的准确性和可靠性高；专属性良好。
3)本发明的测试方法检测下限低，那他霉素的检测下限可达到50ng/mL以下，灵敏度高。
附图说明
图1为实施例1中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图2为实施例1中角膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量下限的图谱。
图3为实施例1中角膜标准曲线中那他霉素的定量上限(即100ng/mL)图谱。
图4为实施例1中角膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量上限的图谱。
图5为实施例1中角膜那他霉素标准曲线图。
图6为实施例2中巩膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图7为实施例2中巩膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量下限的图谱。
图8为实施例2中巩膜标准曲线中那他霉素的定量上限(即100ng/mL)图谱。
图9为实施例2中巩膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量上限的图谱。
图10为实施例2中巩膜那他霉素标准曲线图。
图11为实施例3中虹膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图12为实施例3中虹膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量下限的图谱。
图13为实施例3中虹膜标准曲线中那他霉素的定量上限(即100ng/mL)图谱。
图14为实施例3中虹膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量上限的图谱。
图15为实施例3中虹膜那他霉素标准曲线图。
图16为实施例4中脉络膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图17为实施例4中脉络膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量下限的图谱。
图18为实施例4中脉络膜标准曲线中那他霉素的定量上限(即100ng/mL)图谱。
图19为实施例4中脉络膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量上限的图谱。
图20为实施例4中脉络膜那他霉素标准曲线图。
图21为实施例4中视网膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图22为实施例4中视网膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量下限的图谱。
图23为实施例5中视网膜标准曲线中那他霉素的定量上限(即100ng/mL)图谱。
图24为实施例5中视网膜标准曲线中甲苯磺丁脲(即50ng/mL)在定量上限的图谱。
图25为实施例5中视网膜那他霉素标准曲线图。
图26为实施例6中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图27为实施例7中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图28为实施例8中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图29为实施例9中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图30为实施例10中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
图31为实施例11中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明实施例中，那他霉素为22-[(3-氨基-3,6-二去氧-&beta；-D吡喃甘露糖基)氧基]-1,3,26-三羟基-12-甲基-10-氧-6,11,28-三氧杂环[22.3.1.5.7]二十八烷基-8,14,16,18,20-五烯-25-羧酸。
本发明实施例中，空白眼球壁(角膜、巩膜、虹膜、脉络膜、视网膜)基质为未加入那他霉素的新西兰实验兔的眼球壁(角膜、巩膜、虹膜、脉络膜、视网膜)。
本发明实施例中，“FA”是指甲酸；“H2O”是指水；“ACN”是指乙腈；“IPA”是指异丙醇；“MeOH”是指甲醇。
本实施例中所用试剂如下：
流动相A(MPA)：0.1％FA水溶液。取1000mL H2O，加入1mL FA于溶剂瓶中，混匀制得。室温保存，有效期1个月。
流动相B(MPB)：0.1％FA与ACN混合溶液。取1000mL ACN，加入1mL FA于溶剂瓶中，混匀制得。室温保存，有效期1个月。
强洗溶液(R3)：ACN:MeOH:IPA:DMSO＝1:1:1:1,v/v/v/v。取1000mL ACN,1000mLMeOH，1000mL IPA，1000mL DMSO于溶剂瓶中混匀制得。作为洗针液，室温保存，有效期3个月。
弱洗溶液(R0)：0.1％FA与ACN水混合溶液，取500mL H2O，500mL ACN，加入1mL FA于溶剂瓶中，混匀制得。作为洗针液，室温保存，有效期1个月。
内标稀释液：500mL ACN。室温保存，有效期3个月。
稀释液：MeOH:H2O＝1:1,v/v。取500mL MeOH，500mL H2O，混匀制得。室温保存，有效期3个月。
匀浆液：MeOH:H2O＝1:1,v/v。
实施例1
本实施例为测定眼球壁中那他霉素的方法，通过液相-质谱联用法检测眼球壁待测液中那他霉素，包括以下步骤：
1、配制标准品工作溶液和眼球壁待测液
1.1配制标准品样品溶液
(1)配制1.000mg/mL标准品储备液
称取适量那他霉素标准品于棕色玻璃样品瓶中，加入稀释液(50％甲醇水溶液)溶解、摇匀，得1.000mg/mL标准品储备液。
那他霉素标准品得含量为92.4％，由于那他霉素标准品本身含量不足100％或带有水或盐，MeOH的体积通过标准品储备液的浓度以及经折算的那他霉素质量计算得到，其中，所述的经折算的那他霉素的质量通过称取的那他霉素质量乘以那他霉素的质量折算因子92.4％计算得到。
(2)配制标准品工作液和SST工作液(***适应性样品)
将标准品储备液与稀释液混合，依照下表1配制，得到标准品工作液和SST工作液。其中，SST工作液用于平衡仪器。
表1
(3)配制角膜的标准品样品溶液
使用表1的标准品工作液与空白角膜基质混合，得到标准品样品溶液，具体见表2。在空白角膜基质中，角膜与匀浆液的体积比为1:10(例如，将10μL空白角膜基质和100μL匀浆液混合)。
表2
制得的标准品储备液、标准品工作液和标准品样品溶液均储存在超低温冰箱中(-70～-90℃)中。
1.2配制内标工作液
(1)配制1.000mg/mL内标储备液
向甲苯磺丁脲中加入内标稀释液溶解、摇匀，制得1.000mg/mL内标储备液。
甲苯磺丁脲的质量折算因子为0.999，由于甲苯磺丁脲标准品本身纯度不是100％或带有水或盐，ACN的体积通过标准品储备液的浓度以及经折算的甲苯磺丁脲质量计算得到，其中，所述的经折算的甲苯磺丁脲的质量通过所称取的甲苯磺丁脲质量乘以甲苯磺丁脲的质量折算因子0.999计算得到。
(2)配制内标工作液
将内标储备液与内标稀释液混合，依照下表3配制，得到内标工作液。
表3
1.3配制标准品待测液
(1)向50μL标准品样品溶液中加入150μL内标工作液(50.000ng/mL甲苯磺丁脲)，涡旋混匀，在4℃，离心力4700×g的条件下离心10min；
(2)取离心后的上清液100μL至96孔板中，封膜，1000rpm下涡旋混匀10min，得到标准品待测液。
2、液相-质谱联用法测定角膜待测液中那他霉素的含量
2.1角膜待测液的制备方法包括如下步骤：
S1、将含有那他霉素的角膜剪碎后，得到角膜样品，加入匀浆液进行研磨匀浆，角膜样品与匀浆液的体积比为1:10，得到角膜匀浆液；
S2、将S1中所述眼球壁匀浆液与内标物进行第一次涡旋混匀，第一次涡旋混匀转动时间均为60s，混匀至少三次；
S3、将S2中所述涡旋混合的溶液进行离心，取上清液进行第二次涡旋混匀，第二次涡旋混匀转动时间均为60s，混匀至少三次，即得角膜待测液。
2.2检测条件
采用型号为SCIEX/Triple Quad 4500的液质联用仪。
(1)液相色谱条件：
进样量：5μL；
色谱柱：YMC-Triart C18，50mm×2.1mm,1.9μm，Waters，其中，50mm为色谱柱柱长，2.1mm为色谱柱内径，1.9μm为色谱柱填料粒径；
柱温：40℃；
采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
运行时间：2.5min；
洗针程序：
冲洗类型：仅外部；
冲洗模式：抽吸前后，浸入时间：1s；
冲洗泵方式：冲洗泵，然后停止，时间：2s；
冲洗设置：冲洗速度：35μL/s；
冲洗体积：500μL；
测量管路吹扫量：100μL；
洗脱程序：
表4
表4显示了洗脱程序的参数。由表4可知，梯度洗脱的洗脱程序为：从初始状态到0.20min的时间段内，流动相A的体积百分比为80％，流动相B的体积百分比为20％；在0.21min到1.50min的时间段内，流动相A的体积百分比逐渐下降，由80％变为10％，流动相B的体积百分比逐渐上升，由20％变为90％；在1.51min到2.00min的时间段内，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；在2.00min到2.01min的时间段内，流动相A的体积百分比由10％上升为80％，流动相B的体积百分比由90％下降为20％；在2.01min到2.50min的时间段内，流动相A的体积百分比维持在80％，流动相B的体积百分比维持在20％。流动相A和流动相B的体积百分比以流动相总体积为基准。
(2)质谱条件：
仪器型号：SCIEX/Triple Quad 4500；
质谱仪仪器参数如表5所示；
表5
| 参数 | 那他霉素 | 甲苯磺丁脲 |
| 离子化电压(v) | 5500 | 5500 |
| 温度(℃) | 500 | 500 |
| 碰撞气(psi) | 9 | 9 |
| 气帘气(psi) | 35 | 35 |
| 喷雾气(psi) | 50 | 50 |
| 辅助气(psi) | 50 | 50 |
| 去簇电压(v) | 70 | 50 |
| 入口电压(v) | 10 | 10 |
| 碰撞能(v) | 15 | 25 |
| 碰撞室出口电压(v) | 20 | 20 |
离子源：电喷雾电离ESI；
离子化模式：正离子模式，采用多反应监测模式MRM，MRM离子对信息如表6所示；
扫描间隔时间：80ms
表6
| 分析物 | Q1质荷比 | Q3质荷比 | 扫描间隔(ms) |
| 那他霉素 | 666.300 | 503.300 | 80 |
| 甲苯磺丁脲 | 271.100 | 154.800 | 80 |
2.2标准曲线及回归方程
(1)回归方程的确定
提取MRM色谱图，拟合标准曲线，标准曲线以标准品工作液浓度为横坐标，以标准工作液与内标峰面积比值为纵坐标，设置权重为1/x2，忽略原点，拟合线性标准曲线。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物得理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物得实测浓度。
样品中分析物的实测浓度由以下回归方程计算：
y＝ax+b
其中，y＝分析物与内标峰面积比
a＝标准曲线之斜率
x＝分析物浓度(单位ng/mL)
b＝标准曲线之截距(权重因子为1/x2)
(2)分析批接受标准
1)标准曲线各浓度点的回算值与标示值之间的偏差应在±15.0％范围内(定量下限处的偏差在±20.0％范围内)；
2)至少75％的标准曲线样品，且每个浓度点至少50％的样品应符合接受标准；
3)回归方程的相关系数(r2)必须大于等于0.98；
4)当至少67％的质控样品结果(每个浓度至少50％)与它们相应标示值的偏差在±15.0％之内时，该分析批认为可接受。
(3)回归方程和标准曲线：
图1和图2为STD1样品进样分析所测；图3和图4为STD8样品进样分析所测；图1～图4均表明在标准曲线中的浓度均可通过色谱-质谱联用法进行检测。本实施例中，那他霉素(100ng/mL)和内标物(50ng/mL)的响应值达到了3.0e6(对应于图3图谱的峰面积)、5.5e5(对应于图4图谱的峰面积)。
本实施例中，角膜待测液的标准曲线回归方程如图5所示，标准曲线回归方程为：y＝0.00677x-0.00034(r＝0.9942，r2＞0.99)，标准曲线如图5所示。采用本实施例的测试方法可达到0.2ng/mL的检测下限，灵敏度高。
实施例2
通过液相色谱-质谱联用法检测眼球壁中那他霉素的方法。
将实施例1中使用的角膜替换为巩膜，其他实验条件均与实施例1相同。
图6和图7为STD1样品进样分析所测；图8和图9为STD8样品进样分析所测；图6～图9均表明在标准曲线中的浓度均可通过色谱-质谱联用法进行检测。本实施例中，那他霉素(100ng/mL)和内标物(50ng/mL)的响应值达到了1.39e5(对应于图8图谱的峰面积)、2.19e5(对应于图9图谱的峰面积)。
本实施例中，巩膜待测液的标准曲线回归方程如图10所示，标准曲线回归方程为：y＝0.0057x-0.000031(r＝0.9963，r2＞0.99)，标准曲线如图10所示。采用本实施例的测试方法可达到0.2ng/mL的检测下限，灵敏度高。
实施例3
通过液相色谱-质谱联用法检测眼球壁中那他霉素的方法。
将实施例1中使用的角膜替换为虹膜，其他实验条件均与实施例1相同。
图11和图12为STD1样品进样分析所测；图13和图14为STD8样品进样分析所测；图11～图14均表明在标准曲线中的浓度均可通过色谱-质谱联用法进行检测。本实施例中，那他霉素(100ng/mL)和内标物(50ng/mL)的响应值达到了1.53e5(对应于图13图谱的峰面积)、2.59e5(对应于图14图谱的峰面积)。
本实施例中，虹膜待测液的标准曲线回归方程如图15所示，标准曲线回归方程为：y＝0.00548x-0.000227(r＝0.9970，r2＞0.99)，标准曲线如图15所示。采用本实施例的测试方法可达到0.2ng/mL的检测下限，灵敏度高。
实施例4
通过液相色谱-质谱联用法检测眼球壁中那他霉素的方法。
将实施例1中使用的角膜替换为脉络膜，其他实验条件均与实施例1相同。
图16和图17为STD1样品进样分析所测；图18和图19为STD8样品进样分析所测；图16～图19均表明在标准曲线中的浓度均可通过色谱-质谱联用法进行检测。本实施例中，那他霉素(100ng/mL)和内标物(50ng/mL)的响应值达到了1.37e5(对应于图18图谱的峰面积)、2.42e5(对应于图19图谱的峰面积)。
本实施例中，脉络膜待测液的标准曲线回归方程如图20所示，标准曲线回归方程为：y＝0.00531x-0.000142(r＝0.9972，r2＞0.99)，标准曲线如图20所示。采用本实施例的测试方法可达到0.2ng/mL的检测下限，灵敏度高。
实施例5
通过液相色谱-质谱联用法检测眼球壁中那他霉素的方法。
将实施例1中使用的角膜替换为视网膜，其他实验条件均与实施例1相同。
图21和图22为STD1样品进样分析所测；图23和图24为STD8样品进样分析所测；图21～图24均表明在标准曲线中的浓度均可通过色谱-质谱联用法进行检测。本实施例中，那他霉素(100ng/mL)和内标物(50ng/mL)的响应值达到了1.43e5(对应于图23图谱的峰面积)、2.96e5(对应于图24图谱的峰面积)。
本实施例中，视网膜待测液的标准曲线回归方程如图25所示，标准曲线回归方程为：y＝0.00498x+0.00000603(r＝0.9967，r2＞0.99)，标准曲线如图25所示。采用本实施例的测试方法可达到0.2ng/mL的检测下限，灵敏度高。
实施例6
本实施例中，除步骤S2中，将型号为YMC-Triart C18的色谱柱调整为X-BridgeBEH C18外，其他实验条件均与实施例1相同。
图26为本实施例中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。从图26中可以看出，测定角膜待测液，得到的标准曲线在定量下限为0.2ng/mL时，那他霉素的图谱基线高，分离度不够。虽然本实施例较难达到0.2ng/mL的检测下限，采用本实施例的测试方法可达到50ng/mL的检测下限。
实施例7
本实施例中，除步骤S2中，将色谱柱的规格50mm×2.1mm,1.9μm调整为2.1mm×50mm，2.5μm外，其他实验条件均与实施例1相同。
图27为本实施例中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。从图27中可以看出，测定角膜待测液，得到的标准曲线在定量下限为0.2ng/mL时，那他霉素的图谱基线高，不能在正确的出峰位置出峰。虽然本实施例较难达到0.2ng/mL的检测下限，采用本实施例的测试方法可达到50ng/mL的检测下限。
实施例8
本实施例中，除将流动相A(MPA)：0.1％FA水溶液调整为流动相A(MPA)：0.002％FA水溶液外，其他实验条件均与实施例1相同。
图28为本实施例中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。从图28中可以看出，测定角膜待测液，得到的标准曲线在定量下限为0.2ng/mL时，那他霉素的图谱出现裂峰。虽然本实施例较难达到0.2ng/mL的检测下限，采用本实施例的测试方法可达到50ng/mL的检测下限。
实施例9
本实施例中，除步骤S2中，将表4中洗脱程序的参数调整如下表7中的数据外，其他实验条件均与实施例1相同。
表7
图29为本实施例中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。从图29中可以看出，测定角膜待测液，得到的标准曲线在定量下限为0.2ng/mL时，那他霉素的图谱基线高，响应值很低，分离度差。虽然本实施例较难达到0.2ng/mL的检测下限，采用本实施例的测试方法可达到50ng/mL的检测下限。
实施例10
本实施例中，除步骤S1中，将均浆仪的搅拌速度从6m/sec调整为1m/sec外，其他实验条件均与实施例1相同。
图30为本实施例中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。从图30中可以看出，测定角膜待测液，得到的标准曲线在定量下限为0.2ng/mL时，那他霉素的图谱基线高，响应值很低，分离度差。虽然本实施例较难达到0.2ng/mL的检测下限，采用本实施例的测试方法可达到50ng/mL的检测下限。
实施例11
本实施例中，除步骤S1中，将内标稀释液ACN调整为MeOH外，其他实验条件均与实施例1相同。
图31为本实施例中角膜标准曲线中那他霉素的定量下限(即0.2ng/mL)图谱。从图31中可以看出，测定角膜待测液，得到的标准曲线在定量下限为0.2ng/mL时，那他霉素的图谱基线高，响应值很低，分离度差。虽然本实施例较难达到0.2ng/mL的检测下限，采用本实施例的测试方法可达到50ng/mL的检测下限。
效果实施1角膜待测液的专属性
(1)配制质控储备液
参照步骤(1.1配制标准品样品溶液)中标准品储备液的制备
(2)配制质控工作液
将质控储备液与稀释液混合，依照下表8配制，得到质控工作液。
表8
(3)配制质控样品溶液
使用表8的质控工作液与空白角膜基质混合，得到标准品样品溶液，具体见表9。在空白角膜基质中，角膜与匀浆液的体积比为1:10(例如，将10μL空白角膜基质和100μL匀浆液混合)。
表9
制得的质控样品溶液储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
(4)配制质控溶液
1)向50μL质控样品溶液中加入150μL内标工作液(50.000ng/mL甲苯磺丁脲)；涡旋混匀后，在4℃，离心力4700×g的条件下离心10min；
2)取离心后的上清液100μL至96孔板中，封膜，1000rpm下涡旋混匀10min；得到质控溶液。
(5)进样检测
参照步骤(2.2检测条件)的检测条件。
(6)分析批接收标准
1)标准曲线各浓度点的回算值与标示值之间的偏差应在±15.0％范围内(定量下限处的偏差在±20.0％范围内)；
2)至少75％的标准曲线样品，且每个浓度点至少50％的样品应符合接受标准；
3)回归方程的相关系数(r2)必须大于等于0.98；
4)当至少67％的质控样品结果(每个浓度至少50％)与它们相应标示值的偏差在±15.0％之内时，该分析批认为可接受。
角膜标准品样品溶液、质控样品溶液与标示值准确度偏差结果如表10、表11所示，满足分析批接受标准。
表10
表11
效果实施2巩膜待测液的专属性
巩膜标准品样品溶液、质控样品溶液与标示值准确度偏差结果如表12、表13所示，满足分析批接受标准。
表12
表13
效果实施3虹膜待测液的专属性
虹膜标准品样品溶液、质控样品溶液与标示值准确度偏差结果如表14、表15所示，满足分析批接受标准。
表14
表15
效果实施4脉络膜待测液的专属性
脉络膜标准品样品溶液、质控样品溶液与标示值准确度偏差结果如表16、表17所示，满足分析批接受标准。
表16
表17
效果实施5视网膜待测液的专属性
视网膜标准品样品溶液、质控样品溶液与标示值准确度偏差结果如表18、表19所示，满足分析批接受标准。
表18
表19
综上，本发明的方法可以用于测定新西兰实验兔中眼球壁(角膜、巩膜、虹膜、脉络膜、视网膜)的分析物(即那他霉素)的浓度。
Claims (10)
1.一种测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，其采用液相色谱-质谱联用法测定眼球壁待测液中那他霉素的含量；
所述液相色谱-质谱联用法中的液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为有机酸水溶液，所述流动相A中的有机酸占所述流动相A体积的0.002％～0.1％；所述流动相B为有机酸与乙腈的混合液，所述流动相B中的有机酸占所述流动相B体积的0.002％～0.1％；所述流动相A和所述流动相B的体积比为x:(100-x)，其中，10≤x≤80；所述有机酸为甲酸或乙酸；
所述眼球壁待测液包括那他霉素和内标物。
2.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用法采用液质联用仪；较佳地，所述液质联用仪的型号为SCIEX/Triple Quad 4500；
和/或，所述液相色谱-质谱联用法中，所述液相色谱的色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶，例如YMC-Triart C18；
和/或，所述液相色谱-质谱联用法中，所述液相色谱的色谱柱的规格为50mm×2.1mm,1.9μm；
和/或，所述液相色谱-质谱联用法中，所述液相色谱的柱温为30～50℃，例如40℃；
和/或，所述液相色谱-质谱联用法中，所述液相色谱的进样量为1～20μL，例如5μL；
和/或，所述液相色谱-质谱联用法中，所述质谱的离子源为电喷雾电离ESI；
和/或，所述液相色谱-质谱联用法中，所述质谱的离子化模式为正离子化模式；
和/或，所述液相色谱-质谱联用法中，所述质谱采用多反应检测模式；较佳地，所述多反应监测模式中，所述那他霉素的母离子的质荷比为666.3，子离子的质荷比为503.3；更佳地，当内标物为甲苯磺丁脲，所述甲苯磺丁脲中的母离子的质荷比为271.1，子离子的质荷比为154.8；
和/或，所述液相色谱-质谱联用法中，所述质谱的扫描间隔时间为70～90ms，例如80ms。
3.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，所述液相色谱的洗脱方式采用梯度洗脱；较佳地，不同时间段，所述流动相A和所述流动相B的体积比如下表：
和/或，所述液相色谱的流动相的流速为0.4～0.6mL/min，例如0.5mL/min；
和/或，所述流动相A中的有机酸占所述流动相A体积的0.05％～0.1％，例如0.1％；
和/或，所述流动相B中的有机酸占所述流动相B体积的0.05％～0.1％，例如0.1％。
4.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，所述眼球壁包括角膜、巩膜、虹膜、脉络膜和视网膜中的一种或多种；
和/或，所述眼球壁为新西兰大白兔的眼球壁；
和/或，所述内标物为甲苯磺丁脲。
5.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，所述眼球壁待测液的制备方法包括如下步骤：S1、将含有那他霉素的眼球壁剪碎后，得到眼球壁样品，加入匀浆液进行研磨匀浆，得到眼球壁匀浆液；S2、将S1中所述眼球壁匀浆液与内标物进行第一次涡旋混匀；S3、将S2中所述涡旋混合的溶液进行离心，取上清液进行第二次涡旋混匀，即得所述眼球壁待测液。
6.如权利要求5所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，所述眼球壁样品与所述匀浆液的体积比为1:(8～20)，例如1:10；
和/或，所述匀浆液为甲醇和水的混合液；较佳地，所述甲醇占所述匀浆液的体积的10％～50％，例如50％；
和/或，所述第一次涡旋混匀和第二次涡旋混匀的速度均为3～8m/sec，例如8m/sec；
和/或，所述第一次涡旋混匀和第二次涡旋混匀的转动时间均为50～70s，例如60s；
和/或，所述第一次涡旋混匀和第二次涡旋混匀的次数均为至少3次，例如3次；
和/或，所述离心的温度为4℃；
和/或，所述离心的离心力为4700×g；
和/或，所述离心的时间为10min。
7.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，在检测所述眼球壁待测液之前，建立标准曲线；较佳地，所述标准曲线的建立包括如下步骤：
①配制那他霉素标准品工作液和内标工作液；
②将步骤①中所述的标准品工作液与空白眼球壁基质混合，得到标准样品溶液；
③将步骤①中所述的内标工作液加入步骤②中所述的标准样品溶液，进行涡旋混合、离心，取上清液，涡旋混合，得到标准品待测液；
④采用所述液相色谱-质谱联用法分析步骤③中所述标准品待测液，测得那他霉素与所述内标物的峰面积比；
⑤根据所述那他霉素与所述内标物的峰面积比和所述标准品工作液的浓度拟合，得到回归方程，并绘制所述标准曲线，即可。
8.如权利要求7所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，步骤①中，所述标准品工作液包括那他霉素和稀释液；所述稀释液为50％甲醇水溶液；
和/或，步骤①中，所述标准品工作液的配制方法包括以下步骤：将所述那他霉素与稀释液混合，得到标准品储备液；再将所述标准品储备液与所述稀释液混合，即可；
和/或，步骤①中，所述标准品工作液中的那他霉素的浓度为4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL或2000ng/mL；
和/或，步骤①中，所述内标工作液包括甲苯磺丁脲与内标稀释液；较佳地，所述内标稀释液为乙腈；
和/或，步骤①中，所述内标工作液的配制方法包括以下步骤：将所述内标物与所述内标稀释液混合，即得内标储备液；再将所述内标储备液与所述内标稀释液混合，即可；
和/或，步骤①中，所述内标工作液的浓度为45～55ng/mL，例如50ng/mL。
9.如权利要求8所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，步骤②中，所述标准样品溶液中那他霉素的浓度为0.2ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL或100ng/mL。
10.如权利要求8所述的测定眼球壁中那他霉素的方法，其特征在于，当步骤②中所述空白眼球壁基质为角膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.0067x-0.00034(r＝0.9942，r2＞0.98)；
或，当步骤②中所述空白眼球壁基质为巩膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.0057x-0.000031(r＝0.9963，r2＞0.98)；
或，当步骤②中所述空白眼球壁基质为虹膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.00548x-0.000227(r＝0.9970，r2＞0.98)；
或，当步骤②中所述空白眼球壁基质为脉络膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.00531x-0.000142(r＝0.9972，r2＞0.98)；
或，当步骤②中所述空白眼球壁基质为视网膜时，步骤⑤中所述的回归方程为y＝0.00498x-0.00000603(r＝0.9967，r2＞0.98)。
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| CN106841429A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-06-13 | 华中农业大学 | 一种牛奶中抗菌类药物的高通量筛选方法 |
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