CN115433565A - 用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,包括以下步骤:1)采用包含氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉和4‑巯基苯硼酸在内的原料,通过水热法合成碳量子点;2)制备比率型荧光碳点配合物:3)制备羧基聚苯乙烯微球;4)将步骤2)得到的比率型荧光碳点配合物修饰到步骤3)得到的羧基聚苯乙烯微球上,得到该比率型荧光探针。本发明先制备了具有双荧光发射的比率型荧光碳点配合物,然后将其物修饰到羧基聚苯乙烯微球上,构建得到了一种能够用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针,能够实现核酸扩增产物的高灵敏度、高准确性检测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域,特别涉及一种用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法。
背景技术
核酸扩增技术在食品安全检测、动植物检疫、环境监控、医疗诊断、法医鉴定等领域具有广泛应用,该技术通过核酸扩增产物的分析来实现样品中目标物的定性、定量检测,所以核酸扩增产物检测的准确性、灵敏度对核酸扩增技术的应用具有重要意义。
核酸扩增产物的定量分析方法主要有实时荧光定量法和凝胶成像分析。荧光实时定量法是一种被广泛应用的成熟技术,该方法在DNA扩增反应体系中加入荧光探针,随着扩增反应的进行,扩增产物不断积累,导致荧光信号不断积累,从而利用荧光信号的变化实时监测整个扩增进程。目前,常规的荧光定量法通常是通过在探针上标记荧光物质,最后通过荧光检测进行核酸定量分析,常规的荧光定量法在灵敏度、准确性上的提升已经遇到了一些瓶颈,有必要提供更多的检测方案来丰富核酸扩增产物的的检测手段。
检测核酸扩增反应中会产生副产物焦磷酸,而焦磷酸根(PPi)能进一步分解为磷酸根离子,基于此,现有技术中出现了通过检测磷酸根离子来对核酸扩增产物进行定性或定量检测的方案,例如专利CN114181809A公开的一种核酸扩增产物定量检测仪器及核酸扩增产物定量检测方法,其先通过焦磷酸酶将焦磷酸分解为磷酸根离子,然后通过检测磷酸根离子的含量来对核酸扩增产物进行定量,该专利提供了一种新的核酸扩增产物检测思路,但其至少存在以下不足:(1)其需要通过焦磷酸酶将焦磷酸分解为磷酸根离子,来间接检测焦磷酸的含量,检测结果依赖焦磷酸酶的活性;(2)其采用的是常规的磷酸根离子检测方法,采用的试剂较多、操作较为繁琐。
碳量子点(CDs)是近年来出现的一类新型碳纳米材料,其特殊的性质使得其可作用荧光物质应用于生物检测,如焦磷酸根的检测。专利CN111334293A公开了一种黄光发射荧光探针及其制备方法、选择性检测铁离子和PPi的方法以及细胞成像方法,其通过一种氮掺杂碳量子点构建了一种选择性检测PPi的方法。当该方案存在如下不足:(1)该氮掺杂碳量子点是基于单色荧光检测原理,可实现PPi、Fe3+的检测,以氮掺杂碳量子的单色荧光强度的变化实现目标物的检测,其抗干扰能力较弱,容易受到环境中Fe3+、Cu2+等物质的干扰,难以应用于核酸扩增产物中PPi的精确检测;(2)碳量子点粒径小,容易因粒子间相互作用而出现聚集诱导荧光猝灭的现象,会影响检测结果的准确性。与该专利类似的另外一些方案同样存在以上问题,所以此类方案还难以直接应用于核酸扩增产物中PPi的检测。
若是能够结合碳量子点的荧光特性,通过碳量子点直接检测核酸扩增产物中PPi的含量,从而实现核酸扩增产物进行定性和/或定量分析,对核酸扩增技术显然会具有重要意义,但现在未见公开可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足,提供一种用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
1)采用包含氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉和4-巯基苯硼酸在内的原料,通过水热法合成碳量子点;
2)制备比率型荧光碳点配合物:
2-1)利用步骤1)得到的碳量子点制备碳点溶液;
2-2)将稀土金属离子Mn+的溶液与碳点溶液混合,用碱溶液调节反应体系的pH值至7-10,在加热下反应,制备得到M与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物;
3)制备羧基聚苯乙烯微球;
4)将步骤2)得到的比率型荧光碳点配合物修饰到步骤3)得到的羧基聚苯乙烯微球上,得到该比率型荧光探针。
优选的是,其中,Mn+为Tb3+、Eu3+、DY3+或Sm3+。
优选的是,所述步骤1)具体包括:
1-1)将氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉、4-巯基苯硼酸加入乙醇和水的混合溶液中,超声,得到混合物;
1-2)将步骤1-1)得到的混合物转移到水热反应釜中,150-230℃下反应8-24h;
1-3)反应结束后冷却至室温,产物离心,离心液先用滤膜过滤,得到的滤液用截留分子量为500-1000Da的透析袋透析12-48h,收集透析袋内的透析液,冷冻干燥,得到碳量子点。
优选的是,所述步骤2)具体包括:
2-1)将步骤1)制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散5-30min,制备得到碳点溶液;
2-2)制备稀土金属离子Mn+的溶液,然后在持续搅拌下将Mn+溶液加入到步骤2-1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7-10,在50-85℃,反应10-60min;
2-3)反应结束后冷却至室温,产物在2000-6000rpm下离心1-5min,固体产物真空干燥,得到M与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。
优选的是,其中,Mn+为Tb3+,所述步骤2)具体包括:
2-1)将步骤1)制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散5-30min,制备得到碳点溶液;
2-2)将Tb(NO3)3·6H2O溶解在超纯水中,制备得到Tb3+溶液,然后在持续搅拌下将Tb3+溶液加入到步骤2-1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7-9,在55-70℃,反应10-60min;
2-3)反应结束后冷却至室温,产物在2000-6000rpm下离心1-5min,固体产物真空干燥,得到Tb与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。
优选的是,其中,所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氨水。
优选的是,所述步骤3)具体包括:
3-1)制备聚苯乙烯微球:
3-1-1)将PVP溶解于无水乙醇中,搅拌均匀,通入N2,得到混合物A;
3-1-2)将AIBN加入苯乙烯中,搅拌均匀,通入N2,得到混合物B;
3-1-3)将混合物A和B混合,搅拌均匀,于40-65℃下反应5-45min,然后升高温度至68-95℃,聚合反应6-24h;
3-1-4)反应结束后离心,将离心得到的固体产物用乙醇和去离子水依次清洗,干燥过夜,得到聚苯乙烯微球;
3-2)聚苯乙烯微球表面羧基化包覆:
3-2-1)将聚苯乙烯微球分散在十二烷基硫酸钠溶液中;
3-2-2)向步骤3-2-1)得到的混合物中加入过硫酸钠、十一烯酸的乙醇溶液和二乙烯基苯的甲醇溶液,搅拌均匀,超声3-25min;
3-2-3)于55-90℃下反应3-10h,反应结束后离心,离心得到的固体产物用乙醇和水依次清洗,干燥,得到羧基聚乙烯微球。
优选的是,所述步骤4)具体包括:
4-1)将步骤2)制得的比率型荧光碳点配合物加入去离子水中,超声分散,制备成荧光碳点配合物溶液;
4-2)向荧光碳点配合物溶液中加入1,3-二环己基碳二亚胺;
4-3)取步骤3)制得的羧基聚乙烯微球加入到步骤4-2)得到的混合液中,40-75℃下,搅拌反应6-16小时,反应结束后离心,离心得到的固体产物用去离子水洗涤,真空干燥,得到该比率型荧光探针。
优选的是,利用该比率型荧光探针进行核酸扩增产物检测的方法为:
Ⅰ、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成探针溶液;
Ⅱ、将步骤Ⅰ得到的探针溶液加入到待测样品进行核酸扩增反应后的产物中,搅拌均匀得到检测混合液,静置3-20min;
Ⅲ、利用波长为385nm的激发光源照射步骤Ⅱ得到的检测混合液,测量检测混合液在582nm处的黄色荧光强度I582以及554nm处的绿色荧光强度I554,计算出I582/I554的值,最后根据预先建立的表征荧光强度比值I1/I2与待测样品中目标物浓度关系的标准曲线fB,计算得到待测样品中的目标物浓度,实现核酸扩增产物的定量检测。
优选的是,所述步骤Ⅲ中,标准曲线fB的构建方法为:
a、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成探针溶液;
b、根据要检测的目标物,预先一系列浓度的若干份体积均为V的目标物标准溶液,然后将每份目标物标准溶液于相同条件下分别进行核酸扩增;
c、完成核酸扩增后,在得到的每份扩增产物中分别加入等体积、等浓度的探针溶液,搅拌均匀得到检测混合液,静置3-20min;
d、对于每一份检测混合液,测量其在385nm的激发光下,582nm处的荧光强度I582以及554nm处的荧光强度I554,计算出I582/I554的值,以目标物标准溶液的浓度为X轴,I582/I554的值为Y轴,进行曲线拟合,得到表征荧光强度比值I582/I554与目标物浓度关系的标准曲线fB。
本发明的有益效果是:
本发明以氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉和4-巯基苯硼酸为主要原料通过水热法合成了一种具备明亮的黄色荧光的碳量子点,再通过与稀土金属的配位,制备得到了一种比率型荧光碳点配合物,其在385nm的激发光下在582nm和554nm处均具有荧光发射,且存在焦磷酸根时,该配合物会出现黄色荧光增强、绿色荧光减弱的荧光现象,从而能够实现焦磷酸根的高灵敏度检测;最后通过将该比率型荧光碳点配合物修饰到羧基聚苯乙烯微球上,最终构建得到了一种能够用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针;羧基聚苯乙烯微球的负载,一方面能够显著降低比率型荧光碳点配合物聚集诱导荧光猝灭的现象,另一方面,还能够赋予该荧光探针更好的分散性、稳定性,使用时能够更加均匀分散到核酸扩增产物的体系中,以充分结合产物中的焦磷酸根,可提高检测灵敏度和检测结果的准确性。
本发明制备的碳点为掺杂了N、B、S的表面具备丰富的羧基和羟基官能团的荧光碳点,具备具有高荧光量子产率;
本发明中的羧基聚苯乙烯微球是通过在聚苯乙烯微球表面包覆共聚单体十一烯酸得到,共聚单体十一烯酸的包覆一方面为微球表面引入了大量的羧基,另一方面也可提高微球的稳定性。
本发明能够直接检测焦磷酸根含量的核酸扩增产物检测试剂,可以克服传统方案中间接检测焦磷酸根的分解产物磷酸根所存在的依赖焦磷酸酶的活性而导致检测结果的准确性难以保证的缺陷。
附图说明
图1为本发明的实施例1中制备的碳点的透射电镜照片;
图2为本发明的实施例1中制备的碳点的荧光激发光谱和荧光发射光谱图;
图3为本发明的实施例1中制备的碳点的红外光谱图;
图4为本发明的实施例2中制备的比率型荧光碳点配合物(Tb-CDs)在385nm的激发光下的发射光谱;
图5为本发明的实施例4中制备的比率型荧光探针(Tb-CDs-PS)在385nm的激发光下的发射光谱;
图6为本发明的实施例4中制备的比率型荧光探针与不同浓度的焦磷酸根混合后的荧光变化情况;
图7为本发明的实施例4中构建得到的K值与焦磷酸钠浓度Cppi的线性关系;
图8为本发明的实施例4中制备的检测微球的抗干扰实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
1)采用包含氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉和4-巯基苯硼酸在内的原料,通过水热法合成碳量子点
1-1)将氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉[T(P-OH)PP]、4-巯基苯硼酸加入乙醇和水的混合溶液中,超声,得到混合物;
1-2)将步骤1-1)得到的混合物转移到水热反应釜中,150-230℃下反应8-24h;
1-3)反应结束后冷却至室温,产物离心,离心液先用滤膜过滤,得到的滤液用截留分子量为500-1000Da的透析袋透析12-48h,收集透析袋内的透析液,冷冻干燥,得到碳量子点。本发明制备的碳量子点在385nm的激发光会发出明亮的黄色荧光。
2)制备比率型荧光碳点配合物
2-1)将步骤1)制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散5-30min,制备得到碳点溶液;
2-2)制备稀土金属离子Mn+的溶液,然后在持续搅拌下将Mn+溶液加入到步骤2-1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7-10,在50-85℃,反应10-60min;
2-3)反应结束后冷却至室温,产物在2000-6000rpm下离心1-5min,固体产物真空干燥,得到M与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。其中,Mn+为Tb3+、Eu3+、DY3+或Sm3+。
在优选的实施例中,Mn+为Tb3+。Tb3+具有绿色荧光的发光特性,而DY3+或Sm3+配合物的荧光强度较弱,所以优选为Tb3+,以下均以Tb3+为例进行说明。
所述步骤2)具体包括:
2-1)将步骤1)制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散5-30min,制备得到碳点溶液;
2-2)将Tb(NO3)3·6H2O溶解在超纯水中,制备得到Tb3+溶液,然后在持续搅拌下将Tb3+溶液加入到步骤2-1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7-9,在55-70℃,反应10-60min;
2-3)反应结束后冷却至室温,产物在2000-6000rpm下离心1-5min,固体产物真空干燥,得到Tb与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。
所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氨水。
3)制备羧基聚苯乙烯微球
3-1)制备聚苯乙烯微球:
3-1-1)将PVP(聚乙烯吡咯烷酮)溶解于无水乙醇中,搅拌均匀,通入N2,得到混合物A;
3-1-2)将AIBN(偶氮二异丁腈)加入苯乙烯中,搅拌均匀,通入N2,得到混合物B;
3-1-3)将混合物A和B混合,搅拌均匀,于40-65℃下反应5-45min,然后升高温度至68-95℃,聚合反应6-24h;
3-1-4)反应结束后离心,将离心得到的固体产物用乙醇和去离子水依次清洗,干燥过夜,得到聚苯乙烯微球;
3-2)聚苯乙烯微球表面羧基化包覆:
3-2-1)将聚苯乙烯微球分散在十二烷基硫酸钠溶液中;
3-2-2)向步骤3-2-1)得到的混合物中加入过硫酸钠、十一烯酸的乙醇溶液和二乙烯基苯的甲醇溶液,搅拌均匀,超声3-25min;
3-2-3)于55-90℃下反应3-10h,反应结束后离心,离心得到的固体产物用乙醇和水依次清洗,干燥,得到羧基聚乙烯微球。
4)将步骤2)得到的比率型荧光碳点配合物修饰到步骤3)得到的羧基聚苯乙烯微球上,得到该比率型荧光探针
4-1)将步骤2)制得的比率型荧光碳点配合物加入去离子水中,超声分散,制备成荧光碳点配合物溶液;
4-2)向荧光碳点配合物溶液中加入1,3-二环己基碳二亚胺(DCC);
4-3)取步骤3)制得的羧基聚乙烯微球加入到步骤4-2)得到的混合液中,40-75℃下,搅拌反应6-16小时,反应结束后离心,离心得到的固体产物用去离子水洗涤,真空干燥,得到该比率型荧光探针。
在一种优选的实施例中,利用本发明制备的比率型荧光探针进行核酸扩增产物检测的方法为:
Ⅰ、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成探针溶液;
Ⅱ、将步骤Ⅰ得到的探针溶液加入到待测样品进行核酸扩增反应后的产物中,搅拌均匀得到检测混合液,静置3-20min;
Ⅲ、利用波长为385nm的激发光源照射步骤Ⅱ得到的检测混合液,测量检测混合液在582nm处的黄色荧光强度I582以及554nm处的绿色荧光强度I554,计算出I582/I554的值,最后根据预先建立的表征荧光强度比值I1/I2与待测样品中目标物浓度关系的标准曲线fB,计算得到待测样品中的目标物浓度,实现核酸扩增产物的定量检测。
其中,所述步骤Ⅲ中,标准曲线fB的构建方法为:
a、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成探针溶液;
b、根据要检测的目标物,预先一系列浓度的若干份体积均为V的目标物标准溶液,然后将每份目标物标准溶液于相同条件下分别进行核酸扩增;
c、完成核酸扩增后,在得到的每份扩增产物中分别加入等体积、等浓度的探针溶液,搅拌均匀得到检测混合液,静置3-20min;
d、对于每一份检测混合液,测量其在385nm的激发光下,582nm处的荧光强度I582以及554nm处的荧光强度I554,计算出I582/I554的值,以目标物标准溶液的浓度为X轴,I582/I554的值为Y轴,进行曲线拟合,得到表征荧光强度比值I582/I554与目标物浓度关系的标准曲线fB。
本发明中制备的比率型荧光碳点配合物在385nm的激发光下,在582nm和554nm处均具有荧光发射峰。
本发明的检测试剂的主要机理为:
总体上:本发明制备的碳点具有明亮的黄色荧光,与铽反应形成比率型荧光碳点配合物后,由于铽和碳点之间的德克斯特能量转移,在激发光照射下,具有黄色和绿色两种荧光发射。存在焦磷酸根时,由于焦磷酸根与铽具有更强的结合力,焦磷酸根与碳点竞争,使铽从碳点上脱离,而与焦磷酸根形成配合物,比率型荧光碳点配合物结构被破坏,铽和碳点的解离/分解使两者之间的德克斯特能量转移中断,碳点的黄色荧光增强,而铽的绿色荧光减弱。且黄色荧光与绿色荧光强度的比值同焦磷酸根的浓度在一定范围内具有良好的线性关系,从而可以实现焦磷酸根的检测,而焦磷酸根是核酸扩增过程的副产物,最终根据焦磷酸根的浓度可以计算得到待测样品中目标物的浓度。
本发明的碳点是以氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉[T(P-OH)PP]、4-巯基苯硼酸为主要原料,通过自下而上的水热法制备得到:
(1)氨水杨酸作为碳源,同时又具有丰富的羧基,碳点上羧基的引入一方面能进一步提高了碳点的亲水性,另一方面,碳点通过表面的羧基能够与铽离子配位(铽离子对氧原子具有很强的亲和力),从而产生德克斯特(Dexter)能量转移,导致碳点的黄色荧光减弱、绿色荧光增强。
(2)5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉同时作为碳源和氮源,另外还可引入一定量的硫元素。5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉是一种具有大的共轭π体系的大环有机分子,能够提高sp2-结构域的尺寸;在5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉的大环结构中,由四个氮原子构成了具有一定空间位置的配位环境,利于与铽形成稳定的配合物;另外5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉能够为碳点引入丰富的羟基,使得碳点的亲水性大大提高。
(3)4-巯基苯硼酸作为原料的主要作用是:一方面引入大量羟基,以提升碳点的亲水性,另一方面还能够引入B元素和S元素。
(4)本发明制备的碳点为掺杂了N、B、S的表面具备丰富的羧基和羟基官能团的荧光碳点,N元素与C在原子结构上相似,N元素的掺杂可以有效提高碳点量子产率;B元素能够加快激发态过程的电子转移,掺杂B同样能够提高碳点量子产率,且缺电子的B元素能够诱导碳点的电荷极化,可降低聚集诱导荧光猝灭的现象。S具有与C相似的电负性,但原子半径显著大于C,S的化学性质更加活泼,电子跃迁的概率更大,S元素掺杂能够进一步提高碳点的量子产率;另外,硫提供负电性位点,容易与正电学物质结合,从而使得铽离子更容易结合到碳点表面,以构建形成比率型荧光碳点配合物。所以,本发明通过N、B、S的掺杂活动了一种具有高荧光量子产率的碳点,其荧光强度高,能够提高基于该碳点构建的检测试剂的灵敏度和准确度。
(5)本发明中,借由铽离子与碳点通过丰富的羧基的亲和力,以及S元素辅助提供的结合作用,使得铽离子与碳点形成了具备特殊荧光特性的功能化的比率型荧光碳点配合物:其同时具备黄色荧光和绿色荧光的发射峰,其中,黄色荧光来源与碳点,绿色荧光来自与铽,铽的f-f跃迁能量频率处于可见光区,且f-f跃迁能量适中,使得铽能够作为优异的发光配合物的中心离子。而铽与碳点之间的德克斯特(Dexter)能量转移,导致该比率型荧光碳点配合物的黄色荧光减弱、绿色荧光增强,从而赋予其特殊的荧光特性:当存在焦磷酸根时,由于焦磷酸根与铽具有更强的结合力,焦磷酸根与碳点竞争,使铽从碳点上脱离,而与焦磷酸根形成配合物,比率型荧光碳点配合物结构被破坏,铽和碳点的解离/分解使两者之间的德克斯特能量转移中断,碳点的黄色荧光增强,而铽的绿色荧光减弱。
(6)本发明制备的比率型荧光碳点配合物表面含有丰富的羧基、羟基等亲水性官能团,使得其具有良好的水溶性。
(7)本发明制备的碳点的粒径在10-15nm左右,制备的羧基聚苯乙烯微球的粒径在150-200nm左右;本发明中进一步通过羧基聚苯乙烯微球来负载比率型荧光碳点配合物,最终构建形成以单分散羧基聚苯乙烯微球为载体、比率型荧光碳点配合物为检测化合物的比率型荧光探针。
其中,羧基聚苯乙烯微球是通过在聚苯乙烯微球表面包覆共聚单体十一烯酸得到,共聚单体十一烯酸的包覆一方面为微球表面引入了大量的羧基,另一方面也可提高微球的稳定性。微球表面的羧基通过与比率型荧光碳点配合物表面的羟基进行缩合反应,从而使比率型荧光碳点配合物能够均匀、稳定连接在羧基聚苯乙烯微球表面。在比率型荧光探针中,羧基聚苯乙烯微球上的羧基以及碳点上的羟基等官能的的引入,使得该比率型荧光探针具备良好的亲水性和分散性。
采用比率型荧光碳点配合物进行焦磷酸根检测时,失去铽的碳点的黄色荧光会增强,但碳点由于粒子间相互作用容易出现聚集诱导荧光猝灭的现象,导致黄色荧光出现损失而减弱,使得黄色荧光强度/绿色荧光强度的值减小,导致检测结果偏低。本发明中,通过羧基聚苯乙烯微球来负载比率型荧光碳点配合物构建成检测试剂能够克服该缺陷,本发明中,失去铽的碳点由于羧基聚苯乙烯微球的负载,分散性大大提高,碳点间的间距显著提高,因粒子间相互作用导致的聚集诱导荧光猝灭的现象被大大降低,使得碳点的黄色荧光基本不会因聚集诱导而损失,能够保证检测结果的准确性。另一方面,由于通过羧基聚苯乙烯微球负载,使得该检测试剂具备更好的稳定性,且使用时能够更加均匀分散到核酸扩增产物的体系中,以充分结合产物中的焦磷酸根,可提高检测灵敏度和检测结果的准确性。
以上为本发明的总体构思,以下在其基础上提供详细的实施例,以对本发明做进一步说明。
实施例1制备碳量子点
1)将氨水杨酸1.7g、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉0.9g、4-巯基苯硼酸0.5g加入到150mL乙醇和水的混合溶液(乙醇和水的体积比为3:2)中,搅拌,超声10min,得到混合物;
2)将步骤1-1)得到的混合物转移到聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中,190℃下反应12h;
3)反应结束后冷却至室温,产物在5000rpm下离心10min,离心液先用0.22μm的滤膜过滤,得到的滤液用截留分子量为900Da的透析袋透析20h,收集透析袋内的透析液,冷冻干燥,得到碳量子点,2℃下冷藏备用。
参照图1,为本实施例制备的碳点的透射电镜照片,可以看出该碳点粒径较均匀,尺寸在10-15nm左右。
参照图2,为本实施例制备的碳点(CDs)的荧光激发光谱(Ex)和荧光发射光谱图(Em),激发峰在385nm处,发射峰在582nm处。
参照图3,为本实施例制备的碳点(CDs)的红外光谱图,说明该碳点具有羟基、羧基、氨基、苯环(Benzene)等官能团。
实施例2制备比率型荧光碳点配合物
1)将实施例1制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散15min,制备得到浓度为0.5mg/mL的碳点溶液;
2)将Tb(NO3)3·6H2O溶解在超纯水中,制备得到Tb(NO3)3·6H2O的浓度为0.1mM的硝酸铽水溶液,即Tb3+溶液,然后在持续搅拌下将2.0mLTb3+溶液加入到步骤1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7,在60℃,反应30min;
3)反应结束后冷却至室温,产物在4000rpm下离心3min,固体产物真空干燥,得到Tb与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。
实施例3制备羧基聚苯乙烯微球(PS)
1)制备聚苯乙烯微球:
1-1)将20g PVP溶解于500g无水乙醇中,搅拌均匀,通入N2 3min,得到混合物A;
1-2)将5g AIBN加入100g苯乙烯中,搅拌均匀,通入N2 3min,得到混合物B;
1-3)将混合物A和B混合,搅拌均匀,于55℃下反应25min,然后升高温度至75℃,聚合反应12h;
1-4)反应结束后在2000rpm下离心3min,将离心得到的固体产物用乙醇和去离子水依次清洗3次,干燥过夜,得到聚苯乙烯微球;
2)聚苯乙烯微球表面羧基化包覆:
2-1)将20mg聚苯乙烯微球分散在25ml十二烷基硫酸钠溶液(0.25wt%)中,超声分散15min;
2-2)向步骤2-1)得到的混合物中加入20mg过硫酸钠、200ul十一烯酸的乙醇溶液(1/10,V/V)和120ul二乙烯基苯的甲醇溶液(1/100,V/V),搅拌均匀,超声15min;
2-3)于75℃下反应7h,反应结束后离心,离心得到的固体产物用乙醇和水依次清洗,干燥,得到羧基聚乙烯微球。
本实施例制备的羧基聚乙烯微球直径为150-200nm左右。
实施例4比率型荧光探针
1)将实施例2制得的比率型荧光碳点配合物加入去离子水中,超声分散5min,制备成浓度为0.2mg/mL荧光碳点配合物溶液;
2)向荧光碳点配合物溶液中加入0.1mg 1,3-二环己基碳二亚胺;
3)取5mg实施例3制得的羧基聚乙烯微球加入到步骤2)得到的混合液中,60℃下,搅拌反应10小时,反应结束后离心,离心得到的固体产物用去离子水洗涤,真空干燥,得到该比率型荧光探针。
参照图4,为实施例2制备的比率型荧光碳点配合物(Tb-CDs)在385nm的激发光下的发射光谱,可以看出,该比率型荧光碳点配合物具有两处明显的发射峰:582nm处的黄色荧光以及554nm处的绿色荧光;
参照图5,为实施例4制备的比率型荧光探针(Tb-CDs-PS)在385nm的激发光下的发射光谱;其中,图5的检测微球中所含的Tb-CDs的浓度与图4中的比率型荧光碳点配合物的浓度相同,可以看出,通过羧基聚乙烯微球负载Tb-CDs后,其在582nm处的荧光强度得到了明显的提高。
参照图6,为实施例4制备的比率型荧光探针(0.2mg/mL)与不同浓度的焦磷酸根混合后的荧光变化情况,可以看出,随焦磷酸根浓度(浓度依次为:0、15、30、45、60、75、90μM的焦磷酸钠溶液)的增加,荧光探针在582nm处的黄色荧光强度I582逐渐增强、在554nm处的绿色荧光强度I554逐渐减弱,荧光强度比K=I582/I554的值逐渐增大,且K的值与焦磷酸钠浓度Cppi具有良好的线性关系,如图7所示,线性方程为K=0.1046Cppi+0.381,R2=0.9998。
参照图8,为实施例4制备的比率型荧光探针的抗干扰实验结果,将浓度均为50μM的各离子溶液与比率型荧光探针(0.2mg/mL)混合,检测385nm的激发光下的荧光强度I582、I554,并计算出比值K=I582/I554。从检测结果可以看出,除焦磷酸根(PPi)外,其余的阳离子和阴离子加入前后,比值K均无明显变化,说明该检测微球对焦磷酸根具有很好的特异性。
实施例5
本实施例提供一种利用实施例4制备的比率型荧光探针进行核酸扩增产物检测的方法,具体包括以下步骤:
Ⅰ、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成浓度为0.2mg/mL的探针溶液;
Ⅱ、取2mL步骤Ⅰ得到的探针溶液加入到30mL待测样品进行核酸扩增反应后的产物中,搅拌均匀得到检测混合液,静置15min;
Ⅲ、利用波长为385nm的激发光源照射步骤Ⅱ得到的检测混合液,测量检测混合液在582nm处的黄色荧光强度I582以及554nm处的绿色荧光强度I554,计算出I582/I554的值,最后根据预先建立的表征荧光强度比值I1/I2与待测样品中目标物浓度关系的标准曲线fB,计算得到待测样品中的目标物浓度,实现核酸扩增产物的定量检测。荧光强度比值K越大,表征待测样品中目标物浓度越高。
需要理解的是,不同的目标物进行核酸扩增产物检测需要通过常规方法构建不同的标准曲线,本实施例中不具体举例,只对其构建方法进行简要说明,具体的,标准曲线fB的构建方法为:
a、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成浓度为0.2mg/mL的探针溶液;
b、根据要检测的目标物的具体种类,预先一系列浓度的若干份体积均为V(例如30mL)的目标物标准溶液,然后将每份目标物标准溶液于相同条件下分别进行核酸扩增;
c、完成核酸扩增后,在得到的每份扩增产物中分别加入等体积(2mL)、等浓度(0.2mg/mL)的探针溶液,搅拌均匀得到检测混合液,静置15min;
d、对于每一份检测混合液,测量其在385nm的激发光下,582nm处的荧光强度I582以及554nm处的荧光强度I554,计算出I582/I554的值,以目标物标准溶液的浓度为X轴,I582/I554的值为Y轴,进行曲线拟合,即可得到表征荧光强度比值I582/I554与目标物浓度关系的标准曲线fB。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)采用包含氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉和4-巯基苯硼酸在内的原料,通过水热法合成碳量子点;
2)制备比率型荧光碳点配合物:
2-1)利用步骤1)得到的碳量子点制备碳点溶液;
2-2)将稀土金属离子Mn+的溶液与碳点溶液混合,用碱溶液调节反应体系的pH值至7-10,在加热下反应,制备得到M与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物;
3)制备羧基聚苯乙烯微球;
4)将步骤2)得到的比率型荧光碳点配合物修饰到步骤3)得到的羧基聚苯乙烯微球上,得到该比率型荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,其中,Mn+为Tb3+、Eu3+、DY3+或Sm3+。
3.根据权利要求2所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤1)具体包括:
1-1)将氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉、4-巯基苯硼酸加入乙醇和水的混合溶液中,超声,得到混合物;
1-2)将步骤1-1)得到的混合物转移到水热反应釜中,150-230℃下反应8-24h;
1-3)反应结束后冷却至室温,产物离心,离心液先用滤膜过滤,得到的滤液用截留分子量为500-1000Da的透析袋透析12-48h,收集透析袋内的透析液,冷冻干燥,得到碳量子点。
4.根据权利要求3所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤2)具体包括:
2-1)将步骤1)制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散5-30min,制备得到碳点溶液;
2-2)制备稀土金属离子Mn+的溶液,然后在持续搅拌下将Mn+溶液加入到步骤2-1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7-10,在50-85℃,反应10-60min;
2-3)反应结束后冷却至室温,产物在2000-6000rpm下离心1-5min,固体产物真空干燥,得到M与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。
5.根据权利要求4所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,其中,Mn+为Tb3+,所述步骤2)具体包括:
2-1)将步骤1)制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散5-30min,制备得到碳点溶液;
2-2)将Tb(NO3)3·6H2O溶解在超纯水中,制备得到Tb3+溶液,然后在持续搅拌下将Tb3+溶液加入到步骤2-1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7-9,在55-70℃,反应10-60min;
2-3)反应结束后冷却至室温,产物在2000-6000rpm下离心1-5min,固体产物真空干燥,得到Tb与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。
6.根据权利要求5所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,其中,所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氨水。
7.根据权利要求1所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤3)具体包括:
3-1)制备聚苯乙烯微球:
3-1-1)将PVP溶解于无水乙醇中,搅拌均匀,通入N2,得到混合物A;
3-1-2)将AIBN加入苯乙烯中,搅拌均匀,通入N2,得到混合物B;
3-1-3)将混合物A和B混合,搅拌均匀,于40-65℃下反应5-45min,然后升高温度至68-95℃,聚合反应6-24h;
3-1-4)反应结束后离心,将离心得到的固体产物用乙醇和去离子水依次清洗,干燥过夜,得到聚苯乙烯微球;
3-2)聚苯乙烯微球表面羧基化包覆:
3-2-1)将聚苯乙烯微球分散在十二烷基硫酸钠溶液中;
3-2-2)向步骤3-2-1)得到的混合物中加入过硫酸钠、十一烯酸的乙醇溶液和二乙烯基苯的甲醇溶液,搅拌均匀,超声3-25min;
3-2-3)于55-90℃下反应3-10h,反应结束后离心,离心得到的固体产物用乙醇和水依次清洗,干燥,得到羧基聚乙烯微球。
8.根据权利要求7所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤4)具体包括:
4-1)将步骤2)制得的比率型荧光碳点配合物加入去离子水中,超声分散,制备成荧光碳点配合物溶液;
4-2)向荧光碳点配合物溶液中加入1,3-二环己基碳二亚胺;
4-3)取步骤3)制得的羧基聚乙烯微球加入到步骤4-2)得到的混合液中,40-75℃下,搅拌反应6-16小时,反应结束后离心,离心得到的固体产物用去离子水洗涤,真空干燥,得到该比率型荧光探针。
9.根据权利要求8所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,利用该比率型荧光探针进行核酸扩增产物检测的方法为:
Ⅰ、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成探针溶液;
Ⅱ、将步骤Ⅰ得到的探针溶液加入到待测样品进行核酸扩增反应后的产物中,搅拌均匀得到检测混合液,静置3-20min;
Ⅲ、利用波长为385nm的激发光源照射步骤Ⅱ得到的检测混合液,测量检测混合液在582nm处的黄色荧光强度I582以及554nm处的绿色荧光强度I554,计算出I582/I554的值,最后根据预先建立的表征荧光强度比值I1/I2与待测样品中目标物浓度关系的标准曲线fB,计算得到待测样品中的目标物浓度,实现核酸扩增产物的定量检测。
10.根据权利要求9所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤Ⅲ中,标准曲线fB的构建方法为:
a、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成探针溶液;
b、根据要检测的目标物,预先一系列浓度的若干份体积均为V的目标物标准溶液,然后将每份目标物标准溶液于相同条件下分别进行核酸扩增;
c、完成核酸扩增后,在得到的每份扩增产物中分别加入等体积、等浓度的探针溶液,搅拌均匀得到检测混合液,静置3-20min;
d、对于每一份检测混合液,测量其在385nm的激发光下,582nm处的荧光强度I582以及554nm处的荧光强度I554,计算出I582/I554的值,以目标物标准溶液的浓度为X轴,I582/I554的值为Y轴,进行曲线拟合,得到表征荧光强度比值I582/I554与目标物浓度关系的标准曲线fB。
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