CN115449501A - 巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用 - Google Patents

巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用；步骤如下：S1、生产用液体菌种的制备：以尖孢镰刀菌FJAT‑9290为菌种，以马铃薯葡萄糖培养基PDB为菌种用培养基，制备生产用液体菌种；S2、尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：以巨菌草汁为液体培养基，灭菌后，接种步骤S1所制备的液体菌种，26‑30℃、160‑200r/min振荡培养6‑8d，获得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。该应用方法以巨菌草汁为培养基，进行非致病性尖孢镰刀菌的发酵，发酵方法简单、成本低，经过发酵后的非致病性尖孢镰刀菌菌含量与真菌常用的PDB培养基发酵效果相当，对于提高巨菌草的高附加值利用具有重要意义。

Description

巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用
技术领域
本发明涉及细菌培养基技术领域，尤其是涉及巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用。
背景技术
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的非致病性菌株因能够在植株中定殖、不造成植物病害且对致病性菌株有良好的拮抗作用，被作为天然的植物疫苗菌株，已应用于多种作物枯萎病的防治(Shishido et al.,2005；Veloso et al.,2012；Pu et al.,2014)。现有技术已公开的非致病性尖孢镰刀菌菌株FJAT-9290是一种天然的植物疫苗菌株，前期研究已表明，该菌株不会引起茄科、葫芦科、芭蕉科和百合科等作物发病，且在茄科、葫芦科及芭蕉科等作物上具有良好的定殖能力，可达40-90天。采用提前施用的方法能促进植物生长，且对番茄枯萎病有较好的防治效果，其中盆栽防治效果为 76.70％，田间小区防治效果为69.56％，略高于化学农药50％多菌灵可湿性粉剂处理的防治效果68.64％(肖荣凤等，2015.非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290的定殖特性及对番茄枯萎病的防治效果.植物保护学报,2:169-175)。
现有技术中，非致病性尖孢镰刀菌的发酵培养基，通常使用真菌常用的PDB培养基。
巨菌草是系多年生禾本科直立丛生型植物，根系发达，生长迅速，已知其富含有机酸、多酚类、蛋白质、纤维素、糖类等生物物质。巨菌草适应能力强，在我国各地区被广泛种植。目前巨菌草多用于饲料、沼气发酵生产、燃烧发电、生物质乙醇制造等传统领域上。
目前，还未见过利用巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌的发酵培养基的报道，对于巨菌草的高附加值利用具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用。该应用方法以巨菌草汁为培养基，进行非致病性尖孢镰刀菌的发酵，发酵方法简单、成本低，经过发酵后的非致病性尖孢镰刀菌菌含量与真菌常用的PDB 培养基发酵效果相当，且可使巨菌草汁废弃物变废为宝，对于提高巨菌草的高附加值利用具有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用。
作为一种实施方式，所述非致病性尖孢镰刀菌是尖孢镰刀菌FJAT-9290。
本申请中所述尖孢镰刀菌FJAT-9290：
分类命名：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2012年3月29日
保藏编号：CGMCC No.5910
作为一个优选的实施方式，所述应用的方法步骤如下：
S1、生产用液体菌种的制备：
以尖孢镰刀菌FJAT-9290为菌种，以马铃薯葡萄糖琼脂PDB培养基为菌种用培养基，制备生产用液体菌种；
S2、尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：
以巨菌草汁为液体培养基，灭菌后，接种步骤S1所制备的液体菌种，26-30℃、160-200r/min振荡培养6-8d，获得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。
作为一个优选的实施方式，步骤S1中，所述生产用液体菌种的制备的具体步骤如下：
S11、菌种的活化：
配置PDA培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取 -70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290菌株于PDB培养基平板上划线培养， 28-30℃恒温培养5-7天，获得菌丝；
S12、制备生产用液体菌种
配置PDB液体培养基，挑取步骤S11中的菌丝接种于PDB液体培养基中， 28-30℃，170-200r/min摇床培养5-7天，即为生产用液体菌种。
作为一种实施方式，步骤S11中，所述PDA培养基中包括：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖15.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20g/L，且pH＝7.0。
作为一种实施方式，步骤S12中，所述PDB液体培养基中包括：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖15.0g/L，氯化钠5.0g/L，且pH＝7.0。
作为一个优选的实施方式，步骤S2中，所述尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备的具体步骤如下：
S21、以新鲜巨菌草为材料，采用榨汁机压榨后出汁液，过滤废渣后得巨菌草汁；
S22、以纯巨菌草汁为液体培养基或巨菌草汁与PDB液体培养液的混合物为培养基，调整pH值为7.0，121℃灭菌20min；
S23、向灭菌后的液体培养基中按接种量1％接种步骤S1中得到的生产用液体菌种，在30℃恒温下，180r/min振荡培养30h，即得尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
本发明的有益效果
本发明的应用方法以巨菌草汁为培养基，进行非致病性尖孢镰刀菌的发酵，发酵方法简单、成本低，经过发酵后的非致病性尖孢镰刀菌菌含量与真菌常用的PDB培养基发酵效果相当，且可使巨菌草汁废弃物变废为宝，对于提高巨菌草的高附加值利用具有重要意义。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
除非另有说明，本文中所用的所有百分比和比率均以总组合物重量计。除非另有说明，本文提及的所有成分的百分数、比例和含量均基于该成分的实际含量，并不包括在市售产品找那个可以与这些成分组合的溶剂、填料或其它物质。
本文中的术语“包含/包括”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。
本文中的术语“优选地”和它的变体是指在特定环境下能够提供特定有益效果的本发明的实施方案。然而，其它的实施方案在相同或其它的环境下也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详细描述并不表示其它实施方案是无用的，并且不旨在本发明的范畴中排除其它的实施方案。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
作为本发明的一个方面，本发明提供巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用。
作为一个实施例，所述非致病性尖孢镰刀菌是尖孢镰刀菌FJAT-9290。
本申请中所述尖孢镰刀菌FJAT-9290，于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.5910。
作为一个优选的实施例，所述应用的方法步骤如下：
S1、生产用液体菌种的制备：
以尖孢镰刀菌FJAT-9290为菌种，以马铃薯葡萄糖琼脂PDB培养基为菌种用培养基，制备生产用液体菌种；
S2、尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：
以巨菌草汁为液体培养基，灭菌后，接种步骤S1所制备的液体菌种，26-30℃、160-200r/min振荡培养6-8d，获得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。
作为一个优选的实施例，步骤S1中，所述生产用液体菌种的制备的具体步骤如下：
S11、菌种的活化：
配置PDA培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取 -70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290菌株于PDB培养基平板上划线培养， 28-30℃恒温培养5-7天，获得菌丝；
S12、制备生产用液体菌种
配置PDB液体培养基，挑取步骤S11中的菌丝接种于PDB液体培养液中， 28-30℃，170-200r/min摇床培养5-7天，即为生产用液体菌种。
作为一个实施例，步骤S11中，所述PDA培养基中包括：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖15.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20g/L，且pH＝7.0。
作为一个实施例，步骤S12中，所述PDB液体培养基中包括：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖15.0g/L，氯化钠5.0g/L，且pH＝7.0。
作为一个优选的实施例，步骤S2中，所述尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备的具体步骤如下：
S21、以新鲜巨菌草为材料，采用榨汁机压榨后出汁液，过滤废渣后得巨菌草汁；
S22、以纯巨菌草汁为液体培养基或巨菌草汁与PDB液体培养液的混合物为培养基，调整pH值为7.0，121℃灭菌20min；
S23、向灭菌后的液体培养基中按接种量1％接种步骤S1中得到的生产用液体菌种，在30℃恒温下，180r/min振荡培养30h，即得尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。
实施例1-实施例5、对照组
巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用，步骤如下：
1)试验材料的准备
菌草汁：以新鲜巨菌草汁为材料，采用榨汁机压榨后过滤废渣得巨菌草汁。
主要菌种：非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290，由福建省农业科学院生物资源所菌种库保存；2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.5910。
PDB液体培养基：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10.0g/L；葡萄糖15.0g/L；氯化钠 5.0g/L，pH＝7.0；分装于250mL三角瓶中，每瓶装培养基100mL；在121℃,20min 高压灭菌，冷却，待使用。
2)试验方法
2.1)非致病性尖孢镰刀菌的活化：配置PDA培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290菌株于PDB培养基平板上划线培养，28-30℃恒温培养5～7天，得到已活化的菌丝；
2.2)非致病性尖孢镰刀菌生产用液体菌种的制备：挑取已活化的菌丝接种于PDB培养基中，28～30℃，180r/min摇床培养5～7天，即为生产用液体菌种；
2.3)巨菌草液体培养基的配制：将巨菌草汁分别以0％、20％、40％、60％、80％和100％的体积比例与PDB液体培养基混合，调至pH＝7.0，分装于250mL三角瓶中，每只三角瓶装液量100mL，121℃灭菌20min；每个处理3个重复；
2.4)非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：以1％接种量接种上述制备的非致病性尖孢镰刀菌种子液于巨菌草液体培养基中，28～30℃恒温下，180r/min振荡培养7d，即植物疫苗液体发酵产物；以接种于PDB液体培养基为对照；
2.5)发酵产物孢子数检测：发酵产物用双层无菌纱布过滤得到孢子悬浮液，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7系列稀释后，涂布于PDA培养基平板，于28℃培养5d，统计孢子数量；
3)试验结果
参见表1所示：非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290可在含有菌草汁的培养基中发酵生长，各处理组发酵的活菌含量范围在(4.33-7.23)×107cuf/ml间，均与纯PDB培养基对照组(4.28×107cuf/ml)无显著差异，巨菌草汁含量对该菌的生长无显著不良影响，可用于该菌的发酵。
表1：巨菌草汁对非致病性尖孢镰刀菌的生长影响
处理组(巨菌草汁含量％) 孢子数(cfu/ml)
对照组(0％) (4.28±0.17)×10<sup>7a</sup>
实施例1(20％) (5.50±0.51)×10<sup>7a</sup>
实施例2(40％) (5.08±0.45)×10<sup>7a</sup>
实施例3(60％) (7.23±1.36)×10<sup>7a</sup>
实施例4(80％) (6.53±1.84)×10<sup>7a</sup>
实施例5(100％) (4.33±0.47)×10<sup>7a</sup>
本发明意外地发现，以巨菌草汁为培养基或者巨菌草汁与任意比例的PDB培养基的混合溶液为培养基，经过发酵后的非致病性尖孢镰刀菌菌含量与常用的PDB培养基发酵效果相当或略优。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.巨菌草汁作为非致病性尖孢镰刀菌发酵培养基的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述非致病性尖孢镰刀菌是尖孢镰刀菌FJAT-9290。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的方法步骤如下：
S1、生产用液体菌种的制备：
以尖孢镰刀菌FJAT-9290为菌种，以马铃薯葡萄糖培养基PDB为菌种用培养基，制备生产用液体菌种；
S2、尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：
以巨菌草汁为液体培养基，灭菌后，接种步骤S1所制备的液体菌种，26-30℃、160-200r/min振荡培养6-8d，获得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤S1中，所述生产用液体菌种的制备的具体步骤如下：
S11、菌种的活化：
配置PDA培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290菌株于PDB培养基平板上划线培养，28-30℃恒温培养5-7天，获得菌丝；
S12、制备生产用液体菌种
配置PDB液体培养基，挑取步骤S11中的菌丝接种于PDB液体培养基中，28-30℃，170-200r/min摇床培养5-7天，即为生产用液体菌种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤S11中，所述PDA培养基中包括：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖15.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20g/L，且pH＝7.0。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤S12中，所述PDB液体培养基中包括：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖15.0g/L，氯化钠5.0g/L，且pH＝7.0。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤S2中，所述尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备的具体步骤如下：
S21、以新鲜巨菌草为材料，采用榨汁机压榨后出汁液，过滤废渣后得巨菌草汁；
S22、以纯巨菌草汁为液体培养基或巨菌草汁与PDB液体培养基的混合物为培养基，调整pH值为7.0，121℃灭菌20min；
S23、向灭菌后的液体培养基中按接种量1％接种步骤S1中得到的生产用液体菌种，在30℃恒温下，180r/min振荡培养30h，即得尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。
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郑华坤等: "巨菌草(Pennisetum giganteum)研究进展", 福建农林大学学报(自然科学版), vol. 48, no. 06, pages 681 - 687 *

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